وأيد هذا العمل من قبل وزارة UCSF الرعاية تخدير والمحيطة بالجراحة.

1. الطلاء والصيانة من الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد وتنمو الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الخاصة بك وفقا لتعليمات الشركات المصنعة الموردة. في هذا البروتوكول، ما نمت الخلايا في EGM-2 وسائل الإعلام MV (ونزا)، ويوصى بأن يتم تنفيذ جميع التجارب في غضون أسبوعين من ذوبان الجليد للحد من أي اختلاف بسبب عدد مرور. يتم تنفيذ تجاربنا مع HMVEC والرئة بين الممرات 4-9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 1: عندما تصل خلايا 80-90٪ confluency، يعرض للتريبسين و resuspend في 120،000 الخلايا لكل مل. لوحة 36،000 الخلايا (0.3 مل) لكل بئر في 48 جيدا، البوليسترين نسيج لوحة الثقافة (ق). وتشمل الآبار من HMVEC أنه لن يتم تحضين مع العدلات من أجل الحصول على قراءة مضان الخلفية. إلا باستخدام لوحات 48 بئر صممت خصيصا لفحوصات مضان، الصفوف أو الأعمدة بالتناوب سوف لحد من أي تلوث ضوء من الآبار المجاورة. ملاحظة: يمكن أن يكون ويلز قبل المغلفة مع البولي lysiNE، أو الكولاجين فبرونيكتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 2: إضافة وسائل الإعلام الجديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 3: بحلول مرحلة المجهر النقيض من ذلك، تأكيد الخلايا سليمة (أي &quot;حصوه&quot; مظهر والحطام الخلية قليلا)، وأنها هي متكدسة 100٪ (الشكل 1). إذا كانت الخلايا لم تكن 100٪ متموجة، تغيير وسائل الإعلام كل يوم حتى تصبح جاهزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة في الطبقات الوحيدة HMVEC مستعدون لتلقي العلاج، وغسل خلايا مرة واحدة مع محلول ملحي متوازن هانك (HBSS) وإضافة 0.3 مل من الطازجة وسائل الإعلام MV EGM-2 أو وسائل الإعلام التي تحتوي على ناهض التهابات إلى الآبار المناسب. في هذا البروتوكول تم علاج HMVEC والرئة مع TNFα [100 نانوغرام / مل] (PeproTech، نيو جيرسي) لمدة 3 ساعة منذ هذا هو المنشط وصفها جيدا من ECS 21. ملاحظة: من المستحسن أن لك الوقت تجربتك بحيث الخلايا HMVEC المنشط الخاص بك (الخطوة 4.1) وcalcein AM العدلات المسمى (الخطوة 3.5) جاهزة للاستخدام في نفس الوقت. كان يأخذنا ما يقرب من 2.5 ساعة إلى عزل وتسمية neutrophILS. </li></ol> 2. عزل العدلة باستخدام Polymorphprep <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل العدلات كما هو موضح سابقا 22، أو مع كثافة حل التدرج الجاهزة لعزل المحببة النوى من الدم الكامل. توظيف Polymorphprep بعد بروتوكول من قبل Nuzzi، وآخرون 2007 النتائج في غلة حوالي 2-3 × 10 6 العدلات لكل مل من الدم الكامل 23. ملاحظة: لتجنب الإفراط في تحلل كرات الدم الحمراء، والترسيب ديكستران لإزالة خلايا الدم الحمراء يمكن أداؤها قبل التدرج الكثافة الطرد المركزي 24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جلب كثافة حل التدرج Polymorphprep إلى RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع 30 مل من الدم الكامل من متطوعين من البشر صحي في وجود مضاد للتخثر مثل هيبارين، سيترات أو EDTA. يجب أن يتم استخدام الدم في غضون 2 ساعة، وأبقى بين 18-22 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طبقة 5 مل من الدم الكامل أكثر من 5 مل من