وأيد جوزيف دبليو Ndieyira من قبل مجلس الهندسة والعلوم الفيزيائية البحوث (EPRSC)، مركز البحوث متعددة التخصصات في تقنية النانو (IRC)، الجمعية الملكية (RS) وبيانو الاستشارات (BNC). نشكر، أليخاندرا دونوسو باريرا، Dejian تشو، مانويل Vögtli، ماثيو باتشيلور، ماثيو كوبر A.، تورستن Strunz، تريفور رايمنت وغابرييل Aeppli لإجراء مناقشات مفيدة.

1. إعداد الكابولي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام تفلون ملاقط تزج عدد مختار من رقائق ناتئ (كل ناتئ قياس 500 ميكرون طويل، 100 ميكرون واسعة و 0.9 ميكرومتر سميكة) في حل سمكة البيرانا الطازجة (في نسبة 1:1 H 2 SO 4 و H 2 O 2) لمدة 20 دقيقة . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ما يقرب من 20 دقيقة إزالة رقائق ناتئ من حل سمكة البيرانا وشطف لهم جيدا بالماء منزوع الأيونات ونقل على الفور الى حل سمكة البيرانا الطازجة. كرر الخطوة 1.1 أعلاه إذا رقائق تحتوي على بقع من الأوساخ وإلا المضي قدما إلى الخطوة التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تنظيف شامل في الماء منزوع الأيونات، وشطف مع الإيثانول النقي وتجفيف رقائق ناتئ على موقد في 75 درجة مئوية لإزالة أي آثار للماء. تفتيشها باستخدام المجهر الضوئي للتأكد من نظافتها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل رقائق ناتئ تنظيفها إلى غرفة التبخير وضخ أسفل، واستهداف لتحقيق الفراغالضغط من 10 -7 م بار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة ويتحقق الضغط فراغ المطلوبة، ومعطف جانب واحد من كل مجموعة ناتئ مع التيتانيوم 2 نانومتر أول من يقوم بدور طبقة التصاق قبل طبقة إضافية من 20 نانومتر الذهب سميكة. للتأكد من سماكتها، واستخدام شاشة الكريستال الكوارتز وضعها مباشرة فوق مصدر الهدف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك الذهب المطلي رقائق استشعار ناتئ في غرفة لمدة 1-2 ساعة لتبرد تحت فراغ قبل الافتتاح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل رقائق تبخرت حديثا إلى وعاء تخزين فراغ مليئة الأرجون لمنع أي شكل من أشكال التلوث. </li></ol> 2. ناتئ Functionalization رقاقة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أولا، ترتيب أنابيب-الشعرية الدقيقة في مرحلة functionalization 2 وفقا لحجم الملعب ناتئ من 250 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم حقن 2 مم حلول ثيول الايثانول من الجزيئات المستهدفة سطح، أي mucopeptides البكتيرية (D-علاء وD-لاك)، و &#39;INERيجب ر &#39;alkanethiol تنتهي في غليكول triethylene (PEG) المعروف لمقاومة الجزيئية البيولوجية الامتزاز. 16 كل من الأنابيب الشعرية تحتوي على جزيئات متنوعة التقاط سطح تحدد بشكل عشوائي لتجنب التحيز المستخدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان المقبل لمدة 20 دقيقة في الكابولي في microcapillaries مليئة حلول ثيول التي تحتوي على جزيئات التقاط السطح. ضمان أن تقتصر الحلول من الجزيئات القبض على كل سطح ناتئ استشعار الفرد لتجنب أو تقليل عبر التلوث. إذا تم توظيف هذه العملية بشكل صحيح، ينبغي أن يغير بشكل منهجي الطازجة الكابولي المغلفة الذهب إلى أجهزة استشعار نشط كيميائيا شكلت من خلال السماح صواريخ سام من أهداف mucopeptide البكتيرية لتشكيل على الأسطح المطلية بالذهب باسم المستقبلات. </li></ol> 3. التحضيرات الحل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل 0.1 M أملاح فوسفات الصوديوم أحادية ودى الأساسية في الماء عالى النقاء (18.2 MΩ · سم المقاومية) ومزيج رس تسفر عن قيمة الرقم الهيدروجيني من 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.002٪ من PS80 إلى حلول مخزنة لتقليل الآثار الناجمة عن تجميع التفاعلات غير محددة من جزيئات الدواء إلى الأواني الزجاجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع المخدرات مع حلول مخزنة حديثا إلى تركيزات مختلفة المطلوب الذي سيمكن حساب K د. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الحلول المخدرات الطازجة باستخدام 0.2 ميكرون مرشحات ويصوتن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل تطهير مع الأرجون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الإجراء مع المخدرات في المصل مخزنة باستخدام المصل كله. دوامة بلطف لمدة 15 دقيقة مع 5 دقائق إضافية لضمان الذوبان الكامل. </li></ol> 4. كشف سطح الإجهاد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل جهاز استشعار ناتئ functionalized رقاقة إلى غرفة خلية تدفق السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محاذاة بقعة الليزر على نهاية خالية من كل أجهزة الاستشعار وتأكيد المواءمة بواسطة تسخين السائل لغرفة 1 ° C. وينبغي لجميع ثمانية الذهب المطلي صفائف استشعار الخضوع ناتئ التحليل الشاملssive الانحناء نحو الانخفاض بسبب تأثير متعلق بنظام المعدنين الناجمة عن الاختلافات في معدلات التوسع من السليكون والذهب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التسخين لحوالي 10 دقيقة، والسماح للالكابولي لتبرد لمدة 10 دقيقة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب التباين الانحناء في أقصى إشارات الانحناء بين أجهزة الاستشعار ناتئ الفردية وإذا كان الانحراف المعياري النسبي للإشارات الانحناء ≤ 5٪ ثم قبول المحاذاة على النحو المرغوب فيه وإلا تكرار هذه العملية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل، وقياس الترددات الرنانة من كل ثمانية الكابولي لحساب الثوابت الربيع بهم. إذا كان الاختلاف من ربيع مستمر بين كل جهاز استشعار ناتئ داخل رقاقة هو ≤ 1٪ ثم قبول رقاقة وجود الخواص الميكانيكية متسقة استبدال وإلا فإن رقاقة الاستشعار ناتئ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ذلك، استخدم نظام فلويديك (نموذج جيني زائد) عن طريق صمام السداسية لتحقيق تبادل السائل داخل الخلية التدفق بينما ينبغي أن يتحقق الحصول على البيانات باستخدام ابفيف الآلي بحيثftware. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لرصد ناتئ الانحناء البيانات، واستخدام البروتوكولات القياس التالية: أ) حقن إما حل العازلة أو المصل دون المخدرات لقياس التحكم دائم للدقيقة 5-30 لإنشاء خط الأساس؛ الثاني) حقن محلول المخدرات لمدة 30-60 دقيقة، الثالث) حقن 10 ملم حمض الهيدروكلوريك غسل ل10-60 دقيقة لفصل ملزمة معقدة المخدرات؛ الرابع) حقن أخيرا خطوة الغسيل باستخدام مزيد من حل العازلة للدقيقة 5-30 آخر لتجديد الببتيدات السطحية وإلى استعادة إشارة خط الأساس. تأكد دائما من أن جميع الإشارات يتم الحصول على معدل ثابت تحت تدفق السائل من 30-180 ميكرولتر / دقيقة في درجة حرارة ثابتة و25 ° C في خزانة التحكم في درجة حرارته. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي رصد الإشارات الانحناء المطلق من كل ثمانية الكابولي استخدام الوقت المسلسل المضاعفة طريقة شعاع بصري مع جهاز الكشف عن موقف واحد الحساسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل إشارات الانحناء من كل تركيز من المخدرات، يتم تحويل bendings التفاضلية الناتجة إلى stres الفرقق بين الطرفين العلوي والسفلي من ناتئ باستخدام معادلة ستوني لل. </li></ol>

