معتمدة LMW وRHK من قبل مدرسة UMaine الدراسات العليا للعلوم والهندسة (GSBSE) الطبية الحيوية؛ كان مدعوما أيضا من قبل RHK مين الزراعية وتجربة محطة غابة. وقدمت تمويلا إضافيا من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (NIH P20-GM103423)، ومين الزراعية وتجربة محطة غابة (جرانت عدد ME08004-10، الفريق الاستشاري المشترك)، وجامعة ولاية ماين ADVANCE ارتفاع المد مركز (NSF المنح # 1008498) ، وبحوث كاتب المنحة الصيدلة / علم السموم من مؤسسة فارما (JAG). نشكر الدكاترة. ديفيد Holowka وباربرا بيرد للمستضد والخلايا. ونحن ممتنون لهينا الهاشمي، اليخاندرو فيليز، وأندرو Abovian للمساعدة بالمعدات وأوامر. هذا هو مين الزراعية والغابات تجربة محطة المنشور رقم 3311.

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

في عام 2004، نعال وآخرون. 1 وضع جهاز الاستشعار البيولوجي الخلايا البدينة للاختبار عالية الإنتاجية من تحبب. وهو فحص القوية التي تكيفنا للدراسات TCS لدينا ومفصلة في هذا الفيديو. قبل نعال وآخرون. 1 الفحص، تحبب الخلايا البدينة قد تم تقييمها بشكل روتيني عبر β-هيكسوز?...

