ونود أن نشكر أعضاء المختبر Tsirka لنصائحهم وتعليقات مفيدة. وأيد هذا العمل من قبل R01NS42168 إلى المجموعة، 12PRE12060489 إلى RB، وهو NSF-3MT IGERT وتيرنر أطروحة الزمالة إلى LT، و NSF-3MT IGERT إلى JCN.

1. تشريح (يوم 0) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحث على التخدير لP0-2 الجراء الفأر مع انخفاض حرارة الجسم. مسح رؤوس الجراء مع Kimwipe غارقة في الايثانول 70٪ لتطهير الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الرؤوس مع زوج من مقص، وذلك باستخدام 4 الجراء في 10 سم لوحة الثقافة. وضع رؤساء في طبق بتري تحتوي العازلة الجليد الباردة هانك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترسيخ رؤساء باستخدام ملقط المنحني من خلال تجويف العين وإزالة بعناية الجلد الذي يغطي الجمجمة مع microforceps مستقيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العظام في الجمجمة مع microforceps على التوالي، وذلك باستخدام الحذر لعدم ثقب أو تلف القشور. الطريقة الأكثر فعالية هو لبدء إزالة بدءا بالقرب من المخيخ، والذي يقع عند قاعدة الرأس، كما سيتم تجاهل هذه المنطقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الدماغ مع ملعقة صغيرة، ووضع (4) العقول في طبق بتري الطازجة التي تحتوي على المخزن المؤقت هانك الجليد الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جميع الخطوات من هذه النقطة على الاستفادة microforceps ويتم تنفيذها تحت ديسيهالمجهر كشن. تبدأ على الجانب البطني من الدماغ، ومرساة الأنسجة من خلال عقد المخيخ وجعل اثنين من الشقوق الصغيرة على جانبي الدماغ المتوسط. يجب الحرص على عدم قطع كل الطريق من خلال الأنسجة، كما تغطي القشور الدماغ المتوسط ​​في هذه المنطقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ندف بلطف المخ الأوسط والمخيخ في قطعة واحدة من القشور اثنين. ينبغي للقشرات اثنين تشكيل شكل مقعر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل القشور اثنين وتوجيه القشرة واحدة مع الجانب الإنسي فوق لمزيد من تشريح. الحصين يمكن أن يكون صعبا للاحتفال، ولكن يقع مقابل من البصلة الشمية الذي يظهر على شكل عقيدات صغيرة على نهاية مدببة من القشرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحصين، الذي يحتوي على شكل الهلال. الوجه القشرة أكثر لعرض الجانب الظهري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام البصلة الشمية كنقطة انطلاق، وإزالة جميع السحايا والبصلة الشمية نفسها من القشرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب وضع قشرات تشريح في أنابيب مخروطية 15 مل مع 14 مل من العقيدد ملحي هانك مخزنة على الجليد. </li></ol> 2. الثقافة الخلية (يوم 0) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ما قبل معطف 10 سم الأنسجة أطباق الثقافة مع 5 ميكروغرام / مل من بولي-D-يسين (PDL) المخفف في الماء تعقيمها لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح PDL، وألواح يغسل مرة واحدة مع الماء تعقيمها. لوحة الجافة تحت الأشعة فوق البنفسجية في نسيج الثقافة هود لمدة 20 دقيقة. هذه الخطوة يجب أن يؤديها قبيل عملية تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العازلة نضح هانك من الأنابيب التي تحتوي على القشور من 4 أدمغة كل، وتطبيق 4 مل من 1X التربسين / EDTA الحل، يسحن الأنسجة مع P1000 طرف، وأنابيب مكان في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 4 مل من وسائل الاعلام دبقية كاملة في أنبوب لوقف عملية الهضم الأنزيمية، ومزيج، وتدور باستمرار في محتويات دورة في الدقيقة 1.5K لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف وتكرار غسل مع 4 مل من وسائل الإعلام كاملة. Resuspend الخلايا في 10 مل من وسائل الإعلام دبقية كاملة (DMEM مع FBS 10٪، 1٪ البيروفات الصوديوم، 0.08٪ جنتاميسين)، ومرشح من خلال 40 الصغرىن شبكة مصفاة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة في مناطق ذات كثافة من 8 القشور لكل 10 مل في 10 سم نسيج لوحة الثقافة والمكان في نسيج الثقافة الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 (انظر الخلايا الدبقية الصغيرة بروتوكول الكبار). </li></ol> (يوم 3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير وسائل الإعلام في جميع الأطباق ثقافة الخلية مع