وأيد هذا العمل من قبل معهد علوم الصحة البيئية R01ES014470 (KMZ).

قبل البدء في هذا البروتوكول، وجمع الفئران حديثي الولادة في أيام ما بعد الولادة 1-3 (P1-3) في وعاء معقم متداخلة مع الفراش القفص الأصلي للحماية والدفء. من المهم أن تعمل بسرعة وكفاءة من خلال هذا البروتوكول لتحسين العائد دبقية. يرجى الاطلاع على الجدول 1 لائحة كاشف كاملة. 1. إعداد الصكوك والثقافة وسائل الإعلام، وأطباق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير 10 مل / الجرو الخلايا الدبقية الصغيرة وسائل الإعلام كاملة (MCM؛ 1X الحد الأدنى الضروري متوسط ​​ايرل [MEM] تستكمل مع: 1 مم L-الجلوتامين، 1 ملي البيروفات الصوديوم، و 0.6٪ V / V-D (+) الجلوكوز، 100 ميكروجرام / مل البنسلين / الستربتوميسين (P / S)، و 4٪ ت / ت مصل بقري جنيني (FBS)، و 6٪ ت / ت الحصان مصل)، وإضافة إلى كل T-75 قارورة (1 قارورة / الجرو)؛ كأب والمكان أفقيا إلى حاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2) لكي تتوازن لمدة 1 ساعة. ومن الضروري أن تتوازن هذه الوسائط في قارورة (ق) قبل البدء في تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استعداداتإعادة، قسامة، ودافئة في 37 ° C حمام الماء MCM للتشريح (6 مل / الجرو) وMCM في أنبوب مخروطي منفصل لخلية إعادة تعليق (2 مل / الجرو). إعداد وقسامة، والبرد على الجليد الثرم وسائل الإعلام (MM؛ تستكمل مع HBSS: 100 ميكروغرام / لتر P / S، M 0.01 HEPES؛ 3 مل / الجرو)، وتشريح وسائل الاعلام (DM؛ MEM تستكمل مع 100 ميكروغرام / لتر P / S؛ 2 مل / الجرو). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم الأدوات الجراحية التالية الانغمار في الإيثانول 70٪ لمدة 10 دقيقة: مقص # 1 (1؛ لقطع رأس)، forcep رقم 1 (2؛ لتأمين الأنف وإزالة القشور)، مقص # 2 (1؛ nonangled؛ لفتح فروة الرأس )، forcep رقم 2 (1؛ لإزالة فروة الرأس)، forcep التصنيف رقم 3 (1؛ لإزالة الجمجمة)، forcep رقم 4 (2؛ لإزالة السحايا)، مقص التصنيف رقم 3 (1؛ لتخطر على أنسجة المخ). السماح للهواء الجاف على وسادة العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح أسفل الأفقي، تدفق الهواء محطة وتشريح المجهر مع الايثانول 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء DM إلى 2 العقيمة، و 100 ملم أطباق بتري لالتقاط الرأس (3 مل، 1 طبق / 3 الجراء) وتشريح (1 مل؛1 صحن / الجرو؛ المبردة على الجليد قبل تشريح). الاستغناء MM إلى 1 معقمة، 100 مم طبق بتري لتنميق أنسجة المخ (1 مل، 1 طبق / الجرو). </li></ol> 2. الدماغ الأنسجة تشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل القتل الرحيم، تطهير بلطف الرقبة والرأس من الجرو مع الايثانول 70٪ باستخدام الأنسجة المختبر. مع مقص # 1، الموت ببطء بسرعة الجرو عن طريق إزالة الرأس؛ القبض على الرأس في معدة مسبقا طبق بيتري. الموت ببطء واستكمال تشريح الجرو واحدة قبل الشروع في الحيوان المقبل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الرأس إلى طبق تشريح المبردة؛ تحت المجهر تشريح تأمين رأسه معسر الأنف باستخدام forcep رقم 1 (بدلا من ذلك، يمكن تأمينها عن طريق ثقب الرأس ملقط من خلال محجر العين)؛ فروة الرأس المفتوحة باستخدام مقص رقم 2 عن طريق إنشاء Y قطع: تبدأ من قاعدة الرأس وعند زاوية نحو العينين. استخدام forcep # 3 لإزالة بلطف فروة الرأس عن طريق تقشير أفقيا، وفضح الجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام forcep # 3، وإزالة بلطف النسيج الضام في قاعدةالرأس. عندما يتعرض قاعدة الجمجمة الجمجمة، وفتح بعناية من قبل خيوط ذراع واحدة من forcep في ما بين الدماغ والجمجمة (بعد الشق بين نصفي المخ)؛ قبضة؛ برفق الجمجمة صعودا لتمزيق مفتوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعطيل النسيج الضام تحت الجانب البطنية من الدماغ باستخدام forcep رقم 1، وبعد إزالة الدماغ باستخدام نفس الأداة. رفع الدماغ من الجمجمة باستخدام القوة التصاعدي تحت الجانب البطني من الدماغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبقاء المخ في موقفها التشريحية: الجانب الظهري متجهة لأعلى لتصور القشور تحت المجهر تشريح؛ تأمين الدماغ في المكان عن طريق إدراج نصائح من الملقط في تقاطع الدماغ المتوسط ​​والقشرة، وإزالة السحايا القشرية تماما مع forcep رقم 4، ثم الشروع في إزالة السحايا بطني. مرة واحدة وقد تم السحايا إزالتها تماما، فصل القشور عن بقية الدماغ باستخدام forcep رقم 4. ومن الضروري إزالة الأنسجة السحائي لتعظيم نقاء الخلايا الدبقية الصغيرة وyielد. </li></ol> 3. نسيج الدماغ الثرم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القشور نقل إلى معدة مسبقا تنميق الطبق، ومواصلة تنميق خطوة باستخدام تقنية معقمة في الدرجة الثانية السلامة البيولوجية مجلس الوزراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اللحم المفروم أنسجة المخ باستخدام مقص # 3، ونقل الأنسجة المفروم إلى 15 مل أنبوب مخروطي؛ شطف مقص وتنميق الطبق مع 1 مل من كل MM، وجمع والاستغناء يشطف في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على الأنسجة المفروم وهذه الخطوة شطف تعظيم العائد من الخلايا الدبقية الصغيرة عن طريق ضمان أن يتم نقل جميع الأنسجة المتبقية لأنبوب مخروطي. ترك التعليق الأنسجة دون عائق لمدة 1-2 دقيقة، مما يسمح الأنسجة المفروم ليغلق على مستوى الجزء السفلي من الأنبوب. لا تتجاوز 2 دقيقة كما MM لا يحتوي على العناصر الغذائية الأساسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية وتجاهل 2 مل من طاف مع عام 1000 ميكرولتر micropipettor مع طرف ماصة القياسية، والتأكد من عدم تعطيل استقر الأنسجة المفروم. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 3 مل من MCM إلى الأنسجة المفروم؛ يسحن الأنسجة بكل قوة باستخدام عام 1000 ميكرولتر micropipettor مع طرف ماصة القياسية لا ملحوظ الأنسجة الصلبة ينبغي أن يظل عند سحن كاملة. إضافة 3 مل أخرى من MCM مع نفس ماصة، وجمع عينة المسحوقة المتبقية من غيض ماصة. </li></ol> 4. تزايد الخلايا القشرية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الأنسجة المفروم لتكوير الخلايا (215 x ج؛ 5 دقائق؛ RT؛ الطرد المركزي السريرية مع يتأرجح دلو الدوار). العودة الخلايا مكعبات لمجلس الوزراء السلامة البيولوجية، وإزالة وتجاهل طاف؛ resuspend بلطف بيليه الخلية (2 مل / أنبوب؛ MCM)؛ إضافة إعادة تعليق الخلية إلى معدة مسبقا T-75 قارورة؛ قبعة القارورة ووضعه أفقيا إلى ترطيب، ومعيار نسيج الثقافة الحاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2). تسمح للخلايا لاحتضان لمدة 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 ساعة، اضغط برفق القارورة ضد كف اليد لتعطيلالحطام الأنسجة. تحقق الخلايا قبل وبعد التنصت لضمان إزالة كاملة من الحطام. مجموعة قارورة العمودي، وإزالة وتجاهل وسائل الإعلام، إضافة MCM جديدة إلى الجزء السفلي من القارورة (12 مل و 37 درجة مئوية)؛ قبعة ووضع مرة أخرى في الحاضنة، أفقيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق الخلايا اليومية للتلوث ورصد النمو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حوالي 17-21 أيام في المختبر (DIV)، وخلايا دبقية تكون جاهزة للحصاد من ثقافة الدبقية مختلطة. لتحديد ما إذا الخلايا جاهزة، ودراسة الخلايا تحت المجهر المرحلة على النقيض المقلوب. الخلايا الدبقية الصغيرة هي جاهزة للحصاد عندما في ~ 40٪ confluency. كما تظهر خلايا كروية صغيرة، ومشرق، وتزايد كما أحادي الطبقة على رأس الدبقية الأخرى. </li></ol> 5. عزل الخلايا الدبقية الصغيرة المختلطة من الدبقية الثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة، اضغط بقوة ضد قارورة مقاعد البدلاء المختبر. هذا التحريض يساعد الخلايا الدبقية الصغيرة منفصلة من الخلايا الدبقية الأخرى ويرجع ذلك إلى خصائص منخفضة تمسك الخلايا الدبقية الصغيرة. </li><li&gt; ختم T-75 مباراة دولية قارورة مع parafilm وتدوير الثقافات الدبقية المختلطة (200 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية، 5 ساعة). باستخدام التحكم في درجة حرارته، شاكر دوارة nonhumidified لا تسمح للخلايا أن يهز لمدة أطول من 5 ساعة تفقد البصر. رفعت أن الخلايا الدبقية الصغيرة قبالة سطح القارورة بعد 5 ساعة، وذلك باستخدام المجهر المرحلة على النقيض المقلوب. الخلايا الدبقية الصغيرة مشرقة، كروية، التعويم الحر الخلايا. وسوف يكون هناك طبقة من الخلايا النجمية المتبقية و oligodendrocytes التمسك السفلي من القارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع وسائل الإعلام التي تحتوي على الخلايا الدبقية الصغيرة طاف في أنبوب الطرد المركزي المخروطية العقيمة؛ بيليه الخلايا الدبقية الصغيرة (215 x ج؛ 5 دقائق؛ يتأرجح دلو الدوار). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية دبقية في الحارة دبقية متوسطة النمو (MGM؛ MEM تستكمل مع: 1 ملي البيروفات الصوديوم، و 0.6٪ ت / vglucose، 1 ملم L-الجلوتامين، و 100 ميكروغرام / مل P / S، 5٪ ت / ت FBS؛ ~ 2 مل / قارورة)، تحديد تركيز خلية باستخدام عدادة الكريات، وطبق 1 × 10 5 خلية / جيدا في شكل 24 لوحة جيدا علىالبلاستيك أو العقيمة زلات غطاء زجاجي (500 ميكرولتر / جيد؛ MGM). عن طريق هذا الإجراء ومتوسط ​​العائد الخلايا الدبقية الصغيرة هو 7.5 × 10 5 خلية / الجرو القشرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 ساعة بعد الطلاء، وإزالة كافة وسائل الإعلام والخلايا refeed مع MGM الطازجة (37 درجة مئوية) لإزالة الخلايا العائمة والحطام. هذه الخطوة حاسمة لبقاء الخلايا والحفاظ على الخلايا الدبقية الصغيرة هادئة. يمكن استخدام الخلايا لإجراء التجارب فورا بعد إعادة التغذية. </li></ol> 6. العلاجات سبيل المثال <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعرض الخلايا إلى 10 نانوغرام / مل من بام 3 CSK 4 (بام)، و 10 نانوغرام / مل عديد السكاريد الشحمي (LPS) أو السيطرة على السيارة؛ احتضان لمدة 2 أو 24 ساعة في حاضنة ترطيب (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2). </li></ol> 7. تحليل الخلايا الدبقية الصغيرة لوظائف خارج الحي عبر مناعي التصوير وكيمياء سيتولوجية مناعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد العلاج، وسائل الإعلام والثقافة الخلية الحصاد في أنابيب microfuge (1.5 مل) والمركifuge باستخدام ميكروسنتريفوج الطاولة (2 دقيقة؛ 900 x ج) لمسح وسائل الإعلام. نقل طاف لأنبوب microfuge النظيفة؛ مقايسة على الفور، أو تخزينها في -20 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام. تحليل تركيز TNF-α في خلية ثقافة طاف عبر المتاحة تجاريا الماوس α TNF ELISA عدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، وإصلاح الخلايا مع 4٪ (ث / ت) بارافورمالدهيد / 4٪ (ث / ت) السكروز / PBS درجة الحموضة 7.4 (4٪ PFA؛ 15 دقيقة؛ RT). بعد التثبيت، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق مع طيف والهز على شاكر المداري. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المناعي / كيمياء سيتولوجية مناعية. بعد التثبيت وPBS يغسل، عملية الخلايا الدبقية الصغيرة للكيمياء سيتولوجية مناعية. جميع الخطوات التي أجريت مع الهز لطيف. Permeabilize الخلايا في PBS/0.1٪ تريتون X-100؛ خلايا كتلة في PBS/10٪ مصل الماعز العادي لمدة ساعة واحدة. احتضان الخلايا O / N عند 4 درجة مئوية مع أرنب المضادة للNF كيلوبايت الأجسام المضادة (P65 الوحيدات؛ 1/1، 250) أو أرنب المضادة للإيبا-1 الأضداد (1/750) في عرقلة العازلة. مرئيإيزي مستضد: مجمع الأضداد التالية الحضانة مع الماعز مترافق fluorescently المضادة للأرنب مفتش الأضداد الثانوية (1 ساعة؛ 1/1، 000). إزالة الأجسام المضادة الثانوية غير منضم عن طريق الغسيل مع PBS/0.1٪ تريتون X-100 (3X 5 دقائق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا مكافحة وصمة عار مع 4 &#39;،6-Diamidino-2-Phenylindole / برنامج تلفزيوني (دابي؛ 0.1 ميكروغرام / مل). لتصور كل نواة الخلية المستمدة من الخلايا الدبقية الصغيرة CX3CR1-GFP + / - الفئران التعبير عن GFP. الاستفادة من الطول الموجي 350 نانومتر مرشح لتصور دابي؛ 488 نانومتر مرشح الطول الموجي لتصور GFP؛ و594 نانومتر الطول الموجي مرشح لتصور وP65-1 إيبا immunocomplexes. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل غطاء ينزلق باستخدام محلول مائي التركيب وتصور الخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام المجهر الفلورسنت. </li></ol>

