The authors thank Dr. P.L. Hordijk for critically reading the manuscript. AED is supported by a Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR) fellowship (grant #1028). JK is supported by the Dutch Heart Foundation (2005T3901). JDvB is a NHS Dekker fellow (grant #2005T039).

تم عزل العدلات من المتطوعين الأصحاء الذين وقعوا على الموافقة المسبقة. وقد أجريت الأبحاث في الامتثال للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية لرفاهية الإنسان. 1. الطلاء والصيانة من الوريد السري الإنسان خلايا غشائي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الثقافة الوريد السري الإنسان غشائي (HUVECs) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تنمو HUVECs على فبرونيكتين (FN) -coated الأطباق (10 ميكروغرام / مل، يذوب في الماء المنزوع المعادن) باستخدام وسائل الإعلام (غشائي بصل متوسطة (EBM-2) متوسطة تستكمل مع غشائي متوسط ​​النمو (EGM-2) singlequots). استخدام زراعة الخلايا بين 4-8 الممرات للتجارب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 1: معطف تدفق غرف مع 100 ميكرولتر من فبرونيكتين (10 ميكروغرام / مل في PBS) لمدة 2 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 2: عندما تصل خلايا التقاء 80-90٪، يعرض للتريبسين الخلايا بعد الغسيل حذرا مع الفوسفات مخزنة المالحة RT (PBS) درجة الحموضة 7.4، أجهزة الطرد المركزي في 800 x ج و resuspend في 800،000 خلية / مل باستخدام وسائل الإعلام. لوحة 80،000 الخلايا في كل قناة واحدة من FN المغلفة تدفق غرف وماصة بلطف تعليق الخلية صعودا وهبوطا. ثقافة O / N في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 3: تحديث وسائل الإعلام في الشريحة تدفق الغرفة عن طريق إمالة بلطف الشريحة في زاوية 45 درجة. (انظر الشكل 1A). ملاحظة: من المستحسن لإزالة فقط وسائل الإعلام في الخزانات وليس في القناة نفسها. إزالة وسائل الإعلام في القنوات قد يؤدي إلى فقدان الخلية البطانية والموت بسبب قوة سحب وسائل الإعلام تسبب قبل pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من النقيض من المرحلة المجهري إذا شكلت الخلايا البطانية أحادي الطبقة (أي 100٪ متموجة). إذا كانت الخلايا ليست 100٪ متموجة، تغيير وسائل الإعلام مرتين في اليوم حتى تصل إلى 100٪ التقاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد وصلت الخلايا confluency، وتحفيز الخلايا مع وسائل الإعلام (راجع الخطوة1.1) تحتوي على الوسيط التهابات (TNF-α (10 نانوغرام / مل)). تحفيز HUVECs O / N (أي 12 ساعة) مع نتائج TNF-α في النمط الظاهري التهاب البطانة، مثال.، يصل تنظيم جزيئات التصاق الخلية مثل ICAM-1 وVCAM-1 13. </li></ol> 2. كرية بيضاء متعددة النوى العزل عن طريق التدرجات Percoll <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد N-2-hydroxyethylpiperazine-N&#39;-2-ethanesulfonic حمض (HEPES) -buffer (وتسمى فيما يلي: تدفق العازلة) قبل عزل الكريات البيض النوى (السوداء). يستخدم تدفق العازلة لغسل PMNs معزولة وكما عازلة في فحص التدفق. لإعداد تدفق العازلة: تمييع 7.72 جم كلوريد الصوديوم (132 ملم)، 4.76 غرام HEPES (20 ملم)، 0.45 ز بوكل (6 ملم)، 0.25 غرام MgSO 4 • 7H 2 O (1 ملم)، K 2 هبو 4 • 3H 2 O (1.2 ملم) في 1 لتر من الماء المنزوع المعادن وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 (يمكن أن تبقى هذه الأسهم في 4 درجات مئوية لعدة أسابيع). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الطازج 100 ميكرولتر 1 M CaCl 2 &amp; #160؛ (1 ملم)، 2.5 مل الألبومين البشري من تركيز الأسهم 200 غرام / لتر (0.5٪ V / V) و 0.1 غرام السكر إلى 100 ​​مل (0.1٪ ث / ت) من تدفق العازلة. المقبل، تصفية العازلة تدفق باستخدام فلتر 0.45 ميكرون. ملاحظة: يحتاج هذا العازلة تدفق لتكون على استعداد طازجة لكل تجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل عزل PMN، وإعداد 10٪ صوديوم سترات (TNC) حل في برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع 20 مل من الدم الكامل في vacuettes heparine الصوديوم من المتطوعين الأصحاء. تمييع الدم الكامل 1: 1 مع 10٪ PBS / الشركات عبر الوطنية في 50 مل أنابيب و 20 ماصة مل مخففة الدم بعناية على 12.5 مل من Percoll (أ 23٪ (وزن / وزن) حل الغروية في المياه مع كثافة 1.130 جم / مل) الجديد في أنبوب 50 مل. وضع بعناية الأنابيب في جهاز الطرد المركزي وتدور لمدة 20 دقيقة في 800 x ج مع انخفاض تسارع وعدم انقطاع وضعت في RT. ملاحظة: عند إضافة الدم المخفف إلى Percoll، إمالة أنبوب Percoll التي تحتوي في زاوية 45 درجة وماصة بلطف الدم المخفف في الطرافة أنبوبح أبطأ إعداد ماصة الصبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة جميع السوائل وملء الأنبوب في وقت لاحق مع الجليد الباردة تحلل كرات الدم الحمراء العازلة (4.15 ز NH 4 الكلورين [0.155 م]، 0.5 غرام KHCO 3 [0.01 M] و 18.5 ملغ EDTA (ثلاثي III) [0.1 ملي] إلى 500 مل من الجليد الباردة H 2 O) إلى ليز كريات الدم الحمراء. ترك أنبوب على الجليد، عكس بعض الأحيان الأنبوب، حتى يتحول تعليق الأحمر الداكن، تليها الطرد المركزي 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية مع فواصل تمكين. ملاحظة: جزء بيليه يحتوي على PMNs (العدلات، الحمضات، الخلايا القاعدية) مع الكريات الحمراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف ويغسل بيليه مرتين في الجليد الباردة تحلل العازلة في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية مع تدفق العازلة على RT وتحديد تركيز PMNs باستخدام عدادة الكريات أو خلية مكافحة الآلي. تعليق PMNs في تدفق العازلة في 1 × 10 6 خلية / مل والحفاظ على RT. </li></ol> 3. وصفها من غشائي مفرقآل VE كادهيرين وPECAM-1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة PECAM اليكسا فلور 647 الضد (استنساخ WM59) في التخفيف 1: 100 والكالسيوم مستقل-VE كادهيرين-FITC الأجسام المضادة (استنساخ 55-7H1) في 1:50 التخفيف إلى HUVEC مستنبت (راجع الخطوة 1.1)، واحتضان لمدة 30 دقيقة قبل بدء التجربة تدفق لتصور ديناميات صلي الخلايا البطانية أثناء التهجير العدلات في ظل ظروف تدفق الفسيولوجية. ملاحظة: قبل إضافة الأجسام المضادة المسمى مباشرة إلى التدفق من الدوائر، وضمان أن حجم في كل قناة لا يتجاوز 100 ميكرولتر. هذا يساعد على إبقاء نفقات الأجسام المضادة عند أدنى مستوى ممكن. </li></ol> 4. PMN TEM الفحص تحت التدفق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع PMNs في حمام الماء لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية قبل حقنها في نظام التدفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط أنابيب إلى غرفة فارغة تدفق وملء مع الدافئة (على سبيل المثال، 37 ° C) تدفق العازلة (راجع الخطوة 4.3) لمنع تشكيل فقاعات الهواء عند إعداد اله نظام التدفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط جانب واحد من فارغة تدفق الغرفة إلى حقنة نظام تدفق المضخة باستخدام أنابيب السيليكون التي تحتوي على حقنة 20 مل، ووضع للغرفة التدفق إلى مرحلة المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط الجانب الآخر من الغرفة فارغة تدفق إلى الخزان قارورة مملوءة 37 ° C تدفق العازلة (الشكل 1B) وبدء ضخ حقنة من أجل سد جميع الأنابيب مع تدفق العازلة. فإن مضخة سحب تدفق العازلة من الخزان خلال تدفق غرفة في حقنة. ملاحظة: يحتوي هذا الأنبوب أيضا يور ميناء حقن في خط، والذي يسمح PMNs ليتم حقنه بإبرة في تجربة تشغيل دون توقف تدفق وخلق فقاعات الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال فارغة تدفق غرفة مع تدفق غرفة تحتوي على تعامل TNF-α-HUVECs، قم بتوصيل أنابيب تحتوي على تدفق العازلة ووضعه في المرحلة المجهر (الشكل 1C). قرصة قبالة الأنابيب قبل قطع الاتصال وإعادة توصيلم إلى غرف تحتوي على HUVECs، لا معسر قبالة قد يؤدي إلى تكون فقاعات الهواء داخل أنابيب و / أو تدفق غرف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط سرعة التدفق إلى 1 داين / سم 2، وفقا الفسيولوجية سرعة التدفق في الأوردة الشعرية بعد (1-5 داين / سم 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سجل التفاضلية التدخل التباين (DIC)، FITC (488 نانومتر) واليكسا فلور 647 (647 نانومتر) في وقت واحد باستخدام مجهر المسح الضوئي ليزر متحد البؤر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن PMNs (الخطوة 4.1) ببطء في نظام التدفق عبر خط يور في ميناء حقن (الشكل 1D) باستخدام المحاقن 1 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد بضع دقائق، تظهر الكريات البيض، والتمسك، وtransmigrate. إيقاف التجربة في أي لحظة المطلوب عن طريق قطع من أنابيب التدفق من الغرفة ومثبت pipetting ل(3.7٪ الفورمالديهايد في PBS) إلى منطقة غرفة التدفق. السماح التثبيت لمدة 10 دقيقة، تليها الغسيل مع برنامج تلفزيوني. ويتم تحليل البيانات باستخدام برامج التصوير (انظر الجدول المواد والمعدات). ملاحظة: إجراء التجربة أنه باستخدام متحد البؤر المجهر المسح الضوئي ليزر مجهزة غرفة المناخ مع درجة حرارة ثابتة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2، و63X نفط الهدف. </li></ol>