وسائل الاعلام دبقية كاملة. </li></ol> (اليوم 10) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 400 ميكرولتر من 60 ملم في HBSS يدوكائين (لفصل الخلايا الدبقية الصغيرة) في المتوسط ​​من 10 سم لوحات زراعة الأنسجة واحتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10-15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع وسائل الإعلام / التعليق خلية من لوحة، ويغسل مرة واحدة مع لوحة العازلة هانك. جمع غسل العازلة لاسترداد ما تبقى الخلايا الدبقية الصغيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 ملي EDTA (8.0 درجة الحموضة) إلى تعليق خلية إلى تركيز النهائي من 50 ميكرومتر أو في 1/100 التخفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار تعليق خلية في 1،000 x ج (1،500 دورة في الدقيقة) لمدة 5 دقائق وإعادة تعليق في 1 مل DMEM مع FBS 1٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد عدد الخلايا قابلة للحياة (وفقا مي الكبارcroglia 3.1/3.2) والخلايا الانقسام في لوحات زراعة الأنسجة في كثافة التجريبية المطلوب. ويتم حصاد ما يقرب من 1X10 6 الخلايا الدبقية الصغيرة من سم لوحة تحتوي على 10 القشور من 4 العقول. لالمناعي، فمن المستحسن كثافة 2.5x10 4 خلايا لكل 18 مم ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سماح لا تقل عن 24 ساعة لخلايا دبقية للعودة بالكامل إلى متشعبة، دولتهم يستريح قبل استخدامها. </li></ol> نص البروتوكول: (الكبار الخلايا الدبقية الصغيرة) 1. مجموعة الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأنسجة معطف لوحات ثقافة مع بولي-D-يسين (PDL) لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. تغسل الصحون مرة واحدة مع الماء تعقيمها مباشرة قبل الاستعمال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الماوس عن طريق CO 2 الخنق والتأكد من أن القتل الرحيم كاملة. تنظيف منطقة الحبل الشوكي مع الايثانول 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام زوج من مقص قطع الجلد على الجزء العلوي من النخاع الشوكي، ثم انتقل إلى قطع الحبل الشوكي خارج المنطقة من T1 إلى T12. قطعما تبقى العضلات الخروج من الجانبين من الحبل الشوكي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض ببطء فقرات باستخدام microscissors كما كنت عقد بلطف النخاع الشوكي مع أطراف أصابعك. يجب الحرص على عدم ثقب النخاع الشوكي والأنسجة لينة جدا. استخراج ببطء النخاع الشوكي باستخدام microforceps. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غمر الحبل الشوكي في طبق بتري تحتوي HBSS الجليد الباردة. باستخدام مجهر الضوء إزالة جميع السحايا مرئية باستخدام microforceps </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الحبل الشوكي إلى أجزاء مستعرضة صغيرة بما يكفي لتوليد عدة شظايا. سمك شظايا لا ينبغي أن يكون أكثر من 2 ملم من أجل تسهيل عملية الهضم كفاءة. نقل القطع الحبل الشوكي إلى 15 مل أنبوب مخروطي يحتوي على 1 مل HBSS الجليد الباردة. الحفاظ على أنبوب على الجليد حتى الخطوة الهضم. </li></ol> 2. هضم الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح HBSS من أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على أنسجة الحبل الشوكي. يجب الحرص على عدم نضح أي قطعة من النسيج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من التربسين (2.5 ز / L المشع الخنزيري التربسين و 0.2 غرام / لتر EDTA في HBSS)، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوقف عملية الهضم وإزالة التربسين وإضافة 3 مل من الابتدائية المتوسطة الخلايا الدبقية الصغيرة التي تحتوي على مصل لوقف عملية الهضم الأنزيمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة صعودا وهبوطا لإزاحة الأنسجة. تعليق تصفية الخلية باستخدام 40 ميكرومتر مصفاة الخلية. </li></ol> 3. عد الخلايا وتصفيح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج حجم مساو من تعليق خلية وحل دابي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة في مناطق ذات كثافة بين 5 7x10 5 خلية / مل في PDL المغلفة 35 × 10 ملم الأطباق. الطلاء في مناطق ذات كثافة أقل منع نمو الخلايا حتى عندما تم زراعة الخلايا في 12 لوحات جيدة والتي لها مساحة أصغر مقارنة مع 35 × 10 ملم الأطباق. </li></ol>

