この作品は、麻酔と周術期ケアのUCSF学科によってサポートされていました。

1。微小血管内皮細胞のメッキとメンテナンス<ol><li>命令を供給メーカーによるとあなたの微小血管内皮細胞を解凍し、成長する。このプロトコルでは、細胞をEGM-2 MVメディア（ロンザ）で増殖させた、そしてそれは全ての実験は、継代数に起因するいかなる変動を最小限に抑えるために解凍から2週間以内に行われることが推奨される。 HMVECロンと私たちの実験は4〜9の通路との間で行われている。 </li><li> 1日目：細胞が80〜90％コンフルエントに達したとき、トリプシン処理及び1ml当たり120,000細胞で再懸濁します。 48ウェル、ポリスチレン組織培養プレート（S）にプレートウェルあたり36,000細胞（0.3ミリリットル）を。バックグラウンド蛍光測定値を得るために、好中球とインキュベートされることはありません HMVECの井戸を含めます。特に蛍光アッセイ、交互の行または列用に設計された48ウェルプレートを用いた場合を除き、隣接する井戸からの光の汚染を最小限に抑えることができます。注：ウェルズポリlysiでプレコートすることができますね、コラーゲンやフィブロネクチン。 </li><li> 2日目：新鮮な培地を追加します。 </li><li> 3日目：位相差顕微鏡で、細胞（ すなわち 、 &quot;玉石&quot;の外観と少し細胞の破片）健康的であり、彼らが100％コンフルエント（ 図1）であることを確認します。細胞が100％コンフルエントでない場合、彼らは準備が整うまで、毎日メディアを変更してください。 </li><li> HMVEC単層が治療のために準備ができたら、ハンクス平衡塩溶液（HBSS）で1回細胞を洗浄し、適切なウェルに炎症性アゴニストを含有する新鮮なEGM-2 MVメディアまたはメディア0.3 mlを加える。このプロトコルではHMVEC-肺をTNFαで処理した3時間[100 ngの/ mlの]（ぺプロテック、ニュージャージー州）、これはECの21のよく説明ベーターであるため。注：これは、（ステップ3.5）、好中球のラベルが付いたAM、時間あなたの実験をので、あなたの活性化HMVEC細胞（ステップ4.1）とカルセインことをことをお勧めしますが、同時に使用する準備が整いました。それはneutrophを分離し、標識するために私たちに約2.5時間かかりますILS。 </li></ol> 2。 Polymorphprepを使用して好中球分離<ol><li>以前に22説明したように好中球を分離し、または全血から多形核顆粒球を分離するため、既製の密度勾配液で。 Nuzzi、 らによるプロトコルに従ってPolymorphprepを採用。全血23 1mlあたり約2〜3×10 6の好中球の利回り2007年の結果は。注：赤血球を除去するために過剰な赤血球溶解、デキストラン沈降を回避するためには、密度勾配遠心24の前に行ってもよい。 </li><li> RTへPolymorphprep密度勾配液を持参してください。 </li><li>例えば、ヘパリン、クエン酸塩またはEDTAなどの抗凝固剤の存在下で、健康な人間のボランティアからの全血30mlのを収集します。血液は、2時間以内に使用され、18-22℃の間で保管してください</li><li> 15ミリリットルコニカルチューブ内の密度勾配溶液5mlを超える全血の層5ミリリットル（ <strong&gt;図2A）。これは、その後の遠心分離条件を変更することができるように血液および密度勾配溶液の容積を変化させる避ける。 </li><li> 18-22で30分間450×gで遠心℃、ゆっくりスピードアップとダウンの遠心分離機（ すなわち遠心ブレーキをオフにする）、および好中球の活性化を減少させ、層の混合を防ぐために振動を防ぐためによくチューブのバランスをとることを確認してください。長い遠心倍以上の遠心力がペレット化赤血球に向かってさらに下方に移動するように、好中球を含む下位の白血球層をもたらす。 </li><li>好中球（ 図2B）を含む層の汚染を防止するために、PBMCを含有プラズマ及び上部白血球バンドを吸引。 </li><li>好中球を含む白血球下位層を除去するために1〜2ミリリットル血清ピペットを使用してください。 50mlのPBSを30ml（のCa 2 +およびMg 2 +なし）に好中球のレイヤーを結合コニカルチューブ。 </li><li> PBSで50ミリリットル（のCa 2 +およびMg 2 +なし）にボリュームを起動し、18〜22歳で10分間、450×gで遠心℃、 </li></ol> 注：ステップ2.9と2.10はオプションですが、強く推奨。 <ol start="9"><li>上清を吸引。