LMW und RHK werden von der Graduate School of Biomedical UMaine Science and Engineering (GSBSE) unterstützt; RHK wurde auch von der Maine Agricultural Experiment Station &amp; Wälder unterstützt. Zusätzliche Mittel wurde von der National Institute of General Medical Sciences (NIH P20-GM103423), die Maine Agricultural Experiment Station &amp; Wald (Grant Number ME08004-10, JAG), der University of Maine ADVANCE Rising Tide-Center (NSF Grant # 1008498) zur Verfügung gestellt und ein Forschungs-Starter Grant Pharmakologie / Toxikologie vom PhRMA Stiftung (JAG). Wir danken Drs.. David Holowka und Barbara Baird für das Antigen und Zellen. Wir sind dankbar, dass Hina Hashmi, Alejandro Velez und Andrew Abovian für die Hilfe bei Ausrüstung und Aufträge. Dies ist Maine Agricultural Experiment Station &amp; Wälder Veröffentlichung Nummer 3311.

Im Jahr 2004 entwickelte Naal et al. 1 ein Mastzellen Biosensor für das Hochdurchsatz-Tests Degranulation. Es ist ein robustes Assay, dass wir für unsere TCS Studien angepasst und detailliert in diesem Video. Vor der Naal et al. 1-Test, hatte Mastzelldegranulation routinemäßig über β-Hexosaminidase 59-61 beurteilen, aber diese frühen Verfahren verwendet Fluorometern in denen eine Probe zu einer Zeit gelesen wurde. Wichtig ist, Naal et al. gegründet direkte Übereinstimmung ...