<ol>
	<li>Ransohoff, R. M., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Physiology:+Unique+Stimuli,+Specialized+Responses.">Microglial Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses.</a> Ann. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).</li><li>Ginhoux, F., Greter, M., Leboeuf, M., Nandi, S., See, P., Gokhan, S., Mehler, M., Conway, S., Ng, L., Stanley, E., Samokhavalov, I., Merad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+analysis+reveals+that+adult+microglia+derive+from+primitive+macrophages.">Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages.</a> Science. 330, (2010).</li><li>Kraft, A. D., Harry, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+microglia+and+neuroinflammation+relevant+to+environmental+exposure+and+neurotoxicity.">Features of microglia and neuroinflammation relevant to environmental exposure and neurotoxicity.</a> Int. J. Env. Res. Pub. Health. 8, 2980-3018 (2011).</li><li>Sierra, A., Encinas, J. M., Deudero, J., Chancey, J., Enikolopov, G., Overstreet-Wadiche, L., Tsirka, S., Maletic-Savatic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+shape+adult+hippocampal+neurogenesis+through+apoptosis-coupled+phagocytosis.">Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis.</a> Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).</li><li>Emmetsberger, J., Tsirka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+inhibitory+factor+(MIF/TKP)+mitigates+secondary+damage+following+spinal+cord+injury.">Microglial inhibitory factor (MIF/TKP) mitigates secondary damage following spinal cord injury.</a> Neurobiol. Dis. 47, 295-309 (2012).</li><li>Gao, Z., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+MS+Reveal+Multiple+Roles+of+Microglia+in+Disease+Pathogenesis.">Animal Models of MS Reveal Multiple Roles of Microglia in Disease Pathogenesis.</a> Neurol Res. Int. , 383087 (2011).</li><li>Beggs, S., Trang, T., Salter, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X4R++microglia+drive+neuropathic+pain.">P2X4R+ microglia drive neuropathic pain.</a> Nature Neurosci. 15, 1068-1073 (2012).</li><li>Olson, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+by+microglia+in+the+spinal+cord.">Immune response by microglia in the spinal cord.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1198, 271-278 (2010).</li><li>Batchelor, P. E., Tan, S., Wills, T. E., Porritt, M. J., Howells, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+inflammation+in+the+brain+and+spinal+cord+following+mechanical+injury.">Comparison of inflammation in the brain and spinal cord following mechanical injury.</a> J. Neurotrauma. 25, 1217-1225 (2008).</li><li>Schell, J. B., Crane, C. A., Smith, M. F., Roberts, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ex+vivo+nitric+oxide+production+by+acutely+isolated+neonatal+and+adult+microglia.">Differential ex vivo nitric oxide production by acutely isolated neonatal and adult microglia.</a> J. Neuroimmunol. 189, 75-87 (2007).</li><li>Brannan, C. A., Roberts, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+microglia+from+adult+mice+are+refractory+to+nitric+oxide-inducing+stimuli+due+to+impaired+NOS2+gene+expression.">Resident microglia from adult mice are refractory to nitric oxide-inducing stimuli due to impaired NOS2 gene expression.</a> Glia. 48, 120-131 (2004).</li><li>Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+microglia+isolation+from+mixed+glial+cell+cultures+of+neonatal+rat+brain+tissue.">Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue.</a> J. Vis. Exp. (66), e3814 (2012).</li><li>Yip, P. K., Kaan, T. K., Fenesan, D., Malcangio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+and+culture+of+primary+microglia+from+adult+mouse+spinal+cord.">Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord.</a> J. Neurosci. Methods. 183, 223-237 (2009).</li><li>Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+culture+system+that+supports+adult+microglial+cell+proliferation+and+maintenance+in+the+resting+state.">Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state.</a> J. Immunol. Meth. 300, 32-46 (2005).</li><li>Ji, K., Akgul, G., Wollmuth, L. P., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+actively+regulate+the+number+of+functional+synapses.">Microglia actively regulate the number of functional synapses.</a> PLoS One. 8, e56293 (2013).</li><li>Tremblay, M. -. &. #. 2. 0. 0. ;., Majewska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+microglia+in+synaptic+plasticity.">A role for microglia in synaptic plasticity.</a> Comm. Integr. Biol. 4, 220-222 (2011).</li><li>DeWitt, D. A., Perry, G., Cohen, M., Doller, C., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+regulate+microglial+phagocytosis+of+senile+plaque+cores+of+Alzheimer's+disease.">Astrocytes regulate microglial phagocytosis of senile plaque cores of Alzheimer's disease.</a> Expt. Neurol. 149, 329-340 (1998).</li><li>Aloisi, F., Penna, G., Cerase, J., Men&#233;ndez Iglesias, B., Adorini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-12+production+by+central+nervous+system+microglia+is+inhibited+by+astrocytes.">IL-12 production by central nervous system microglia is inhibited by astrocytes.</a> J. Immunol. 159, 1604-1612 (1997).</li><li>Min, K. -. J., Yang, M. -. S., Kim, S. -. U., Jou, I., Joe, E. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+induce+hemeoxygenase-1+expression+in+microglia:+a+feasible+mechanism+for+preventing+excessive+brain+inflammation.">Astrocytes induce hemeoxygenase-1 expression in microglia: a feasible mechanism for preventing excessive brain inflammation.</a> J. Neurosci. 26, 1880-1887 (2006).</li><li>Sasmono, R., Oceandy, D., Pollard, J., Tong, W., Pavli, P., Wainwright, B., Ostrowski, M., Himes, S., Hume, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+macrophage+colony-stimulating+factor+receptor-green+fluorescent+protein+transgene+is+expressed+throughout+the+mononuclear+phagocyte+system+of+the+mouse.">A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse.</a> Blood. 101, 1155-1163 (2003).</li><li>Ekdahl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+activation+-+tuning+and+pruning+adult+neurogenesis.">Microglial activation - tuning and pruning adult neurogenesis.</a> Front Pharmacol. 3, 14 (2012).</li><li>Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A., McEwen, B., Bulloch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+derived+from+aging+mice+exhibit+an+altered+inflammatory+profile.">Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile.</a> Glia. 55, 412-424 (2007).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