الخلايا البدينة وحبيبات غاية الخلايا المناعية المستجيب أن تكون بمثابة الوسطاء الرئيسيين في الربو، والحساسية، والطفيليات الدفاع والتسرطن 13-16. يقيمون في ما يقرب من كل الأنسجة أوعية دموية 15، حيث تخزن بشكل آمن وسطاء حساسية والتهابات في حبيبات هيولية حتى المنشط لdegranulate. تحبب هو إيماس من حبيبات غشاء محدد، مما يؤدي إلى إطلاق وسطاء الصيدلانية الفعالة مثل الهستامين، تريبتاز، و leukotrienes 15. هذه النتائج العملية في الشروع في النوع الأول من تفاعلات فرط الحساسية التي تعتبر بالغة الأهمية في تصاعد الدفاع ضد الطفيليات وكذلك الشروع في استجابات حساسية، الربو، ومسببة للسرطان 15. الخلايا البدينة والخلايا القاعدية مستقبلات FcεRI، المستقبلات عالية تقارب لالغلوبولين المناعي E (إيج) 17. التعرض لمسببات الحساسية أو مستضد يسبب تجميع عدة مستقبلات FcεRI فريق الخبراء الحكومي الدولي متجهة الى 17، وهذا هو قس يسمى ب &quot;يشابك&quot; من مستقبلات القطعة Fc فريق الخبراء الحكومي الدولي متجهة الذي يبدأ عملية تحبب: سلسلة من الأحداث التيروزين الفسفرة، وتفعيل فسفوليباز C، هروب رأس المال من الكالسيوم من مخازن الداخلية، وتدفق الكالسيوم إلى داخل الخلية 18. هذا التدفق الكالسيوم ضروري للتحبب، و، علاوة على ذلك، يشير الانصهار الحبيبية مع الغشاء قبل أن يتسببوا إيماس الحبيبية 15. تجريبيا، وهو حامل الأيون الكالسيوم يمكن أن تستخدم لنقل الكالسيوم مباشرة عبر غشاء الخلية 19، والذي يتجاوز أساسا عن نقل الإشارة الخطوات من قبل لتدفق الكالسيوم الخطوة 20، والسماح لتحديد مسار هدفا بواسطة مادة سامة على أنها المنبع أو المصب الكالسيوم مما يشير 20. تحبب يمكن قياسها بسرعة وفعالية من خلال رصد إطلاق سراح β-هيكسوزامينيداز إلى طاف الخلية، والتي يتم تحريرها خطيا من حبيبات جنبا إلى جنب مع الهستامين 6، ولكن أناأسهل بكثير للكشف عن رد فعل بسيط باستخدام انزيم الركيزة وقارئ صفيحة ميكروسكوبية لفحص المنتج الفلورسنت. ويستند هذا الاختبار صفيحة ميكروسكوبية، على النحو المفصل في قسم البروتوكول، بناء على وسيلة قوية ضعت أصلا من قبل نعال وآخرون. 1، التي تقيس انشقاق الركيزة الفلورة 4-ميثيل مبيليفيريل-N-أسيتيل β-D-β-glucosaminide من قبل هيكسوزامينيداز. قمنا بتعديل مقايسة لاختبار آثار المخدرات والمواد السامة، مع تسليط الضوء التريكلوسان هنا. هذا الأسلوب الكمي موثوق تحبب، هو بديل رخيص الثمن، على سبيل المثال، تدفق طرق الكشف على أساس cytometric 21، ولديه القدرة على تقديم نفسه بشكل جيد لفحص عالية الإنتاجية من مجموعة واسعة من الأدوية المضادة للحساسية، وكذلك جهاز المناعة أو المواد الكيميائية المسببة للحساسية. هذه النقطة الأخيرة لها أهميتها ولا سيما في ضوء لعام 2007 تقرير المجلس القومي للبحوث &quot;اختبار السمية في القرن الحادي و21: رؤية وSTRATايجى &quot;( <a href="http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970">http://www.nap.edu/openbook.php؟record_id=11970</a> )، الذي يدعو لتطوير اختبارات السموم عالية الإنتاجية التي تستخدم خلية ثقافة للحد من استخدام مكلفة من حيوانات المختبر التقليدية مثل الفئران. بروتوكول تحبب التي وضعتها نعال وآخرون. 1 وتعديلها من قبلنا 2، يستخدم خط الخلية RBL-2H3، الذي هو نموذج مقبولة تماما مثلي إلى الإنسان الخلايا البدينة المخاطية أو قعدات 3-5. (ترد تفاصيل طرق لزراعة الخلايا RBL-2H3 في هاتشينسون وآخرون 22). يمكن أن المرجح أن تتكيف هذا الاختبار إلى أي المرفقة نوع الخلايا البدينة. التريكلوسان (TCS) هو المضادة للميكروبات واسعة الطيف التي تم استخدامها لأكثر من 30 عاما في المستشفيات، ومنتجات العناية الشخصية، والسلع الاستهلاكية 23،24. طريقة عمل لخاصية مضادة للميكروبات TCS هو تثبيط الحيوي الدهنية حمض، من المحتمل عن طريق تثبيط enoyl-أسيلالناقل البروتين اختزال 25،26. انها وجدت في جميع أنحاء العالم في مجموعة واسعة من المنتجات الاستهلاكية مثل هلام الاستحمام، وغسول اليد ومعجون الأسنان وغسول الفم، وفي صابون اليد بتركيزات تصل إلى 0.3٪ أو 10 ملم 24. وقد أدى الاستخدام الواسع النطاق للTCS في المستويات التي يمكن اكتشافها في البشر و27-29 في الأنهار والجداول 30. وهناك دراسة أجريت من قبل Allmyr وآخرون. أثبتت أن 27 TCS وعناصره موجودة في كل من البلازما واللبن من أمهات المرضعات. الأهم من ذلك، يتم امتصاصه بسهولة TCS في الجلد 31-37. Queckenberg وآخرون. وجد 37 ~ 10٪ من امتصاص ~ 70 ملم TCS كريم في الجلد البشري في غضون 12 ساعة، مما أدى إلى تركيز كبير في الجلد، حيث تتواجد الخلايا البدينة. وقد تبين TCS سريريا لإدارة الإنسان مرض حساسية الجلد 7-11، ولكن كانت الآلية التي TCS يخفف من أمراض حساسية الجلد غير معروف 38. باستخدام صفيحة ميكروسكوبية الفلورسنت وdetaile مقايسةد في هذا الفيديو، ونحن في الآونة الأخيرة أظهرت أن TCS، بتركيزات منخفضة تصل إلى 2 ميكرون، يخفف من حدة بشكل ملحوظ وظيفة الخلايا البدينة وتحبب، وتوفير تفسير محتمل لهذه البيانات السريرية 2. وبالإضافة إلى تقديم تفسيرا لهذه المعطيات السريرية، النتائج التي توصلنا إليها في بالمر وآخرون. 