LMW e RHK sono supportati dalla Scuola di Dottorato di Scienze Biomediche e Ingegneria (GSBSE) di UMaine; RHK è stato supportato anche dal Maine Agricultural Experiment Station &amp; Forest. Ulteriori finanziamenti è stato fornito dal National Institute of General Medical Sciences (NIH P20-GM103423), il Maine Agricultural Experiment Station &amp; Foresta (Grant Numero ME08004-10, JAG), l&#39;Università del Maine ADVANCE Rising Tide Center (NSF concedere # 1.008.498) , e una ricerca Starter di Grant in Farmacologia / Tossicologia dalla fondazione PhRMA (JAG). Ringraziamo Drs. David Holowka e Barbara Baird per l&#39;antigene e cellule. Siamo grati a Hina Hashmi, Alejandro Velez, e Andrew Abovian aiuto con attrezzature e gli ordini. Questo è il Maine Agricultural Experiment Station &amp; Forest numero di pubblicazione 3311.

Nel 2004, Naal et al. 1 ha sviluppato un biosensore mastociti per la prova high-throughput di degranulazione. Si tratta di un test affidabile che abbiamo adattato per i nostri studi TCS e dettagliato in questo video. Prima della Naal et al. 1 assay, degranulazione mastocitaria era stata regolarmente valutata mediante β-hexosaminidase 59-61, ma questi primi metodi utilizzati fluorimetri in cui un campione è stata letta a volta. È importante sottolineare che, Naal et al. stabilito...

