ברצוננו להודות לחברים במעבדה Tsirka לעצתם והערות מועילות. עבודה זו נתמכה על ידי R01NS42168 להגדיר, 12PRE12060489 לRB, IGERT NSF-3MT ומלגת דוקטורט טרנר לשעון מקומי, וNSF-3MT IGERT לJCN.

1. נתיחה (יום 0) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום הרדמה לP0-2 גורי עכבר עם היפותרמיה. נגב את ראשיהם של הגורים עם Kimwipe ספוג באתנול 70% כדי לחטא את הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הראש עם זוג מספריים, באמצעות 4 גורים בצלחת תרבות 10 ס&quot;מ. מניחים את הראשים בצלחת פטרי שמכילה המאגר של האנק הקר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעגן את הראשים באמצעות מלקחיים מעוקלים דרך ארובות העיניים ולהסיר את העור המכסה את הגולגולת עם microforceps ישר בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את עצמות גולגולת עם microforceps ישר, תוך שימוש בזהירות כדי לא לנקב או נזק הקורטקס. הדרך היעילה ביותר היא להתחיל את ההסרה מתחילה ליד המוח הקטן, הנמצא בבסיסו של הראש, כפי שהאזור זה יהיה מושלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המוח עם מרית קטנה, והמקום (4) את המוח בצלחת פטרי שמכילה טרי החיץ קר כקרח של האנק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הצעדים מנקודה זו והלאה לנצל microforceps ומבוצעים תחת disseמיקרוסקופ ction. החל בצד הגחוני של המוח, לעגן את הרקמה על ידי מחזיק את המוח הקטן ולעשות שני חתכים קטנים בכל צד של המוח התיכון. היזהר שלא לחתוך את כל הדרך דרך הרקמה, כמו הקורטקס לכסות את המוח התיכון באזור זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להקניט המוח התיכון והמוח הקטן בחתיכה אחת משתי קליפת המוח. שני הקורטקס צריך ליצור צורה קעורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפריד בין שני הקורטקס ולכוון את קליפה אחד עם הצד המדיאלי עד לנתיחה נוספת. ההיפוקמפוס יכול להיות קשה להתבונן, אבל הוא ממוקם מול של הנורה חוש הריח שמופיע כגולה קטנה בקצה המחודד של קליפת המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את ההיפוקמפוס, שבו יש צורת סהר. להעיף את הקליפה מעל לצפייה בצד הגב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בנורת חוש הריח כנקודת התחלה, להסיר את כל קרומי המוח ונורת חוש הריח עצמו מקליפת המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקורטקס גזור צריך להיות ממוקם בתוך 15 צינורות חרוטי מ&quot;ל עם 14 מ&quot;ל של colמלוח נאגר של האנק ד על קרח. </li></ol> 2. תרבית תאים (יום 0) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 מנות בתרבית רקמת ס&quot;מ מראש מעיל עם 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של פולי-D-ליזין (PDL) מדוללים במי autoclaved עבור 3 שעות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב PDL, וצלחות לשטוף פעם עם מים autoclaved. צלחת יבש תחת UV במכסת המנוע בתרבית הרקמה למשך 20 דקות. צעד זה צריך להתבצע רק לפני תהליך הנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיצו של האנק לשאוב מצינורות המכילים את קליפת המוח מהמוח של 4 כל אחת, להחיל 4 מ&quot;ל של תמיסת טריפסין / EDTA 1x, triturate רקמה עם P1000 טיפ, וצינורות מקום 37 ° C בחממה במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 מ&quot;ל של תקשורת microglial המלאה לכל צינור כדי לעצור את עיכול אנזימטי, לערבב, ומסובב את תכנים בסל&quot;ד 1.5K למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant וחזור על לשטוף עם 4 מ&quot;ל של מדיה מלאה. תאי Resuspend ב 10 מ&quot;ל של תקשורת microglial המלאה (DMEM עם 10% FBS, 1% פירובט נתרן, 0.08% gentamycin), ולסנן דרך 40 מיקרומסננת תא רשת N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת בצפיפות של 8 לקורטקס 10 מ&quot;ל בצלחת 10 ס&quot;מ תרבות רקמות ומקום בתרבות רקמות חממה ב 37 ° C ו 5% CO 2 (ראה למבוגרים Microglia פרוטוקול). </li></ol> (יום 