<ol>
	<li>Ndieyira, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+detection+of+antibiotic-mucopeptide+binding+in+a+model+for+superbug+drug+resistance.">Nanomechanical detection of antibiotic-mucopeptide binding in a model for superbug drug resistance.</a> Nat. Nanotech. 3, 691-696 (2008).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+label-free+nanomechanical+detection+of+biomarker+transcripts+in+human+RNA.">Rapid and label-free nanomechanical detection of biomarker transcripts in human RNA.</a> Nat. Nanotech. 1, 214-220 (2006).</li><li>McKendry, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+label-free+biodetection+and+quantitative+DNA-binding+assays+on+a+nanomechanical+cantilever+array.">Multiple label-free biodetection and quantitative DNA-binding assays on a nanomechanical cantilever array.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 9783-9788 (2002).</li><li>Wu, G., Datar, R. H., Hansen, K. M., Thundat, T., Cote, R. J., Majumdar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioassay+of+prostate-specific+antigen+(PSA)+using+microcantilevers.">Bioassay of prostate-specific antigen (PSA) using microcantilevers.</a> Nat. Biotech. 19, 856-860 (2001).</li><li>Fritz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+biomolecular+recognition+into+nanomechanics.">Translating biomolecular recognition into nanomechanics.</a> Science. 288, 316-318 (2000).</li><li>Dwyer, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic-induced+bacterial+cell+death+exhibits+physiological+and+biochemical+hallmarks+of+apoptosis.">Antibiotic-induced bacterial cell death exhibits physiological and biochemical hallmarks of apoptosis.</a> Mol. Cell. 46, 561-572 (2012).</li><li>Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Wierzbowski, J., Cottarel, G., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mistranslation+of+membrane+proteins+and+two-component+system+activation+trigger+antibiotic-mediated+cell+death.">Mistranslation of membrane proteins and two-component system activation trigger antibiotic-mediated cell death.</a> Cell. 135, 679-690 (2008).</li><li>Kahne, D., Leimkuhler, C., Wei, L., Walsh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycopeptide+and+lipoglycopeptide+antibiotics.">Glycopeptide and lipoglycopeptide antibiotics.</a> Chem. Revs. 105, 425-448 (2005).</li><li>Williams, D. H., Maguire, A. J., Tsuzuki, W., Westwell, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+origins+of+a+cooperative+binding+energy+of+dimerization.">An analysis of the origins of a cooperative binding energy of dimerization.</a> Science. 280, 711-714 (1998).</li><li>Bugg, T. D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular-basis+for+vancomycin+resistance+in+enterococcus+faecium+BM4147-+biosynthesis+of+a+depsipeptide+peptidoglycan+precursor+by+vancomycin+resistance+proteins+VanH+and+VanA.">Molecular-basis for vancomycin resistance in enterococcus faecium BM4147- biosynthesis of a depsipeptide peptidoglycan precursor by vancomycin resistance proteins VanH and VanA.</a> Biochem. 30, 10408-10415 (1991).</li><li>Neu, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crisis+in+antibiotic+resistance.">The crisis in antibiotic resistance.</a> Science. 257, 1064-1073 (1992).</li><li>Walsh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+that+confer+antibacterial+drug+resistance.">Molecular mechanisms that confer antibacterial drug resistance.</a> Nature. 406, 775-781 (2000).</li><li>Xu, J., Li, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemistry+of+self-assembled+long-chain+alkanethiol+monolayers+on+gold.">The chemistry of self-assembled long-chain alkanethiol monolayers on gold.</a> J. Colloid Interface Sci. 176, 138-149 (1995).</li><li>Wink, T., van Zuilen, S. J., Bult, A., van Bennekom, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+monolayers+for+biosensors.">Self-assembled monolayers for biosensors.</a> Analyst. 122, 43-50 (1997).</li><li>Cho, Y. R., Entress, R. M., Williams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+cell-wall+analogues+of+vancomycin-resistant+enterococci+using+solid+phase+peptide+synthesis.">Synthesis of cell-wall analogues of vancomycin-resistant enterococci using solid phase peptide synthesis.</a> Tetrahedron Lett. 38, 5229-5232 (1997).</li><li>Prime, K. L., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+organic+monolayers+-+model+systems+for+studying+adsorption+of+proteins+at+surfaces.">Self-assembled organic monolayers - model systems for studying adsorption of proteins at surfaces.</a> Science. 252, 1164-1167 (1991).</li><li>Rotschafer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetics+of+Vancomycin:+Observations+in+28+Patients+and+Dosage+Recommendations.">Pharmacokinetics of Vancomycin: Observations in 28 Patients and Dosage Recommendations.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 22, 391-394 (1982).</li><li>Cooper, M. A., Fiorini, M. T., Abell, C., Williams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+vancomycin+group+antibiotics+to+D-alanine+and+D-lactate+presenting+self-assembled+monolayers.">Binding of vancomycin group antibiotics to D-alanine and D-lactate presenting self-assembled monolayers.</a> Bioorg. Med. Chem. 8, 2609-2616 (2000).</li><li>Rao, J., Yan, L., Xu, B., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+surface+plasmon+resonance+to+study+the+binding+of+vancomycin+and+its+dimer+to+self-assembled+monolayers+presenting+D-Ala-D-Ala.">Using surface plasmon resonance to study the binding of vancomycin and its dimer to self-assembled monolayers presenting D-Ala-D-Ala.</a> J. Am. Chem. Soc. 121, 2629-2630 (1999).</li><li>MacBeath, G., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+Proteins+as+Microarrays+for+High-Throughput+Function+Determination.">Printing Proteins as Microarrays for High-Throughput Function Determination.</a> Science. 289, 1760-1763 (2000).</li><li>Baller, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cantilever+array-based+artificial+nose.">A cantilever array-based artificial nose.</a> Ultramicroscopy. 82, 1-9 (2000).</li><li>Burg, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weighing+of+biomolecules,+single+cells+and+single+nanoparticles+in+fluid.">Weighing of biomolecules, single cells and single nanoparticles in fluid.</a> Nature. 446, 1066-1069 (2007).</li><li>Lahiri, J., Isaacs, L., Tien, J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+the+generation+of+surfaces+presenting+ligands+for+studies+of+binding+based+on+an+active+ester+as+a+common+reactive+intermediate:+A+surface+plasmon+resonance+study.">A strategy for the generation of surfaces presenting ligands for studies of binding based on an active ester as a common reactive intermediate: A surface plasmon resonance study.</a> Anal. Chem. 71, 777-790 (1999).</li><li>Nugaeva, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromechanical+cantilever+array+sensors+for+selective+fungal+immobilization+and+fast+growth+detection.">Micromechanical cantilever array sensors for selective fungal immobilization and fast growth detection.</a> Biosens. Bioelectron. 21, 849-856 (2005).</li><li>Von Muhlen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biomarker+sensing+in+undiluted+serum+with+suspended+microchannel+resonators.">Label-free biomarker sensing in undiluted serum with suspended microchannel resonators.</a> Anal. Chem. 82, 1905-1910 (2010).</li><li>Godin, M., M, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+buoyant+mass+to+measure+the+growth+of+single+cells.">Using buoyant mass to measure the growth of single cells.</a> Nat. Methods. 7, 387-390 (2010).</li><li>Mertens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+gas+trace+of+hydrofluoric+acid+using+microcantilever.">Detection of gas trace of hydrofluoric acid using microcantilever.</a> Sens. Actuators B Chem. 99, 58-65 (2004).</li><li>Porter, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+solidstate+sensor+platform+for+the+detection+of+hydrogen+cyanide+gas.">A solidstate sensor platform for the detection of hydrogen cyanide gas.</a> Sens. Actuator B Chem. 123, 313-317 (2007).</li></ol>

يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح

نموذج التعرف الجزيئي يدعم مساحات واسعة من الأحياء والطب. في الصيدلة، على سبيل المثال كان الهدف هو تتداخل مع مسار المرضية من خلال استهداف أحد المشاركين الرئيسيين في عملية البيوكيميائية مثل transglycoslyation أو transpeptidation أن يحفز يشابك من الببتيدات جدار الخلية البكتيرية. وبالتالي يتم تقليل تصميم الأدوية لتحديد جزيء مناسبة لاستهداف موقع معين لرسو السفن البكتيرية للحث على مثاليا. والمثال الكلاسيكي محاكاة نجاح هذا النهج هو فانكومايسين (فان)، الذي يستهدف جدار الخلية ببتيدوغليكان، وهو سمة هيكلية الحفظ من جرثومة. في نوع من البكتيريا إيجابية الجرام الوليدة، المصفوفة ببتيدوغليكان يتكون من الببتيدات تنتهي في تسلسل يسين-D-ألانين-D-ألانين، المربوطة عبر C55 الدهون 8-10 رابط هنا تسمى D-علاء. هذه الببتيدات كشفها على السلائف ببتيدوغليكان أساسية للالحماية الميكانيكية للخلايا البكتيرية ضد القوات البيئية القاسية، والأهم من ذلك، لا توجد في الخلايا البشرية، مما يجعلها أهدافا مثالية للعقاقير المضادات الحيوية. يربط فان على وجه التحديد إلى C-محطة للبكتيريا الخلية الببتيدات بالحائط لتشكيل قوي باعتدال فان الببتيد معقدة كما هو مبين في الشكل 1. هذا التفاعل بين فان والببتيدات كتل يتعرض تصرفات transpeptidases وtransglycosylases، التي تحفز عبر ربط للجدران الخلايا 1، وقف على نحو فعال لهم من يشابك وبالتالي يضعف nanomechanically الخلية البكتيرية التي تؤدي إلى الوفاة عن طريق تمزق 1،6، 7. ظهور المقاومة للفانكومايسين المعوية (VRE) هو زيادة مشكلة الرعاية الصحية (11) ولأن المقاومة البكتيرية المعوية في ينشأ بسبب التغيير خفية من أميد لين<html> كاجي لاستر الربط 8، وهذا التغيير الهيكلي مخادعة بسيطة على سطح حذف بكتيريا السندات الهيدروجين واحد من موقع فان &#39;ق الالتحام مع التعديلات اللاحقة من جيب ملزمة. الأهم يغير هذه العملية ألانين محطة خماسي الببتيد موجودة في فانكومايسين عرضة المعوية (VSE) ليسين-D-ألانين-D-اللاكتات 10،12، وهنا يسمى D-لاك، مما أسفر عن انخفاض كبير في Van-D-لاك تقارب ملزم من قبل ولذلك ثلاثة أوامر من حجم التقديم فان غير فعالة علاجيا ضد الالتهابات Enterococcal 1، ونمو مثيرة للقلق من البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية الدافعة لتطوير نهج مبتكرة لتسريع واستعادة النشاط المضاد للبكتيريا من وكلاء المضادة للبكتيريا أو اكتشاف أدوية أقوى ضد أدوية متعددة البكتيرية مقاومة الالتهابات. الطبقة = &quot;jove_content&quot;&gt; تجاربنا باستخدام الكابولي قائمة بذاتها مستوحاة من النظم مثل الخلايا التي تسخير الطاقة الكيميائية إلى حركة. قدرة أجهزة الاستشعار ناتئ لترجمة الطاقة الكيميائية إلى الحركة الميكانيكية يجعلها تحقيقات فريدة من نوعها مع مزايا كبيرة لرصد الاضطرابات الميكانيكية للأهداف جدار الخلية البكتيرية في الوقت الحقيقي. أجهزة الاستشعار ناتئ تتطلب &#39;به&#39; أي مراسل ويتم الكشف عن الجزيئات الحيوية بسرعة في رد فعل خطوة واحدة. يمكن أن فحص المخدرات متعددة في نفس الوقت في ظل بيئات الفسيولوجية مثل حلول مخزنة والمصل كله. وبالإضافة إلى ذلك، يستخدم تكنولوجيا ناتئ المرجعية الموقعية لقياس الفرق السماح لهم للكشف على وجه التحديد التفاعلات المستهدفة المخدرات و، بحكم تلفيق لهم عبر طرق معالجة أشباه الموصلات القياسية، فهي قابلة لانتاج كميات كبيرة والموازاة لالفرز الفائق الإنتاجية الآلاف الأدوية للساعة الواحدة. في particجزيئية متعددة صفائف استشعار ناتئ هي أدوات مفيدة لدراسة مقاومة المضادات الحيوية للفانكومايسين - لأن المقاومة للفانكومايسين هي في جوهرها مشكلة ميكانيكية 1،6،7. ويمكن الكشف عن التفاعلات بين نموذج البكتيرية جدار الخلية الهدف وفان في حل عن طريق رصد التغيرات في الضغط ذات الصلة سريريا الناجمة عن التفاعلات المستهدفة المخدرات ملزمة. ويتم تحليل الضغط المتولدة من تفاعلات السطح الذي يتجلى في إشارة الانحناء ناتئ بصريا بواسطة أجهزة استشعار المضيئة مع شعاع الليزر. وعلاوة على ذلك من خلال تخصيص طلاء تقبلا من البكتيريا الجزيئات المستهدفة على رأس السطح من أجهزة الاستشعار ناتئ، على مقربة من عدد غير محدود من التحاليل (فان)، والتفاعلات البيوكيميائية محددة ويتم رصد الميكانيكا الحيوية من نموذج البكتيرية جدار الخلية المصفوفة في الوقت الحقيقي. وبصرف النظر عن هذا الحدث التعرف الجزيئي، وهناك العديد من العوامل التي يمكن أن تسبب أجهزة الاستشعار ناتئ إلى مواطنهlect الأول، والتي تشمل - تغيرات درجة الحرارة، ملزم غير محددة أو تغييرات في معامل الانكسار من الحل. لحساب إشارات غير محددة، وقياسات الفرق في الموقع حيث يتم تنفيذ الانحناء للكل من القياس والكابولي إشارة تتم مراقبتها بشكل مستمر لتحليل التفاعلات المحددة. وعلاوة على ذلك، فإن الحساسيات كشف من أجهزة الاستشعار ناتئ التي تعتمد على كيمياء المياه السطحية والهندسة يمكن أن تتعزز ضبط كثافة P السطحية (حيث يتم تعريف P كنسبة من المساحة السطحية بواسطة جزيئات التقاط المحتلة إلى منطقة السطح العلوي بأكمله للناتئ من مجموع السكان من الجزيئات كما هو محدد بواسطة الأشعة السينية الضوئية الطيفي (XPS) 1 تغطيتها. هنا تفاصيل هذا البروتوكول كيفية فانكومايسين أو أي مضاد حيوي الأخرى ملزمة لجدار الخلية البكتيرية النظير السلائف (mucopeptides) عند تركيزات ذات الصلة سريريا في حل مخزنة علىويمكن الكشف عن مصل الدم الثانية باستخدام التسمية خالية من التكنولوجيا ناتئ. وتستخدم أسطح الذهب الطازجة لأن المجمعة monolayers النفس (صواريخ سام) تميل إلى تشكيل بسهولة طبقات مستقرة على الذهب نظيفة 13،14. يتكون عادة من صواريخ سام جزيئات قصيرة مع شاردة ثيول المرفقة تساهميا على سطح الذهب، ولا يسمح وحدة التقاط المطلوب على الطرف الآخر للتفاعل بحرية مع أهداف الحليلة في الحل. ثيول تشكيل نظام مرن خاصة وأن العديد من المركبات ثيول مع مختلف الفئات نهاية الكيميائية متاحة تجاريا أو يتم تصنيعه بسهولة في المختبر. ومع ذلك، ينبغي توخي الحذر لضمان أن الجزيئات مع شاردة ثيول يجب أن يكون الجماعات نهاية الصحيحة، على سبيل المثال في البروتين أو الاقتران الببتيد، ينبغي للفريق الأمينية مواجهة الداخل للتفاعل مع المجموعة الكربوكسيلية من شاردة ثيول المربوطة على السطح ليحدث. هنا، كانت ثيول مترافق مباشرة مع mimetics ثلاثي الببتيد من الدهون البكتيرية الثاني من بجدار الخلية acterial أهداف توليفها من قبل منهجية المرحلة الصلبة باستخدام المتاحة تجاريا مسبقة انغ-D-علاء وانغ-D-لاك راتنجات ومستوى FMOC-حماية مجموعة الكيمياء 15. على الرغم من تركيز هذا الوصف للفانكومايسين، من الواضح أنها يمكن أن تمتد إلى المضادات الحيوية الأخرى، بل يتم إجراء المزيد من الدراسات دعا من قبل الباحثين من مختلف المجالات وخاصة في الكيمياء الحيوية، علم الصيدلة، والعلوم المادية لاعتماد هذا البروتوكول بسهولة لإجراء التجارب الخاصة بهم.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Items</td>
			<td>Catalog Number </td>
			<td>Company</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scentris</td>
			<td></td>
			<td>Scentris, Veeco Instruments, Inc</td>
			<td>Not in production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-way valve</td>
			<td></td>
			<td>MVP, Hamilton, Reno, NV</td>
			<td>Enables multiple concentration injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EB Evaporator</td>
			<td></td>
			<td>BOC Edwards Auto 500, UK</td>
			<td>Electron beam is preferable because of deformation of cantilevers caused by thermal heating problems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage vessel</td>
			<td></td>
			<td>Agar Scientific, UK</td>
			<td>Keeps gold coated films fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary</td>
			<td></td>
			<td>King Precision Glass, Claremont, CA, USA</td>
			<td>For capillary functionalization of the cantilever arrays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump</td>
			<td></td>
			<td>Model Genie Plus, Kent Scientific, Torrington, CT, USA</td>
			<td>Good for controlled flow rate of liquid samples in microfluidic channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2-4.5 &#956;m Filters</td>
			<td>1511940001</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>For sample filtering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilever chips</td>
			<td></td>
			<td>London Centre for Nanotechnology (LCN)</td>
			<td>Highly sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>For making buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>For making buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 80 (PS80) or Tween 80</td>
			<td>9005-65-6</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>Used in buffer solutions to prevent nonspecific interactions on glassware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td>Millipore Co., Billerica, MA, USA</td>
			<td>Used for making solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whole serum</td>
			<td>GEM-700-110-H</td>
			<td>Sera Laboratories International Ltd, UK</td>
			<td>Used in measurements that mimic physiological conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin (Van)</td>
			<td>1404-93-9</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>Drug used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>7664-93-9</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>Used for glassware cleaning procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>7722-84-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>Used for glassware cleaning procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Ala and D-Lac</td>
			<td></td>
			<td>London Centre for Nanotechnology (LCN)</td>
			<td>Surface receptors coated on the cantilever for detecting drug-target interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabView</td>
			<td></td>
			<td>National Instruments Co., Austin, TX, USA</td>
			<td>Software used for instrumental interface to allow controlled measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanomechanics of drug-target interactions and antibacterial resistance detection