<ol>
	<li>Ranshoff, R. M. P. V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Physiology:+Unique+Stimuli,+Specialized+Responses.">Microglia Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses.</a> Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).</li><li>Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+the+distribution+and+morphology+of+microglia+in+the+normal+adult+mouse+brain.">Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.</a> Neuroscience. 39, 151-170 (1990).</li><li>Gomez Perdiguero, E., Schulz, C., Geissmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+homeostasis+of+&amp;#34;resident&amp;#34;+myeloid+cells:+The+case+of+the+microglia.">Development and homeostasis of &amp;#34;resident&amp;#34; myeloid cells: The case of the microglia.</a> Glia. 61, 112-120 (2013).</li><li>Kierdorf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+emerge+from+erythromyeloid+precursors+via+Pu.1-+and+Irf8-dependent+pathways.">Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways.</a> Nat. Neurosci. 16, 273-280 (2013).</li><li>Saijo, K., Glass, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+cell+origin+and+phenotypes+in+health+and+disease.+Nature+reviews.">Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nature reviews.</a> Immunology. , 11-775 (2011).</li><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo.">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo.">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308, 1314-1318 (2005).</li><li>Hu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+and+free+radical+production+by+porcine+microglia.">Cytokine and free radical production by porcine microglia.</a> Clin. Immunol. Immunopathol. 78, 93-96 (1996).</li><li>Muzio, M., Polentarutti, N., Bosisio, D., Prahladan, M. K., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors:+a+growing+family+of+immune+receptors+that+are+differentially+expressed+and+regulated+by+different+leukocytes.">Toll-like receptors: a growing family of immune receptors that are differentially expressed and regulated by different leukocytes.</a> J. Leukocyte Biol. 67, 450-456 (2000).</li><li>Lee, S. J., Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptors+and+inflammation+in+the+CNS.">Toll-like receptors and inflammation in the CNS.</a> Curr. Drug Targets. Inflamm. Allergy. 1, 181-191 (2002).</li><li>Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia-mediated+neurotoxicity:+uncovering+the+molecular+mechanisms.">Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms.</a> Nat. Rev. Neurosci. 8, 57-69 (2007).</li><li>Halle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NALP3+inflammasome+is+involved+in+the+innate+immune+response+to+amyloid-beta.">The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-beta.</a> Nat. Immunol. 9, 857-865 (2008).</li><li>Chen, G. Y., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterile+inflammation:+sensing+and+reacting+to+damage.">Sterile inflammation: sensing and reacting to damage.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).</li><li>Duewell, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLRP3+inflammasomes+are+required+for+atherogenesis+and+activated+by+cholesterol+crystals.">NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals.</a> Nature. 464, 1357-1361 (2010).</li><li>Stewart, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD36+ligands+promote+sterile+inflammation+through+assembly+of+a+Toll-like+receptor+4.">CD36 ligands promote sterile inflammation through assembly of a Toll-like receptor 4.</a> 11, 155-161 (2010).</li><li>Beraud, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-Synuclein+Alters+Toll-Like+Receptor+Expression.">alpha-Synuclein Alters Toll-Like Receptor Expression.</a> Front. Neurosci. 5, 80 (2011).</li><li>Banati, R. B., Gehrmann, J., Schubert, P., Kreutzberg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+of+microglia..">Cytotoxicity of microglia..</a> Glia. 7, 111-118 (1993).</li><li>Combs, C. K., Karlo, J. C., Kao, S. C., Landreth, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Amyloid+stimulation+of+microglia+and+monocytes+results+in+TNF+alpha-dependent+expression+of+induciblenitric+oxide+synthase+and+neuronal+apoptosis.">beta-Amyloid stimulation of microglia and monocytes results in TNF alpha-dependent expression of induciblenitric oxide synthase and neuronal apoptosis.</a> J. Neurosci. 21, 1179-1188 (2001).</li><li>Kim, Y. S., Joh, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia,+major+player+in+the+brain+inflammation:+their+roles+in+the+pathogenesis+of+Parkinson's+disease.">Microglia, major player in the brain inflammation: their roles in the pathogenesis of Parkinson's disease.</a> Exp. Mol. Med. 38, 333-347 (2006).</li><li>Colton, C., Wilcock, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+activation+states+in+microglia.">Assessing activation states in microglia.</a> CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 174-191 (2010).</li><li>Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ceramide+activates+microglia+to+enhance+the+production/secretion+of+brain-derived+neurotrophic+factor+(BDNF)+without+induction+of+deleterious+factors+in+vitro.">Ceramide activates microglia to enhance the production/secretion of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) without induction of deleterious factors in vitro.</a> J. Neurochem. 80, 697-705 (2002).</li><li>Uesugi, M., Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonparticipation+of+nuclear+factor+kappa+B+(NFkappaB)+in+the+signaling+cascade+of+c-JunN-terminal+kinase+(JNK)-+and+p38+mitogen-activated+protein+kinase+(p38MAPK)-dependent+tumor+necrosis+factor+alpha+(TNFalpha)+induction+in+lipopolysaccharide+(LPS)-stimulated+microglia.">Nonparticipation of nuclear factor kappa B (NFkappaB) in the signaling cascade of c-JunN-terminal kinase (JNK)- and p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK)-dependent tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) induction in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated microglia.</a> Brain Res. , 1073-1074 (2006).</li><li>Beraud, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Activation+and+Antioxidant+Responses+Induced+by+the+Parkinson's+Disease+Protein+alpha-Synuclein.">Microglial Activation and Antioxidant Responses Induced by the Parkinson's Disease Protein alpha-Synuclein.</a> J. Neuroimmun. Pharmacol. 8, 94-117 (2013).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synuclein+activates+microglia+in+a+model+of+Parkinson's+disease.">Synuclein activates microglia in a model of Parkinson's disease.</a> Neurobiol. Aging. 29, 1690-1701 (2008).</li><li>Minghetti, L., Levi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+as+effector+cells+in+brain+damage+and+repair:+focus+on+prostanoids+and+nitric+oxide.">Microglia as effector cells in brain damage and repair: focus on prostanoids and nitric oxide.</a> Prog. Neurobiol. 54, 99-125 (1998).</li><li>Hirsch, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cells+and+Parkinson's+disease.">Glial cells and Parkinson's disease.</a> J. Neurol.. 247 (2), 58-62 (2000).</li><li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+nitric+oxide+in+inflammation-mediated+neurodegeneration.">Role of nitric oxide in inflammation-mediated neurodegeneration.</a> Ann. NY Acad. Sci. 962, 318-331 (2002).</li><li>Shie, F. S., Nivison, M., Hsu, P. C., Montine, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+microglialinnate+immunity+in+Alzheimer's+disease+by+activation+of+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma.">Modulation of microglialinnate immunity in Alzheimer's disease by activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma.</a> Curr. Med. Chem. 16, 643-651 (2009).</li><li>Rogers, J., Mastroeni, D., Leonard, B., Joyce, J., Grover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation+in+Alzheimer's+disease+and+Parkinson's+disease:+are+microglia+pathogenic+in+either+disorder.">Neuroinflammation in Alzheimer's disease and Parkinson's disease: are microglia pathogenic in either disorder.</a> Int. Rev. Neurobiol. 82, 235-246 (2007).</li><li>Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+murinemicroglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry.">Isolation of murinemicroglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li><li>Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+adult+ramified+microglia+separated+from+other+central+nervous+system+macrophages+by+flow+cytometric+sorting.+Phenotypic+differences+defined+and+direct+ex+vivo+antigenpresentation+to+myelin+basic+protein-reactive+CD4++T+cells+compared.">Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigenpresentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared.</a> J. Immunol. 154, 4309-4321 (1995).</li><li>Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+digestion+with+dispase+substantially+reduces+lymphocyte+and+macrophage+cell-surface+antigen+expression.">Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression.</a> J. Immunol. Methods. 194, 71-75 (1996).</li><li>Pino, P. A., Cardona, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+brain+and+spinal+cord+mononuclear+cells+using+percoll+gradients.">Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Veremeyko, T., Starossom, S. C., Weiner, H. L., Ponomarev, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+microRNAs+in+microglia+by+real-time+PCR+in+normal+CNS+and+during+neuroinflammation.">Detection of microRNAs in microglia by real-time PCR in normal CNS and during neuroinflammation.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Su, X., Federoff, H. J., Maguire-Zeiss, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+alpha-synuclein+overexpression+mediates+early+proinflammatory+activity.">Mutant alpha-synuclein overexpression mediates early proinflammatory activity.</a> Neurotox. Res. 16, 238-254 (2009).</li><li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+fractalkine+receptorCX(3)CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion.">Analysis of fractalkine receptorCX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).</li><li>Imai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+molecular+characterization+of+fractalkine+receptor+CX3CR1,+which+mediates+both+leukocyte+migration+and+adhesion.">Identification and molecular characterization of fractalkine receptor CX3CR1, which mediates both leukocyte migration and adhesion.</a> Cell. 91, 521-530 (1997).</li><li>Cardona, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+microglial+neurotoxicity+by+the+fractalkine+receptor.">Control of microglial neurotoxicity by the fractalkine receptor.</a> Nat. Neurosci. 9, 917-924 (2006).</li><li>Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+microgliosis.">Reactive microgliosis.</a> Prog. Neurobiol. 57, 563-581 (1999).</li><li>Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+highly+enriched+and+quiescent+microglia+from+adult+rat+hippocampus:immunophenotypic+and+functional+characteristics.">Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus:immunophenotypic and functional characteristics.</a> J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).</li></ol>