محلول التدرج الكثافة في أنبوب 15 مل المخروطية ( <strong&gt; الشكل 2A). تجنب تغيير حجم الدم والحل التدرج الكثافة لأن ذلك قد تتغير الظروف الطرد المركزي لاحقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 30 دقيقة في 18-22 درجة مئوية. تأكد لتسريع ببطء صعودا وهبوطا في أجهزة الطرد المركزي (أي إيقاف الفرامل أجهزة الطرد المركزي)، وتحقيق التوازن بين أنابيب جيدا لمنع الاهتزازات للمساعدة في خفض تفعيل العدلات ومنع اختلاط طبقات. سوف مرات الطرد المركزي لفترة أطول أو قوة الطرد المركزي العالي يؤدي إلى طبقة الكريات البيض أقل من ذلك، والذي يحتوي على العدلات، إلى الهجرة إلى مزيد من الانخفاض نحو لخلايا الدم الحمراء مكعبات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح في البلازما والكريات البيض الفرقة العلوية التي تحتوي على PBMCs لمنع التلوث من الطبقة التي تحتوي العدلات (الشكل 2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الماصة المصلية 1-2 مل لإزالة الطبقة السفلى تحتوي على الكريات البيض العدلات. الجمع بين طبقات العدلة في 30 مل من برنامج تلفزيوني (من دون كا 2 + والمغنيسيوم 2 +) في 50 ملأنبوب مخروطي الشكل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبرزي حجم ما يصل الى 50 مل مع برنامج تلفزيوني (بدون كا 2 + والمغنيسيوم 2 +) وأجهزة الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 10 دقيقة في 18-22 درجة مئوية. </li></ol> ملاحظة: الخطوات 2.9 و 2.10 اختيارية ولكن يوصى بشدة. <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف. Resuspend والعدلات في 8 مل من الماء المعقم لمدة 30 ثانية إلى ليز خلايا الدم الحمراء، إضافة تعليق الخلية على الفور إلى 2 مل من برنامج تلفزيوني 5X (دون كا 2 + والمغنيسيوم 2 +) وتخلط بلطف باليد. لا احتضان الخلايا في المياه لمدة أطول من 30 ثانية منذ يمكن أن يحدث الموت كبيرة العدلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 5 دقائق عند 18-22 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل خلايا مرة واحدة مع 10 مل من برنامج تلفزيوني (بدون كا 2 + والمغنيسيوم 2 +) وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 250 x ج لمدة 5 دقائق عند 18-22 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend والعدلات في 10 مل من RPMI-1640 (بدون أحمر الفينول) وعدد الخلايا الحية باستخدام التريبان بلوه صبغ طريقة الاستبعاد. تجنب فترات طويلة من كثافة الخلية أكبر من 5 × 10 6 لكل مل لأن هذا قد يؤدي إلى تفعيل العدلات. </li></ol> 3. العدلة وصفها مع Calcein AM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتستخدم 6 × 10 5 العدلات لكل بئر من لوحة 48 أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد العد، ونقل الخلايا معلق إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل ويخفف من العدلات إلى 2-4 × 10 6 خلية لكل مل مع الفينول الحمراء الخالية RPMI-1640. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة calcein AM محلول المخزون إلى 3 ميكرومتر (أي 2.98 ميكرولتر من calcein AM الأوراق المالية (1 ملغ / مل) لكل مل من وسائل الإعلام)، ومزيج جيد من قبل بلطف عبها الأنبوب. أكبر من 5 ميكرومتر AM calcein سوف يؤدي إلى التسرب من العدلات ملاحظة: هو المشقوق غير الفلورسنت calcein AM داخل الخلايا عن طريق الاسترات الذاتية لإنتاج جزيء calcein نيون للغاية (وأي خلايا ميتة لا يتألق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية الأنبوب بورق الألمنيوم واحتضان جمعةأو 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الظلام ملاحظة: قد يؤدي مرات حضانة أطول في أكثر calcein كونها تحررت من العدلات على مدى مقايسة التصاق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 5 دقائق عند 18-22 درجة مئوية، وغسل العدلات 2X مع 10 مل من RPMI-1640 (بدون الفينول الأحمر؛ قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية). بعد إعادة التعليق على خلايا لغسل الثاني، يمر أولا العدلات على الرغم من تصفية العقيمة 40 ميكرومتر لإزالة كتل ثم الطرد المركزي مرة أخرى في 450 x ج لمدة 5 دقائق عند 18-22 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend والعدلات في المتوسط ​​1640 (بدون الفينول الأحمر؛ قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية) في 2 × 10 6 العدلات لكل مل. </li></ol> 4. مقايسة الربط العدلة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الطبقات الوحيدة HMVEC 3x مع 0.5 مل من فلتر تعقيم (0.22 ميكرون) المتوسط ​​1640 (بدون أحمر الفينول) التي تحتوي على 3٪ BSA لكل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح في وسائل الاعلام وإضافة 6 × 10 5 العدلات calcein المسمى (0.3 مل من خلية suspensioن)، أو 0.3 مل من المتوسط ​​1640 (بدون أحمر الفينول) دون العدلات، إلى الآبار المناسب من 48 لوحة جيدا ملاحظة: هذا هو ما يعادل 8 × 10 5 العدلات لكل سم 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مجموع العدلات الإسفار (PRE غسل): قياس كثافة مضان من كل بئر مع الطول الموجي من 485 نانومتر الإثارة والطول الموجي الانبعاثات من 520 نانومتر (فلوريسئين مجموعة فلتر) في FLUOstar، أو ما يعادلها، مقياس الطيف الضوئي. تنفيذ هذه الخطوة قبل فقط إلى نقطة نهاية الحضانة ملاحظة: في هذا البروتوكول، وأجريت calcein الإثارة والكشف عن الضوء المنبعث من الجزء العلوي من الآبار المكشوفة، ولكن على حد سواء ويمكن أيضا أن يؤديها من الجزء السفلي من الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الآبار التي تحتوي على الطبقات الوحيدة HMVEC والعدلات 5X مع 0.5 مل لكل بئر من برنامج تلفزيوني (ث / كا 2 + والمغنيسيوم 2 +). إزالة وسائل الإعلام ويغسلبواسطة قلب اللوحة، والربت برفق على مناشف ورقية لإزالة السائل المتبقي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أضف إلى الوراء 0.3 مل من المتوسط ​​1640 (بدون أحمر الفينول) لكل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمسكا العدلات الإسفار (POST غسل): قياس كثافة مضان من كل بئر كما في الخطوة 4.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الالتزام والتقيد في المئة النسبية لكل بئر: </li></ol> ملاحظة: في هذه المرحلة، والصور من العدلات calcein المسمى يمكن الحصول عليها باستخدام المجهر مضان قادرة مزودة بمرشحات فلوريسئين القياسية. تم الحصول على الصور في الشكل 4 على أوليمبوس IX51 مجهر مقلوب مجهزة 2000R كاميرا Retiga (Q التصوير) باستخدام Q-التقاط Pro7 البرمجيات (Q التصوير).