<ol>
	<li>Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis--an+inflammatory+disease.">Atherosclerosis--an inflammatory disease.</a> N. Engl. J. Med. 340, 115-126 (1999).</li><li>Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+migration+in+inflammation:+present+and+future+therapeutic+targets.">Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets.</a> Nat. Immunol. 6, 1182-1190 (2005).</li><li>Szekanecz, Z., Koch, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+involvement+in+rheumatic+diseases:+'+vascular+rheumatology.">Vascular involvement in rheumatic diseases: ' vascular rheumatology.</a> Arthritis Res. Ther. 10, 224 (2008).</li><li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial+cell+recognition:+three+(or+more)+steps+to+specificity+and+diversity.">Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Cinamon, G., Shinder, V., Shamri, R., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoattractant+signals+and+beta+2+integrin+occupancy+at+apical+endothelial+contacts+combine+with+shear+stress+signals+to+promote+transendothelial+neutrophil+migration.">Chemoattractant signals and beta 2 integrin occupancy at apical endothelial contacts combine with shear stress signals to promote transendothelial neutrophil migration.</a> J. Immunol. 173, 7282-7291 (2004).</li><li>Shulman, Z., Cohen, S. J., Roediger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transendothelial+migration+of+lymphocytes+mediated+by+intraendothelial+vesicle+stores+rather+than+by+extracellular+chemokine+depots.">Transendothelial migration of lymphocytes mediated by intraendothelial vesicle stores rather than by extracellular chemokine depots.</a> Nat. Immunol. 13, 67-76 (2012).</li><li>Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-cellular+migration:+cell-cell+contacts+get+intimate.">Trans-cellular migration: cell-cell contacts get intimate.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 20, 533-540 (2008).</li><li>Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transmigratory+cup+in+leukocyte+diapedesis+both+through+individual+vascular+endothelial+cells+and+between+them.">A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them.</a> J. Cell Biol. 167, 377-388 (2004).</li><li>Millan, J., Hewlett, L., Glyn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+transcellular+migration+occurs+through+recruitment+of+endothelial+ICAM-1+to+caveola-+and+F-actin-rich+domains.">Lymphocyte transcellular migration occurs through recruitment of endothelial ICAM-1 to caveola- and F-actin-rich domains.</a> Nat. Cell Biol. 8, 113-123 (2006).</li><li>Schulte, D., Kuppers, V., Dartsch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+the+VE-cadherin-catenin+complex+blocks+leukocyte+extravasation+and+vascular+permeability.">Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability.</a> EMBO J. 30, 4157-4170 (2011).</li><li>Buul, J. D., Mul, F. P., van der Schoot, C. E., Hordijk, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-3+activation+modulates+cell-cell+contacts+of+human+bone+marrow+endothelial+cells.">ICAM-3 activation modulates cell-cell contacts of human bone marrow endothelial cells.</a> J. Vasc. Res. 41, 28-37 (2004).</li><li>Shaw, S. K., Bamba, P. S., Perkins, B. N., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+vascular+endothelial-cadherin+during+leukocyte+transmigration+across+endothelium.">Real-time imaging of vascular endothelial-cadherin during leukocyte transmigration across endothelium.</a> J. Immunol. 167, 2323-2330 (2001).</li><li>Su, W. H., Chen, H., Jen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+movements+of+VE-cadherin+and+PECAM-1+during+transmigration+of+polymorphonuclear+leukocytes+through+human+umbilical+vein+endothelium.">Differential movements of VE-cadherin and PECAM-1 during transmigration of polymorphonuclear leukocytes through human umbilical vein endothelium.</a> Blood. 100, 3597-3603 (2002).</li><li>Paulsson, J. M., Jacobson, S. H., Lundahl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+activation+during+transmigration+in+vivo+and+in+vitro:+A+translational+study+using+the+skin+chamber+model.">Neutrophil activation during transmigration in vivo and in vitro: A translational study using the skin chamber model.</a> J. Immunol. Methods. 361, 82-88 (2010).</li><li>Williams, M. R., Azcutia, V., Newton, G., Alcaide, P., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+mechanisms+of+neutrophil+recruitment+across+endothelium.">Emerging mechanisms of neutrophil recruitment across endothelium.</a> Trends Immunol. 32, 461-469 (2011).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