يعلن الكتاب الذي أجري البحث في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن أن يفسر على أنه تضارب محتمل في المصالح.

يوفر الإجراء الحالي وسيلة فعالة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة القشرية من الفئران حديثي الولادة. هذا الإجراء له فائدة شقين من 1) الحفاظ على نمط ظاهري مناعي الخلايا الدبقية الصغيرة وظيفة، على النحو الذي يحدده التصوير الفلورسنت، كيمياء سيتولوجية مناعية، وإليسا، و، 2) ال...

خلايا دبقية، الضامة مراقبة لحمة الجهاز العصبي المركزي، تشكل حوالي 12٪ من السكان الخلية الكلي للدماغ الثدييات الكبار. وتستمد الخلايا الدبقية الصغيرة من الكيس المحي النخاعي السلائف الخلايا وتختلف في كثافة الخلايا والتشكل في مناطق مختلفة داخل cytoarchitectural الكبار CNS 1-5. في البالغين الأصحاء الدماغ، الخلايا الدبقية الصغيرة هي خلايا صغيرة، أو القطبية متشعبة مع العمليات الحيوية غرامة. وعلى النقيض من الطرفية التشكل بلعم، يبرهن على وجود الخلايا الدبقية الصغيرة هادئة، النمط الظاهري الأضواء في أدمغة الصحية التي قد تظهر الخمول الخلوية، ولكن التظاهر في الدراسات المجراة أن عمليات التصوير دبقية تمديد حيوي وسحب لمراقبة المكروية بهم بطريقة تذكرنا &quot; أخذ العينات والمسح &quot;6،7. الخلايا الدبقية الصغيرة هي غاية وبشكل مختلف تستجيب لتغيرات البيئية والفيزيولوجية المرضية في الدماغ، والتحولمن surveillant إلى الدول تعتبر يستريح وتنشيط عادة الدولة المستجيب، على التوالي. هذا التبديل في تنشيط يمكن بوساطة إشراك مستقبلات غشاء محدد والتعرف على نمط (خنازير)، مثل مستقبلات تول مثل (TLRs)، التي تستجيب لأنماط الجزيئية المرتبطة الممرض (PAMPs)، وهي البروتينات الدهنية البكتيرية والفيروسية مشتقة والأحماض النووية، والكربوهيدرات 8-11. بالإضافة إلى PAMPs، وأيضا ثبت خنازير للحث على تفعيل دبقية ضد العقيمة، والجزيئات غير إمراضية المعروفة باسم أنماط الجزيئية الخطر / الضرر المصاحب (DAMPs)، والتي تمثل اضطراب في الجهاز العصبي المركزي التوازن، مثل تلف الخلايا 12-16. مرة واحدة تعمل، خنازير الشروع في داخل الخلايا مما يشير إلى أن النتائج في سلسلة تغييرات في التشكل دبقية الخلية والجينات التعبير، على وجه التحديد، الخلايا الدبقية الصغيرة تنشيط التكيف مع النمط الظاهري مثل أميبية، ونقل من P65 NF كيلوبايت الوحيدات (P65) إلى نواة الخلية، وupregulate و الم Ùكشن وإفراز السيتوكينات proinflammatory، مثل عامل نخر الورم-α (TNF-α)، انترلوكين 1 β (IL-1β)، جنبا إلى جنب مع أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) 16-24. على الرغم من أن يتجزأ في الاستجابة المناعية الفطرية للجهاز العصبي المركزي، كما تم العثور على هذه الجزيئات يفرز لزيادة الاكسدة العصبية، مما يحفز وتفاقم تنكس عصبي في الدول المريضة مثل الشلل الرعاش ومرض الزهايمر 25-29. ومع ذلك، لا يفهم تماما آليات تفعيل دبقية في الحالات المرضية. لذلك، عزل الخلايا الدبقية الصغيرة هو أداة قوية التحقيق في هذه العمليات البيولوجية، والعديد من الميزات في الجسم الحي من تفعيل دبقية يمكن تلخيصها في الثقافة. العديد من الطرق المتاحة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة، بما في ذلك العزلة عن طريق التدرج Percoll التالية الهضم الأنزيمي من الأنسجة CNS 30،31. ومع ذلك، يمكن تغيير الهضم الأنزيميعلى نمط ظاهري مناعي للخلايا عن طريق الحد من سطح الخلية مستضد التعبير 32، والنتائج في انخفاض العائد خلية لكل حيوان من الطريقة الموضحة في هذه الوثيقة. على وجه التحديد، ونحن التقرير متوسط ​​العائد الخلايا الدبقية الصغيرة في القشرة الجرو من 7.5 × 10 5 خلايا، في حين ذكرت سابقا أساليب بمعزل عن كامل الجهاز العصبي المركزي عن طريق التدرج العائد Percoll 3-5 × 10 5 خلايا 30،33،34. تلتف الإجراء الحاضر استخدام إنزيمات الهضم من خلال عزل الخلايا الدبقية الصغيرة استنادا إلى خصائص المنخفض تمسكهم، وبالتالي الحفاظ على نمط ظاهري مناعي دبقية وظيفة. في هذه الدراسة، ونحن تصف عزل خلايا دبقية من ثقافات مختلطة الدبقية مشتقة من حديثي الولادة متخالف CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP + / -)، وC57BL / 6 قشرات الفئران عن طريق التحريض على شاكر الميكانيكية الدوارة، امتدادا من السابق طريقة نشر 24،35. نحن الاستفادة من سلالة الماوس السابق لتصور سهل من الخلايا الدبقية الصغيرة، وهذه الفئران التعبير عن GFP تحت سيطرة CX3CR1 موضع الذاتية - مروج الوحيدات محددة 36-38. وتنتج هذه الطريقة الثقافات دبقية نقية للغاية مع الحفاظ على نمط ظاهري مناعي فيفو السابقين كما يتضح من تغيرات شكلية، إزفاء النووية من P65، وإفراز TNF-α عندما تحدى مع عديد السكاريد الشحمي البكتيرية (LPS) أو بام 3 CSK 4، TLR4 وTLR1 / 2 منبهات ، على التوالي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="680">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:233px;">Glucose</td>
			<td style="width:149px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">G8270</td>
			<td style="width:143px;">Make 20% Stock Solution with MilliQ water; filter sterilize; store at 4 &#176;C; shelf life: 3-6 months. Used to make MCM and MGM.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:233px;">Sodium pyruvate 100 mM (100x)</td>
			<td style="width:149px;">Hyclone</td>
			<td style="width:155px;">SH30239.01</td>
			<td style="width:143px;">Store at 4 &#176;C. Used to make MCM and MGM.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:233px;">Penicillin/Streptomycin 10,000 units/ml (100x)</td>
			<td style="width:149px;">Gibco</td>
			<td style="width:155px;">15140-122</td>
			<td style="width:143px;">Store at -20 &#176;C. Used to make MCM, MGM, MM, and DM.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:233px;">L-glutamine 200 mM (100x)</td>
			<td style="width:149px;">Gibco</td>
			<td style="width:155px;">25030-081</td>
			<td style="width:143px;">Store at -20 &#176;C. Used to make MCM and MGM.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:233px;">Fetal Bovine Serum (Defined)</td>
			<td style="width:149px;">Hyclone</td>
			<td style="width:155px;">SH30070.03</td>
			<td style="width:143px;">Filter sterilize; store at -20 &#176;C. Used to make MCM and MGM.</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:233px;">Minimum Essential Medium Earle&#39;s (MEM)</td>
			<td style="width:149px;">Cellgro</td>
			<td style="width:155px;">15-010-CV</td>
			<td style="width:143px;">Without L-glutamine. Contains Earle&#39;s salts. Used to make MCM, MGM, and DM.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:233px;">Horse Serum</td>
			<td style="width:149px;">Gibco</td>
			<td style="width:155px;">16050</td>
			<td style="width:143px;">Filter sterilize; store at -20 &#176;C. Used to make MCM and MGM.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:233px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:149px;">Cellgro</td>