Mastzellen sind sehr Immuneffektorzellen, die als Schlüssel dienen Mediatoren bei Asthma, Allergien, Parasiten Verteidigung und Krebsentstehung 13-16 granuliert. Sie in fast jedem vaskularisierten Gewebe 15 wohnen, wo sie sicher speichern allergischen und entzündlichen Mediatoren in zytoplasmatischen Granula bis aktiviert degranulieren. Degranulation der Exozytose von Membran-gebundenen Granulaten, was zur Freisetzung pharmakologisch aktiver Mediatoren, wie Histamin, Tryptase, Leukotriene und 15 ergibt. Dieses Verfahren führt bei der Initiierung von Typ I Überempfindlichkeitsreaktionen, die entscheidend bei der Montage Verteidigung gegen Parasiten sowie Initiierung Allergiker, Asthmatiker und krebserregend sind 15 Antworten. Mastzellen und Basophilen auszudrücken Fc &amp;egr; RI-Rezeptoren, die mit hoher Affinität Rezeptoren für Immunglobulin E (IgE) 17. Die Exposition gegenüber einem Allergen oder Antigen verursacht Aggregation mehrerer IgE-Rezeptoren gebundenen Fc &amp;egr; RI 17, und es ist diese so genannte &quot;Vernetzung&quot; von IgE-gebundenen Fc-Rezeptoren, die die Degranulation einleitet: eine Kaskade von Tyrosinphosphorylierung Ereignisse, die Aktivierung von Phospholipase C, Austausch von Calcium aus internen Speichern und Einstrom von Calcium in die Zelle 18. Das Calcium-Einstrom ist für Degranulation, und ferner Signale Granulat Fusion mit der Membran vor verursacht Granulat Exozytose 15. Experimentell kann ein Calcium-Ionophor zur Haltestelle Calcium direkt über die Zellmembran 19, die im wesentlichen umgeht alle Signaltransduktion Schritte vor der Calcium-Einstrom Schritt 20 verwendet werden, die die Identifizierung eines Weges vorbei durch einen Giftstoff als vor oder hinter Calcium-Signalgebung 20. Degranulation können schnell und effektiv durch die Überwachung der Freisetzung von β-Hexosaminidase in Zellüberstand, die linear aus dem Granulat neben Histamin freigesetzt 6 gemessen werden, aber ichs viel leichter zu detektieren unter Verwendung eines einfachen Enzym-Substrat-Reaktion und eines Mikroplatten-Lesegeräts zum Testen des fluoreszierenden Produkts. Diese Mikroplattenassay, wie im Protokoll Abschnitt beschrieben, ist auf einem robusten Verfahren ursprünglich von Naal et al. 1, die die Spaltung des fluorogenen Substrates 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid quantifiziert durch β-Basis Hexosaminidase. Wir haben den Test zu Test Wirkungen von Arzneimitteln und Giftstoffen Änderungsdatum, mit Triclosan hier hervorgehoben. Diese Methode zuverlässig quantifiziert Degranulation, ist eine kostengünstige Alternative zu z. B. Durchflusszytometrie basierende Nachweisverfahren 21 und hat das Potenzial, sich gut eignen, um High-Throughput-Screening von einer Vielzahl von Anti-Allergie-Medikamente sowie immunotoxische oder allergene Chemikalien. Dieser letzte Punkt ist besonders wichtig im Hinblick auf die 2007 National Research Council Bericht &quot;Toxicity Testing in das 21. Jahrhundert: Eine Vision und eine Stratgie &quot;( <a href="http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970">http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970</a> ), die für die Entwicklung von High-Throughput-toxikologischen Tests, die Zellkultur zu nutzen, um den kostspieligen Einsatz von traditionellen Labortieren wie Mäusen reduzieren befürwortet. Die Degranulation Protokoll Naal et al. 1 entwickelt und modifiziert von uns 2, nutzt die RBL-2H3-Zelllinie, die ein gut akzeptiertes Modell homolog zu menschlichen Schleimhaut Mastzellen oder Basophilen 3-5 ist. (Methoden zur Kultivierung von RBL-2H3-Zellen werden in Hutchinson et al beschrieben. 22). Dieser Test könnte wahrscheinlich auf einem angeschlossenen Mastzellen Typ angepasst werden. Triclosan (TCS) ist ein Breitspektrum-Antibiotika, die für mehr als 30 Jahren in Krankenhäusern, Körperpflegeprodukte und Konsumgüter 23,24 verwendet. Die Wirkungsweise für die antimikrobielle Eigenschaft TCS ist die Hemmung der Fettsäure-Biosynthese, wahrscheinlich durch Hemmung der Enoyl-AcylCarrier-Protein-Reduktase 25,26. Es wird weltweit in einer breiten Palette von Konsumgütern wie Duschgel, Handcreme, Zahnpasta, Mundwasser, und in der Hand Seifen in Konzentrationen bis zu 0,3% oder 10 mM 24. Der flächendeckende Einsatz von TCS hat in nachweisbaren Mengen beim Menschen 27-29 und in Flüssen und Bächen 30 geführt. Eine Studie von Allmyr et al. Gezeigt, dass 27 TCS und seinen Metaboliten, die sowohl im Plasma und Milch von stillenden Müttern sind. Wichtig ist, dass TCS leicht in die Haut absorbiert 31-37. Queckenberg et al. Gefunden 37 ~ 10% Absorption eines ~ 70 mM TCS-Creme in die