لهذا البروتوكول، فمن الأهمية بمكان لمنع تشكيل فقاعات الهواء في التدفق من الدوائر، لأن هذا سوف يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج الخلية وأحادي الطبقة تعطلت. لتجنب هذا، نود أن نؤكد لدفع فوائد خاصة الخطوات 4.2 و 4.5، حيث يتم توصيل الأنابيب إلى غرفة التدفق. آخر خطوة حاسمة في البروتوكول هي فتيلة من PMNs التي يتم الاحتفاظ بها في RT التي تفرخ لهم ل15-30 دقيقة عند 37 درجة مئوية قبل حقنها إلى تدفق غرفة (الخطوة 4.1). هذه النتائج في فتيلة من integrins الكريات البيض، مما يتيح لهم الانضمام إلى جزيئات الالتصاق مثل ICAM-1 أو VCAM-1 في البطانة. لا يقتصر هذا البروتوكول لدراسة التهجير من العدلات. أيضا أنواع أخرى مثل الكريات البيض وحيدات الخلايا اللمفية أو يمكن استخدام. لاحظ أن الخطوة 4.1، أي فتيلة الكريات البيض قد تختلف بين أنواع الكريات البيض. أيضا، وأنواع أخرى من الخلايا البطانية يمكن استخدامها. لهذا فإنها لا تزال حرجةلتحفيز الخلايا البطانية مع المحفزات المناسبة التهابات مثل TNF-α أو IL-1β. إذا العدلات لا تستجيب في transmigrating، يمكن للمرء النظر علاج لفترة وجيزة العدلات (5 دقائق) مع N-فورميل-L-methionyl-L-لوسيل-L-فينيل ألانين (fMLP) الببتيد 16. وهذا تحفيز العدلات، ولا سيما integrins، وأبعد من ذلك، مما يجعلها أكثر عرضة للالتمسك البطانة. وعادة ما تستخدم 1 داين / سم 2 سرعة التدفق. يتم قياس هذه السرعة في تدفق الأوردة بعد الشعرية، المواقع التي يحدث فيها معظم هجرة الكريات البيض transendothelial 17. استخدام وصف تدفق غرف، فمن الممكن زيادة سرعة تدفق تصل إلى 10 داين / سم 2. ومع ذلك، فمن غير المستحسن لزيادة القص أبعد من ذلك. فإنه قد يؤدي إلى تسرب غير مرغوب فيه من الأنابيب ومفرزة من الخلايا الموجهة من غرفة التدفق. نتائج موضح في الشكل (3) تدل على أن هذهالأجسام المضادة يمكن استخدامها لتصور ودراسة ديناميات البطانية تقاطعات خلية خلية خلال انسلال الكريات البيض. على وجه الخصوص، بالإضافة إلى فحوصات التهجير القائمة هذا البروتوكول يسمح للتمييز paracellular من الهجرة العابر للخلايا في ظل الظروف الفسيولوجية تدفق في الوقت الحقيقي. منذ الأجسام المضادة وصمة عار على تقاطعات خلية خلية، يمكن للمرء أن يسجل عدد الكريات البيض التي تعبر VE كادهيرين / تقاطعات PECAM-1-الإيجابية مقابل nonpositive-VE كادهيرين / PECAM-1 المواقع. بهذه الطريقة، والهجرة العابر للخلايا يمكن تمييز من الهجرة paracellular. من المهم التأكيد على أن هذه الأجسام المضادة لا تتداخل مع وظيفة من البروتينات التي تربط ل: الأجسام المضادة PECAM-1 المستخدمة في هذه الدراسة موجهة ضد المجال خارج الخلية الثانية. الخلايا البطانية التي كانت مطلية في وجود الأجسام المضادة لم تظهر أي عيوب في نشر أو تشكيل أحادي الطبقة، مما يشير إلى أن الجسم المضاد لم يقل لاتتداخل مع التفاعلات بين الخلايا البطانية مثلي النمط. بالإضافة إلى ذلك، كل من الأجسام المضادة لا يضعف قدرة العدلات على الهجرة من خلال أحادي الطبقة البطانية. بالإضافة إلى ذلك، لا يتم تغيير عدد العدلات أن transmigrate عبر أحادي الطبقة البطانية في غياب أو وجود الأجسام المضادة (لا تظهر البيانات). الأهم من ذلك، متحد البؤر المسح المجهري بالليزر يعطي لنا إمكانية لتسجيل القنوات الفلورسنت مختلفة ومدينة دبي للإنترنت في وقت واحد. وبالتالي، يسمح هذا الاختبار دراسة ديناميات-VE كادهيرين وPECAM-1 في نفس الوقت عندما تعبر على العدلات والبطانية تقاطع خلية خلية، وسوف تساعد على فهم لماذا الكريات البيض اختيار طريق واحد على الآخر، أي paracellular مقابل العابر للخلايا.