3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי בתקשורת בכל מנות תרבות התאים עם תקשורת microglial מלאה. </li></ol> (יום 10) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 400 מיקרוליטר של 60 מ&quot;מ לידוקאין בHBSS (לנתק microglia) לתוך מדיום של תרבות צלחות רקמות של 10 ס&quot;מ והדגירה בטמפרטורת חדר (RT) למשך 10-15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התקשורת / השעיה תא מהצלחת, ולשטוף את צלחת פעם אחת עם החיץ של האנק. לאסוף חיץ לשטוף להתאושש microglia שנותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;מ EDTA (pH 8.0) להשעית התא לריכוז סופי של 50 מיקרומטר או בדילול 1/100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה השעיה תא XG ב 1000 (1,500 סל&quot;ד) במשך 5 דקות ומחדש להשעות ב1 מ&quot;ל DMEM עם 1% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת מספר תאי קיימא (לפי Mi מבוגריםcroglia 3.1/3.2) ותאים מחולקים לצלחות תרבית רקמה בצפיפות הניסוי הרצויה. כ 1x10 6 microglia נקצרים מצלחת 10 ס&quot;מ המכילה את קליפת המוח מגיל 4 מוחות. לimmunofluorescence, צפיפות של 2.5x10 4 תאים לכל coverslip 18 מ&quot;מ מומלצת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר לפחות 24 שעות לתאי microglial לחזור באופן מלא למצבו המסועף, מנוחתם לפני השימוש. </li></ol> טקסט פרוטוקול: (למבוגרים Microglia) 1. אוסף רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות תרבית רקמה מעיל עם פולי-D-ליזין (PDL) עבור 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס או הלילה ב 4 ° C. לשטוף את צלחות פעם אחת עם מים autoclaved מייד לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר בחנק CO 2, ויוודא כי המתת חסד היא מוחלטת. יש לנקות את אזור חוט השדרה עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מספריים לחתוך את העור בחלקו העליון של חוט השדרה, ואז להמשיך לחתוך את חוט השדרה מהאזור T1 לT12. לחתוךשרירים את שנותרו מהצדדים של חוט השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט לחתוך את החוליות באמצעות microscissors כמו שאתה בעדינות להחזיק את חוט השדרה עם קצות אצבעותיך. היזהר שלא לנקב את חוט השדרה כרקמה רכה מאוד. לאט לחלץ את חוט השדרה באמצעות microforceps. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את חוט השדרה בצלחת פטרי המכילה HBSS קר כקרח. השימוש במיקרוסקופ אור להסיר את כל קרומי המוח הגלויים באמצעות microforceps </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את חוט השדרה למקטעים רוחביים קטנים מספיק כדי לייצר כמה שברים. העובי של שברים לא צריך להיות יותר מ 2 מ&quot;מ על מנת להקל על עיכול יעיל. להעביר את החלקים בעמוד השדרה לצינור חרוטי 15 מ&quot;ל המכיל 1 HBSS קר כקרח מ&quot;ל. שמור את הצינור על קרח עד שלב העיכול. </li></ol> 2. עיכול של רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HBSS לשאוב מצינור חרוטי 15 מ&quot;ל המכיל רקמת חוט השדרה. היזהר שלא לשאוב כל פיסת הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של טריפסין (2.5 גר &#39;/ ליטר מוקרן חזירי טריפסין ו0.2 גר&#39; / ל &#39;בHBSS EDTA) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעצור את העיכול להסיר טריפסין ומוסיף 3 מ&quot;ל של מדיום microglia העיקרי המכיל סרום לעצור עיכול אנזימטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet למעלה ולמטה כדי לסלק את הרקמה. סנן את ההשעיה התא באמצעות מסננת תא 40 מיקרומטר. </li></ol> 3. ספירת תאים וציפוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים נפח שווה של השעיה תא ופתרון DAPI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת בצפיפות בין 5-7x10 5 תאים / מ&quot;ל ב35 x 10 מ&quot;מ צלחות PDL מצופים. ציפוי בצפיפות נמוכה מנע צמיחת תאים גם כאשר תאים בתרבית 12 צלחות גם בו יש שטח קטן יותר בהשוואה ל -35 מ&quot;מ x 10 מנות. </li></ol>