الخلايا الدبقية الصغيرة تعدل CNS السير العادي فضلا عن الاستجابات الالتهابية لمختلف الأمراض. وقد تورط إعادة عرض متشابك وظيفية من قبل الخلايا الدبقية الصغيرة في الحفاظ على التوازن الطبيعي للدماغ 15. خلال تتالي العصبية يشاركون في إزالة الخلايا العصبية السلف من الت...

الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا المناعية مقيم في الجهاز العصبي المركزي، تشبه بشكل وثيق الضامة الطرفية في البنية والوظيفة 1. وقد ثبت مؤخرا أن الخلايا دبقية بعد الولادة مستمدة من الأسلاف النخاعي بدائية ويتم إنشاؤها قبل اليوم الثامن من مرحلة التطور الجنيني، تقلب فكرة سابقة أن الأسلاف المكونة للدم بعد الولادة هي مصدر الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ بالغ 2. أنها تلعب دورا رئيسيا في العديد من الأمراض العصبية ويمكن أن تستجيب بسرعة للعدوى أو إصابة عن طريق الإفراج عن السيتوكينات الموالية للالتهابات أو المضادة للالتهابات 3. وهكذا الخلايا الدبقية الصغيرة تشمل وحدة قائمة بذاتها في الجهاز العصبي المركزي التي يمكن التلاعب بها لتؤثر على تطور المرض. تطوير أساليب قوية وقابلة للتكرار لعزل وثقافة الأطفال حديثي الولادة أو الكبار خلايا دبقية المهم أن الدراسات المستقبلية. ومن المعروف الخلايا الدبقية الصغيرة ليكونوا لاعبين الحرجة في عدد من الحالات المرضية في الدماغ. وفي الآونة الأخيرة، رولES آخذة في الظهور للخلايا في نمو الدماغ العادي وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة يبلعم فائض الخلايا العصبية السلف من التلفيف المسنن من الحصين 1 و 4. الخلايا الدبقية الصغيرة يمكن أيضا أن تعدل العديد من الحالات العصبية التي تؤثر على الحبل الشوكي، مثل MS، ألم الأعصاب، وإصابات الحبل الشوكي 5-7. الخلايا الدبقية الصغيرة الحبل الشوكي تتفاعل بشكل مختلف مقارنة مع الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ استجابة لإشارات التنشيط 8، 9، ربما بسبب وجود خلافات في البيئة المحلية. وبالتالي فإنه من المهم لإنشاء المناسبة في نظام المختبر للثقافة ودراسة الخلايا الدبقية الصغيرة الحبل الشوكي. الخلايا الدبقية الصغيرة حديثي الولادة إنتاج أكثر بكثير من الموالية للالتهابات خلوى أكسيد النيتريك مقارنة مع الخلايا البالغة بعد في التحفيز المختبر مع الإنترفيرون γ أو TNF-A 10،11 مزيد من تسليط الضوء على الحاجة إلى استخدام خلايا بالغة لدراسة الخلايا الدبقية الصغيرة في سياق بعض الأمراض. بروتوكول نستخدمها في المختبر لCUlture الخلايا الدبقية الصغيرة حديثي الولادة هو الاختلاف من الأساليب الحديثة التي تستخدم اهتزاز الثقافات الدبقية المختلطة في محاولة لإزالة الخلايا الدبقية الصغيرة من سطح خلية ثقافة قارورة 12. نحن أيضا تصف طريقة لثقافة الخلايا الدبقية الصغيرة من البالغين الماوس الحبل الشوكي على أساس بروتوكول وصف لأول مرة من قبل ييب، وآخرون 13. يوفر هذا الأسلوب وسيلة أسرع لخلايا بالغة ثقافة مقارنة البروتوكولات الأخرى المتاحة 14. إعداد الناتج هو 70٪ الخلايا الدبقية الصغيرة، وتتكون النسبة الباقية من الخلايا النجمية. على الرغم من أن نقاء ثقافتنا هو أقل بالمقارنة مع غيرها من وسائل نشر 13، وهذا النظام الثقافة هي مفيدة لإستكشاف دبقية في استجابة الثقافة لمختلف المحفزات تفعيل وكذلك لدراسة الأمراض التي تؤثر بشكل رئيسي في النخاع الشوكي والتي قوية استجابة التهابية هو السمة الرئيسية. وقد تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التي وصفها ستوني بروك اجلامعاتتاي IACUC.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EDTA, 5mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567-028</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Lidocaine, 60mM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L-5647</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM, 1X</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-017</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-000-Cl</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Gentamycin Sulfate</td>
			<td>Biowittaker</td>
			<td>17-518Z</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>35 x 10mm tissue culture dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Poly-D-Lysine, 100 &mu;g/ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 1:20</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>HBSS, 1X</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>20-023-CV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