<ol>
	<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Collins, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+endothelial+cell+adhesion+molecules:+NF-kappa+B+and+cytokine-inducible+enhancers.">Transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules: NF-kappa B and cytokine-inducible enhancers.</a> FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 9, 899-909 (1995).</li><li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+physiological+roles+of+inflammation.">Origin and physiological roles of inflammation.</a> Nature. 454, 428-435 (2008).</li><li>Chen, G. Y., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterile+inflammation:+sensing+and+reacting+to+damage.">Sterile inflammation: sensing and reacting to damage.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).</li><li>Middleton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcytosis+and+surface+presentation+of+IL-8+by+venular+endothelial+cells.">Transcytosis and surface presentation of IL-8 by venular endothelial cells.</a> Cell. 91, 385-395 (1997).</li><li>Rot, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+binding+of+NAP-1/IL-8:+role+in+neutrophil+emigration.">Endothelial cell binding of NAP-1/IL-8: role in neutrophil emigration.</a> Immunol. Today. 13, 291-294 (1992).</li><li>Detmers, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-activating+protein+1/interleukin+8+stimulates+the+binding+activity+of+the+leukocyte+adhesion+receptor+CD11b/CD18+on+human+neutrophils.">Neutrophil-activating protein 1/interleukin 8 stimulates the binding activity of the leukocyte adhesion receptor CD11b/CD18 on human neutrophils.</a> J. Exp. Med. 171, 1155-1162 (1990).</li><li>Laudanna, C., Kim, J. Y., Constantin, G., Butcher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+leukocyte+integrin+activation+by+chemokines.">Rapid leukocyte integrin activation by chemokines.</a> Immunol. Rev. 186, 37-46 (2002).</li><li>Simon, S. I., Hu, Y., Vestweber, D., Smith, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+tethering+on+E-selectin+activates+beta+2+integrin+binding+to+ICAM-1+through+a+mitogen-activated+protein+kinase+signal+transduction+pathway.">Neutrophil tethering on E-selectin activates beta 2 integrin binding to ICAM-1 through a mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway.</a> J. Immunol. 164, 4348-4358 (2000).</li><li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+consequences+of+neutrophil+interaction+with+the+endothelium.">Mechanisms and consequences of neutrophil interaction with the endothelium.</a> The American Journal of Pathology. 172, 1-7 (2008).</li><li>Muller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+leukocyte+transendothelial+migration.">Mechanisms of leukocyte transendothelial migration.</a> Annu. Rev. Pathol. 6, 323-344 (2011).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li><li>Kumar, V., Sharma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils:+Cinderella+of+innate+immune+system.">Neutrophils: Cinderella of innate immune system.</a> International Immunopharmacology. 10, 1325-1334 (2010).</li><li>McDonald, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+danger+signals+guide+neutrophils+to+sites+of+sterile+inflammation.">Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation.</a> Science. 330, 362-366 (2010).</li><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).</li><li>Soehnlein, O., Lindbom, L., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+neutrophil-mediated+monocyte+recruitment.">Mechanisms underlying neutrophil-mediated monocyte recruitment.</a> Blood. 114, 4613-4623 (2009).</li><li>Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Prakash, A., Xu, F., Hellman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+endothelial+TLR2+by+bacterial+lipoprotein+upregulates+proteins+specific+for+the+neutrophil+response.">Activation of endothelial TLR2 by bacterial lipoprotein upregulates proteins specific for the neutrophil response.</a> Innate Immun. 18, 602-616 (2012).</li><li>Haugland, R. P., Johnson, I. D., Basey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies. , (2005).</li><li>Shin, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+lipoprotein+TLR2+agonists+broadly+modulate+endothelial+function+and+coagulation+pathways+in+vitro+and+in+vivo.">Bacterial lipoprotein TLR2 agonists broadly modulate endothelial function and coagulation pathways in vitro and in vivo.</a> J. Immunol. 186, 1119-1130 (2011).</li><li>Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Lucero, J., Xu, F., Hellman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERK5+protein+promotes,+whereas+MEK1+protein+differentially+regulates,+the+Toll-like+receptor+2+protein-dependent+activation+of+human+endothelial+cells+and+monocytes.">ERK5 protein promotes, whereas MEK1 protein differentially regulates, the Toll-like receptor 2 protein-dependent activation of human endothelial cells and monocytes.</a> J. Biol. Chem. 287, 26478-26494 (2012).</li><li>Pober, J. S., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+functions+of+endothelial+cells+in+inflammation.">Evolving functions of endothelial cells in inflammation.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 803-815 (2007).</li><li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+isolation+protocol.">Neutrophil isolation protocol.</a> J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).</li><li>Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+neutrophil+chemotaxis.">Analysis of neutrophil chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 370, 23-36 (2007).</li><li>Garcia-Garcia, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+method+to+detect+nuclear+factor+activation+in+human+neutrophils+by+flow+cytometry.">A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (74), e50410 (2013).</li><li>Kuma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BIRB796+inhibits+all+p38+MAPK+isoforms+in+vitro+and+in+vivo.">BIRB796 inhibits all p38 MAPK isoforms in vitro and in vivo.