كفاءة ورقابة مشددة هجرة الكريات البيض transendothelial (TEM) ذات أهمية رئيسية في العمليات الفيزيولوجية مثل المراقبة المناعة والتهاب حاد. ومع ذلك، تحت بعض الظروف الفسيولوجية patho، TEM غير المنضبط والمفرط لوحظ الناتجة في الأمراض الالتهابية المزمنة (مثل التهاب المفاصل وتصلب الشرايين والربو). أيضا خلال الانبثاث ورم الخلايا، وعملية الهجرة transendothelial هي مفيدة لخلايا الورم لمغادرة تعميمها على metastasize 1-3. من أجل التدخل على وجه التحديد مع الكريات البيض المفرطة أو TEM الخلايا السرطانية، لا بد من فهم مفصل لتنظيم هذه العملية. ويعتقد أن عملية TEM تحدث من خلال الخطوات المختلفة. دراسات المنوية، استعرض قبل عقدين من الزمن من قبل جزار والوثاب، أدى إلى نموذج متعددة الخطوات واصفا عملية TEM 4،5. هذا النموذج لا يزال صحيحا، رغم أن بعض الإعلاناتوقد شملت الخطوات المشروط 6. ألون وآخرون وصفت الحاجة إلى وجود كيموكينات يجمد على سطح البطانة 7. مؤخرا، أنها أظهرت أن البطانة نفسها تولد كيموكينات التي يتم تقديمها في السطح القمي البطانية 8. وعلاوة على ذلك، وضعت الجماعة نفسها إلى الأمام أهمية ظروف تدفق خلال TEM 7. مؤخرا، يمكن أن العديد من المنشورات ركزت على طريقين الكريات البيض مختلفة تأخذ في المرحلة النهائية من انسلال TEM. إما أنها يمكن أن تذهب من خلال تقاطعات خلية خلية، أي طريق الهجرة paracellular، أو عبور من خلال جسم الخلية البطانية، والمعروفة باسم العابر للخلايا طريق الهجرة 9. درس كارمان وزملاؤه هذه المسارات بالتفصيل وخلص إلى أن الكريات البيض تفضيلي اختيار طريق الهجرة paracellular (90٪) عبر الطريق العابر للخلايا (10٪) عند عبور الوريد السري البطانية أحادي الطبقة 10.ومع ذلك، عندما استخدمت الخلايا البطانية من أصول أخرى مثل المخ أو الأوعية الدموية الدقيقة، وتستخدم المزيد من الكريات البيض الطريق العابر للخلايا (30٪) 11. أظهرت مجموعة Vestweber مؤخرا أنه عندما كانت غير قادرة على فصل عن بعضها البعض باستخدام طرق في نموذج حيواني، لتحل محل الذاتية تقاطعات خلية خلية VE كادهيرين لVE كادهيرين ألفا catenin الوهم، تم حجب الكريات البيض TEM بالكامل 12 . والمثير للدهشة، لاحظ المؤلفون أن TEM تم حجب في العديد، ولكن ليس كل شيء، والأنسجة. عموما، أشارت هذه التجارب الأنيقة التي الكريات البيض فضل الطريق paracellular على الطريق العابر للخلايا، على الرغم من الإشارات التنظيمية التي تؤدي هذا القرار لا تزال غير معروفة. على الرغم من أن الغالبية العظمى من الكريات البيض يفضلون طريق الهجرة paracellular، فإنه لا يزال من الصعب التمييز بين كل من المسارات. بالإضافة إلى ذلك، على الرغم من العديد من الدراسات التي تركز على دور البطانية junct خلية خليةالأيونات، وديناميات هذه التقاطعات، ولا سيما البروتينات صلي VE كادهيرين وPECAM-1، خلال معبر الكريات البيض لا يزال قيد النقاش. وضعنا مقايسة بسيطة نسبيا والتي تقاطع هذه الجزيئات يمكن رصدها في الوقت الحقيقي خلال انسلال الكريات البيض تحت ظروف تدفق الفسيولوجية باستخدام الأجسام المضادة fluorescently المسمى. لم هذه الأجسام المضادة لا يتداخل أو عرقلة سلامة صلي أو التنقل من البروتينات المستهدفة. هذا الاختبار يسمح لنا لمتابعة ديناميكية البروتينات صلي أثناء عملية paracellular TEM. بالإضافة إلى ذلك، يسمح هذا الاختبار أيضا تمييزا بين طرق الهجرة شبه النظامية والعابر للخلايا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1251">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:471px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:365px;">Company</td>
			<td style="width:184px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#956;-Slide VI</td>
			<td style="width:365px;">IBIDI</td>
			<td style="width:184px;">80606</td>
			<td>Flow-chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.45 &#956;m filter&#160;</td>
			<td>Whatman/GE Lifesciences</td>
			<td style="width:184px;">10462100</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">1 mL syringe&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:184px;">300013</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">20 mL syringe&#160;</td>
			<td>BD Discardit II</td>
			<td style="width:184px;">366296</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">21G needle&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Microlance</td>
			<td style="width:184px;">301155</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Albumin&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Sanquin</td>
			<td style="width:184px;">15522644</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Ammunium chloride (NH4Cl)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1009245000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">449709</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:471px;">EBM-2 Basal medium + EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. &#38; Growth Factors</td>
			<td style="width:365px;">Lonza</td>
			<td style="width:184px;">CC-3156 + CC-4176</td>
			<td>media</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">EDTA (Titriplex III)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1370041000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon tubes&#160;</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:184px;">352096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">F1141-2MG</td>
			<td>FN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Glucose</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">G7528</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">HEPES</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">H3375</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">In-line Luer Injection port&#160;</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td style="width:184px;">10820</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">105886</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PECAM-1-ALEXA-647&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:184px;">561654</td>
			<td>clone WM59 
			stock concentration 0.1mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Percoll&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:184px;">17-0891-09</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:365px;">Fresenius Kabi&#160; Nederland</td>
			<td style="width:184px;">M090001/01NL</td>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Potassium chloride (KCl)</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">P9541</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Potassium hydrogen carbonate (KHCO3)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1048540500</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Potassium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4)</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">P5504</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Silicone Tygon 3350 tubing</td>
			<td style="width:365px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">228-4331</td>
			<td>tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:365px;">Calbiochem (Millipore)</td>
			<td style="width:184px;">567441</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe pump&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>model number 55-5920</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TNF&#945;&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Peprotech</td>
			<td style="width:184px;">300-01A</td>
			<td>tumor necrosis factor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">trisodium citrate&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1.06447.5000</td>
			<td>TNC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vacuettes</td>
			<td style="width:365px;">Greiner, Germany</td>
			<td style="width:184px;">980044</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VE-Cadherin-FITC&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:184px;">560411</td>
			<td>clone 55-7H1</td>
			<td>stock concentration 0.5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zeiss LSM510 META&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Zen Software 2008</td>
			<td style="width:365px;">Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of endothelial cell-cell junctions during neutrophil transmigration under physiological flow