culturing microglia from the neonatal and adult central nervous system

الخلايا الدبقية الصغيرة هي المقيم الخلايا الشبيهة بلعم من الجهاز العصبي المركزي (CNS)، وعلى هذا النحو، لهما أدوار بالغة الأهمية في العمليات الفسيولوجية والمرضية مثل CNS نضوج في التنمية، والتصلب المتعدد، وإصابات الحبل الشوكي. ويمكن تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة وتجنيدهم للعمل بسبب الاصابة العصبية أو التحفيز، مثل تلف المحاور ينظر في مرض التصلب العصبي المتعدد أو الصدمة الدماغ الدماغية الناجمة عن السكتة الدماغية. ويعتقد أن هذه الأعضاء مناعيا من الجهاز العصبي المركزي أيضا أن يكون الأدوار في اللدونة متشابك في ظل ظروف غير مرضية. نحن توظيف بروتوكولات لزراعة الخلايا الدبقية الصغيرة من الأنسجة حديثي الولادة والكبار والتي تهدف إلى تحقيق أقصى قدر من أرقام الهواتف المحمولة قابلة للحياة مع التقليل من المتغيرات التباس، مثل وجود CNS الأخرى أنواع الخلايا والحطام خلية ثقافة. نحن نستخدم مكونات الجهاز العصبي المركزي كبير وملحوظ بسهولة (مثل القشرة، شرائح الحبل الشوكي)، مما يجعل العملية برمتها مجدية وقابلة للتكرار. استخدام الخلايا الكبارS هو البديل المناسب لاستخدام الأطفال حديثي الولادة الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ، كما درس العديد من الأمراض تؤثر في الأساس على الحبل الشوكي بعد الولادة. هذه الأنظمة الثقافة هي أيضا مفيدة لاختبار تأثير مباشرة من المركبات التي قد تمنع أو إما تعزيز التنشيط دبقية. منذ تفعيل دبقية صغيرة يمكن أن تشكل نتائج مرض في الجهاز العصبي المركزي الكبار، وهناك حاجة لفي نظم المختبر في الخلايا الدبقية الصغيرة التي حديثي الولادة والكبار يمكن تربيتها ودراستها.

<html> ويرد مثال من خلايا دبقية يستريح والمفعلين يمكنهم في الشكل 1. تم تصور والخلايا الدبقية الصغيرة 24 ساعة بعد الطلاء (الشكل 1A) ويحمل متشعبة مورفولوجيا (يستريح). التعرض للكاشف فتيلة، عديد السكاريد الشحمي البكتيرية (LPS) يؤدي إلى إحداث تغييرات في التشكل د?...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System at JoVE.com

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

ونحن الخطوط العريضة لطرق فعالة وسريعة العزلة / ثقافة الخلايا الدبقية الصغيرة قابلة للحياة من القشرة الدماغية حديثي الولادة والحبل الشوكي الكبار. تشريح والطلاء من الخلايا الدبقية الصغيرة القشرية يمكن إنجازه في غضون 90 دقيقة، مع موسم الحصاد دبقية اللاحقة التي تجري ~ 10 يوما بعد تشريح الأولي.

الخلايا الدبقية الصغيرة زراعة من الجهاز العصبي المركزي حديثي الولادة والكبار

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

culturing-microglia-from-the-neonatal-and-adult-central-nervous-system

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

27.5K Views.  Stony Brook University. ونحن الخطوط العريضة لطرق فعالة وسريعة العزلة / ثقافة الخلايا الدبقية الصغيرة قابلة للحياة من القشرة الدماغية حديثي الولادة والحبل الشوكي الكبار. تشريح والطلاء من الخلايا الدبقية الصغيرة القشرية يمكن إنجازه في غضون 90 دقيقة، مع موسم الحصاد دبقية اللاحقة التي تج?...