</a> J. Biol. Chem. 280, 19472-19479 (2005).</li><li>Westra, J., Kuldo, J. M., van Rijswijk, M. H., Molema, G., Limburg, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+production+and+E-selectin+expression+in+activated+endothelial+cells+are+inhibited+by+p38+MAPK+(mitogen+activated+protein+kinase)+inhibitor+RWJ+67657.">Chemokine production and E-selectin expression in activated endothelial cells are inhibited by p38 MAPK (mitogen activated protein kinase) inhibitor RWJ 67657.</a> International Immunopharmacology. 5, 1259-1269 (2005).</li><li>Leeuwenberg, J. F., Jeunhomme, G. M., Buurman, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+polymorphonuclear+cells+to+human+endothelial+cells.+Adhesion-molecule-dependent,+and+Fc+receptor-mediated+adhesion-molecule-independent+mechanisms.">Adhesion of polymorphonuclear cells to human endothelial cells. Adhesion-molecule-dependent, and Fc receptor-mediated adhesion-molecule-independent mechanisms.</a> Clinical and Experimental Immunology. 81, 496-500 (1990).</li><li>Akeson, A. L., Woods, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorometric+assay+for+the+quantitation+of+cell+adherence+to+endothelial+cells.">A fluorometric assay for the quantitation of cell adherence to endothelial cells.</a> Journal of Immunological Methods. 163, 181-185 (1993).</li><li>Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+leukocyte-endothelial+adhesion.">Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion.</a> Journal of Immunological Methods. 159, 93-100 (1993).</li><li>De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+fluorescent+dyes+in+the+determination+of+adherence+of+human+leucocytes+to+endothelial+cells+and+the+effect+of+fluorochromes+on+cellular+function.">Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leucocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function.</a> Journal of Immunological Methods. 172, 115-124 (1994).</li><li>Bevilacqua, M. P., Pober, J. S., Wheeler, M. E., Cotran, R. S., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+1+acts+on+cultured+human+vascular+endothelium+to+increase+the+adhesion+of+polymorphonuclear+leukocytes,+monocytes,+and+related+leukocyte+cell+lines.">Interleukin 1 acts on cultured human vascular endothelium to increase the adhesion of polymorphonuclear leukocytes, monocytes, and related leukocyte cell lines.</a> The Journal of Clinical Investigation. 76, (1985).</li><li>Schleimer, R. P., Rutledge, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+human+vascular+endothelial+cells+acquire+adhesiveness+for+neutrophils+after+stimulation+with+interleukin+1,+endotoxin,+and+tumor-promoting+phorbol+diesters.">Cultured human vascular endothelial cells acquire adhesiveness for neutrophils after stimulation with interleukin 1, endotoxin, and tumor-promoting phorbol diesters.</a> J. Immunol. 136, 649-654 (1986).</li><li>Gamble, J. R., Harlan, J. M., Klebanoff, S. J., Vadas, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+the+adherence+of+neutrophils+to+umbilical+vein+endothelium+by+human+recombinant+tumor+necrosis+factor.">Stimulation of the adherence of neutrophils to umbilical vein endothelium by human recombinant tumor necrosis factor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8667-8671 (1985).</li><li>Braut-Boucher, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-isotopic,+highly+sensitive,+fluorimetric,+cell-cell+adhesion+microplate+assay+using+calcein+AM-labeled+lymphocytes.">A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes.</a> Journal of Immunological Methods. 178, 41-51 (1995).</li><li>Ait-Oufella, H., Maury, E., Lehoux, S., Guidet, B., Offenstadt, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelium:+physiological+functions+and+role+in+microcirculatory+failure+during+severe+sepsis.">The endothelium: physiological functions and role in microcirculatory failure during severe sepsis.</a> Intensive Care Medicine. 36, 1286-1298 (2010).</li><li>Andonegui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium-derived+Toll-like+receptor-4+is+the+key+molecule+in+LPS-induced+neutrophil+sequestration+into+lungs.">Endothelium-derived Toll-like receptor-4 is the key molecule in LPS-induced neutrophil sequestration into lungs.</a> The Journal of Clinical Investigation. 111, 1011-1020 (2003).</li><li>Sharma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+endothelial+cell+platelet-activating+factor+production+and+inflammatory+cell+adherence+are+increased+in+response+to+cigarette+smoke+component+exposure.">Lung endothelial cell platelet-activating factor production and inflammatory cell adherence are increased in response to cigarette smoke component exposure.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302, L47-L55 (2012).</li><li>Deban, L., Correale, C., Vetrano, S., Malesci, A., Danese, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+pathogenic+roles+of+microvasculature+in+inflammatory+bowel+disease:+a+Jack+of+all+trades.">Multiple pathogenic roles of microvasculature in inflammatory bowel disease: a Jack of all trades.</a> The American Journal of Pathology. 172, 1457-1466 (2008).</li><li>Gross, W. L., Trabandt, A., Csernok, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+Wegener&amp;#39;s+granulomatosis.">Pathogenesis of Wegener&amp;#39;s granulomatosis.</a> Annales de Medecine Interne. 149, 280-286 (1998).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+inflammatory+cell+involvement+in+brain+arteriovenous+malformations.">Evidence of inflammatory cell involvement in brain arteriovenous malformations.</a> Neurosurgery. 62, 1340-1349 (2008).</li><li>Martens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptides+which+bind+to+E-selectin+and+block+neutrophil+adhesion.">Peptides which bind to E-selectin and block neutrophil adhesion.</a> J. Biol. Chem. 270, 21129-21136 (1995).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