<ol>
	<li>Ransohoff, R. M., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Physiology:+Unique+Stimuli,+Specialized+Responses.">Microglial Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses.</a> Ann. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).</li><li>Ginhoux, F., Greter, M., Leboeuf, M., Nandi, S., See, P., Gokhan, S., Mehler, M., Conway, S., Ng, L., Stanley, E., Samokhavalov, I., Merad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+analysis+reveals+that+adult+microglia+derive+from+primitive+macrophages.">Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages.</a> Science. 330, (2010).</li><li>Kraft, A. D., Harry, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+microglia+and+neuroinflammation+relevant+to+environmental+exposure+and+neurotoxicity.">Features of microglia and neuroinflammation relevant to environmental exposure and neurotoxicity.</a> Int. J. Env. Res. Pub. Health. 8, 2980-3018 (2011).</li><li>Sierra, A., Encinas, J. M., Deudero, J., Chancey, J., Enikolopov, G., Overstreet-Wadiche, L., Tsirka, S., Maletic-Savatic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+shape+adult+hippocampal+neurogenesis+through+apoptosis-coupled+phagocytosis.">Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis.</a> Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).</li><li>Emmetsberger, J., Tsirka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+inhibitory+factor+(MIF/TKP)+mitigates+secondary+damage+following+spinal+cord+injury.">Microglial inhibitory factor (MIF/TKP) mitigates secondary damage following spinal cord injury.</a> Neurobiol. Dis. 47, 295-309 (2012).</li><li>Gao, Z., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+MS+Reveal+Multiple+Roles+of+Microglia+in+Disease+Pathogenesis.">Animal Models of MS Reveal Multiple Roles of Microglia in Disease Pathogenesis.</a> Neurol Res. Int. , 383087 (2011).</li><li>Beggs, S., Trang, T., Salter, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P2X4R++microglia+drive+neuropathic+pain.">P2X4R+ microglia drive neuropathic pain.</a> Nature Neurosci. 15, 1068-1073 (2012).</li><li>Olson, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+by+microglia+in+the+spinal+cord.">Immune response by microglia in the spinal cord.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1198, 271-278 (2010).</li><li>Batchelor, P. E., Tan, S., Wills, T. E., Porritt, M. J., Howells, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+inflammation+in+the+brain+and+spinal+cord+following+mechanical+injury.">Comparison of inflammation in the brain and spinal cord following mechanical injury.</a> J. Neurotrauma. 25, 1217-1225 (2008).</li><li>Schell, J. B., Crane, C. A., Smith, M. F., Roberts, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ex+vivo+nitric+oxide+production+by+acutely+isolated+neonatal+and+adult+microglia.">Differential ex vivo nitric oxide production by acutely isolated neonatal and adult microglia.</a> J. Neuroimmunol. 189, 75-87 (2007).</li><li>Brannan, C. A., Roberts, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+microglia+from+adult+mice+are+refractory+to+nitric+oxide-inducing+stimuli+due+to+impaired+NOS2+gene+expression.">Resident microglia from adult mice are refractory to nitric oxide-inducing stimuli due to impaired NOS2 gene expression.</a> Glia. 48, 120-131 (2004).</li><li>Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+microglia+isolation+from+mixed+glial+cell+cultures+of+neonatal+rat+brain+tissue.">Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue.</a> J. Vis. Exp. (66), e3814 (2012).</li><li>Yip, P. K., Kaan, T. K., Fenesan, D., Malcangio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+and+culture+of+primary+microglia+from+adult+mouse+spinal+cord.">Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord.</a> J. Neurosci. Methods. 183, 223-237 (2009).</li><li>Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+culture+system+that+supports+adult+microglial+cell+proliferation+and+maintenance+in+the+resting+state.">Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state.</a> J. Immunol. Meth. 300, 32-46 (2005).</li><li>Ji, K., Akgul, G., Wollmuth, L. P., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+actively+regulate+the+number+of+functional+synapses.">Microglia actively regulate the number of functional synapses.</a> PLoS One. 8, e56293 (2013).</li><li>Tremblay, M. -. &. #. 2. 0. 0. ;., Majewska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+microglia+in+synaptic+plasticity.">A role for microglia in synaptic plasticity.</a> Comm. Integr. Biol. 4, 220-222 (2011).</li><li>DeWitt, D. A., Perry, G., Cohen, M., Doller, C., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+regulate+microglial+phagocytosis+of+senile+plaque+cores+of+Alzheimer's+disease.">Astrocytes regulate microglial phagocytosis of senile plaque cores of Alzheimer's disease.</a> Expt. Neurol. 149, 329-340 (1998).</li><li>Aloisi, F., Penna, G., Cerase, J., Men&#233;ndez Iglesias, B., Adorini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-12+production+by+central+nervous+system+microglia+is+inhibited+by+astrocytes.">IL-12 production by central nervous system microglia is inhibited by astrocytes.</a> J. Immunol. 159, 1604-1612 (1997).</li><li>Min, K. -. J., Yang, M. -. S., Kim, S. -. U., Jou, I., Joe, E. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+induce+hemeoxygenase-1+expression+in+microglia:+a+feasible+mechanism+for+preventing+excessive+brain+inflammation.">Astrocytes induce hemeoxygenase-1 expression in microglia: a feasible mechanism for preventing excessive brain inflammation.</a> J. Neurosci. 26, 1880-1887 (2006).</li><li>Sasmono, R., Oceandy, D., Pollard, J., Tong, W., Pavli, P., Wainwright, B., Ostrowski, M., Himes, S., Hume, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+macrophage+colony-stimulating+factor+receptor-green+fluorescent+protein+transgene+is+expressed+throughout+the+mononuclear+phagocyte+system+of+the+mouse.">A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse.</a> Blood. 101, 1155-1163 (2003).</li><li>Ekdahl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+activation+-+tuning+and+pruning+adult+neurogenesis.">Microglial activation - tuning and pruning adult neurogenesis.</a> Front Pharmacol. 3, 14 (2012).</li><li>Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A., McEwen, B., Bulloch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+derived+from+aging+mice+exhibit+an+altered+inflammatory+profile.">Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile.</a> Glia. 55, 412-424 (2007).</li></ol>