赤血球を溶解するために30秒間の滅菌水8mlに好中球を再懸濁し、すぐに5倍の2mlのPBS（のCa 2なし+およびMg 2 +）と優しく手でミックス。で細 ​​胞をインキュベートしない]に細胞懸濁液を追加30秒より長くのための水の重要な好中球の死が発生する可能性があるため。 </li><li> 18-22で5分間250 xgで遠心℃、 </li><li> 10mlのPBS（Ca 2 +のおよびMg 2 +なし）で1回細胞を洗浄し、18〜22歳で5分間250 xgで再び遠心℃、 </li><li> RPMI-1640（フェノールレッドなし）10ml中の好中球を再懸濁し、トリパンブルーを用いて生細胞を数える電子色素排除法。これは、好中球の活性化につながる可能性があるので、1mlあたり5×10 6より大きい細胞密度の長時間は避けてください。 </li></ol> 3。カルセインAMと好中球のラベル<ol><li> 6×10 5好中球は、48ウェルプレートのウェルあたりに使用される。 </li><li>カウントした後、50ミリリットルコニカルチューブに再懸濁した細胞を転送し、フェノールレッドを含まないRPMI-1640で1mlあたり2-4×10 6細胞に好中球を希釈。 </li><li>カルセインが3μm（カルセインAM株式すなわち 2.98液（1 mg / ml）でml当たりのメディア）に原液AM加え、穏やかにチューブをフリックでよく混ぜる。以上5μMはカルセイン好中球からの漏れが発生しますAM 注：非蛍光カルセインAMが高い蛍光分子カルセイン（ つまり死んだ細胞が蛍光を発することはありません）を生成するために、内因性エステラーゼにより細胞内で切断される。 </li><li>アルミホイルでチューブをカバーとfをインキュベートまたは37℃で30分間、暗注C：長いインキュベーション時間は接着アッセイの過程で好中球から解放され、よりカルセインになることがあります。 </li><li> 18-22°Cで5分間450×gで遠心分離し、RPMI-1640（フェノールレッドなし、37℃に予熱）10mlで2倍の好中球を洗う。 40μM無菌フィルターは18-22で塊を除去した後、5分間450 xgで再び遠心分離するのに二回目の洗浄のために細胞を再懸濁した後、最初の好中球を渡​​す℃に</li><li> 1mlあたり2×10 6好中球で。（37℃に予め温めずにフェノールレッド）RPMI 1640中で好中球を再懸濁し</li></ol> 4。好中球結合アッセイ<ol><li>フィルター滅菌を0.5ml（0.22μm）をRPMI 1640（フェノールレッドなし）ウェルあたり3％BSAを含むと3倍HMVEC単層を洗浄します。 </li><li>メディアを吸引し、6×10 5カルセイン標識好中球（細胞サスペンシオ0.3 mlを加える48ウェルプレートの適当なウェルに好中球なしN）、またはRPMI 1640 0.3mlの（フェノールレッドなし）、 注：これは1cm 2あたり8×10 5の好中球と同等です。 </li><li> 37°C、5％CO 2インキュベーター内で20分間インキュベートする。 </li><li> 総好中球蛍光（PRE洗浄）：485 nmでの励起波長および発光FLUOstarにおける520nmの（フルオレセインフィルターセット）の波長、またはそれと同等の分光光度計を用いて各ウェルの蛍光強度を測定する。直前のインキュベーション終了点までこのステップを実行注：このプロトコルでは、放出される光のカルセインの励起および検出が覆わウェルの上部から行われたが、両方はまた、ウェルの底部から行うことができる。 </li><li> 0.5ミリリットルウェルあたりのPBS（W / Ca 2 +のおよびMg 2 +）と5倍HMVEC単層および好中球を含むウェルを洗ってください。メディアや洗浄を削除反転プレートによって、残りの液体を除去するためにペーパータオルの上に優しくパッティング。 </li><li>バックウェルあたりRPMI 1640 0.3ミリリットル（フェノールレッドなし）を追加します。 </li><li> 付着性好中球蛍光（POSTウォッシュ）：ステップ4.4のように、各ウェルの蛍光強度を測定します。 </li><li>パーセント順守とウェルあたり相対遵守を決定する： </li></ol> 注：この段階で、カルセイン-標識された好中球の画像は標準フルオレセインフィルターを備えた蛍光顕微鏡を使用することができることによって得ることができる。 図4の画像は、Pro7ソフトウェア（Qイメージング）、Qは-キャプチャ使用Retiga 2000Rカメラ（Qイメージング）を搭載したオリンパスIX51倒立顕微鏡で得た。