2 تشير إلى أن TCS تستهدف الجزيئات مما يشير المصب من تدفق الكالسيوم. ونظرا لأهمية الكالسيوم في العديد من إشارات المناعية والعمليات البيولوجية الأخرى، يمكن أن يكون TCS يحتمل أن تكون الآثار السلبية على تشكيلة واسعة من العمليات البيولوجية اللازمة. في الواقع، أظهرت Udoji وآخرون. TCS 39 أن يقمع الخلايا القاتلة النشاط التحللي الإنسان الطبيعي، وظيفة المناعة الفطرية هامة أخرى. خارج إمكاناته كأداة مساعدة العلاجية لمرض حساسية الجلد (أو، على العكس، باعتبارها immunotoxicant)، قد يكون TCS أيضا اضطرابات الغدد الصماء 40-49. وهكذا، فإن إجراءات واضحة بشأن كيفية إعداد هذه المادة الكيميائية في حل طS من الفائدة لعلماء السموم. لأن TCS هو جزيء صغير مسعور، وغالبا ما تستخدم المركبات العضوية لجعله أكثر قابلية للذوبان في الماء. في معظم الدراسات السمية حيث تم اختبار TCS، وإعداد تشارك انحلال في الماء مع المعونة من المذيبات العضوية مثل الإيثانول، الأسيتون، أو زيت 2،50،51. ومع ذلك، في كثير من الأحيان هذه المذيبات نشطة بيولوجيا أنفسهم، وبالتالي تعقيد تفسير المادة الكيميائية اختبار البيانات 51. في الواقع، وفقا لRufli وآخرون. 52 و 53 آخرين، فمن المستحسن أن حلول اختبار للتجارب السمية المائية يتم إعدادها باستخدام الطرق الفيزيائية على الطرق الكيميائية، ونظرا لإمكانات المذيبات الكيماوية لخلق التحف سمية. لقد أظهرنا سابقا أن TCS يذوب في الإيثانول بنسبة 0.24٪ / الماء (المجلد / المجلد) وsonicated لمدة 30 دقيقة يخفف من حدة RBL الصاري تحبب الخلية 2. وقد تبين الإيثانول بتركيزات أعلى من 0.24٪ إلى تثبيط الخلايا البدينة إدناءnulation 54،55-أمثلة على الآثار المحتملة التباس من المذيبات العضوية على دراسات سمية. ليس فقط هو أنه من المهم أن تنظر في تأثير المذيبات على الكائن الحي أو الخلايا المستخدمة للدراسة، ولكن أيضا من المهم لرصد تأثير المذيبات الكيميائية على اختبار نفسه. على سبيل المثال، سكاري وآخرون. وجدت أن 51 في تذويب TCS البولي ايثيلين جلايكول (التي توجد عادة في معاجين الأسنان وغسول الفم) ضعفت تأثيرات مضادة للبكتيريا ومضادة للالترسبات في النساء أنثى صحي في حين حل في الزيوت تسبب في خسارة كاملة من وظيفة. ولذلك، فإن قدرة المذيبات المختلفة لتعدل السموم والمخدرات، بما في ذلك TCS، وينبغي النظر في الآثار في تصميم مقايسة. استخدام الزيوت أو المواد المضافة نكهة قد تتداخل مع آثار TCS في مختلف المنتجات 50،51. في محاولة للقضاء على الحاجة إلى استخدام المذيبات العضوية، ونحن تحسينها لدينا وسيلة لتذويب TCS 2 من خلال القضاء على استخدام وسيلة سول العضويةتنفيس. في هذا البروتوكول، ونحن تذوب حبيبات TCS مباشرة إلى المخزن المؤقت مائي مع الحرارة (≤ 50 ° C)، ومن ثم تحقق من تركيز هذا المخزون TCS بواسطة القياس الطيفي للأشعة فوق البنفسجية فيس. هذه التحسينات ممكنة لأن TCS قابل للذوبان في الماء تصل إلى 40 ميكرومتر ( <a href="http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf">http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf</a> ) ولقد ثبت على مقاومة التحلل عند تسخينها إلى 50 درجة مئوية ( <a href="http://oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf">http:// على / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf</a> ) 56،57. لدينا أيضا فائدة إضافية تتمثل في القياس الطيفي للأشعة فوق البنفسجية فيس، كما TCS وكما هو معروف لاستيعاب بقوة 280 نيوتن متر في 58 مع معامل الانقراض المولي من 4،200 L / مول / سم 12. هذا البروتوكول يوفر وسيلة بسيطة، لكنها فعالة لإذابة حبيبات TCS في منطقة عازلة من دون المعونة من المذيبات العضوية، بما في ذلك تكاليف منخفضة والتحقق السريعمن التركيز، ويصف قوية الفلورسنت فحص صفيحة ميكروسكوبية لرصد الآثار الكيميائية على تحبب الخلايا البدينة.