יש מחברים אין לחשוף.

Microglia לווסת את מערכת העצבים המרכזית תפקוד תקין, כמו גם תגובות דלקתיות לפתולוגיות שונות. שיפוץ הסינפטי פונקציונלי על ידי microglia היה מעורב בשמירה על הומאוסטזיס המוח הנורמלי 15. במהלך מפל neurogenic הם משתתפים באישור של תאים עצביים מהרכס משוננת של ההיפוקמפוס 4, 16. לכ...

Microglia הם התאים החיסוניים המקומיים של מערכת העצבים המרכזית, המזכירים באופן הדוק ביותר מקרופאגים היקפיים במבנה ותפקוד 1. זה כבר הוכיח לאחרונה כי תאי microglial לאחר לידה נובעים מאבות מיאלואידית פרימיטיביות ונוצרים לפני היום השמיני של עובר, הפילו את הרעיון הקודם שאבות hematopoietic לאחר לידה הם המקור של microglia במוח הבוגר 2. הם משחקים תפקידי מפתח במספר מחלות נוירולוגיות ויכולים להגיב במהירות לזיהום או פגיעה על ידי שחרור הפרו ציטוקינים דלקתיים ואנטי דלקתיים 3. לפיכך microglia להקיף יחידה עצמאית של מערכת העצבים המרכזית שניתן להשפיע להשפיע התקדמות מחלה. פיתוח שיטות חזקות ולשעתק לבודד ותאי microglial ילוד או מבוגר תרבות חשוב למחקרים עתידיים. Microglia ידוע להיות שחקנים קריטיים במספר פתולוגיות מוחיות. לאחרונה, רולes הם מתעוררים לתאים בהתפתחות מוח הנורמלי ולתפקד כתאי microglia phagocytose עודפים עצביים אב מהרכס משוננת של ההיפוקמפוס 1, 4. Microglia יכול גם לווסת את מספר תנאי נוירולוגיות שמשפיעים על חוט השדרה, כגון טרשת נפוצה, כאב נוירופתי, ופגיעה בחוט השדרה 5-7. microglia בעמוד השדרה מגיב באופן שונה בהשוואה למוח microglia בתגובה לאותות הפעלה 8, 9, כנראה בשל הבדלים בסביבה המקומית. לכן חשוב להקים מתאים במערכת במבחנה לתרבות וללמוד microglia חוט השדרה. microglia הילוד לייצר באופן משמעותי יותר של תחמוצת חנקן ציטוקינים פרו דלקתית בהשוואה לתאים בוגרים לאחר גירוי במבחנה עם IFN-γ או TNF-10,11 נוסף המדגיש את הצורך בשימוש בתאי בוגרים ללמוד microglia בהקשר של מחלות מסוימות. הפרוטוקול אנחנו מעסיקים במעבדה למ&quot;קmicroglia ילוד lture הוא וריאציה של השיטות האחרונות אשר מנצלים רועד של תרבויות גליה מעורבות במאמץ להסיר את microglia מפני השטח של תא בקבוק התרבות 12. אנחנו גם מתארים שיטה לתרבות microglia מחוט השדרה למבוגרים העכבר מבוסס על פרוטוקול שתואר לראשונה על ידי ייפ, ואח&#39; 13. שיטה זו מספקת דרך מהירה לתאים בוגרים תרבות בהשוואה לפרוטוקולים זמינים 14 אחרים. ההכנה המתקבלת היא 70% microglia; האחוז הנותר מורכב מהאסטרוציטים. למרות טוהר התרבות שלנו הוא נמוך יותר בהשוואה לשיטות אחרות שפורסמו 13, מערכת התרבות זו היא שימושית לחקר תרבות microglial בתגובה לגירויים הפעלה שונים, כמו גם למחקר של מחלות שבעיקר משפיעים על חוט השדרה ושבו חזק תגובה דלקתית היא תכונה עיקרי. כל הפרוטוקולים שתוארו כבר אושר על ידי סטוני ברוק Universiטאי IACUC.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EDTA, 5mM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567-028</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Lidocaine, 60mM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L-5647</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM, 1X</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-017</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-000-Cl</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Gentamycin Sulfate</td>
			<td>Biowittaker</td>
			<td>17-518Z</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>35 x 10mm tissue culture dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Poly-D-Lysine, 100 &mu;g/ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 1:20</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>HBSS, 1X</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>20-023-CV</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