وقد أظهرت أجهزة الاستشعار ناتئ، الذي يعمل بمثابة محول من التفاعلات بين نموذج البكتيرية جدار الخلية المصفوفة يجمد على سطحه وعقاقير المضادات الحيوية في الحل، وإمكانات كبيرة في تطبيقات الاستشعار البيوكيميائية مع حساسية وخصوصية لم يسبق لها مثيل 1-5. التفاعلات المستهدفة المخدرات توليد التوتر السطحي، مما تسبب في ناتئ على الانحناء، وإشارة يمكن تحليلها بصريا عندما يضيء عليه بواسطة الليزر. التغير في الضغط سطح قياس بدقة نانو النطاق يسمح للاضطرابات الميكانيكا الحيوية من نموذج البكتيرية جدار الخلية يستهدف لتعقبها في الوقت الحقيقي. وعلى الرغم من تقدم مزايا كبيرة، لم تم تطبيق عدة صفائف استشعار ناتئ في قياس التفاعلات المستهدفة المخدرات ملزمة. هنا، ونحن التقرير على استخدام السيليكون صفائف ناتئ متعددة المغلفة مع alkanethiol المجمعة monolayers النفس محاكاة الخلية البكتيرية مصفوفة الجدار لستو كمياالتفاعلات ملزم المضادات الحيوية دى. لفهم تأثير فانكومايسين على اليات البكتيرية الهياكل جدار الخلية 1،6،7. قمنا بتطوير نموذج جديد (1) الذي يقترح أن ناتئ الانحناء يمكن وصفها من قبل اثنين من العوامل المستقلة، وأنا) وهي أحد العوامل الكيميائية، والتي تعطى من قبل انجميور الكلاسيكية امتصاص حرارة ثابتة، من الذي نقوم بحساب الحرارية التوازن التفكك المستمر (K د) و II) عامل الهندسية، أساسا مقياس لكيفية توزيع مستقبلات الببتيد البكتيرية على سطح ناتئ. يستخدم توزيع سطح مستقبلات الببتيد (ع) للتحقيق في الاعتماد للهندسة وتحميل يجند. يتبين أن قيمة عتبة P ~ 10٪ أمر بالغ الأهمية لتطبيقات الاستشعار عن بعد. أدناه والتي لا يوجد أي إشارة يمكن كشفها في حين الانحناء فوق هذه القيمة، في إشارة الانحناء يزيد خطيا تقريبا، وكشف عن أن الإجهاد هو نتاج مادة كيميائية ملزم القوات المسلحة الكونغولية المحليةتور وعامل الهندسية يجمعهما الربط الميكانيكية من المناطق كان رد فعل ويقدم نموذجا جديدا للتصميم وكلاء قوية لمكافحة العدوى بكتيريا.