I mastociti sono altamente granulato cellule immunitarie effettrici che fungono da mediatori chiave in asma, allergie, parassiti della difesa e della carcinogenesi 13-16. Essi risiedono in quasi ogni tessuto vascolarizzato 15, dove archiviare in modo sicuro i mediatori infiammatori e allergici in granuli citoplasmatici fino attivato per degranulano. Degranulazione è l&#39;esocitosi di granuli legati alla membrana, che provoca il rilascio di mediatori farmacologicamente attivi come istamina, triptasi e leucotrieni 15. Questo processo determina l&#39;avvio di tipo I reazioni di ipersensibilità che sono fondamentali per la difesa contro i parassiti di montaggio, nonché avviare le risposte allergiche, asma, e cancerogeni 15. Mastociti e basofili esprimono recettori FcεRI, i recettori ad alta affinità per le immunoglobuline E (IgE) 17. Esposizione ad un allergene o antigene provoca aggregazione di più IgE-bound recettori FcεRI 17, ed è questa so-chiamato &quot;reticolazione&quot; di IgE-bound recettori Fc che avvia il processo di degranulazione: una cascata di eventi tirosin-fosforilazione, l&#39;attivazione della fosfolipasi C, passaggio di calcio dai depositi interni e afflusso di calcio nelle cellule 18. Questo flusso di calcio è necessario per la degranulazione, e, inoltre, segnala granulo fusione con la membrana prima di causare granuli esocitosi 15. Sperimentalmente, un calcio ionoforo può essere usato per il calcio navetta direttamente attraverso la membrana cellulare 19, che bypassa essenzialmente tutto trasduzione del segnale passi prima della fase di afflusso di calcio 20, consentendo l&#39;identificazione di un bersaglio percorso da una sostanza tossica come a monte oa valle dei segnalazione di calcio 20. Degranulazione può essere misurata rapido ed efficace monitorando il rilascio di β-hexosaminidase nel supernatante cellulare, che viene rilasciata linearmente dai granuli accanto istamina 6, ma is molto più facile da rilevare con una semplice reazione enzima-substrato e di un lettore di micropiastre per saggiare il prodotto fluorescente. Questo saggio micropiastre, come dettagliato nella sezione del protocollo, si basa su un metodo robusto originariamente sviluppato da Naal et al. 1, che quantifica il clivaggio del substrato fluorogenico 4-metilumbelliferil-N-acetil-β-D-glucosaminide da β- hexosaminidase. Abbiamo modificato il dosaggio per gli effetti di test di farmaci e sostanze tossiche, con triclosan evidenziato qui. Questo metodo quantifica affidabile degranulazione, è un&#39;alternativa economica a, per esempio, il flusso di metodi di rilevamento mediante citometria a base 21, e ha il potenziale per prestarsi bene a high-throughput screening di una vasta gamma di farmaci anti-allergia, così come immunotossico o prodotti chimici allergizzanti. Quest&#39;ultimo punto è particolarmente importante alla luce del 2007 National Research relazione del Consiglio &quot;Test di tossicità nel 21 ° secolo: una visione e di una Strattegia &quot;( <a href="http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970">http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970</a> ), che sostiene per lo sviluppo di test tossicologici high-throughput che utilizzano colture cellulari di ridurre l&#39;uso di animali da laboratorio costoso tradizionali come topi. Il protocollo sviluppato da degranulazione Naal et al. 1 e modificato da noi 2, utilizza la linea cellulare RBL-2H3, che è un modello ben accettato omologa ai mastociti mucosali umani o basofili 3-5. (Metodi per la coltura di cellule RBL-2H3 sono dettagliate nel Hutchinson et al. 22). Questo dosaggio può probabilmente essere adattata a qualsiasi tipo mastociti allegata. Triclosan (TCS) è un antimicrobico ad ampio spettro che è stato usato per più di 30 anni negli ospedali, per la cura personale e beni di consumo 23,24. La modalità di azione antimicrobica per la caratteristica di TCS è l&#39;inibizione della biosintesi di acidi grassi, probabilmente inibendo enoil-acilproteina carrier reduttasi 25,26. Si trova in tutto il mondo in una vasta gamma di prodotti di consumo come gel doccia, lozione per le mani, dentifricio, collutorio, e in saponi a concentrazioni fino allo 0,3% o 10 mm 24. L&#39;impiego diffuso di TCS ha portato a livelli rilevabili nell&#39;uomo 27-29 e nei corsi d&#39;acqua 30. Uno studio fatto da Allmyr et al. Ha dimostrato che 27 TCS e dei suoi metaboliti sono presenti sia nel plasma e latte di madri che allattano. È importante sottolineare che, TCS è facilmente assorbito nella pelle 31-37. Queckenberg et al. Trovato 37 ~ 10% l&#39;assorbimento di un ~ 70 mm TCS crema nella pelle umana entro 12 ore, con conseguente significativa concentrazione nella pelle, dove i mastociti risiedono. TCS è stato dimostrato clinicamente per la gestione della malattia allergica della pelle umana 7-11, ma il meccanismo con cui TCS allevia le malattie allergiche della pelle è rimasta sconosciuta 38. Usando la fluorescenza per micropiastre saggio detailed in questo video, abbiamo recentemente dimostrato che TCS, a concentrazioni a partire da 2 micron, attenua significativamente la funzione dei mastociti e degranulazione, fornendo una potenziale spiegazione per questi dati clinici 2. Oltre a fornire una spiegazione per questi dati clinici, i nostri risultati in Palmer et al. 2 suggeriscono che TCS rivolge molecole di segnalazione a valle del flusso di calcio. A causa dell&#39;importanza del calcio segnalazione in molti immunologico e altri processi biologici, TCS potrebbe potenzialmente avere effetti negativi su un&#39;ampia varietà di processi biologici necessari. Infatti, Udoji et al. Ha dimostrato che 39 TCS sopprime cellula attività umana natural killer litico, un altro importante funzione immunitaria innata. Oltre al suo potenziale come un aiuto terapeutico nella malattia allergica della pelle (o, al contrario, come un immunotossico), TCS può anche essere un distruttore endocrino 40-49. Così, una procedura chiara su come preparare questa sostanza chimica in soluzione is di interesse per i tossicologi. Poiché TCS è una piccola molecola idrofobica, veicoli organici vengono spesso utilizzati per renderla più solubile in acqua. Nella maggior parte degli studi di tossicità in cui TCS è stato testato, preparato è coinvolto dissoluzione in acqua con l&#39;ausilio di un solvente organico quale etanolo, acetone, o olio 2,50,51. Tuttavia, spesso questi solventi sono biologicamente attivi stessi, complicando in tal modo l&#39;interpretazione della sostanza chimica di prova dei dati 51. In effetti, secondo Rufli et al. 52 e altri 53, si raccomanda che le soluzioni di prova per esperimenti di tossicità acquatica sono preparati utilizzando metodi fisici sopra metodi chimici, a causa del potenziale di solventi chimici per creare artefatti tossicità. Abbiamo precedentemente dimostrato che gli STC dissolto in 0,24% di etanolo / acqua (vol / vol) e sottoposto a sonicazione per 30 min smorza RBL degranulazione mastocitaria 2. Etanolo a concentrazioni superiori a 0,24% è stato indicato per smorzare degrado mastocitinulation 54,55-esempi degli effetti potenzialmente confondenti di solventi organici in studi di tossicità. Non solo è importante considerare l&#39;azione di solventi sull&#39;organismo o cellule utilizzate per lo studio, ma anche che è importante monitorare l&#39;effetto di un solvente la parte chimica prova stessa. Ad esempio, Skaare et al. 51 hanno trovato che la dissoluzione TCS in polietilene glicole (che si trovano comunemente nei dentifrici e colluttori) indebolito gli effetti anti-batteriche e anti-placca in donne sane durante dissoluzione in oli causato una perdita completa della funzione. Pertanto, la capacità di diversi solventi per modulare tossico e di droga, tra cui TCS, gli effetti devono essere considerati nella progettazione di test. Uso di oli o additivi aromatici può interferire con gli effetti di STC in vari prodotti 50,51. Nel tentativo di eliminare la necessità di utilizzare solventi organici, abbiamo migliorato il nostro metodo di dissoluzione TCS 2 eliminando l&#39;uso di un sol organicasfogare. Nel presente protocollo, ci sciogliamo TCS granuli direttamente in tampone acquoso con il calore (≤ 50 ° C), e quindi verificare la concentrazione di questo stock TCS con spettrofotometria UV-Vis. Questi miglioramenti sono possibili perché TCS è solubile in acqua fino a 40 pM ( <a href="http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf">http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf</a> ) e ha dimostrato di resistere alla degradazione quando viene riscaldata a 50 ° C ( <a href="http://oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf">http:/ / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf</a> ) 56,57. Abbiamo anche il vantaggio di spettrofotometria UV-Vis, come TCS inoltre è conosciuto per assorbire fortemente a 280 nm 58 con un coefficiente di estinzione molare di 4.200 L / mol / cm 12. Questo protocollo fornisce un modo semplice, ma efficace per dissolvere TCS granuli in un buffer senza l&#39;ausilio di un solvente organico, tra cui basso costo e rapida verificadi concentrazione, e descrive un potente saggio di micropiastre a fluorescenza per monitorare gli effetti chimici sulla degranulazione dei mastociti.