culturing microglia from the neonatal and adult central nervous system

Microglia הם התאים דמויי מקרופאג התושבים של מערכת העצבים המרכזית (CNS), וככזה, יש תפקידים חשובים וקריטי בתהליכים פיסיולוגיים ופתולוגיים כגון CNS התבגרות בפיתוח, טרשת נפוצה, ופגיעה בחוט השדרה. יכול להיות מופעל microglia וגייס לפעולה על ידי פציעה או גירוי עצבי, כגון פגיעה בaxonal ראתה ב-MS או טראומה המוחית איסכמי כתוצאה משבץ מוחי. חברי immunocompetent אלה של מערכת העצבים המרכזית גם הם חשבו שיש תפקידים בפלסטיות הסינפטית בתנאים שאינם פתולוגיים. אנו מעסיקים פרוטוקולים לmicroglia culturing מן רקמות היילודים ומבוגרים שהמטרה למקסם את המספרים הסלולריים קיימא תוך מזעור משתנים מבלבלים, כגון נוכחות של סוגי תאים במערכת העצבים המרכזית ופסולת אחרים תרבית תאים. אנו משתמשים ברכיבים גדולים ולהבחין בקלות במערכת העצבים המרכזית (לדוגמה: קליפה, פלחי חוט השדרה), מה שהופך את כל התהליך אפשרי לשחזור. השימוש בתא בוגרים הוא חלופה מתאימה לשימוש בmicroglia מוח ילוד, כפי שפתולוגיות רבות למדה בעיקר משפיעות על חוט השדרה לאחר הלידה. מערכות התרבות אלה הן גם שימושיות עבור ישירות בדיקת ההשפעה של תרכובות שיכולים גם לעכב או לקדם את הפעלת microglial. מאז הפעלת microglial יכולה לעצב את התוצאות של מחלה של מערכת העצבים המרכזית למבוגרים, יש צורך במערכות מבחנה שבה יכול להיות מתורבת microglia יילודים ומבוגרים ולמדו.

<html> דוגמה של תאי microglial מנוחה והופעלו מוצגת באיור 1. Microglia היה דמיין 24 שעות לאחר ציפוי (איור 1 א) ולהציג מורפולוגיה מסועפת (מנוחה). חשיפה למגיב תחול, lipopolysaccharide (LPS) תוצאות חיידקיים בשינויים במורפולוגיה microglial כמו התאים להיות מופעלת (איור 1). <p class...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System at JoVE.com

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

אנו מתארים שיטות לבידוד היעילה ומהיר / התרבות של microglia קיימא מקליפת המוח וחוט השדרה בילוד מבוגר. הנתיחה והציפוי של microglia קליפת המוח יכולים להיות מושלמת תוך 90 דקות, עם קציר microglial שלאחר מכן מתקיים ~ 10 ימים לאחר הנתיחה הראשונית.

Microglia culturing ממערכת העצבים המרכזי וילודים למבוגרים

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

culturing-microglia-from-the-neonatal-and-adult-central-nervous-system

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

27.5K Views.  Stony Brook University. אנו מתארים שיטות לבידוד היעילה ומהיר / התרבות של microglia קיימא מקליפת המוח וחוט השדרה בילוד מבוגר. הנתיחה והציפוי של microglia קליפת המוח יכולים להיות מושלמת תוך 90 דקות, עם קציר microglial שלאחר מכן מתקיים ~ 10 ימים לאחר הנתיחה הראשונית.