يتم استغلال التغيير الإجهاد قياسها باستخدام الدقة مقياس النانو مع حساسية غير مسبوقة لحذف H-السندات واحد، لتعقب الاضطرابات من نموذج الميكانيكا الحيوية البكتيرية جدار الخلية في الوقت الحقيقي (أرقام 2A-D). وكان التحقيق الحد من حساسية للكشف عن المخدرات لفان عن طريق تمييع متسلسل تركيزات في الخطوات من 1،000 ميكرومتر إلى ≤ 10 نانومتر، وكشف عن 10 نيوتن متر (~ 15 نانوغرام / مل) كما تحتوي على نسبة أقل كشفها مما أدى إلى ما متوسطه ~ -9 ± 2 نانومتر كما الإشارات الانحناء الفرق (الشكل 2C). القدرة على اكتشاف المضادات الحيوية تحت بيئة الفسيولوجية ومزيد من التحقيق في المصل في مجموعة تركيز ذات الصلة سريريا من 3-27 ميكرومتر 17. عند حقن من 7 ميكرومتر فان في مصل الدم (90٪ مصل العجل الجنين بالإضافة إلى 10٪ من الصوديوم العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 7.4) في جميع الكابولي في ظل ظروف مماثلة، في إشارة التفاضلية للDALA في مصل الدم كان 105 ± 4 نانومتر بينما لالكابولي المغلفة DLac، لم يلاحظ أي الانحناء (الشكل 3). هي سبب الإشارات الانحناء كبيرا لوحظ DALA المغلفة (فانكومايسين عرضة) الكابولي من تفاعلات قوية ملزمة المستهدفة المخدرات. ولكن لDLac المغلفة (مقاومة فانكومايسين) الكابولي، وجود تنافر للدولة أرض الواقع من الزوج الوحيد الأوكسجين وانخفاض السندات NH في جيب ملزمة فانكومايسين 10،12 يسهم في إضعاف التفاعلات المستهدفة المخدرات ملزم والذي ينتج في أقل أو لا ناتئ الانحناء، ولا سيما بالنسبة للتركيزات فانكومايسين السفلى (الشكل 3). ومع ذلك، لتركيز فانكومايسين عالية، نلاحظ إشارات الانحناء قابلة للقياس لDLac. وعلاوة على ذلك، لدينا تصميم تجريبي مهم لمراجع في الموقع حيث كل CAويتعرض ntilevers المغلفة مع كل دلع وDLac في وقت واحد لنفس الحليلة في الوقت الحقيقي. لفهم الدور المحدد الكيمياء والهندسة، قمنا بتصميم نموذج (أ) 1 اصفا العلاقة بين التفاعلات المذيبات والميكانيكا السطح. وهذا ينتج الضغط السطحية: <img alt="المعادلة 1" src="/files/ftp_upload/50719/50719eq1.jpg" /> لP&gt; الكمبيوتر وصفر خلاف ذلك (1) الفصل الدراسي الأول في المعادلة (1) هو انجميور امتزاز متساوي الحرارة، وهو ما يمثل الأحداث المستهدفة المخدرات ملزمة والفترة الثانية هي شكل قانون السلطة تصف عواقب الميكانيكية على نطاق واسع من تشكيل شبكة شدد. ثابت ليتوافق مع التوتر القصوى السطح عندما تكون جميع مواقع الربط التي يمكن الوصول إليها المحتلة وK d هو سطح التوازن سلبيات التفككتانت على ناتئ. التحليل كما هو مبين في الشكل (4) هو نتيجة لنوبة العالمية من المعادلة (1) فرضه على الفرق قياس إشارات الإجهاد يكشف؛ A ~ 29.7 ± 1.0 أو 14.1 ± 3.0 مليون / م وK د ~ 1.0 ± 0.3 أو 800 ± 310 ميكرومتر لD-علاء أو الببتيدات DLac، حيث يتوافق مع مقياس التوتر السطحي عندما تشغل جميع المواقع ملزم الوصول إليها. كان ضبطها حساسية تعزيز ناتئ من خلال تغيير منهجي كثافة الببتيد P في حين رصد البيانات الإجهاد بوصفها وظيفة من P بينما تركيزات المضادات الحيوية ثابتة عند 10، 100، و 250 ميكرومتر، على التوالي (الشكل 5). وتكرر هذه العملية مع الضغط كدالة للتركيزات فان في حين أن كثافة الببتيد ثابتة في P ~ 100٪. &lt;IMG بديل = &quot;الشكل 1&quot; FO: محتوى العرض = &quot;5IN&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/50719/50719fig1.jpg&quot; /&gt; الشكل 1. كشف ناتئ من المضادات الحيوية التفاعلات سطح ملزمة. أ) تمثيل تخطيطي من مجموعة أجهزة الاستشعار ناتئ وطريقة التي يتم من خلالها الكشف عن التفاعلات المستهدفة المخدرات nanomechanically. ب) التفاعل الكيميائي بين ملزمة جزيء المخدرات (فان) والتناظرية mucopeptide البكتيرية (D-علاء أو D-لاك). ج) الآلية التي يتم من خلالها تحور البكتيريا المكورة عرضة (VSE) يكتسب مقاومة للعقار عن طريق حذف H-السندات واحد في جيب ملزمة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50719/50719fig1large.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض أكبر شخصية</a> . <img alt="الشكل 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig2.jpg" /&gt; الشكل 2. تتبع الاضطرابات من طراز البكتيرية الميكانيكا الحيوية جدار الخلية في الوقت الحقيقي. أ) إشارات الانحناء المطلق من D-علاء، D-لاك وPEG الكابولي المغلفة في العازلة الفوسفات و 250 ميكرومتر فانكومايسين. وترد إشارات مرجعية PEG الفرق في خطوط سوداء. ب) إشارات الانحناء التفاضلية من D-علاء وD-لاك الكابولي المغلفة في العازلة الفوسفات و 250 ميكرومتر فانكومايسين. ج) ناتئ انحراف الفرق من إشارة تعتمد على الجرعة بوصفها وظيفة من الوقت في وجود تركيزات فانكومايسين في الترتيب من 10 نانومتر (الخط الأصفر)، و 100 نيوتن متر (خط أحمر) و 1،000 نيوتن متر (خط أحمر الداكن) على التوالي. د) ناتئ إشارات انحراف الفرق لمدة ثلاثة D-علاء أجهزة الاستشعار ناتئ المغلفة باعتباره وظيفة من الوقت في ظل وجود 10فانكومايسين نانومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50719/50719fig2large.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض أكبر شخصية</a> . <img alt="الشكل (3)" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig3.jpg" /> الشكل (3). تتبع من الاضطرابات من طراز البكتيرية الميكانيكا الحيوية جدار الخلية في الوقت الحقيقي لD-علاء وD-لاك الكابولي المغلفة في وجود 7 فانكومايسين ميكرومتر في مصل العجل الجنين. <img alt="الشكل 4" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig4.jpg" /> الشكل 4. التحقيق في nanomechanics من التفاعلات المستهدفة المخدرات. القطعة يظهر سطح الفرق قياس الاستجابة للتوتر لD-علاء (الدوائر السوداء) وD-لاك (الدوائر الحمراء) الكابولي المغلفة بوصفها وظيفة من فانكومايسينالتركيز في حل [فان]. يتم وصف البيانات بواسطة المعادلة (1) (خطوط الصلبة). 1 <img alt="الرقم 5" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig5.jpg" /> الشكل 5. تعظيم الاستفادة من حساسية الكشف ميكانيكية نانوية من التفاعلات مستقبلات يجند من خلال التحقيق في الاعتماد التحميل مستقبلات والهندسة عبر الطبقات الوحيدة المختلطة. المقاسة الفرق سطح استجابات التوتر من أجهزة الاستشعار ناتئ بوصفها وظيفة من D-علاء التغطية السطحية، p في وجود تركيزات فانكومايسين الثابتة في حل في 10 ميكرومتر (الخط الأسود)، و 100 ميكرومتر (خط أحمر)، و 250 ميكرومتر (الخط الأخضر).