menschliche Haut innerhalb von 12 Stunden, was zu erheblichen Konzentration in der Haut, wo Mastzellen befinden. TCS wurde klinisch für die menschliche allergische Hautkrankheit 7-11 verwalten gezeigt, aber der Mechanismus, durch den TCS lindert allergische Hauterkrankungen ist unbekannt 38. Mit dem fluoreszierenden Mikroplattenassay detailed in diesem Video haben wir vor kurzem gezeigt, dass TCS in Konzentrationen so niedrig wie 2 um, deutlich dämpft Mastzellfunktion und Degranulation und bietet eine mögliche Erklärung für diesen klinischen Daten 2. Neben der Bereitstellung eine Erklärung für diesen klinischen Daten, unsere Erkenntnisse in Palmer et al. 2 legen nahe, dass TCS Signalmoleküle stromabwärts von Calcium-Einstrom zielt. Aufgrund der Bedeutung von Calcium-Signalisierung in vielen immunologischen und andere biologische Prozesse könnten TCS potentiell nachteilige Auswirkungen auf eine Vielzahl von biologischen Prozessen erforderlich. In der Tat zeigte Udoji et al., Dass 39 TCS menschliche natürliche Killerzellen lytische Aktivität unterdrückt, ein weiterer wichtiger angeborenen Immunfunktion. Jenseits sein Potenzial als therapeutische Hilfe bei allergischen Hauterkrankungen (oder umgekehrt, als immunotoxicant) kann TCS auch eine endokrine Disruptoren 40-49 sein. So ein klares Verfahren, wie diese Chemikalie in Lösung herzustellen is von Interesse Toxikologen. Da TCS ist ein kleines hydrophobes Molekül werden organische Fahrzeugen häufig verwendet, um es in Wasser löslich. In den meisten Toxizitätsstudien, wo TCS getestet wurde, wurde Herstellung Auflösung in Wasser mit Hilfe eines organischen Lösungsmittels, wie Ethanol, Aceton oder Öl 2,50,51 beteiligt. Doch oftmals diese Lösungsmittel sind biologisch aktiv selbst erschweren dadurch Interpretation des Tests chemische Daten 51. In der Tat, nach Rufli et al. 52 und andere 53, empfiehlt es sich, Testlösungen für aquatische Toxizität Experimente werden unter Verwendung physikalischer Methoden auf chemische Verfahren, durch das Potenzial von chemischen Lösungsmitteln Toxizität Artefakte zu erstellen. Wir haben zuvor gezeigt, dass TCS in 0,24% Ethanol / Wasser (v / v) gelöst und 30 min mit Ultraschall behandelt dämpft RBL Mastzelldegranulation 2. Ethanol bei höheren Konzentrationen als 0,24% wurde gezeigt, dass Mastzellen Degra dämpfennulation 54,55-Beispiele für die möglicherweise verwirren Auswirkungen von organischen Lösungsmitteln auf Toxizität. Es ist nicht nur wichtig, um die Wirkung von Lösungsmitteln auf den Organismus oder Zellen zur Untersuchung verwendeten betrachten, sondern es ist auch wichtig, um die Wirkung von Lösungsmitteln aus der Prüfsubstanz selbst überwachen. Zum Beispiel Skaare et al. Fanden heraus, dass 51 Auflösen TCS in Polyethylenglykol (häufig in Zahnpasten und Mundwasser gefunden) geschwächt anti-bakterielle und anti-Plaque-Effekte bei gesunden weiblichen Frauen, während in Auflösung Öle verursacht einen vollständigen Verlust der Funktion. Daher ist die Fähigkeit von verschiedenen Lösungsmitteln zu modulieren Giftstoff und Arzneimittel, einschließlich TCS sollte Effekte in Assays berücksichtigt werden. Verwendung von Ölen oder Geschmack Additive können mit den Auswirkungen der TCS in verschiedenen Produkten 50,51 stören. In dem Bemühen, die Notwendigkeit der Verwendung organischer Lösungsmittel zu beseitigen, verbesserten wir auf unsere Methode zum Lösen TCS 2 durch den Wegfall der Verwendung eines organischen Solentlüften. In der vorliegenden Protokoll, wir lösen TCS Granulat direkt in wässrigem Puffer mit Wärme (≤ 50 ° C), und überprüfen Sie dann die Konzentration dieser TCS Lager durch UV-Vis-Spektroskopie. Diese Verbesserungen sind möglich, weil TCS löslich ist in Wasser bis zu 40 um ( <a href="http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf">http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf</a> ) und es wurde gezeigt, um den Abbau zu widerstehen, wenn auf 50 ° C (erhitzt <a href="http://oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf">http:// / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf</a> ) 56,57. Wir haben auch den zusätzlichen Vorteil der UV-Vis-Spektroskopie, wie TCS ist auch bekannt, bei 280 nm stark absorbieren 58 mit einem molaren Extinktionskoeffizienten von 4200 L / mol / cm 12. Dieses Protokoll bietet eine einfache, aber effektive Möglichkeit, TCS Granulat in einen Puffer zu lösen, ohne die Hilfe eines organischen Lösungsmittels, einschließlich Low-Cost und schnelle ÜberprüfungKonzentration, beschreibt und eine leistungsfähige fluoreszierenden Mikroplattenassay zur Überwachung chemischer Effekte auf Mastzelldegranulation.