Video: Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Microglia account for approximately 12% of the total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered the major cell types of the nervous system, microglia play a significant role in normal brain physiology by monitoring tissue for debris and pathogens and maintaining homeostasis in the parenchyma via phagocytic activity 1,2. Microglia are activated during a number of injury and disease conditions, including neurodegenerative disease, traumatic brain injury, and nervous system infection 3. Under these activating conditions, microglia increase their phagocytic activity, undergo morpohological and proliferative change, and actively secrete reactive oxygen and nitrogen species, pro-inflammatory chemokines and cytokines, often activating a paracrine or autocrine loop 4-6. As these microglial responses contribute to disease pathogenesis in neurological conditions, research focused on microglia is warranted.
	Due to the cellular heterogeneity of the brain, it is technically difficult to obtain sufficient microglial sample material with high purity during in vivo experiments. Current research on the neuroprotective and neurotoxic functions of microglia require a routine technical method to consistently generate pure and healthy microglia with sufficient yield for study. We present, in text and video, a protocol to isolate pure primary microglia from mixed glia cultures for a variety of downstream applications. Briefly, this technique utilizes dissociated brain tissue from neonatal rat pups to produce mixed glial cell cultures. After the mixed glial cultures reach confluency, primary microglia are mechanically isolated from the culture by a brief duration of shaking. The microglia are then plated at high purity for experimental study.
	The principle and protocol of this methodology have been described in the literature 7,8. Additionally, alternate methodologies to isolate primary microglia are well described 9-12. Homogenized brain tissue may be separated by density gradient centrifugation to yield primary microglia 12. However, the centrifugation is of moderate length (45 min) and may cause cellular damage and activation, as well as, cause enriched microglia and other cellular populations. Another protocol has been utilized to isolate primary microglia in a variety of organisms by prolonged (16 hr) shaking while in culture 9-11. After shaking, the media supernatant is centrifuged to isolate microglia. This longer two-step isolation method may also perturb microglial function and activation. We chiefly utilize the following microglia isolation protocol in our laboratory for a number of reasons: (1) primary microglia simulate in vivo biology more faithfully than immortalized rodent microglia cell lines, (2) nominal mechanical disruption minimizes potential cellular dysfunction or activation, and (3) sufficient yield can be obtained without passage of the mixed glial cell cultures.
	It is important to note that this protocol uses brain tissue from neonatal rat pups to isolate microglia and that using older rats to isolate microglia can significantly impact the yield, activation status, and functional properties of isolated microglia. There is evidence that aging is linked with microglia dysfunction, increased neuroinflammation and neurodegenerative pathologies, so previous studies have used ex vivo adult microglia to better understand the role of microglia in neurodegenerative diseases where aging is important parameter. However, ex vivo microglia cannot be kept in culture for prolonged periods of time. Therefore, while this protocol extends the life of primary microglia in culture, it should be noted that the microglia behave differently from adult microglia and in vitro studies should be carefully considered when translated to an in vivo setting.

Isolating primary microglia from the cellular heterogeneity of the brain is essential to investigate their role in both physiological and pathological conditions. This protocol describes a mechanical isolation and mixed cell culture technique that provides high yield and high purity, viable primary microglial cells for in vitro study and downstream applications.

בידוד ראשי microglia מ מעורבים בתרביות תאים גליה של רקמת מוח החולדה ילודים

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Lipopolysaccharide (LPS) is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of lipid A, which is embedded in the outer membrane, a core oligosaccharide and repeating O-antigen units that extend outward from the surface of the cell1, 2. LPS is an immunodominant molecule that is important for the virulence and pathogenesis of many bacterial species, including Pseudomonas aeruginosa, Salmonella species, and Escherichia coli3-5, and differences in LPS O-antigen composition form the basis for serotyping of strains. LPS is involved in attachment to host cells at the initiation of infection and provides protection from complement-mediated killing; strains that lack LPS can be attenuated for virulence6-8. For these reasons, it is important to visualize LPS, particularly from clinical isolates. Visualizing LPS banding patterns and recognition by specific antibodies can be useful tools to identify strain lineages and to characterize various mutants. 
In this report, we describe a hot aqueous-phenol method for the isolation and purification of LPS from Gram-negative bacterial cells. This protocol allows for the extraction of LPS away from nucleic acids and proteins that can interfere with visualization of LPS that occurs with shorter, less intensive extraction methods9. LPS prepared this way can be separated by sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and directly stained using carbohydrate/glycoprotein stains or standard silver staining methods. Many anti-sera to LPS contain antibodies that cross-react with outer membrane proteins or other antigenic targets that can hinder reactivity observed following Western immunoblot of SDS-PAGE-separated crude cell lysates. Protease treatment of crude cell lysates alone is not always an effective way of removing this background using this or other visualization methods. Further, extensive protease treatment in an attempt to remove this background can lead to poor quality LPS that is not well resolved by any of the aforementioned methods. For these reasons, we believe that the following protocol, adapted from Westpahl and Jann10, is ideal for LPS extraction.