a microplate assay to assess chemical effects on rbl-2h3 mast cell degranulation: effects of triclosan without use of an organic solvent

I mastociti svolgono un ruolo importante nella malattia allergica e la difesa immunitaria contro i parassiti. Una volta attivato (ad esempio da un allergene), essi degranulano, un processo che comporta la esocitosi di mediatori allergici. Modulazione di degranulazione dei mastociti da farmaci e sostanze tossiche può avere effetti positivi o negativi sulla salute umana. Funzione mastociti è stato sezionato in dettaglio con l&#39;uso di ratto basofile mastociti leucemiche (RBL-2H3), un modello largamente accettato di mastociti mucosali umane 3-5. Mast componente cellulare dei granuli e il mediatore allergica β-hexosaminidase, che viene rilasciato linearmente in tandem con istamina dai mastociti 6, possono essere facilmente ed attendibilmente misurati tramite reazione con un substrato fluorogenico, cedendo misurabile intensità di fluorescenza in un saggio di micropiastra che è suscettibile di studi di high-throughput 1. Originariamente pubblicato da Naal et al. 1, abbiamo adattato questo dosaggio degranulazione per lo screening of farmaci e sostanze tossiche e dimostrare il suo uso qui. Triclosan è un agente ad ampio spettro antibatterico che è presente in molti prodotti di consumo ed è stato trovato per essere un aiuto terapeutico in malattie allergiche della pelle umana 7-11, anche se il meccanismo di questo effetto è sconosciuta. Qui mostriamo un saggio per l&#39;effetto del triclosan sulla degranulazione mastocitaria. Abbiamo recentemente dimostrato che il triclosan influenza fortemente la funzione delle cellule mast 2. Nel tentativo di evitare l&#39;impiego di un solvente organico, triclosan è disciolto direttamente in tampone acquoso con il calore e agitazione, e la concentrazione risultante viene confermata mediante spettrofotometria UV-Vis (usando 280 ε = 4,200 L / M / cm) 12. Questo protocollo ha il potenziale per essere usato con una varietà di prodotti chimici per determinare i loro effetti sulla degranulazione dei mastociti, e più in generale, il loro potenziale allergico.

