وتسمح هذه الطريقة بالتقويم الكمي لاستهلاك الأكسجين من أعداد صغيرة من الجزر الصغيرة من الأنواع ذات الصلة، مثل الرئيسيات غير البشرية والبشر، مما يسمح بتقييم وظيفة الميتوكوندريا. ويمكن تنفيذ هذه التقنية مع أعداد صغيرة من الجزر الأولية، وزيادة النسخ المتماثلة التقنية، والسماح لاختبار ظروف متعددة، وتحسين صرامة وإعادة إنتاج من الفحص. هذه التقنية تقيم صحة الميتوكوندريا، وهو محدد رئيسي لوظيفة جزيرة وإفراز الأنسولين الذي غالبا ما يكون ضعيف في مرض السكري وهو مؤشر كبير على زرع الجزر الناجحة.
ومن الضروري التأكد من أن الجزر المحلية هي إلى مركز الآبار بعد نقلها. ويؤدي عدم القيام بذلك إلى قياسات استهلاك الأكسجين غير المتسقة. إثبات هذا الإجراء سيكون، فاليري ريتشياردي، طالبة جامعية تعمل في مختبري.
في اليوم السابق للتشايس، إضافة 200 ميكرولترات من الخلايا والأنسجة لاصقة إلى 2.8 ملليلتر من 0.1 مولار حل بيكربونات الصوديوم وإضافة 20 ميكرولترات من الحل الناتج إلى الجزء السفلي من كل بئر من 96 جيدا spheroid المتنخر. تأكد من إزالة أي فقاعات الهواء من طرف الماصات. عندما يتم تحميل جميع الآبار، ضع الصفيحة في حاضنة لثاني أكسيد الكربون 37 درجة مئوية.
بعد ساعة واحدة، الاستنشاق محلول لاصق الخلية من لوحة داخل بيئة معقمة وغسل كل بئر مرتين مع 400 ميكرولترات من 37 درجة مئوية من الماء المعقم. ثم تسمح للآبار بالهواء الجاف لمدة 30 إلى 40 دقيقة قبل تغطية اللوحة للتخزين الليلي عند أربع درجات مئوية. لترطيب خرطوشة المستشعر، في بيئة معقمه افتح حزمة خرطوشة المستشعر وأزل المحتويات.
ضع خرطوشة الاستشعار رأسًا على عقب بجوار لوحة المرافق وملء كل بئر من لوحة المرافق بـ 200 ميكرولترات من الماء المعقم. عندما تم تحميل جميع الآبار، وخفض خرطوشة الاستشعار في لوحة فائدة ووضع خرطوشة الاستشعار المجمعة ولوحة فائدة في 37 درجة مئوية غير الكربونية حاضنة ثاني أكسيد بين عشية وضحاها. في يوم الفحص، قم بإزالة غطاء خرطوشة المستشعر وفك الماء من آبار لوحة المرافق.
إضافة 200 ملليلتر من الفرجان ما قبل الدفء إلى كل بئر واستبدال غطاء خرطوشة الاستشعار. ثم ضع خرطوشة الاستشعار مرة أخرى في الحاضنة لمدة ساعة واحدة. لإعداد الجزر لنقلها، اختيار اليد الجزر في طبق ثقافة خلية 60 في 15 ملليمتر تحتوي على متوسطة تجميعها إلى ما يقرب من 100٪ نقاء.
عندما تم جمع جميع الجزر، تحميل كل بئر من الصفرة المجهرية spheroid المعدة مع 175 ميكرولترات من المتوسطة المجمعة واستخدام ماصة P20 تعيين إلى 15 ميكرولترات لpirate 15 الجزيرة في 15 ميكرولترات من المتوسطة من طبق ثقافة الخلية. لزرع الجزر على الصفرة الصغيرة spheroid، خفض طرف ماصة إلى الجزء السفلي من البئر، ورفع بالكاد غيض، وصرف ببطء حوالي خمسة ميكروليتر من المتوسط. لتحميل الجزر في الآبار، والسماح الجزر لتسوية في طرف ماصة قبل الإفراج بلطف لهم مباشرة فوق الجزء السفلي من مركز البئر في حجم صغير من المتوسط.
تأكد من أن جميع الجزر قد تركت طرف الماصات، والتحقق من حين لآخر من الصفائح الصغيرة الزفية تحت المجهر للتحقق من أن الجزر مبذرة في الجزء السفلي من اللوحة ولا تلتصق بالجوانب من الآبار. عندما تم نقل جميع الجزر، ضع اللوح الصغير في حاضنة ثاني أكسيد الكربون غير الكربونية 37 درجة مئوية. قبل البدء في إجراء الفحص ، قم بتحميل Port A لـ cartridge أجهزة الاستشعار مع 20 ميكروليتر من 45 oligomycin حديثًا ، وبورت B مع 22 ميكرولترات من 10 ميكرومولار FCCP الطازجة ، وميناء C مع 25 ميكرولترات من 25 ميكرومولار AA الطازجة. المقبل, برنامج تحليل تدفق خارج الخلية المقايسة لمدة 30 دقيقة خط الأساس التنفس الفترة, 42 دقيقة oligomycin فترة قياس, 30 دقيقة فترة FCCP, و 30 دقيقة روفينون AA الفترة.
ثم تشغيل المقايسة التالية للتعليمات على الشاشة لمعايرة الاستشعار وإدراج microplate. لتسليم جزيرة إلى لوحة المقايسة، ينبغي أن يستنشق 15 الجزر في 15 ميكرولترات من المتوسطة كما هو موضح. وسوف يؤدي هذا الأسلوب في وضع متسقة من الجزر في مركز أسفل كل بئر microplate السماح لقياسات استهلاك الأكسجين دقيقة.
وفي هذه التجربة التمثيلية التي تبين استهلاك الأكسجين من الآبار الفردية، كانت الآبار محملة بشكل سيئ مما أدى إلى مستوى خط أساس منخفض جداً من استهلاك الأكسجين واستجابة ضئيلة أو معدومة لـ FCCP. وفي هذه التجربة، أظهرت معظم الآبار وجود تنفس أساسي كبير واستجابة للمخدرات. ومع ذلك، لم تظهر بئران أي استجابة للروتينون، مما يشير إلى أن الدواء لم يتم إطلاقه بشكل صحيح في البئر.
وقد استُبعدت هذه الآبار من إجراء المزيد من التحليلات. وهنا، يمكن ملاحظة النتائج التي أسفر عنها فحص ناجح كانت فيه الآبار محملة بشكل صحيح بالرياح الصغيرة وحقنها بشكل صحيح بالعقاقير. ومن المفيد إعداد الكواشف واللوحات في اليوم السابق لأداء الفحص للسماح الجزر لاستخدامها بعد وقت قصير من عزلها أو تلقيها.
بعد الفحص، يمكن استرداد الجزر لاستخراج البروتين أو الحمض النووي لتطبيع بيانات استهلاك الأكسجين أو لتحديد محتوى الحمض النووي الميتوكوندريا. القدرة على قياس وظيفة الميتوكوندريا في أعداد صغيرة من الجزر الرئيسيات الأولية يسمح باختبار الأدوية المتعددة وغيرها من التلاعبات في تكرار بيولوجي واحد. وينبغي أن يكون من المؤكد أن الأفراد الذين يعملون مع الجزر الرئيسيات الأولية أن تكون مدربة على التعامل السليم والآمن مع هذه الأنسجة.
وعلى وجه الخصوص، استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة والتخلص السليم من هذه العينات.