			<td style="width:155px;">21-021-CV</td>
			<td style="width:143px;">Without calcium and magnesium. Store at 4 &#176;C. Used to make MM.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">HEPES 1 M</td>
			<td style="width:149px;">Gibco</td>
			<td style="width:155px;">15630-031</td>
			<td style="width:143px;">Store at 4 &#176;C. Used to make MM.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">T-75 Flask</td>
			<td style="width:149px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">430641</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, dilactate (DAPI)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:155px;">D3571</td>
			<td style="width:143px;">Used to stain cell nucleus.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:233px;">Rabbit anti-Iba1</td>
			<td style="width:149px;">Wako</td>
			<td style="width:155px;">019-19741</td>
			<td style="width:143px;">Used at 1/750 dilution for ICC staining of Iba1.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:233px;">Rabbit anti-NF&#954;B (p65)</td>
			<td style="width:149px;">Abcam</td>
			<td style="width:155px;">7970</td>
			<td style="width:143px;">Used at 1/1250 dilution for ICC staining for p65.</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:233px;">Alexafluor 594 Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:155px;">A11012</td>
			<td style="width:143px;">Used at 1/1000 dilution for visualization of antigen:antibody complex in ICC.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">10 ml Disposable Serological Pipet</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">13-678-11E</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">50 ml Disposable Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">05-539-8</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">15 ml Disposible Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">05-539-12</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Sterile Polystyrene Petri Dish</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">875713</td>
			<td style="width:143px;">100 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Scissor: Straight Metzembaum (scissor #1)</td>
			<td style="width:149px;">Roboz Surgical</td>
			<td style="width:155px;">RS-6010</td>
			<td style="width:143px;">1; 5 inch; used for removing head</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:233px;">Scissor: Vannas 
			(scissor #2)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:155px;">15000-08</td>
			<td style="width:143px;">1; non-angled; 2.5mm cutting edge; used to open scalp</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Scissor: Student Vannas (scissor #3)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:155px;">91501-09</td>
			<td style="width:143px;">1; curved; used to mince brain tissue</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:233px;">Forcep: Dumont #7 
			(forcep #1)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:155px;">91197-00</td>
			<td style="width:143px;">2; used to secure nose and remove cortices&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Forcep: Dumont #2 
			(forcep #2)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:155px;">11223-20</td>
			<td style="width:143px;">1; used to remove scalp</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Forcep: Dumont #3 
			(forcep #3)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:155px;">11231-30</td>
			<td style="width:143px;">1; used to remove skull</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Forcep: Dumont #5a 
			(forcep #4)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:155px;">11253-21</td>
			<td style="width:143px;">1; used to remove meninges</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Table of specific equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:233px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:149px;">Name of Company</td>
			<td style="width:155px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:143px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:233px;">Zoom Stereo Dissection Microscope&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Olympus</td>
			<td style="width:155px;">SZ4060</td>
			<td style="width:143px;">Microscope is placed inside Laminar-Horizontal Flow Cabinet</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Laminar-Horizontal Flow Cabinet</td>
			<td style="width:149px;">Nuaire</td>
			<td style="width:155px;">NU-201-330</td>
			<td style="width:143px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Biological Safety Cabinet</td>
			<td style="width:149px;">Labconco</td>
			<td style="width:155px;">3440001</td>
			<td style="width:143px;">Class II</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:233px;">Water-Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td style="width:149px;">VWR</td>
			<td>97025-836</td>
			<td style="width:143px;">Set to 37 &#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Swing-out buckets</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td>75006441</td>
			<td style="width:143px;">To be used with Swing-out rotor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Swing-out Rotor</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td>75006445</td>
			<td style="width:143px;">Max Radius: 19.2 (cm)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:233px;">Sorvall Legend RT+ Centrifuge 
			(clinical centrifuge)</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td>75-004-377</td>
			<td style="width:143px;">With swing-out rotor</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:233px;">AccuSpin Micro 17 microcentrifuge 
			(tabletop microcentrifuge)</td>
			<td style="width:149px;">Fisher Scientific</td>
			<td>S98645</td>
			<td style="width:143px;">With microliter rotor (24 x 1.5/2.0 ml; 
			Cat #: 75003524)&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cortical microglia with preserved immunophenotype and functionality from murine neonates