Quando riscaldato a 50 ° C per 90 min, lo spettro di assorbanza UV-Vis per TCS produce un forte curva regolare tra ~ 260 e 300 nm, con un picco a 280 nm, come mostrato in Figura 1. Spettrofotometria UV-Vis è, quindi, un importante strumento che può essere utilizzata per calcolare la concentrazione, poiché il coefficiente di assorbimento molare pubblicato a 280 nm è 4,200 L / mol / cm 12. Abbiamo scoperto che TCS non cada dalla soluzione durante l&#39;arco di tempo l&#39;intero esperimento degranulazione, seg...

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A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Degranulazione dei mastociti, il rilascio di mediatori allergici, è importante per l&#39;allergia, l&#39;asma, e la difesa parassita. Qui mostriamo tecniche 1 per la valutazione degli effetti di farmaci e sostanze tossiche sulla degranulazione, metodologia recentemente utilizzato per esporre il potente effetto inibitorio di agente antibatterico triclosan 2.

Un saggio di micropiastre per valutare gli effetti chimici su RBL-2H3 Mast cellule Degranulazione: Effetti del Triclosan senza l&#39;uso di un solvente organico

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

39.8K Views.  University of Maine, Orono.  Degranulazione dei mastociti, il rilascio di mediatori allergici, è importante per l'allergia, l'asma, e la difesa parassita. Qui mostriamo tecniche 1 per la valutazione degli effetti di farmaci e sostanze tossiche sulla degranulazione, metodologia recentemente utilizzato per esporre il potente effetto inibitorio di agente antibatterico triclosan 2. 

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Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

Dilated cardiomyopathy (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1. Although genetic disposition and exposition to toxic substances are known causes for this disease in about one third of the patients, the origin of DCM remains largely unclear. In a substantial number of these patients, autoantibodies against cardiac epitopes have been detected and are suspected to play a pivotal role in the onset and progression of the disease2,3. The importance of cardiac autoantibodies is underlined by a hemodynamic improvement observed in DCM patients after elimination of autoantibodies by immunoadsorption3-5. A variety of specific antigens have already been identified2,3 and antibodies against these targets may be detected by immunoassays. However, these assays cannot discriminate between stimulating (and therefore functionally effective) and blocking autoantibodies. There is increasing evidence that this distinction is crucial6,7. It can also be assumed that the targets for a number of cardiotropic antibodies are still unidentified and therefore cannot be detected by immunoassays. Therefore, we established a method for the detection of functionally active cardiotropic antibodies, independent of their respective antigen. The background for the method is the high homology usually observed for functional regions of cardiac proteins in between mammals8,9. This suggests that cardiac antibodies directed against human antigens will cross-react with non-human target cells, which allows testing of IgG from DCM patients on adult rat cardiomyocytes. Our method consists of 3 steps: first, IgG is isolated from patient plasma using sepharose coupled anti-IgG antibodies obtained from immunoadsorption columns (PlasmaSelect, Teterow, Germany). Second, adult cardiomyocytes are isolated by collagenase perfusion in a Langendorff perfusion apparatus using a protocol modified from previous works10,11. The obtained cardiomyocytes are attached to laminin-coated chambered coverglasses and stained with Fura-2, a calcium-selective fluorescent dye which can be easily brought into the cell to observe intracellular calcium (Ca2+) contents12. In the last step, the effect of patient IgG on the cell shortening and Ca2+ transients of field stimulated cardiomyocytes is monitored online using a commercial myocyte calcium and contractility monitoring system (IonOptix, Milton, MA, USA) connected to a standard inverse fluorescent microscope.

The presented method offers a way to detect functional effective cardiotropic autoantibodies in the plasma of patients with dilated cardiomyopathy, irrespective of the specific antigen, by analysing the impact of isolated patient immunoglobulin on cellular shortening and intracellular calcium transients in isolated rat cardiomyocytes.

Misurazione degli effetti degli anticorpi sulla funzione cellulare di cardiomiociti isolati

Dilated cardiomyopathy  (DCM) is one of the main causes for heart failure in younger adults1.  Although genetic disposition and exposition to toxic ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

Indagare gli effetti dei probiotici sul pneumococcico colonizzazione utilizzo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Aderenza Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

Analizzando gli effetti delle cellule stromali per il reclutamento dei leucociti da portata

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly synthesized allergic, inflammatory and immunoregulatory mediators. MCs&#8217; mediators affect multiple tissues and organs culminating in allergic and immune responses. The synthesis, storage and release of the MC mediators are highly regulated. The pre-formed mediators are packed in cytoplasmic secretory granules&#160;(SG) that fuse with the plasma membrane and release their content by regulated exocytosis. We present a protocol, based on the co-expression of a gene of interest with a reporter gene that is targeted to the SGs and is released in a regulated fashion alongside the endogenous SG mediators. The protocol enables high resolution four dimensional confocal analyses of the MC SGs and monitoring their timeline from biogenesis to triggered exocytosis. Thus, using this protocol for screening genes of interest for their phenotypic and functional impact allows deciphering the molecular mechanisms that govern the biogenesis and exocytosis of the MC SGs and identifying the regulators involved. Thereby, further insights into the cellular mechanisms that account for MCs function in health and disease should be provided.