a microplate assay to assess chemical effects on rbl-2h3 mast cell degranulation: effects of triclosan without use of an organic solvent

الخلايا البدينة تلعب دورا هاما في أمراض الحساسية والمناعة ضد الطفيليات الدفاع. تنشيط مرة واحدة (مثلا عن طريق مثيرة للحساسية)، فإنها degranulate، وهي العملية التي ينتج إيماس من الوسطاء حساسية. التشكيل من تحبب الخلايا البدينة من المخدرات والمواد السامة قد يكون لها آثار إيجابية أو سلبية على صحة الإنسان. وقد تم تشريح وظيفة الخلايا البدينة بالتفصيل مع استخدام مستقعد الخلايا البدينة سرطان الدم الفئران (RBL-2H3)، وهو النموذج المقبول على نطاق واسع من الإنسان الخلايا البدينة المخاطية 3-5. يمكن بسهولة وبشكل موثوق أن تقاس الصاري مكون الخلية الحبيبية والوسيط حساسية β-هيكسوزامينيداز، التي يتم تحريرها خطيا جنبا إلى جنب مع الهيستامين من الخلايا البدينة 6، من خلال رد الفعل مع ركيزة الفلورة، مما أسفر عن كثافة مضان قابلة للقياس في فحص صفيحة ميكروسكوبية التي هي قابلة لل دراسات عالية الإنتاجية 1. نشرت أصلا من قبل نعال وآخرون. 1، ونحن قد تكيفت هذه مقايسة تحبب لفحص سالأدوية و المواد السامة والتظاهر واستخدامه هنا. التريكلوسان هي وكيل واسع الطيف مضاد للجراثيم التي هي موجودة في كثير من المنتجات الاستهلاكية وعثر عليها لتكون المساعدات العلاجية في الإنسان مرض حساسية الجلد 7-11، على الرغم من أن آلية هذا التأثير غير معروف. هنا علينا أن نظهر مقايسة للتأثير على التريكلوسان تحبب الخلايا البدينة. أظهرنا مؤخرا أن التريكلوسان يؤثر بقوة ظيفة الخلايا البدينة 2. في محاولة لتجنب استخدام مذيب عضوي، يذوب التريكلوسان مباشرة إلى المخزن المؤقت مائي مع الحرارة والتحريك، وتأكيد تركيز الناتجة باستخدام القياس الطيفي للأشعة فوق البنفسجية فيس (باستخدام ε 280 = 4،200 L / M / سم) 12. هذا البروتوكول لديه القدرة على أن تستخدم مع مجموعة متنوعة من المواد الكيميائية لتحديد آثارها على تحبب الخلايا البدينة، وعلى نطاق أوسع، إمكاناتهم حساسية.

عند تسخينها إلى 50 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة، وطيف الامتصاص للأشعة فوق البنفسجية فيس TCS لتنتج، منحنى قوي السلس بين ~ 260 و 300 نانومتر، مع ذروة عند 280 نانومتر، كما هو مبين في الشكل 1. القياس الطيفي للأشعة فوق البنفسجية فيس هو، بالتالي، أداة هامة التي يمكن استخدامها لحساب تركيز، ...

Watch this Scientific Journal Video about A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent at JoVE.com

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

تحبب الخلايا البدينة، والإفراج عن وسطاء حساسية، والمهم في الحساسية، والربو، والدفاع الطفيلي. نحن هنا لشرح تقنيات 1 لتقييم آثار المخدرات والمواد السامة على تحبب، المنهجية المستخدمة مؤخرا لإظهار تأثير مثبط قوي من وكيل مضاد للجراثيم التريكلوسان 2.