Watch this Scientific Journal Video about Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection at JoVE.com

Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection

المقاومة المكتسبة للمضادات الحيوية هي مشكلة رئيسية الرعاية الصحية العامة وحاليا تحتل من قبل منظمة الصحة العالمية باعتبارها واحدة من أكبر الأخطار التي تهدد حياة الإنسان. نحن هنا وصف استخدام التكنولوجيا ناتئ لتحديد المقاومة للجراثيم، وهو أمر حاسم لاكتشاف عوامل جديدة وقوية ضد البكتيريا المقاومة للأدوية المتعددة.

Nanomechanics من المخدرات التفاعلات المستهدفة وكشف المقاومة للجراثيم

The cantilever sensor, which acts as a transducer of reactions between model bacterial cell wall matrix immobilized on its surface and antibiotic drugs in ...

nanomechanics-drug-target-interactions-antibacterial-resistance

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.1K Views.  University College London. المقاومة المكتسبة للمضادات الحيوية هي مشكلة رئيسية الرعاية الصحية العامة وحاليا تحتل من قبل منظمة الصحة العالمية باعتبارها واحدة من أكبر الأخطار التي تهدد حياة الإنسان. نحن هنا وصف استخدام التكنولوجيا ناتئ لتحديد المقاومة للجراثيم، وهو أمر حاسم لاكتشاف عوامل...