a microplate assay to assess chemical effects on rbl-2h3 mast cell degranulation: effects of triclosan without use of an organic solvent

Mastzellen spielen eine wichtige Rolle bei allergischen Erkrankungen und Immunabwehr gegen Parasiten. Einmal aktiviert (z. B. durch ein Allergen), sie degranulieren, ein Prozess, dass die Ergebnisse in der Exozytose von allergischen Mediatoren. Modulation von Mastzelldegranulation durch Medikamente und Giftstoffe können positive oder negative Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit. Mastzellfunktion wurde im Detail unter Verwendung von Ratten-Basophilenleukämie Mastzellen (RBL-2H3), eine allgemein anerkannte Modell der menschlichen Schleimhaut Mastzellen 3-5 seziert. Mastzellen Granulat-Komponente und der allergischen Mediator β-Hexosaminidase, der linear zusammen mit Histamin aus Mastzellen 6 freigegeben, leicht und zuverlässig durch die Reaktion mit einem fluorogenen Substrat gemessen werden, was messbar Fluoreszenzintensität in einem Mikroplatten-Assay, der zugänglich ist, Hochdurchsatz-Studien 1. Zitat von Naal et al. 1 veröffentlicht, haben wir diese Degranulation Assay für das Screening o angepasstf Drogen und Giften und demonstrieren ihren Einsatz hier. Triclosan ist ein Breitspektrum-Antibiotikum, die in vielen Verbraucherprodukten ist und sich als ein therapeutisches Hilfsmittel in menschlichen allergischen Hauterkrankungen 7-11, obwohl der Mechanismus für diesen Effekt ist nicht bekannt. Hier zeigen wir einen Assay für die Wirkung von Triclosan auf Mastzellen Degranulation. Wir haben kürzlich gezeigt, dass Triclosan wirkt sich stark auf Mastzellfunktion 2. In dem Bemühen, den Einsatz eines organischen Lösungsmittels zu vermeiden, wird Triclosan direkt in wässrigem Puffer mit Wärme und unter Rühren gelöst, und die daraus resultierende Konzentration die Bestätigung mit UV-Vis-Spektroskopie (mit ε 280 = 4,200 L / M / cm) 12. Dieses Protokoll hat das Potential, mit einer Vielzahl von Chemikalien verwendet werden, um ihre Wirkung auf Mastzellen Degranulation bestimmt, und im weiteren Sinne, deren allergenes Potential.

Beim Erwärmen auf 50 ° C für 90 min, erzeugt das UV-Vis-Absorptionsspektrum für TCS eine starke, glatte Kurve zwischen ~ 260 und 300 nm, mit einem Peak bei 280 nm, wie in Abbildung 1 gezeigt. UV-Vis-Spektroskopie ist daher ein wichtiges Instrument, das verwendet wird, um die Konzentration berechnet werden kann, da die veröffentlichte molaren Absorptionskoeffizienten bei 280 nm 4,200 l / mol / cm 12. Wir haben festgestellt, dass TCS nicht aus der Lösung während des Zeitrahmens der gesamten Degranulation Exp...

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A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Mastzelldegranulation, die Freisetzung von allergischen Mediatoren ist in Allergie, Asthma und Parasiten Verteidigung wichtig. Hier haben wir Techniken 1 für die Beurteilung Auswirkungen von Drogen und Giften auf Degranulation demonstrieren, Methodik kürzlich genutzt, um die leistungsfähige hemmende Wirkung von antibakteriellen Wirkstoff Triclosan 2 aufweisen.