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L., Trabandt, A., Csernok, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+Wegener&amp;#39;s+granulomatosis.">Pathogenesis of Wegener&amp;#39;s granulomatosis.</a> Annales de Medecine Interne. 149, 280-286 (1998).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+inflammatory+cell+involvement+in+brain+arteriovenous+malformations.">Evidence of inflammatory cell involvement in brain arteriovenous malformations.</a> Neurosurgery. 62, 1340-1349 (2008).</li><li>Martens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptides+which+bind+to+E-selectin+and+block+neutrophil+adhesion.">Peptides which bind to E-selectin and block neutrophil adhesion.</a> J. Biol. Chem. 270, 21129-21136 (1995).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

成功した好中球/微小血管内皮細胞接着アッセイのための最も重要なステップは次のとおりである：1）低継数（&lt;9）、健康な内皮細胞の使用は、低密度（ すなわち &lt;5×10 6個の細胞で孤立した好中球を維持2） / ml）と分離の2時間以内にそれらを使用して、それぞれ、3）気難しいカルセインAMで標識された好中球の洗浄および好中球からのカルセインのECの汚染や損失を最小限...

血管内皮の循環血液と直接接触しているので、一意的に感染または損傷時に迅速な炎症反応を開始させる位置している。内皮細胞（ECS）の保存された細菌成分と危険分子の多様性、ならびにTNFαなどの炎症性メディエーターホストに対する受容体を認識する明白なパターン認識受容体。これらの受容体の活性化は、分泌性サイトカイン（ 例えば、IL-6、IL-8、CXCL1およびCCL2）へのECを誘導し、そしてその細胞表面1の接着分子（ 例えば、E / P-セレクチン、VCAM-1およびICAM-1）をアップレギュレートする、2。これらの分子は、すべての感染性病原体の宿主をクリアし、組織修復を3,4を開始するために感染や傷害部位への白血球の局在を促進する。感染に好中球応答が血管内皮と応答の間でよく調整された相互作用を伴う好中球。 EC活性化、ILアポン8が分泌され、感染症やけが5,6のサイトに家に好中球を可能に内皮に血管内の勾配を形成する。 E / P-セレクチン好中球の取り込みを仲介し、好中球の細胞表面上にglycomoleculesと比較的弱い団体を通じてローリング。これらの相互作用は、その同族受容体へのIL-8結合とともに、堅牢な、インテグリン媒介アタッチメントおよび内皮細胞表面7-10に好中球の最終的な逮捕を容易にします。停止した後、好中球は、直接病原体を排除するために、感染の特定の部位への脈管構造から移動病原体の拡散を防ぐために好中球細胞外トラップを生成し、創傷治癒を促進し、単球、マクロファージおよび樹状などの他の白血球を補充する追加の因子を放出することができ細胞11-17。 microvへの好中球の接着を定量するためのインビトロ方法は、この報告書に記載ascularはTNFα宿主炎症性メディエータによる活性化した後にECを。このアッセイは、ECの活性化のではなく、好中球を評価するために設計されている。初代ヒト好中球は、第密度勾配分離を用いて単離され、次いで、カルセインアセトキシメチル（AM）で標識される。生細胞加水カルセイン内エステラーゼは、492から495 nmおよび513から516 nmの18の放射の励起と高蛍光カルセイン分子にAM。蛍光標識された好中球は、その後、EC単層と共にインキュベートし、非付着性好中球は、その後、除去される。残りの結合した好中球の蛍光は、その後、蛍光分光光度計を用いて測定し、ウェルあたりの総好中球の蛍光入力のパーセントとして計算される。この方法は、分光光度法で使用される結合したカルセイン-標識された好中球を直接より定性的なEC交流から読み出さを与えるために蛍光顕微鏡を用いて可視化することができるというさらなる利点を有するtivati​​on。このアッセイは、静的条件下で行われるので、好中球の接着カスケードに生じるごく初期のイベントが評価される。これは、そのE-セレクチンとの相互作用が中断されたときTNFα処理ヒト肺微小血管EC（HMVEC-肺）単層への好中球の順守を大幅に低減されることを示すために、E-セレクチン遮断抗体を使用して、この報告書で確認された。 TNFαに加えて、我々は正常Toll様受容体1/2アゴニストペプチドグリカン関連リポタンパク質（PAL）、ムレインリポタンパク質（MLP）とPam3Cysによってヒト臍帯静脈EC（HUVEC）活性化の程度を決定するために、このアッセイを使用しているPam3Cys 19,20によってHMVEC-肺の活性化。さらに、我々は正常にこの方法論は、さまざまな互換性があることを示唆し、キナーゼ阻害剤とHMVEC-肺における表面および細胞質タンパク質のRNAiによるノックダウンした後に、このアッセイを使用した生化学的およびscreeninグラムアッセイ20。要約すると、このアッセイは、in vitroで炎症性メディエーターによってECの活性化の程度にアクセスするため、使いやすい、再現性、より機能的な方法を提供します。