أثناء الالتهاب، الكريات البيض تترك الدورة الدموية وتعبر البطانة لمكافحة غزو مسببات الأمراض في الأنسجة الكامنة. وتعرف هذه العملية باسم هجرة الكريات البيض transendothelial. وقد وصفت طريقين عن الكريات البيض لعبور أحادي الطبقة البطانية: الطريق paracellular، أي من خلال تقاطعات خلية خلية والطريق العابر للخلايا، أي من خلال جسم الخلية البطانية. ومع ذلك، فقد كان من الصعب من الناحية الفنية على التمييز بين بارا والطريق العابر للخلايا. وضعنا مقايسة بسيطة في المختبر لدراسة توزيع الذاتية VE كادهيرين وPECAM-1 خلال العدلات transendothelial الهجرة في ظل ظروف تدفق الفسيولوجية. قبل العدلات نضح، تم علاج الخلايا البطانية لفترة وجيزة مع الأجسام المضادة fluorescently المسمى ضد VE كادهيرين وPECAM-1. لم هذه الأجسام المضادة لا تتداخل مع وظيفة كل من البروتينات، كما يحددها الكهربائية خلية substraالشركة المصرية للاتصالات مقاومة الاستشعار عن بعد وFRAP القياسات. باستخدام هذا الاختبار، تمكنا من متابعة توزيع الذاتية VE كادهيرين وPECAM-1 أثناء الترحيل transendothelial تحت ظروف التدفق ويميز بين الطرق بارا والهجرة العابر للخلايا من الكريات البيض في البطانة.