Video: Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Microglia account for approximately 12% of the total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered the major cell types of the nervous system, microglia play a significant role in normal brain physiology by monitoring tissue for debris and pathogens and maintaining homeostasis in the parenchyma via phagocytic activity 1,2. Microglia are activated during a number of injury and disease conditions, including neurodegenerative disease, traumatic brain injury, and nervous system infection 3. Under these activating conditions, microglia increase their phagocytic activity, undergo morpohological and proliferative change, and actively secrete reactive oxygen and nitrogen species, pro-inflammatory chemokines and cytokines, often activating a paracrine or autocrine loop 4-6. As these microglial responses contribute to disease pathogenesis in neurological conditions, research focused on microglia is warranted.
	Due to the cellular heterogeneity of the brain, it is technically difficult to obtain sufficient microglial sample material with high purity during in vivo experiments. Current research on the neuroprotective and neurotoxic functions of microglia require a routine technical method to consistently generate pure and healthy microglia with sufficient yield for study. We present, in text and video, a protocol to isolate pure primary microglia from mixed glia cultures for a variety of downstream applications. Briefly, this technique utilizes dissociated brain tissue from neonatal rat pups to produce mixed glial cell cultures. After the mixed glial cultures reach confluency, primary microglia are mechanically isolated from the culture by a brief duration of shaking. The microglia are then plated at high purity for experimental study.
	The principle and protocol of this methodology have been described in the literature 7,8. Additionally, alternate methodologies to isolate primary microglia are well described 9-12. Homogenized brain tissue may be separated by density gradient centrifugation to yield primary microglia 12. However, the centrifugation is of moderate length (45 min) and may cause cellular damage and activation, as well as, cause enriched microglia and other cellular populations. Another protocol has been utilized to isolate primary microglia in a variety of organisms by prolonged (16 hr) shaking while in culture 9-11. After shaking, the media supernatant is centrifuged to isolate microglia. This longer two-step isolation method may also perturb microglial function and activation. We chiefly utilize the following microglia isolation protocol in our laboratory for a number of reasons: (1) primary microglia simulate in vivo biology more faithfully than immortalized rodent microglia cell lines, (2) nominal mechanical disruption minimizes potential cellular dysfunction or activation, and (3) sufficient yield can be obtained without passage of the mixed glial cell cultures.
	It is important to note that this protocol uses brain tissue from neonatal rat pups to isolate microglia and that using older rats to isolate microglia can significantly impact the yield, activation status, and functional properties of isolated microglia. There is evidence that aging is linked with microglia dysfunction, increased neuroinflammation and neurodegenerative pathologies, so previous studies have used ex vivo adult microglia to better understand the role of microglia in neurodegenerative diseases where aging is important parameter. However, ex vivo microglia cannot be kept in culture for prolonged periods of time. Therefore, while this protocol extends the life of primary microglia in culture, it should be noted that the microglia behave differently from adult microglia and in vitro studies should be carefully considered when translated to an in vivo setting.

Isolating primary microglia from the cellular heterogeneity of the brain is essential to investigate their role in both physiological and pathological conditions. This protocol describes a mechanical isolation and mixed cell culture technique that provides high yield and high purity, viable primary microglial cells for in vitro study and downstream applications.

عزل الخلايا الدبقية الصغيرة الابتدائية المختلطة من زراعات الخلايا الغروية من المواليد الجدد الجرذ أنسجة المخ

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Lipopolysaccharide (LPS) is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of lipid A, which is embedded in the outer membrane, a core oligosaccharide and repeating O-antigen units that extend outward from the surface of the cell1, 2. LPS is an immunodominant molecule that is important for the virulence and pathogenesis of many bacterial species, including Pseudomonas aeruginosa, Salmonella species, and Escherichia coli3-5, and differences in LPS O-antigen composition form the basis for serotyping of strains. LPS is involved in attachment to host cells at the initiation of infection and provides protection from complement-mediated killing; strains that lack LPS can be attenuated for virulence6-8. For these reasons, it is important to visualize LPS, particularly from clinical isolates. Visualizing LPS banding patterns and recognition by specific antibodies can be useful tools to identify strain lineages and to characterize various mutants. 
In this report, we describe a hot aqueous-phenol method for the isolation and purification of LPS from Gram-negative bacterial cells. This protocol allows for the extraction of LPS away from nucleic acids and proteins that can interfere with visualization of LPS that occurs with shorter, less intensive extraction methods9. LPS prepared this way can be separated by sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and directly stained using carbohydrate/glycoprotein stains or standard silver staining methods. Many anti-sera to LPS contain antibodies that cross-react with outer membrane proteins or other antigenic targets that can hinder reactivity observed following Western immunoblot of SDS-PAGE-separated crude cell lysates. Protease treatment of crude cell lysates alone is not always an effective way of removing this background using this or other visualization methods. Further, extensive protease treatment in an attempt to remove this background can lead to poor quality LPS that is not well resolved by any of the aforementioned methods. For these reasons, we believe that the following protocol, adapted from Westpahl and Jann10, is ideal for LPS extraction.