أهم الخطوات الحاسمة لنجاح العدلة / الاوعية الدموية الدقيقة البطانية خلية مقايسة التصاق هي: 1) استخدام منخفض عدد مرور (&lt;9)، والخلايا البطانية صحية؛ 2) الحفاظ على العدلات معزولة في مناطق ذات كثافة منخفضة (أي &lt;5 × 10 6 خلايا / مل)، واستخدامها في غضون ساعتين من الع?...

منذ بطانة الأوعية الدموية هي في اتصال مباشر مع الدورة الدموية، وهو يقع بشكل فريد لبدء الاستجابة الالتهابية السريع خلال العدوى أو الإصابة. الخلايا البطانية (ECS) مستقبلات التعرف على نمط صريحة تعترف مجموعة متنوعة من المكونات البكتيرية الحفظ والجزيئات خطر، ومستقبلات للوسطاء المضيف التهابات مثل TNFα. تفعيل هذه المستقبلات يؤدي إلى إفراز السيتوكينات ECS (مثل IL-6، IL-8، CXCL1 وCCL2)، وupregulate جزيئات الالتصاق (على سبيل المثال E / ف selectin، VCAM-1 و ICAM-1) على سطح الخلية الخاصة بهم 1 ، 2. كل هذه الجزيئات تسهيل توطين الكريات البيض إلى مواقع الإصابة والإصابات من أجل مسح مجموعة من العوامل المعدية، والشروع في إصلاح الأنسجة 3،4. الاستجابة العدلة للإصابة ينطوي على تفاعل منسقة تنسيقا جيدا بين بطانة الأوعية الدموية والاستجابة العدلات. عند تفعيل EC، IL-8 ويفرز ويشكل التدرج داخل الأوعية الدموية على البطانة التي تسمح العدلات إلى الوطن الدخول إلى موقع العدوى أو الإصابة 5،6. E / P-selectins التوسط العدلة التقاط والمتداول من خلال الجمعيات ضعيفة نسبيا مع glycomolecules على سطح الخلية العدلة. هذه التفاعلات، جنبا إلى جنب مع IL-8 ملزم لمستقبلات لها وما شابه ذلك، وتيسير قوية، والتعلق إنتغرين بوساطة والاعتقال في نهاية المطاف من العدلات على سطح الخلية البطانية 7-10. بعد الاعتقال، يمكن العدلات تهاجر من الأوعية الدموية إلى مواقع محددة للعدوى للقضاء على مسببات الأمراض مباشرة، وتوليد الفخاخ خارج الخلية العدلات لمنع انتشار مسببات الأمراض، وتعزيز التئام الجروح والافراج عن العوامل الإضافية التي تجنيد الكريات البيض الأخرى مثل وحيدات، الضامة وشجيري الخلايا 11-17. وصفها في هذا التقرير هو طريقة في المختبر ل quantitate التقيد العدلة لmicrovascular ECS بعد التنشيط من قبل المضيف الوسيط التهابات TNFα. تم تصميم هذا الاختبار لتقييم تفعيل ECS، وليس العدلات. العدلات الإنسان الأساسية هي الأولى في عزل باستخدام الفصل المتدرج الكثافة، ومن ثم وصفت مع calcein acetoxymethyl (AM). الاسترات داخل الخلايا الحية يتحلل calcein صباحا إلى جزيء calcein نيون للغاية مع الإثارة من 492-495 نانومتر، والانبعاثات من 513-516 نانومتر 18. ثم يتم تحضين العدلات fluorescently المسمى مع الطبقات الوحيدة EC، وتتم إزالة العدلات غير ملتصقة في وقت لاحق. ثم يقاس مضان من تبقى من العدلات، متجهة باستخدام مقياس الطيف الضوئي مضان، وتحسب كنسبة مئوية من إجمالي المدخلات مضان العدلة لكل بئر. هذا الأسلوب له ميزة إضافية أن العدلات منضم calcein المسمى المستخدمة في القياس الطيفي يمكن تصور مباشرة باستخدام المجهر مضان لإعطاء مزيد من نوعي تلا من EC ACtivation. منذ يتم تنفيذ هذا الاختبار في ظل ظروف ثابتة، وسوف يتم تقييم فقط الأحداث الأولي جدا التي تحدث في تتالي التصاق الخلايا المتعادلة. ويتأكد هذا في هذا التقرير باستخدام الأجسام المضادة حجب E-selectin لإظهار أن انضمام العدلة إلى المعالجة TNFα البشرية الرئة الاوعية الدموية الدقيقة EC (HMVEC والرئة) يتم تقليل الطبقات الوحيدة جذريا عندما تعطل التفاعل مع E-selectin. بالإضافة إلى TNFα، وقد استخدمنا بنجاح هذا الاختبار لتحديد مدى الوريد EC تفعيل السري الإنسان (HUVEC) من قبل تول مثل مستقبلات 1/2 منبهات البروتين الدهني ببتيدوغليكان المصاحب (PAL)، murein البروتين الدهني (MLP) وPam3Cys و تفعيل HMVEC والرئة بواسطة Pam3Cys 19،20. وبالإضافة إلى ذلك، استخدمنا بنجاح هذا الاختبار مع مثبطات كيناز وبعد ضربة قاضية رني بوساطة من سطح البروتينات وحشوية في HMVEC والرئة، مما يوحي بأن هذه المنهجية هو متوافق مع مجموعة متنوعة من البيوكيميائية وscreeninز المقايسات 20. وباختصار، هذا الاختبار يوفر وسيلة سهلة الاستخدام، واستنساخه الطريقة، أكثر وظيفية للوصول إلى مدى تفعيل EC عن التهابات وسطاء في المختبر.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HMVEC-Lung</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC-2527</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EGM-2 MV</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC-3202</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HBSS</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>14175-095</td>
 <td>Can be substituted with any vendor</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>48-well Tissue Culture Plates</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>353078</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS (without phenol red)</td>
 <td>UCSF Cell Culture Facility</td>
 <td>CCFAL001 </td>
 <td>Can be substituted with any vendor</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red)</td>
 <td>UCSF Cell Culture Facility</td>
 <td>CCFAL003</td>
 <td>Can be substituted with any vendor</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI-1640 (without phenol red)</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>11835-030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polymorphprep</td>
 <td>Axis-Shield</td>
 <td>1114683</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>calcein AM</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>C3099</td>
 <td>(0.995 mM) stock soln</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypan Blue Solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>T8154</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>40 &mu;M filters</td>
 <td>VWR</td>
 <td>21008-949</td>
 <td>Can be substituted with any vendor</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer</td>
 <td>BMG LABTECH</td>
 <td>-</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