اختبرنا أولا إذا الأجسام المضادة لا تتداخل مع وظيفة حاجز البطانة. قمنا بقياس المقاومة من الطبقات الوحيدة البطانية الكهربائية باستخدام الخلايا الركيزة مقاومة الاستشعار (ECIS). لمزيد من التفاصيل، انظر فان Buul وآخرون 13 ولم يلاحظ أي تغيير في المقاومة عندما أضيف الأجسام المضادة المناهضة لل-VE كادهيرين fluorescently المسمى إلى الخلايا (الشكل 2A). الأجسام المضادة لمكافحة VE كادهيرين معترف بها جيدا لمنع VE كادهيرين خفضت وظيفة المقاومة بشكل كبير (الشكل 2A). كما أن الأجسام المضادة المستخدمة في التصوير لا تغير ديناميات-VE كادهيرين، كما تم تقييم من خلال قياس الفلورسنت الانتعاش بعد صورة تبيض (FRAP) من VE كادهيرين-GFP (الشكل 2B). بعد 1-2 دقائق، العدلات انضمت إلى أحادي الطبقة البطانية تفعيلها كما يمكن تصوره في القناة DIC (الشكل 3A). بعد الزحف ل5-30 حد ذاتهج، فإن الغالبية العظمى من العدلات transmigrated من خلال أحادي الطبقة البطانية من خلال تقاطعات خلية خلية التي وصفت مع الأجسام المضادة الموجهة ضد PECAM-1-VE وكادهيرين. خلال عملية انسلال، وأعقب وPECAM-1 في الوقت الحقيقي (الشكل 3B) توزيع كادهيرين VE. في مواقع العدلات انسلال، VE كادهيرين تعطلت محليا وأظهر PECAM-1 تشبه حلقة هيكل أكثر. بعد الانتهاء من انسلال، وتقاطعات وثيقة و-VE كادهيرين وPECAM-1 نقلهم بوضوح في مواقع انسلال (الشكل 3C). لاحظ أنه تم الكشف عن أجزاء من الأجسام المضادة لمكافحة PECAM-1 على سطح العدلات مرة واحدة وصلت العدلات الجانب باسو الوحشي من البطانة. غير أن هذا لا يمنع العدلات من عبور البطانة. كانت ديناميات وحظ من VE كادهيرين في الوقت الحقيقي أثناء الترحيل العدلات transendothelial بالاتفاق مع العمل من قبل شو وزملاؤه الذينأظهرت، باستخدام متحد البؤر المجهري و-VE كادهيرين-GFP transfected الخلايا البطانية، التي VE كادهيرين-GFP تنتشر أفقيا عندما عبرت الكريات البيض في البطانية تقاطعات خلية خلية 14. عمل أيضا سو وزملاء العمل أكدت ملاحظاتنا من PECAM-1. وأظهر الباحثون أن، بجانب الوحشي VE كادهيرين نشر على الكريات البيض مرور، تم توزيع PECAM-1 محليا في حلقة حول transmigrating العدلات 15. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig1highres.jpg" width="400" /> الرقم 1. في غرفة تدفق المختبر. (A) يشير السهم الخزان من المتوسط ​​الذي يحتاج إلى تحديث. (B) سيليكون أنابيب يربط غرفة التدفق مع في خط ميناء حقن يور تستخدم لحقن PMNs دون فصل أنابيب (رأس السهم). (C) كونيتيكتection من تدفق غرفة فارغة إلى قارورة خزان مملوء 37 ° C تدفق العازلة (رأس السهم). (D) اتصال للغرفة التدفق مع HUVECs تعامل TNF-α إلى الأنابيب التي تحتوي على تدفق العازلة وضعت في مرحلة المجهر (رأس السهم). <img alt="الشكل 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig2highres.jpg" width="500" /> الشكل 2.-VE كادهيرين الأجسام المضادة لا تتداخل مع ديناميات صلي أو وظيفة. يقاس (A) مقاومة الخلايا البطانية أحادي الطبقة باستخدام ECIS. Y محور يعبر عن مقاومة في أوم ومحور س يمثل الوقت بالساعات. VE كادهيرين الأجسام المضادة استنساخ 55-7H1، وصفت مع ALEXA647 (الخط الأزرق) أو نمط إسوي السيطرة مفتش-ALEXA647 (خط أحمر) لا تغير أحادي الطبقة البطانية مقاومة الخلايا، في حين أن كادهيرين VE-CL75 منع الأجسام المضادة (الخط الأسود) لم تقلل من مقاومة . (B </stroنانوغرام&gt;) وأعرب في HUVEC-VE كادهيرين GFP وتحليل FRAP باستخدام متحد البؤر المجهري كشف أي تغيير في الانتعاش مضان في وجود أو عدم وجود VE كادهيرين 55-7H1 الأجسام المضادة. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" width="500" /> الرقم 3.-VE كادهيرين وPECAM-1 التوزيع خلال TEM العدلات في الوقت الحقيقي. (A) العدلات (ملحوظ مع خط أبيض) الالتزام على البطانة وعبور تقاطع خلية خلية دون التأثير على توزيع VE كادهيرين وPECAM -1. (B) العدلات عبور أحادي الطبقة البطانية من خلال تقاطعات خلية خلية. وPECAM-1 يمكن ملاحظتها عندما يبرز على العدلات من خلال تقاطعات خلية خلية وتشتت المحلي كادهيرين VE. ويوضح خط أبيض جود العدلات لا يزال على رأس البطانة. يظهر خط أصفر ثا غشاء العدلاتر هي بالفعل تحت البطانة. (C) العدلات عبرت تماما أحادي الطبقة البطانية. VE كادهيرين ونقلت وPECAM-1 في مواقع انسلال. يوضح الخط الأصفر حدود العدلات transmigrated. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow at JoVE.com