The goal of the present&#160;protocol was to develop a method that will allow functional genomic analyses of mast cell secretion. The protocol is based on quantitative assessment of the release of a fluorescent reporter gene cotrasfected with the gene of interest and real time&#160;analyses of the secretory granule&#39;s morphology.

Indagare Mast Cellula secretoria Granuli; dal Biosintesi a Esocitosi

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

Un miniaturizzato Glycan microarray test per la valutazione avidità e Specificità del virus influenzale A emoagglutinine

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate immune system responses during the course of infection. Though methods have been developed to successfully purify and produce many of these important virulence factors, there are still many bacterial toxins whose unique structure or extensive post-translational modifications make them difficult to purify and study in in vitro systems. Furthermore, even when pure toxin can be obtained, there are many challenges associated with studying the specific effects of a toxin under relevant physiological conditions. Most in vitro cell culture models designed to assess the effects of secreted bacterial toxins on host cells involve incubating host cells with a one-time dose of toxin. Such methods poorly approximate what host cells actually experience during an infection, where toxin is continually produced by bacterial cells and allowed to accumulate gradually during the course of infection. This protocol describes the design of a permeable membrane insert-based bacterial infection system to study the effects of Streptolysin S, a potent toxin produced by Group A Streptococcus, on human epithelial keratinocytes. This system more closely mimics the natural physiological environment during an infection than methods where pure toxin or bacterial supernatants are directly applied to host cells. Importantly, this method also eliminates the bias of host responses that are due to direct contact between the bacteria and host cells. This system has been utilized to effectively assess the effects of Streptolysin S (SLS) on host membrane integrity, cellular viability, and cellular signaling responses. This technique can be readily applied to the study of other secreted virulence factors on a variety of mammalian host cell types to investigate the specific role of a secreted bacterial factor during the course of infection.

Here, a method using a permeable membrane insert-based infection system to study the effects of Streptolysin S, a secreted toxin produced by Group A Streptococcus, on keratinocytes is described. This system can be readily applied to the study of other secreted bacterial proteins on various host cell types during infection.

Implementazione di un sistema di infezione permeabile membrana Insert-based per studiare gli effetti di secrete batteriche tossine su cellule ospiti

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

Flusso analisi di citometria di Particle-bound Bet v 1 allergene in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Visualizzare gli effetti di espettorato su biofilm di sviluppo utilizzando un modello Chambered coprioggetti

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Basato sulla fluorescenza neuraminidasi Inibizione Assay per valutare la suscettibilità dei virus influenzali di neuraminidasi Inhibitor classe di antivirali

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Effects of Exposure of Formaldehyde to a Rat Model of Atopic Dermatitis Induced by Neonatal Capsaicin Treatment

Atopic dermatitis is chronically relapsing pruritic eczema and prevails around the world especially in developed countries. Complex interactions between genetic and environmental factors are known to play an important role in the pathophysiology of atopic dermatitis. However, we still lack a detailed picture of the pathogenesis of this disease. Thus, it is of importance to develop appropriate animal models for elucidating the progression of atopic dermatitis. Moreover, investigating the effect of environmental factors such as air pollutants on atopic dermatitis expands understanding of the disease. Here, we describe a method for inducing atopic dermatitis in rats with neonatal capsaicin treatment and a protocol for exposure of a constant concentration of formaldehyde to rats to reveal effects on the development of atopic dermatitis in infantile and adolescent periods. These protocols have been successfully applied to several experiments and can be used for other substances.

We describe here methods for neonatal capsaicin treatment to induce atopic dermatitis in rats and exposure of vaporized formaldehyde to investigate the effects of formaldehyde inhalation on atopic dermatitis.

Effetti dell'esposizione di formaldeide per un modello del ratto della dermatite atopica indotta dal trattamento neonatale capsaicina

Atopic dermatitis is chronically relapsing pruritic eczema and prevails around the world especially in developed countries. Complex interactions between ...