We describe a modified hot aqueous-phenol extraction method for purifying lipopolysaccharide (LPS) from Gram-negative bacteria. Once extracted, the LPS can be subsequently analyzed by SDS-PAGE and visualized by direct staining or Western immunoblot.

تنقية والتصور من Lipopolysaccharide من البكتريا سالبة الجرام بواسطة استخراج مائي، الفينول الساخن

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure for isolation of microglia from neonatal murine cortices by mechanical agitation with a rotary shaker. This microglia isolation method yields highly pure cortical microglia that exhibit morphological and functional characteristics indicative of quiescent microglia in normal, nonpathological conditions in vivo. This procedure also preserves the microglial immunophenotype and biochemical functionality as demonstrated by the induction of morphological changes, nuclear translocation of the p65 subunit of NF-&#954;B (p65), and secretion of the hallmark proinflammatory cytokine, tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), upon lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam) challenges. Therefore, the present isolation procedure preserves the immunophenotype of both quiescent and activated microglia, providing an experimental method of investigating microglia biology in ex vivo conditions.

One key to successful investigation of microglial biology is the preservation of microglial immunofunction ex vivo during isolation from CNS tissue. Isolating microglia via rotary shaking results in highly pure and immunofunctional cell cultures as assessed by fluorescent imaging, immunocytochemistry, and ELISA following microglia activation with the proinflammatory stimuli lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam).

عزل الخلايا الدبقية الصغيرة القشرية مع نمط ظاهري مناعي المحفوظة وظيفة من الفئران حديثي الولادة

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.

Here we describe a newly developed hepatitis B virus (HBV) reporter system to monitor the early stages of the HBV life cycle. This simplified in vitro system will aid in the screening of anti-HBV agents using a high-throughput strategy.

تطوير نظام الفيروسات مراسل التهاب الكبد B لرصد المراحل المبكرة من دورة النسخ المتماثل

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main macrophage populations in the CNS: (i) the microglia, which are the resident macrophages of the CNS and are derived from yolk sac progenitors during embryogenesis, and (ii) the monocyte-derived macrophages (MDM), which can infiltrate the CNS during disease and are derived from bone marrow progenitors. The roles of each macrophage subpopulation differ depending on the pathology being studied. Furthermore, there is no consensus on the histological markers or the distinguishing criteria used for these macrophage subpopulations. However, the analysis of the expression profiles of the CD11b and CD45 markers by flow cytometry allows us to distinguish the microglia (CD11b+CD45med) from the MDM (CD11b+CD45high). In this protocol, we show that the density gradient centrifugation and the flow cytometry analysis can be used to characterize these CNS macrophage subpopulations, and to study several markers of interest expressed by these cells as we recently published. Thus, this technique can further our understanding of the role of macrophages in mouse models of neurological diseases and can also be used to evaluate drug effects on these cells.

This protocol provides an analysis of the macrophage subpopulations in the adult mouse central nervous system by flow cytometry and is helpful for the study of multiple markers expressed by these cells.

تحليل الخلايا الدبقية الصغيرة والبلاعم المستمدة من الخلايا العصبية من الجهاز العصبي المركزي عن طريق التدفق الخلوي

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

عزل الخلايا الليمفاوية من الماوس صغيرة المعوية المناعي

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

A Positioning Device for the Placement of Mice During Intranasal siRNA Delivery to the Central Nervous System

Intranasal (IN) drug delivery to the brain has emerged as a promising method to bypass the blood-brain barrier (BBB) for the delivery of drugs into the central nervous system (CNS). Recent studies demonstrate the use of a peptide, RVG9R, incorporating the minimal receptor-binding domain of the Rabies virus glycoprotein, in eliciting the delivery of siRNA into neurons in the brain. In this protocol, the peptide-siRNA formulation is delivered intranasally with a pipette in the dominant hand, while the anesthetized mouse is restrained by the scruff with the nondominant hand in a "head down-and-forward position" to avoid drainage into the lung and stomach upon inhalation. This precise gripping of mice can be learned but is not easy and requires practice and skill to result in effective CNS uptake. Furthermore, the process is long-drawn, requiring about 45 min for the administration of a total volume of ~20-30 &#181;L of solution in 1-2 &#181;L droplet volumes per inhalation, with 3-4 min rest periods between each inhalation. The objective of this study is to disclose a mouse positioning device that enables the appropriate placement of mice for efficient IN administration of the peptide-siRNA formulation. Multiple features are incorporated into the design of the device, such as four or eight positioning chairs with adjustable height and tilt to restrain anesthetized mice in the head down-and-forward position, enabling easy visualization of the mice's nares and a built-in heating pad to maintain the mice's body temperatures during the procedure. Importantly, the ability to treat four or eight mice simultaneously with RVG9R-siRNA complexes in this manner enables studies on a much quicker time scale, for the testing of an IN therapeutic siRNA approach. In conclusion, this device allows for appropriate and controlled mouse head positioning for IN application of RVG9R-siRNA and other therapeutic molecules, such as nanoparticles or antibodies, for CNS delivery.