We describe a modified hot aqueous-phenol extraction method for purifying lipopolysaccharide (LPS) from Gram-negative bacteria. Once extracted, the LPS can be subsequently analyzed by SDS-PAGE and visualized by direct staining or Western immunoblot.

טיהור ויזואליזציה של Lipopolysaccharide של חיידקים גראם שליליים, על ידי הפקת מימית, פנול חם

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure for isolation of microglia from neonatal murine cortices by mechanical agitation with a rotary shaker. This microglia isolation method yields highly pure cortical microglia that exhibit morphological and functional characteristics indicative of quiescent microglia in normal, nonpathological conditions in vivo. This procedure also preserves the microglial immunophenotype and biochemical functionality as demonstrated by the induction of morphological changes, nuclear translocation of the p65 subunit of NF-&#954;B (p65), and secretion of the hallmark proinflammatory cytokine, tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), upon lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam) challenges. Therefore, the present isolation procedure preserves the immunophenotype of both quiescent and activated microglia, providing an experimental method of investigating microglia biology in ex vivo conditions.

One key to successful investigation of microglial biology is the preservation of microglial immunofunction ex vivo during isolation from CNS tissue. Isolating microglia via rotary shaking results in highly pure and immunofunctional cell cultures as assessed by fluorescent imaging, immunocytochemistry, and ELISA following microglia activation with the proinflammatory stimuli lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam).

בידוד של קליפת המוח Microglia עם immunophenotype משומר ופונקציונאלי מילודי Murine

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.

Here we describe a newly developed hepatitis B virus (HBV) reporter system to monitor the early stages of the HBV life cycle. This simplified in vitro system will aid in the screening of anti-HBV agents using a high-throughput strategy.

פיתוח של מערכת Reporter וירוס הפטיטיס B לפקח בשלבים המוקדמים של מחזור שכפול

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main macrophage populations in the CNS: (i) the microglia, which are the resident macrophages of the CNS and are derived from yolk sac progenitors during embryogenesis, and (ii) the monocyte-derived macrophages (MDM), which can infiltrate the CNS during disease and are derived from bone marrow progenitors. The roles of each macrophage subpopulation differ depending on the pathology being studied. Furthermore, there is no consensus on the histological markers or the distinguishing criteria used for these macrophage subpopulations. However, the analysis of the expression profiles of the CD11b and CD45 markers by flow cytometry allows us to distinguish the microglia (CD11b+CD45med) from the MDM (CD11b+CD45high). In this protocol, we show that the density gradient centrifugation and the flow cytometry analysis can be used to characterize these CNS macrophage subpopulations, and to study several markers of interest expressed by these cells as we recently published. Thus, this technique can further our understanding of the role of macrophages in mouse models of neurological diseases and can also be used to evaluate drug effects on these cells.

This protocol provides an analysis of the macrophage subpopulations in the adult mouse central nervous system by flow cytometry and is helpful for the study of multiple markers expressed by these cells.

ניתוח של microglia ומונוציטים הנגזרות מקרופאגים ממערכת העצבים המרכזית על ידי cytometry זרימה

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

לימפוציטים בידוד מן העכבר קטן המעי המערכת החיסונית

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

A Positioning Device for the Placement of Mice During Intranasal siRNA Delivery to the Central Nervous System

Intranasal (IN) drug delivery to the brain has emerged as a promising method to bypass the blood-brain barrier (BBB) for the delivery of drugs into the central nervous system (CNS). Recent studies demonstrate the use of a peptide, RVG9R, incorporating the minimal receptor-binding domain of the Rabies virus glycoprotein, in eliciting the delivery of siRNA into neurons in the brain. In this protocol, the peptide-siRNA formulation is delivered intranasally with a pipette in the dominant hand, while the anesthetized mouse is restrained by the scruff with the nondominant hand in a "head down-and-forward position" to avoid drainage into the lung and stomach upon inhalation. This precise gripping of mice can be learned but is not easy and requires practice and skill to result in effective CNS uptake. Furthermore, the process is long-drawn, requiring about 45 min for the administration of a total volume of ~20-30 &#181;L of solution in 1-2 &#181;L droplet volumes per inhalation, with 3-4 min rest periods between each inhalation. The objective of this study is to disclose a mouse positioning device that enables the appropriate placement of mice for efficient IN administration of the peptide-siRNA formulation. Multiple features are incorporated into the design of the device, such as four or eight positioning chairs with adjustable height and tilt to restrain anesthetized mice in the head down-and-forward position, enabling easy visualization of the mice's nares and a built-in heating pad to maintain the mice's body temperatures during the procedure. Importantly, the ability to treat four or eight mice simultaneously with RVG9R-siRNA complexes in this manner enables studies on a much quicker time scale, for the testing of an IN therapeutic siRNA approach. In conclusion, this device allows for appropriate and controlled mouse head positioning for IN application of RVG9R-siRNA and other therapeutic molecules, such as nanoparticles or antibodies, for CNS delivery.