والفحص صفيحة ميكروسكوبية لتقييم تأثيرات المواد الكيماوية على RBL-2H3 الصاري تحبب الخلايا: آثار التريكلوسان بدون استخدام مذيب عضوي

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

a-microplate-assay-to-assess-chemical-effects-on-rbl-2h3-mast-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

39.8K Views.  University of Maine, Orono.  تحبب الخلايا البدينة، والإفراج عن وسطاء حساسية، والمهم في الحساسية، والربو، والدفاع الطفيلي. نحن هنا لشرح تقنيات 1 لتقييم آثار المخدرات والمواد السامة على تحبب، المنهجية المستخدمة مؤخرا لإظهار تأثير مثبط قوي من وكيل مضاد للجراثيم التريكلوسان ...

Video: A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

Dilated cardiomyopathy (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1. Although genetic disposition and exposition to toxic substances are known causes for this disease in about one third of the patients, the origin of DCM remains largely unclear. In a substantial number of these patients, autoantibodies against cardiac epitopes have been detected and are suspected to play a pivotal role in the onset and progression of the disease2,3. The importance of cardiac autoantibodies is underlined by a hemodynamic improvement observed in DCM patients after elimination of autoantibodies by immunoadsorption3-5. A variety of specific antigens have already been identified2,3 and antibodies against these targets may be detected by immunoassays. However, these assays cannot discriminate between stimulating (and therefore functionally effective) and blocking autoantibodies. There is increasing evidence that this distinction is crucial6,7. It can also be assumed that the targets for a number of cardiotropic antibodies are still unidentified and therefore cannot be detected by immunoassays. Therefore, we established a method for the detection of functionally active cardiotropic antibodies, independent of their respective antigen. The background for the method is the high homology usually observed for functional regions of cardiac proteins in between mammals8,9. This suggests that cardiac antibodies directed against human antigens will cross-react with non-human target cells, which allows testing of IgG from DCM patients on adult rat cardiomyocytes. Our method consists of 3 steps: first, IgG is isolated from patient plasma using sepharose coupled anti-IgG antibodies obtained from immunoadsorption columns (PlasmaSelect, Teterow, Germany). Second, adult cardiomyocytes are isolated by collagenase perfusion in a Langendorff perfusion apparatus using a protocol modified from previous works10,11. The obtained cardiomyocytes are attached to laminin-coated chambered coverglasses and stained with Fura-2, a calcium-selective fluorescent dye which can be easily brought into the cell to observe intracellular calcium (Ca2+) contents12. In the last step, the effect of patient IgG on the cell shortening and Ca2+ transients of field stimulated cardiomyocytes is monitored online using a commercial myocyte calcium and contractility monitoring system (IonOptix, Milton, MA, USA) connected to a standard inverse fluorescent microscope.

The presented method offers a way to detect functional effective cardiotropic autoantibodies in the plasma of patients with dilated cardiomyopathy, irrespective of the specific antigen, by analysing the impact of isolated patient immunoglobulin on cellular shortening and intracellular calcium transients in isolated rat cardiomyocytes.

قياس تأثيرات على الأجسام المضادة من وظيفة الخلوية Cardiomyocytes متفرقة

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

التحقيق في آثار البروبيوتيك على المكورات الرئوية الاستعمار باستخدام<em&gt; في المختبر</em&gt; الالتزام الفحص

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

تحليل آثار خلايا انسجة على تجنيد الكريات البيض من التدفق

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly synthesized allergic, inflammatory and immunoregulatory mediators. MCs&#8217; mediators affect multiple tissues and organs culminating in allergic and immune responses. The synthesis, storage and release of the MC mediators are highly regulated. The pre-formed mediators are packed in cytoplasmic secretory granules&#160;(SG) that fuse with the plasma membrane and release their content by regulated exocytosis. We present a protocol, based on the co-expression of a gene of interest with a reporter gene that is targeted to the SGs and is released in a regulated fashion alongside the endogenous SG mediators. The protocol enables high resolution four dimensional confocal analyses of the MC SGs and monitoring their timeline from biogenesis to triggered exocytosis. Thus, using this protocol for screening genes of interest for their phenotypic and functional impact allows deciphering the molecular mechanisms that govern the biogenesis and exocytosis of the MC SGs and identifying the regulators involved. Thereby, further insights into the cellular mechanisms that account for MCs function in health and disease should be provided.