عزل الخلايا الدبقية الصغيرة من الأنسجة CNS هو أداة قوية التحقيق تستخدم لدراسة البيولوجيا دبقية فيفو السابقين. تفاصيل هذا الأسلوب إجراء لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة من القشور الفئران حديثي الولادة عن طريق الانفعالات الميكانيكية مع شاكر دوارة. هذه العزلة الخلايا الدبقية الصغيرة غلة طريقة الخلايا الدبقية الصغيرة القشرية نقية للغاية التي تظهر الخصائص المورفولوجية والوظيفية يدل على الخلايا الدبقية الصغيرة هادئة في ظروف طبيعية nonpathological في الجسم الحي. كما يحفظ هذا الإجراء نمط ظاهري مناعي دبقية وظائف البيوكيميائية كما يتبين من استقراء التغيرات المورفولوجية، إزفاء النووية من الوحيدات P65 من NF كيلوبايت (P65)، وإفراز خلوى proinflammatory السمة المميزة، عامل نخر الورم-α (TNF-α )، بناء على عديد السكاريد الشحمي (LPS) وبام 3 CSK 4 (بام) التحديات. وبالتالي فإن إجراء العزل الحاضر يحافظ على نمط ظاهري مناعي من كلا هادئة وموارد الوراثية الحيوانيةالخلايا الدبقية الصغيرة vated، وتوفير المنهج التجريبي من التحقيق البيولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة في فيفو السابقين الظروف.