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

الكريات البيض تعبر أحادي الطبقة البطانية باستخدام paracellular أو الطريق العابر للخلايا. وضعنا مقايسة بسيطة لمتابعة توزيع موصلي الذاتية VE كادهيرين وPECAM-1 خلال الكريات البيض transendothelial الهجرة تحت تدفق الفسيولوجية للتمييز بين طرق التهجير اثنين.

التصوير في الوقت الحقيقي من غشائي المفارق خلايا العدلات خلية أثناء التهجير تحت الفسيولوجية تدفق

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

real-time-imaging-endothelial-cell-cell-junctions-during-neutrophil

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

Cell-Cell Interactions

SCIENTISTS IN ACTION

19.4K Views.  Sanquin Research and Landsteiner Laboratory, AMC at University of Amsterdam.  الكريات البيض تعبر أحادي الطبقة البطانية باستخدام paracellular أو الطريق العابر للخلايا. وضعنا مقايسة بسيطة لمتابعة توزيع موصلي الذاتية VE كادهيرين وPECAM-1 خلال الكريات البيض transendothelial الهجرة تحت تدفق الفسيولوجية للتمييز بين طرق التهجير اثنين. 

Video: Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to intracellular responses. GPCRs control diverse biological functions such as chemotaxis, intracellular calcium release, gene regulation in a ligand dependent manner via heterotrimeric G-proteins1-2. Ligand binding induces a series of conformational changes leading to activation of heterotrimeric G-proteins that modulate levels of second messengers such as cyclic adenosine monophosphate (cAMP), inositol triphosphate (IP3) and diacyl glycerol (DG). Concomitant with activation of the receptor ligand binding also initiates a series of events to attenuate the receptor signaling via desensitization, sequestration and/or internalization. The desensitization process of GPCRs occurs via receptor phosphorylation by G-protein receptor kinases (GRKs) and subsequent binding of &beta;-arrestins3. &beta;-arrestins are cytosolic proteins and translocate to membrane upon GPCR activation, binding to phosphorylated receptors (most cases) there by facilitating receptor internalization 4-6.
Leukotriene B4 (LTB4) is a pro-inflammatory lipid molecule derived from arachidonic acid pathway and mediates its actions via GPCRs, LTB4 receptor 1 (BLT1; a high affinity receptor) and LTB4 receptor 2 (BLT2; a low affinity receptor)7-9. The LTB4-BLT1 pathway has been shown to be critical in several inflammatory diseases including, asthma, arthritis and atherosclerosis10-17. The current paper describes the methodologies developed to monitor LTB4-induced leukocyte migration and the interactions of BLT1 with &beta;-arrestin and , receptor translocation in live cells using microscopy imaging techniques18-19.
Bone marrow derived dendritic cells from C57BL/6 mice were isolated and cultured as previously described 20-21. These cells were tested in live cell imaging methods to demonstrate LTB4 induced cell migration. The human BLT1 was tagged with red fluorescent protein (BLT1-RFP) at C-terminus and &beta;-arrestin1 tagged with green fluorescent protein (&beta;-arr-GFP) and transfected the both plasmids into Rat Basophilic Leukomia (RBL-2H3) cell lines18-19. The kinetics of interaction between these proteins and localization were monitored using live cell video microscopy. The methodologies in the current paper describe the use of microscopic techniques to investigate the functional responses of G-protein coupled receptors in live cells. The current paper also describes the use of Metamorph software to quantify the fluorescence intensities to determine the kinetics of receptor and cytosolic protein interactions.

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &amp;#946;-arrestin

This paper describes the methodology to determine the chemotactic response of leukocytes to specific ligands and identify interactions between the cell surface receptors and cytosolic proteins using live cell imaging techniques.