quantitative in vitro assay to measure neutrophil adhesion to activated primary human microvascular endothelial cells under static conditions

البطانة الوعائية يلعب دورا أساسيا في استجابة التهابية. أثناء المرحلة الحادة من الالتهاب، ويتم تنشيط الخلايا البطانية (ECS) من خلال وسطاء المضيف أو مباشرة من قبل مكونات الميكروبية الحفظ أو جزيئات خطر المضيف المشتقة. المنشط ECS صريحة السيتوكينات، كيموكينات وجزيئات الالتصاق التي تعمل على حشد وتفعيل والاحتفاظ الكريات البيض في موقع العدوى أو الإصابة. العدلات هي أول الكريات البيض للوصول، والتمسك البطانة من خلال مجموعة متنوعة من جزيئات الالتصاق موجودة على سطوح الخلايا على حد سواء. أهم وظائف العدلات هي للقضاء على تهديدات مباشرة الميكروبية، وتعزيز تجنيد الكريات البيض الأخرى من خلال الافراج عن عوامل إضافية، والشروع في إصلاح الجرح. ولذلك، تجنيدهم والتعلق البطانة هو خطوة حاسمة في الشروع في الاستجابة الالتهابية. في هذا التقرير، وصفنا في المختبر العدلة مقايسة التصاق باستخدامcalcein AM المسمى العدلات الإنسان الأساسية ل quantitate مدى الاوعية الدموية الدقيقة تنشيط الخلايا البطانية في ظل ظروف ثابتة. هذا الأسلوب له ميزة إضافية أن نفس العينات quantitated بواسطة القياس الطيفي مضان يمكن أيضا تصور مباشرة باستخدام المجهر مضان لإجراء تقييم أكثر النوعي للملزمة العدلة.