Ein Mikroplatten Assay Chemical Auswirkungen auf die RBL-2H3 Mastzelldegranulation bewerten: Effekte von Triclosan ohne Verwendung eines organischen Lösungsmittels

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

39.8K Aufrufe.  University of Maine, Orono.  Mastzelldegranulation, die Freisetzung von allergischen Mediatoren ist in Allergie, Asthma und Parasiten Verteidigung wichtig. Hier haben wir Techniken 1 für die Beurteilung Auswirkungen von Drogen und Giften auf Degranulation demonstrieren, Methodik kürzlich genutzt, um die leistungsfähige hemmende Wirkung von antibakteriellen Wirkstoff Triclosan 2 aufweisen. 

Serie: A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

Dilated cardiomyopathy (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1. Although genetic disposition and exposition to toxic substances are known causes for this disease in about one third of the patients, the origin of DCM remains largely unclear. In a substantial number of these patients, autoantibodies against cardiac epitopes have been detected and are suspected to play a pivotal role in the onset and progression of the disease2,3. The importance of cardiac autoantibodies is underlined by a hemodynamic improvement observed in DCM patients after elimination of autoantibodies by immunoadsorption3-5. A variety of specific antigens have already been identified2,3 and antibodies against these targets may be detected by immunoassays. However, these assays cannot discriminate between stimulating (and therefore functionally effective) and blocking autoantibodies. There is increasing evidence that this distinction is crucial6,7. It can also be assumed that the targets for a number of cardiotropic antibodies are still unidentified and therefore cannot be detected by immunoassays. Therefore, we established a method for the detection of functionally active cardiotropic antibodies, independent of their respective antigen. The background for the method is the high homology usually observed for functional regions of cardiac proteins in between mammals8,9. This suggests that cardiac antibodies directed against human antigens will cross-react with non-human target cells, which allows testing of IgG from DCM patients on adult rat cardiomyocytes. Our method consists of 3 steps: first, IgG is isolated from patient plasma using sepharose coupled anti-IgG antibodies obtained from immunoadsorption columns (PlasmaSelect, Teterow, Germany). Second, adult cardiomyocytes are isolated by collagenase perfusion in a Langendorff perfusion apparatus using a protocol modified from previous works10,11. The obtained cardiomyocytes are attached to laminin-coated chambered coverglasses and stained with Fura-2, a calcium-selective fluorescent dye which can be easily brought into the cell to observe intracellular calcium (Ca2+) contents12. In the last step, the effect of patient IgG on the cell shortening and Ca2+ transients of field stimulated cardiomyocytes is monitored online using a commercial myocyte calcium and contractility monitoring system (IonOptix, Milton, MA, USA) connected to a standard inverse fluorescent microscope.

The presented method offers a way to detect functional effective cardiotropic autoantibodies in the plasma of patients with dilated cardiomyopathy, irrespective of the specific antigen, by analysing the impact of isolated patient immunoglobulin on cellular shortening and intracellular calcium transients in isolated rat cardiomyocytes.

Die Messung der Antikörper Auswirkungen auf zelluläre Funktion von isolierten Kardiomyozyten

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

Untersuchung der Effekte von Probiotika auf Pneumokokken-Kolonisation Mit ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Einhaltung Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

Analyse der Auswirkungen von Stromazellen an der Rekrutierung von Leukozyten von Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly synthesized allergic, inflammatory and immunoregulatory mediators. MCs&#8217; mediators affect multiple tissues and organs culminating in allergic and immune responses. The synthesis, storage and release of the MC mediators are highly regulated. The pre-formed mediators are packed in cytoplasmic secretory granules&#160;(SG) that fuse with the plasma membrane and release their content by regulated exocytosis. We present a protocol, based on the co-expression of a gene of interest with a reporter gene that is targeted to the SGs and is released in a regulated fashion alongside the endogenous SG mediators. The protocol enables high resolution four dimensional confocal analyses of the MC SGs and monitoring their timeline from biogenesis to triggered exocytosis. Thus, using this protocol for screening genes of interest for their phenotypic and functional impact allows deciphering the molecular mechanisms that govern the biogenesis and exocytosis of the MC SGs and identifying the regulators involved. Thereby, further insights into the cellular mechanisms that account for MCs function in health and disease should be provided.