Here, we present a protocol using a mouse positioning device that enables the appropriate placement of mice for the intranasal administration of a brain-targeting peptide-siRNA formulation enabling effective gene silencing in the central nervous system.

מתקן מיקום להצבת עכברים במהלך המסירה Intranasal siRNA למערכת העצבים המרכזית

Intranasal (IN) drug delivery to the brain has emerged as a promising method to bypass the blood-brain barrier (BBB) for the delivery of drugs into the ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible genetic background. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a typical disease model of MS widely used for investigating the pathogenesis in which T lymphocytes specific for myelin antigens initiate an inflammatory reaction in CNS. It is very important to assess how lymphocytes in the CNS regulate the development of disease. However, the approach for measuring the quantity and quality of infiltrated lymphocytes in the CNS is very limited due to the difficulties in isolating and detecting infiltrated lymphocytes from the brain. This manuscript presents a protocol for that is useful for the isolation, identification, and characterization of infiltrated lymphocytes from the CNS and will be helpful for our understanding of how lymphocytes are involved in the development of the CNS autoimmune disease.

This manuscript presents a protocol to induce active experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in mice. A method for the isolation and characterization of the infiltrated lymphocytes in the central nervous system (CNS) is also presented to show how lymphocytes are involved in the development of CNS autoimmune disease.

זרימה ניתוח ציטומטרי של חדירה לימפוציטים במערכת העצבים המרכזית במהלך אנצפלומיאלטיס אוטואימונית ניסיונית

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells

The central nervous system (CNS) is comprised of the brain and spinal cord and is enveloped by the meninges, membranous layers serving as a barrier between the periphery and the CNS. The CNS is an immunologically specialized site, and in steady state conditions, immune privilege is most evident in the CNS parenchyma. In contrast, the meninges harbor a diverse array of resident cells, including innate and adaptive immune cells. During inflammatory conditions triggered by CNS injury, autoimmunity, infection, or even neurodegeneration, peripherally derived immune cells may enter the parenchyma and take up residence within the meninges. These cells are thought to perform both beneficial and detrimental actions during CNS disease pathogenesis. Despite this knowledge, the meninges are often overlooked when analyzing the CNS compartment, because conventional CNS tissue extraction methods omit the meningeal layers. This protocol presents two distinct methods for the rapid isolation of murine CNS tissues (i.e., brain, spinal cord, and meninges) that are suitable for downstream analysis via single-cell techniques, immunohistochemistry, and in situ hybridization methods. The described methods provide a comprehensive analysis of CNS tissues, ideal for assessing the phenotype, function, and localization of cells occupying the CNS compartment under homeostatic conditions and during disease pathogenesis.

This paper presents two optimized protocols for examining resident and peripherally derived immune cells within the central nervous system, including the brain, spinal cord, and meninges. Each of these protocols helps to ascertain the function and composition of the cells occupying these compartments under steady state and inflammatory conditions.

בידוד רקמות מערכת העצבים המרכזית וקרומי המוח הקשורים לניתוח במורד הזרם של תאי מערכת החיסון

The central nervous system (CNS) is comprised of the brain and spinal cord and is enveloped by the meninges, membranous layers serving as a barrier ...

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method for isolating DCs primarily involves inducing bone marrow (BM) differentiation into DCs by injecting large doses (&#62;10 ng/mL) of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor/interleukin-4 (GM-CSF/IL-4), making the procedure complex and expensive. In this protocol, using all BM cells cultured in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 medium, after 3-4 half-culture exchanges, up to 2.7 x 107 CD11c+ cells&#160;(DCs) per mouse (two femurs) were harvested with a purity of 80%-95%. After 10 days in culture, the expression of CD11c, CD80, and MHC II increased, whereas the number of cells decreased. The number of cells peaked after 7 days of culture. Moreover, this method only took 10 min to harvest all bone marrow cells, and a high number of DCs were obtained after 1 week of culture.

Here, we present an economical and efficient method to isolate and generate high-purity bone marrow-derived dendritic cells from mice after 7 days of culture with 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

פרוטוקול חסכוני ויעיל לבידוד וגידול תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם מעכברים

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...