من أجل الحصول على موثوقة، والنتائج استنساخه باستخدام مقايسة ملزمة العدلة، فمن الضروري أن صحة وconfluency من الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة هي الأمثل في يوم الفحص، كما هو موضح مع HMVEC والرئة في الشكل 1. وبالإضافة إلى ذلك، لا بد من أن انخفاض مرور عدد الاوع?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions at JoVE.com

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

الانضمام إلى العدلة البطانة تفعيلها في مواقع الإصابة هي جزء لا يتجزأ من استجابة المضيف للالتهابات. وصفها في هذا التقرير هو فحص ملزم العدلة التي تسمح لل<em&gt; في المختبر</em&gt; الكميات من العدلات الإنسان الأساسية ملزمة لخلايا بطانة الأوعية الدموية تفعيلها من خلال وسطاء التهابات في ظل ظروف ثابتة.

كمي<em&gt; في المختبر</em&gt; الفحص لقياس التصاق العدلات إلى تنشيط الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الأساسية بموجب الشروط ثابت

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

quantitative-vitro-assay-to-measure-neutrophil-adhesion-to-activated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

17.0K Views.  University of California, San Francisco. الانضمام إلى العدلة البطانة تفعيلها في مواقع الإصابة هي جزء لا يتجزأ من استجابة المضيف للالتهابات. وصفها في هذا التقرير هو فحص ملزم العدلة التي تسمح لل في المختبر الكميات من العدلات الإنسان الأساسية ملزمة لخلايا بطانة الأوعية الدموية تفعيلها من خلال وس...

Video: Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

الفحص في المختبر من الالتصاق الجرثومي على الخلايا الظهارية الثدييات

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

عزل خلايا الإنسان الوريد السري غشائي واستخدامها في دراسة التهجير تحت ظروف تدفق العدلات

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

و<em&gt; في المختبر</em&gt; المشارك عدوى نموذج لدراسة<em&gt; المتصورة المنجلية</em&gt; HIV-1-التفاعلات في الإنسان خلايا الوحيدات المشتقة الابتدائية المناعي

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

في المختبر المقايسة المشتركة لتقييم الهجرة العدلية المستحثة المسببة للأمراض عبر الظهارية

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

تدفق التصاق الفحص لدراسة توظيف الكرية البيضاء لالكبدي الإنسان جيبية البطانة Endothelium تحت ظروف إجهاد القص

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

غرفة تدفق العدلات الإنسان التصاق الفحص

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

ثابت التصاق الفحص لدراسة إنتغرين تنشيط الخلايا اللمفية تي في

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

التصوير في الوقت الحقيقي من غشائي المفارق خلايا العدلات خلية أثناء التهجير تحت الفسيولوجية تدفق

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

في المختبر والمجراة نموذج لدراسة التصاق البكتيريا إلى سفينة ستريت تحت ظروف التدفق

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

فحص من التصاق تحت إجهاد القص لدراسة تي اللمفاويات-التصاق جزيء التفاعلات

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...