Here, we present a protocol using a mouse positioning device that enables the appropriate placement of mice for the intranasal administration of a brain-targeting peptide-siRNA formulation enabling effective gene silencing in the central nervous system.

جهاز تحديد المواقع لوضع الفئران أثناء تسليم siRNA داخل الأنف إلى الجهاز العصبي المركزي

Intranasal (IN) drug delivery to the brain has emerged as a promising method to bypass the blood-brain barrier (BBB) for the delivery of drugs into the ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible genetic background. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a typical disease model of MS widely used for investigating the pathogenesis in which T lymphocytes specific for myelin antigens initiate an inflammatory reaction in CNS. It is very important to assess how lymphocytes in the CNS regulate the development of disease. However, the approach for measuring the quantity and quality of infiltrated lymphocytes in the CNS is very limited due to the difficulties in isolating and detecting infiltrated lymphocytes from the brain. This manuscript presents a protocol for that is useful for the isolation, identification, and characterization of infiltrated lymphocytes from the CNS and will be helpful for our understanding of how lymphocytes are involved in the development of the CNS autoimmune disease.

This manuscript presents a protocol to induce active experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in mice. A method for the isolation and characterization of the infiltrated lymphocytes in the central nervous system (CNS) is also presented to show how lymphocytes are involved in the development of CNS autoimmune disease.

تحليل تدفق Cytometric لتسلل الخلايا اللمفاوية في الجهاز العصبي المركزي أثناء التهاب الدماغ المناعي الذاتي التجريبي

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells

The central nervous system (CNS) is comprised of the brain and spinal cord and is enveloped by the meninges, membranous layers serving as a barrier between the periphery and the CNS. The CNS is an immunologically specialized site, and in steady state conditions, immune privilege is most evident in the CNS parenchyma. In contrast, the meninges harbor a diverse array of resident cells, including innate and adaptive immune cells. During inflammatory conditions triggered by CNS injury, autoimmunity, infection, or even neurodegeneration, peripherally derived immune cells may enter the parenchyma and take up residence within the meninges. These cells are thought to perform both beneficial and detrimental actions during CNS disease pathogenesis. Despite this knowledge, the meninges are often overlooked when analyzing the CNS compartment, because conventional CNS tissue extraction methods omit the meningeal layers. This protocol presents two distinct methods for the rapid isolation of murine CNS tissues (i.e., brain, spinal cord, and meninges) that are suitable for downstream analysis via single-cell techniques, immunohistochemistry, and in situ hybridization methods. The described methods provide a comprehensive analysis of CNS tissues, ideal for assessing the phenotype, function, and localization of cells occupying the CNS compartment under homeostatic conditions and during disease pathogenesis.

This paper presents two optimized protocols for examining resident and peripherally derived immune cells within the central nervous system, including the brain, spinal cord, and meninges. Each of these protocols helps to ascertain the function and composition of the cells occupying these compartments under steady state and inflammatory conditions.

عزل أنسجة الجهاز العصبي المركزي والسحايا المرتبطة به لتحليل المصب للخلايا المناعية

The central nervous system (CNS) is comprised of the brain and spinal cord and is enveloped by the meninges, membranous layers serving as a barrier ...

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method for isolating DCs primarily involves inducing bone marrow (BM) differentiation into DCs by injecting large doses (&#62;10 ng/mL) of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor/interleukin-4 (GM-CSF/IL-4), making the procedure complex and expensive. In this protocol, using all BM cells cultured in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 medium, after 3-4 half-culture exchanges, up to 2.7 x 107 CD11c+ cells&#160;(DCs) per mouse (two femurs) were harvested with a purity of 80%-95%. After 10 days in culture, the expression of CD11c, CD80, and MHC II increased, whereas the number of cells decreased. The number of cells peaked after 7 days of culture. Moreover, this method only took 10 min to harvest all bone marrow cells, and a high number of DCs were obtained after 1 week of culture.

Here, we present an economical and efficient method to isolate and generate high-purity bone marrow-derived dendritic cells from mice after 7 days of culture with 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

بروتوكول اقتصادي وفعال لعزل وزراعة الخلايا الشجيرية المشتقة من نخاع العظم من الفئران

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...