الإبقاء على نمط ظاهري مناعي وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة فيفو السابقين خلال العزلة أمر بالغ الأهمية لتكون قادرة على الاستفادة من هذه الخلايا لتكون نموذجا للبيولوجيا دبقية التحقيق. من أجل إظهار المحافظة الناجح الخلايا الدبقية الصغيرة immunofunctionality باستخدام طريق...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates at JoVE.com

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

مفتاح واحد لتحقيق النجاح في البيولوجيا دبقية هو الحفاظ على immunofunction دبقية فيفو السابقين خلال العزلة من أنسجة الجهاز العصبي المركزي. عزل الخلايا الدبقية الصغيرة عبر نتائج تهز الدوارة في مزارع الخلايا نقية للغاية وفقا لتقييم immunofunctional التصوير الفلورسنت، كيمياء سيتولوجية مناعية، وتفعيل الخلايا الدبقية الصغيرة ELISA التالية مع عديد السكاريد الشحمي المحفزات proinflammatory (LPS) وبام 3 CSK 4 (بام).

عزل الخلايا الدبقية الصغيرة القشرية مع نمط ظاهري مناعي المحفوظة وظيفة من الفئران حديثي الولادة

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

isolation-cortical-microglia-with-preserved-immunophenotype

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.6K Views.  Georgetown University Medical Center.  مفتاح واحد لتحقيق النجاح في البيولوجيا دبقية هو الحفاظ على immunofunction دبقية فيفو السابقين خلال العزلة من أنسجة الجهاز العصبي المركزي. عزل الخلايا الدبقية الصغيرة عبر نتائج تهز الدوارة في مزارع الخلايا نقية للغاية وفقا لتقييم immunofunctional ا...

Video: Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Microglia account for approximately 12% of the total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered the major cell types of the nervous system, microglia play a significant role in normal brain physiology by monitoring tissue for debris and pathogens and maintaining homeostasis in the parenchyma via phagocytic activity 1,2. Microglia are activated during a number of injury and disease conditions, including neurodegenerative disease, traumatic brain injury, and nervous system infection 3. Under these activating conditions, microglia increase their phagocytic activity, undergo morpohological and proliferative change, and actively secrete reactive oxygen and nitrogen species, pro-inflammatory chemokines and cytokines, often activating a paracrine or autocrine loop 4-6. As these microglial responses contribute to disease pathogenesis in neurological conditions, research focused on microglia is warranted.
	Due to the cellular heterogeneity of the brain, it is technically difficult to obtain sufficient microglial sample material with high purity during in vivo experiments. Current research on the neuroprotective and neurotoxic functions of microglia require a routine technical method to consistently generate pure and healthy microglia with sufficient yield for study. We present, in text and video, a protocol to isolate pure primary microglia from mixed glia cultures for a variety of downstream applications. Briefly, this technique utilizes dissociated brain tissue from neonatal rat pups to produce mixed glial cell cultures. After the mixed glial cultures reach confluency, primary microglia are mechanically isolated from the culture by a brief duration of shaking. The microglia are then plated at high purity for experimental study.
	The principle and protocol of this methodology have been described in the literature 7,8. Additionally, alternate methodologies to isolate primary microglia are well described 9-12. Homogenized brain tissue may be separated by density gradient centrifugation to yield primary microglia 12. However, the centrifugation is of moderate length (45 min) and may cause cellular damage and activation, as well as, cause enriched microglia and other cellular populations. Another protocol has been utilized to isolate primary microglia in a variety of organisms by prolonged (16 hr) shaking while in culture 9-11. After shaking, the media supernatant is centrifuged to isolate microglia. This longer two-step isolation method may also perturb microglial function and activation. We chiefly utilize the following microglia isolation protocol in our laboratory for a number of reasons: (1) primary microglia simulate in vivo biology more faithfully than immortalized rodent microglia cell lines, (2) nominal mechanical disruption minimizes potential cellular dysfunction or activation, and (3) sufficient yield can be obtained without passage of the mixed glial cell cultures.
	It is important to note that this protocol uses brain tissue from neonatal rat pups to isolate microglia and that using older rats to isolate microglia can significantly impact the yield, activation status, and functional properties of isolated microglia. There is evidence that aging is linked with microglia dysfunction, increased neuroinflammation and neurodegenerative pathologies, so previous studies have used ex vivo adult microglia to better understand the role of microglia in neurodegenerative diseases where aging is important parameter. However, ex vivo microglia cannot be kept in culture for prolonged periods of time. Therefore, while this protocol extends the life of primary microglia in culture, it should be noted that the microglia behave differently from adult microglia and in vitro studies should be carefully considered when translated to an in vivo setting.

Isolating primary microglia from the cellular heterogeneity of the brain is essential to investigate their role in both physiological and pathological conditions. This protocol describes a mechanical isolation and mixed cell culture technique that provides high yield and high purity, viable primary microglial cells for in vitro study and downstream applications.