The goal of the present&#160;protocol was to develop a method that will allow functional genomic analyses of mast cell secretion. The protocol is based on quantitative assessment of the release of a fluorescent reporter gene cotrasfected with the gene of interest and real time&#160;analyses of the secretory granule&#39;s morphology.

التحقيق ماست الخلية الإفرازية حبيبات. من البناء الحيوي لالإيماس

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

والمنمنمة غليكان ميكروأري الفحص لتقييم الطمع وخصوصية الأنفلونزا من الفيروسات Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate immune system responses during the course of infection. Though methods have been developed to successfully purify and produce many of these important virulence factors, there are still many bacterial toxins whose unique structure or extensive post-translational modifications make them difficult to purify and study in in vitro systems. Furthermore, even when pure toxin can be obtained, there are many challenges associated with studying the specific effects of a toxin under relevant physiological conditions. Most in vitro cell culture models designed to assess the effects of secreted bacterial toxins on host cells involve incubating host cells with a one-time dose of toxin. Such methods poorly approximate what host cells actually experience during an infection, where toxin is continually produced by bacterial cells and allowed to accumulate gradually during the course of infection. This protocol describes the design of a permeable membrane insert-based bacterial infection system to study the effects of Streptolysin S, a potent toxin produced by Group A Streptococcus, on human epithelial keratinocytes. This system more closely mimics the natural physiological environment during an infection than methods where pure toxin or bacterial supernatants are directly applied to host cells. Importantly, this method also eliminates the bias of host responses that are due to direct contact between the bacteria and host cells. This system has been utilized to effectively assess the effects of Streptolysin S (SLS) on host membrane integrity, cellular viability, and cellular signaling responses. This technique can be readily applied to the study of other secreted virulence factors on a variety of mammalian host cell types to investigate the specific role of a secreted bacterial factor during the course of infection.

Here, a method using a permeable membrane insert-based infection system to study the effects of Streptolysin S, a secreted toxin produced by Group A Streptococcus, on keratinocytes is described. This system can be readily applied to the study of other secreted bacterial proteins on various host cell types during infection.

تنفيذ نظام العدوى أساس إدراج-نافذ غشاء لدراسة آثار يفرز البكتيرية السموم على خلايا المضيف الثدييات

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

تدفق تحليل Cytometric من متجهة الجسيمات بيت ت 1 مسببات الحساسية في PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

تصور آثار البلغم للتنمية بيوفيلم باستخدام نموذج غرف ساترة

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

مضان القائم على النورامينيداز تثبيط الفحص لتقييم مدى حساسية فيروسات الأنفلونزا إلى والنورامينيداز المانع فئة من الأدوية المضادة للفيروسات

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Effects of Exposure of Formaldehyde to a Rat Model of Atopic Dermatitis Induced by Neonatal Capsaicin Treatment

Atopic dermatitis is chronically relapsing pruritic eczema and prevails around the world especially in developed countries. Complex interactions between genetic and environmental factors are known to play an important role in the pathophysiology of atopic dermatitis. However, we still lack a detailed picture of the pathogenesis of this disease. Thus, it is of importance to develop appropriate animal models for elucidating the progression of atopic dermatitis. Moreover, investigating the effect of environmental factors such as air pollutants on atopic dermatitis expands understanding of the disease. Here, we describe a method for inducing atopic dermatitis in rats with neonatal capsaicin treatment and a protocol for exposure of a constant concentration of formaldehyde to rats to reveal effects on the development of atopic dermatitis in infantile and adolescent periods. These protocols have been successfully applied to several experiments and can be used for other substances.

We describe here methods for neonatal capsaicin treatment to induce atopic dermatitis in rats and exposure of vaporized formaldehyde to investigate the effects of formaldehyde inhalation on atopic dermatitis.

آثار تعرض فورمالدهايد لنموذج الفئران الاستشرائية الناجمة عن معاملة الأطفال حديثي الولادة كبخاخات

Atopic dermatitis is chronically relapsing pruritic eczema and prevails around the world especially in developed countries. Complex interactions between ...