في الوقت الحقيقي التصوير باء Leukotriene 4 الهجرة خلية وساطة BLT1 التفاعلات مع arrestin - β

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

عزل خلايا الإنسان الوريد السري غشائي واستخدامها في دراسة التهجير تحت ظروف تدفق العدلات

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many diseases associated with neuroinflammation such as multiple sclerosis (MS)2. Microglia in a normal CNS express macrophage marker CD11b and exhibit a resting phenotype by expressing low levels of activation markers such as CD45. During pathological events in the CNS, microglia become activated as determined by upregulation of CD45 and other markers3. The factors that affect microglia phenotype and functions in the CNS are not well studied. MicroRNAs (miRNAs) are a growing family of conserved molecules (~22 nucleotides long) that are involved in many normal physiological processes such as cell growth and differentiation4 and pathologies such as inflammation5. MiRNAs downregulate the expression of certain target genes by binding complementary sequences of their mRNAs and play an important role in the activation of innate immune cells including macrophages6 and microglia7. In order to investigate miRNA-mediated pathways that define the microglial phenotype, biological function, and to distinguish microglia from other types of macrophages, it is important to quantitatively assess the expression of particular microRNAs in distinct subsets of CNS-resident microglia. Common methods for measuring the expression of miRNAs in the CNS include quantitative PCR from whole neuronal tissue and in situ hybridization. However, quantitative PCR from whole tissue homogenate does not allow the assessment of the expression of miRNA in microglia, which represent only 5-15% of the cells of neuronal tissue. Hybridization in situ allows the assessment of the expression of microRNA in specific cell types in the tissue sections, but this method is not entirely quantitative. In this report we describe a quantitative and sensitive method for the detection of miRNA by real-time PCR in microglia isolated from normal CNS or during neuroinflammation using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mouse model for MS. The described method will be useful to measure the level of expression of microRNAs in microglia in normal CNS or during neuroinflammation associated with various pathologies including MS, stroke, traumatic injury, Alzheimer's disease and brain tumors.

Microglia are resident macrophages that provide the first line of defense and immune surveillance of the central nervous system. MicroRNAs are regulatory molecules that play an important role in many physiological processes including activation and differentiation of macrophages. In this article, we describe the method for measurement of microRNAs in microglia.

الكشف عن MicroRNAs في الخلايا الدبقية الصغيرة من قبل في الوقت الحقيقي PCR في الجهاز العصبي المركزي للمعلمين وأثناء Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

في الوقت الحقيقي تصوير لايف تي خلية اشارة تشكيل مجمع

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

في الوقت الحقيقي التصوير من التفاعلات صفائح الدم، العدلات غيروي على البطانة الوعائية التهاب المنشط خلال تشكيل خثرة في والفئران الحية

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

كمي<em&gt; في المختبر</em&gt; الفحص لقياس التصاق العدلات إلى تنشيط الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الأساسية بموجب الشروط ثابت

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

غرفة تدفق العدلات الإنسان التصاق الفحص

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

التصوير في الوقت الحقيقي من خلايا الدم النخاعي في ديناميات<em&gt; APC<sup&gt; مين / +</sup</em&gt; الأورام المعوية التي كتبها غزل القرص متحد البؤر المجهر

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor response to insulin, local hypoxia, and inflammation. By stimulating the differentiation of functional white adipocytes from progenitors, radical hypertrophy of the adipocyte population can be prevented and, consequently, the metabolic health of adipose tissue can be improved along with a reduction of inflammation. Also, by stimulating a differentiation of beige/brown adipocytes, the total body energy expenditure can be increased, resulting in weight loss. This approach could prevent the development of obesity co-morbidities such as type 2 diabetes and cardiovascular disease.
This paper describes the isolation, expansion, and differentiation of white and beige adipocytes from a subset of human adipose tissue endothelial cells that co-express the CD31 and CD34 markers. The method is relatively cheap and is not labor-intensive. It requires access to human adipose tissue and the subcutaneous depot is suitable for sampling. For this protocol, fresh adipose tissue samples from morbidly obese subjects [body mass index (BMI) &#62;35] are collected during bariatric surgery procedures. Using a sequential immunoseparation from the stromal vascular fraction, enough cells are produced from as little as 2&#8211;3 g of fat. These cells can be expanded in culture over 10&#8211;14 days, can be cryopreserved, and retain their adipogenic properties with passaging up to passage 5&#8211;6. The cells are treated for 14 days with an adipogenic cocktail using a combination of human insulin and the PPAR&#947; agonist-rosiglitazone.
This methodology can be used for obtaining proof of concept experiments on molecular mechanisms that drive adipogenic responses in adipose endothelial cells, or for screening new drugs that can enhance the adipogenic response directed either towards white or beige/brown adipocyte differentiation. Using small subcutaneous biopsies, this methodology can be used to screen out non-responder subjects for clinical trials aimed to stimulate beige/brown and white adipocytes for the treatment of obesity and co-morbidities.

The differentiation of white and beige adipocytes from adipose tissue vascular progenitors bears potential for metabolic improvement in obesity. We describe protocols for a CD34+CD31+ endothelial cell isolation from human fat and for a subsequent in vitro expansion and differentiation into white and beige adipocytes. Several downstream applications are discussed.

العزلة والتوسع وتحريض أديبوجينيك CD34 + CD31 + خلايا بطانية من الأنسجة الدهنية تحت الجلد وأومينتال البشرية

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

التصوير في الوقت الحقيقي والتحديد الكمي للتنمية بيوفيلم الفطرية باستخدام نظام تدفق دائرية ذات مرحلتين

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...