عزل الخلايا الدبقية الصغيرة الابتدائية المختلطة من زراعات الخلايا الغروية من المواليد الجدد الجرذ أنسجة المخ

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique and important tissue to study immune mechanisms because it is involved in host immune response against oral biofilm that might cause periodontal diseases. Furthermore, the close proximity of the gingiva to alveolar bone tissue enables also studying bone remodeling under inflammatory conditions. Our method yields large amount of immune cells that allows analysis of even rare cell populations such as Langerhans cells and T regulatory cells as we demonstrated previously 1. Employing mice to study local immune responses involved in alveolar bone loss during periodontal diseases is advantageous because of the availability of various immunological and experimental tools. Nevertheless, due to their small size and the relatively inconvenient access to the murine gingiva, many studies avoided examination of this critical tissue. The method described in this work could facilitate gingival analysis, which hopefully will increase our understating on the oral immune system and its role during periodontal diseases.

This study describes an efficient technique to isolate and process gingival tissues from the mouse oral cavity in order to produce a single-cell culture. The resulting cells can be further used for flow cytometry analysis and molecular studies.

العزلة، معالجة وتحليل خلايا اللثة الفئران

We have developed a technique to precisely isolate and process murine gingival tissue for flow cytometry and molecular studies. The gingiva is a unique ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

الخلايا الدبقية الصغيرة زراعة من الجهاز العصبي المركزي حديثي الولادة والكبار

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

عزل خلايا الفئران العقدة الليمفاوية اللحمية

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

عزل الكريات البيض من أنسجة الفئران في واجهة الأم والجنين

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

العزلة وتنشيط الخلايا الليمفاوية الفئران

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during physiological and pathological states. The isolation of EVs continues to be a major challenge in this field, due to limitations intrinsic to each technique. The differential ultracentrifugation with density gradient centrifugation method is a commonly used approach and is considered to be the gold standard procedure for EV isolation. However, this procedure is time-consuming, labor-intensive, and generally results in low scalability, which may not be suitable for small-volume samples such as bronchoalveolar lavage fluid. We demonstrate that an ultrafiltration centrifugation isolation method is simple and time- and labor-efficient yet provides a high recovery yield and purity. We propose that this isolation method could be an alternative approach that is suitable for EV isolation, particularly for small-volume biological specimens.

Here, we describe two extracellular vesicle isolation protocols, ultrafiltration centrifugation and ultracentrifugation with density gradient centrifugation, to isolate extracellular vesicles from murine bronchoalveolar lavage fluid samples. The extracellular vesicles derived from murine bronchoalveolar lavage fluid by both methods are quantified and characterized.

عزل حويصلات خارج الخلية من السوائل مورين للفيسيولوجيا الغسل باستخدام أسلوب الطرد المركزي أولترافيلتريشن

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of massage on skeletal muscles, the molecular mechanisms behind are poorly understood. We have recently developed a simple device to apply local cyclical compression (LCC), which can generate intramuscular pressure waves with varying amplitudes. Using this device, we have demonstrated that LCC modulates inflammatory responses of macrophages in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Here, we describe protocols for the optimization and application of LCC as a massage-like intervention against immobilization-induced inflammation and atrophy of skeletal muscles of mouse hindlimbs. The protocol that we have developed can be useful for investigating the mechanism underlying beneficial effects of physical exercise and massage. Our experimental system provides a prototype of the analytical approach to elucidate the mechanical regulation of muscle homeostasis, although further development needs to be made for more comprehensive studies.

Here we describe the protocols for applying defined mechanical loads to mouse calves and for monitoring the concomitant intramuscular pressure changes. The experimental systems that we have developed can be useful for investigating the mechanism behind the beneficial effects of physical exercise and massage.

تطبيق اضطرابات متناسقة تشبه التدليك على عجول الماوس ومراقبة التغيرات الناتجة عن الضغط العضلي العضلي

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous antigens and modulate responses to potent microbially derived immune stimuli. For this reason, the intestine is a major target site of immune dysregulation and inflammation in many diseases including but, not limited to inflammatory bowel diseases such as Crohn&#8217;s disease and ulcerative colitis, graft-versus-host disease (GVHD) after bone marrow transplantation (BMT), and many allergic and infectious conditions. Murine models of gastrointestinal inflammation and colitis are heavily used to study GI complications and to pre-clinically optimize strategies for prevention and treatment. Data gleaned from these models via isolation and phenotypic analysis of immune cells from the intestine is critical to further immune understanding that can be applied to ameliorate gastrointestinal and systemic inflammatory disorders. This report describes a highly effective protocol for the isolation of mononuclear cells (MNC) from the colon using a mixed silica-based density gradient interface. This method reproducibly isolates a significant number of viable leukocytes while minimizing contaminating debris, allowing subsequent immune phenotyping by flow cytometry or other methods.

The goal of this protocol is to isolate mononuclear cells that reside in the lamina propria of the colon by enzymatic digestion of the tissue using collagenase. This protocol allows for the efficient isolation of mononuclear cells resulting in a single cell suspension which in turn can be used for robust immunophenotyping.

عزل الخلايا أحادية اللامينا بروبريا أحادية النونافة من القولون المورين باستخدام Collagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...

Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central nervous system (CNS). The increasing evidences of their involvement in the control of infectious diseases justify the emerging interest in the improvement of methodologies to isolate primary astrocytes and microglia in order to evaluate their responses to infections that affect the CNS. Considering the impact of Trypanosoma cruzi (T. cruzi) and Toxoplasma gondii (T. gondii) infection in the CNS, here we provide a method to extract, maintain, dissociate and infect murine astrocytes and microglia cells with protozoa parasites. Extracted cells from newborn cortices are maintained in vitro for 14 days with periodic differential media replacement. Astrocytes and microglia are obtained from the same extraction protocol by mechanical dissociation. After phenotyping by flow cytometry, cells are infected with protozoa parasites. The infection rate is determined by fluorescence microscopy at different time points, thus enabling the evaluation of differential ability of glial cells to control protozoan invasion and replication. These techniques represent simple, cheap and efficient methods to study the responses of astrocytes and microglia to infections, opening the field for further neuroimmunology analysis.

The overall goal of this protocol is to instruct how to extract, maintain, and dissociate murine astrocyte and microglia cells from the central nervous system, followed by infection with protozoa parasites.

العزلة المصاحبة للخلايا الفلكية الأولية وMicroglia لعدوى طفيلي بروتوزوا

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central ...