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HMVEC-Lung</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC-2527</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EGM-2 MV</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC-3202</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HBSS</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>14175-095</td>
 <td>Can be substituted with any vendor</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>48-well Tissue Culture Plates</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>353078</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS (without phenol red)</td>
 <td>UCSF Cell Culture Facility</td>
 <td>CCFAL001 </td>
 <td>Can be substituted with any vendor</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red)</td>
 <td>UCSF Cell Culture Facility</td>
 <td>CCFAL003</td>
 <td>Can be substituted with any vendor</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI-1640 (without phenol red)</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>11835-030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polymorphprep</td>
 <td>Axis-Shield</td>
 <td>1114683</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>calcein AM</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>C3099</td>
 <td>(0.995 mM) stock soln</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypan Blue Solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>T8154</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>40 &mu;M filters</td>
 <td>VWR</td>
 <td>21008-949</td>
 <td>Can be substituted with any vendor</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer</td>
 <td>BMG LABTECH</td>
 <td>-</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

quantitative in vitro assay to measure neutrophil adhesion to activated primary human microvascular endothelial cells under static conditions

血管内皮は、炎症反応に不可欠な役割を果たしている。炎症の急性期の間に、内皮細胞（ECの）保存された微生物成分又は宿主由来の危険分子による宿主メディエーター直接によって活性化される。活性化されたECの特急サイトカイン、動員ケモカインおよび接着分子は、感染症やけがの部位で白血球を活性化し、維持する。好中球は到着する最初の白血球であり、両方の細胞の表面に存在する接着分子のさまざまな内皮に付着する。好中球の主な機能は、直接、微生物の脅威を除去するための追加の因子の放出を介して他の白血球の動員を促進し、創傷修復を開始することである。したがって、内皮への採用とアタッチメントは、炎症応答の開始に重要なステップです。本稿では、用いたin vitro好中球接着アッセイで説明カルセインAM-標識された一次ヒト好中球は、静的条件下で微小血管内皮細胞の活性化の程度を定量する。この方法は、蛍光分光光度計で定量し、同じサンプルは、直接結合好中球のより定性的評価のために蛍光顕微鏡を用いて可視化することができるというさらなる利点を有する。

好中球結合アッセイを使用して、信頼性、再現性のある結果を得るためには、 図1のHMVEC-肺に示すように、健康および微小血管内皮細胞のコンフルエントには、アッセイの当日に最適であることが不可欠である。また、低継番号微小血管のECは（9未満通路すなわち ）が使用されることが不可欠であり、従って、我々は、解凍から2週間以内にすべての実験を行うことをお勧?...

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Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

感染部位における活性化内皮への好中球の順守は、ホストの炎症反応に不可欠なコンポーネントです。を可能にした好中球結合アッセイは、この報告書に記載<em&gt; in vitroで</em静的な条件下での炎症性メディエーターによって活性化内皮細胞への結合初代ヒト好中球の&gt;定量。

定量的な<em&gt;インビトロ</em静的な条件の下で活性化された初代ヒト微小血管内皮細胞への好中球の接着を測定するために&gt;アッセイ

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

quantitative-vitro-assay-to-measure-neutrophil-adhesion-to-activated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

17.0K ビュー.  University of California, San Francisco. 感染部位における活性化内皮への好中球の順守は、ホストの炎症反応に不可欠なコンポーネントです。を可能にした好中球結合アッセイは、この報告書に記載 in vitroで定量。