The goal of the present&#160;protocol was to develop a method that will allow functional genomic analyses of mast cell secretion. The protocol is based on quantitative assessment of the release of a fluorescent reporter gene cotrasfected with the gene of interest and real time&#160;analyses of the secretory granule&#39;s morphology.

Untersuchung Mast Cell Sekretgranula; von Biosynthese zu Exocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

Ein miniaturisiertes Glycan Microarray-Test zur Beurteilung der Avidität und Spezifität von Influenza-A-Virus Hämagglutininarten

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate immune system responses during the course of infection. Though methods have been developed to successfully purify and produce many of these important virulence factors, there are still many bacterial toxins whose unique structure or extensive post-translational modifications make them difficult to purify and study in in vitro systems. Furthermore, even when pure toxin can be obtained, there are many challenges associated with studying the specific effects of a toxin under relevant physiological conditions. Most in vitro cell culture models designed to assess the effects of secreted bacterial toxins on host cells involve incubating host cells with a one-time dose of toxin. Such methods poorly approximate what host cells actually experience during an infection, where toxin is continually produced by bacterial cells and allowed to accumulate gradually during the course of infection. This protocol describes the design of a permeable membrane insert-based bacterial infection system to study the effects of Streptolysin S, a potent toxin produced by Group A Streptococcus, on human epithelial keratinocytes. This system more closely mimics the natural physiological environment during an infection than methods where pure toxin or bacterial supernatants are directly applied to host cells. Importantly, this method also eliminates the bias of host responses that are due to direct contact between the bacteria and host cells. This system has been utilized to effectively assess the effects of Streptolysin S (SLS) on host membrane integrity, cellular viability, and cellular signaling responses. This technique can be readily applied to the study of other secreted virulence factors on a variety of mammalian host cell types to investigate the specific role of a secreted bacterial factor during the course of infection.

Here, a method using a permeable membrane insert-based infection system to study the effects of Streptolysin S, a secreted toxin produced by Group A Streptococcus, on keratinocytes is described. This system can be readily applied to the study of other secreted bacterial proteins on various host cell types during infection.

Implementierung eines Systems durchlässige Membran Insert-basierten Infektion der Auswirkungen von sekretierten bakteriellen Toxins zur Untersuchung auf Säugetierwirtszellen

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

Durchflusszytometrische Analyse von partikelgebundenen Bet v 1 Allergens in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Visualisierung der Auswirkungen von Sputum auf Biofilm-Entwicklung eines Modells mit Kammerdeckgläser

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Fluoreszenz-basierte Neuraminidase-Inhibitionsassay die Empfänglichkeit der Influenza-Viren an die Neuraminidase-Inhibitor-Klasse von Anti-Virus zu beurteilen

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Effects of Exposure of Formaldehyde to a Rat Model of Atopic Dermatitis Induced by Neonatal Capsaicin Treatment

Atopic dermatitis is chronically relapsing pruritic eczema and prevails around the world especially in developed countries. Complex interactions between genetic and environmental factors are known to play an important role in the pathophysiology of atopic dermatitis. However, we still lack a detailed picture of the pathogenesis of this disease. Thus, it is of importance to develop appropriate animal models for elucidating the progression of atopic dermatitis. Moreover, investigating the effect of environmental factors such as air pollutants on atopic dermatitis expands understanding of the disease. Here, we describe a method for inducing atopic dermatitis in rats with neonatal capsaicin treatment and a protocol for exposure of a constant concentration of formaldehyde to rats to reveal effects on the development of atopic dermatitis in infantile and adolescent periods. These protocols have been successfully applied to several experiments and can be used for other substances.

We describe here methods for neonatal capsaicin treatment to induce atopic dermatitis in rats and exposure of vaporized formaldehyde to investigate the effects of formaldehyde inhalation on atopic dermatitis.

Auswirkungen der Exposition von Formaldehyd zu einem Rattenmodell der Neurodermitis durch Behandlung der Neugeborenen Capsaicin induziert

Atopic dermatitis is chronically relapsing pruritic eczema and prevails around the world especially in developed countries. Complex interactions between ...