Video: Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

مزيج من الشريط اللاصق على أساس أخذ العينات والإسفار في الموقع تهجين للكشف السريع عن السالمونيلا على المنتجات الطازجة

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below 50-75 copies/ml) is necessary to gain insight to viral dynamics and virus host interactions in patients who naturally control the infection and those who are on combination antiretroviral therapy (cART). 
Here we describe how to amplify viral genomes by single genome sequencing (the SGS protocol) 13, 19 and how to accurately quantify HIV-1 RNA in patients with low viral loads (the single-copy assay (SCA) protocol) 12, 20. 
The single-copy assay is a real-time PCR assay with sensitivity depending on the volume of plasma being assayed. If a single virus genome is detected in 7 ml of plasma, then the RNA copy number is reported to be 0.3 copies/ml. The assay has an internal control testing for the efficiency of RNA extraction, and controls for possible amplification from DNA or contamination. Patient samples are measured in triplicate.
The single-genome sequencing assay (SGS), now widely used and considered to be non-labor intensive 3, 7, 12, 14, 15,is a limiting dilution assay, in which endpoint diluted cDNA product is spread over a 96-well plate. According to a Poisson distribution, when less than 1/3 of the wells give product, there is an 80% chance of the PCR product being resultant of amplification from a single cDNA molecule. SGS has the advantage over cloning of not being subjected to resampling and not being biased by PCR-introduced recombination 19. However, the amplification success of SCA and SGS depend on primer design. Both assays were developed for HIV-1 subtype B, but can be adapted for other subtypes and other regions of the genome by changing primers, probes, and standards.

Quantifying levels of HIV-1 RNA in plasma and sequencing single HIV-1 genomes from individuals with viral loads below the limit of detection (50-75 copies/ml) is difficult. Here we describe how to extract and quantify plasma viral RNA using a real time PCR assay that reliably measures HIV-1 RNA down to 0.3 copies/ml and how to amplify viral genomes by single genome sequencing, from samples with very low viral loads.

تضخيم وقياس HIV - 1 الحمض النووي الريبي في الأفراد المصابين بالايدز مع الأحمال الفيروسية أقل من الحد كشفها بواسطة فحوصات السريرية القياسية

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. Therefore, rapid administration of adequate antibiotic therapy is of foremost importance in the treatment of bloodstream infections. The critical element in this process is timing, heavily dependent on the results of bacterial identification and antibiotic susceptibility testing. Both of these parameters are routinely obtained by culture-based testing, which is time-consuming and takes on average 24-48 hours2, 4. The aim of the study was to develop DNA-based assays for rapid identification of bloodstream infections, as well as rapid antimicrobial susceptibility testing. The first assay is a eubacterial 16S rDNA-based real-time PCR assay complemented with species- or genus-specific probes5. Using these probes, Gram-negative bacteria including Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli as well as Gram-positive bacteria including Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp., and Streptococcus pneumoniae could be distinguished. Using this multiprobe assay, a first identification of the causative micro-organism was given after 2 h.
Secondly, we developed a semi-molecular assay for antibiotic susceptibility testing of S. aureus, Enterococcus spp. and (facultative) aerobe Gram-negative rods6. This assay was based on a study in which PCR was used to measure the growth of bacteria7. Bacteria harvested directly from blood cultures are incubated for 6 h with a selection of antibiotics, and following a Sybr Green-based real-time PCR assay determines inhibition of growth. The combination of these two methods could direct the choice of a suitable antibiotic therapy on the same day (Figure 1). In conclusion, molecular analysis of both identification and antibiotic susceptibility offers a faster alternative for pathogen detection and could improve the diagnosis of bloodstream infections.

The design of a straightforward one-day workflow scheme for bacterial pathogen diagnostics enables the rapid recognition of bloodstream infections. The inclusion of eight clinically relevant bacterial targets and their antibiotic resistance profiles offers the clinician an initial insight on the same day, which can lead to more adequate therapy.

في يوم واحد خطة سير العمل للكشف عن مسببات الأمراض البكتيرية ومضادات الميكروبات اختبار المقاومة من زرع الدم

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

الكشف عن جسيمات متناهية الصغر نيون التفاعل مع مجموعات سكانية فرعية خلية المناعة الأولية من قبل التدفق الخلوي

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

الفحص السريع للفيروس نقص المناعة البشرية والناسخ العكسي مثبطات Integrase

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

طريقة جديدة لتحليل نوعي متعدد حجم البكتيرية الأغشية الحيوية على شعيري الفطرية المستعمرات عن طريق متحد البؤر والمجهر الإلكتروني

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, preferably in models which mimic the intended clinical indication. A method for inducing robust lung infections in immunocompetent rats and mice is described which allows for the assessment of treatments in a model of serious pneumonia caused by S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae or A. baumannii. Animals are anesthetized, and an agar-based inoculum is deposited deep into the lung via nonsurgical intratracheal intubation. The resulting infection is consistent, reproducible, and stable for at least 48 h and up to 96 h for most isolates. Studies with marketed antibacterials have demonstrated good correlation between in vivo efficacy and in vitro susceptibility, and concordance between pharmacokinetic/pharmacodynamic targets determined in this model and clinically accepted targets has been observed. Although there is an initial time investment when learning the technique, it can be performed quickly and efficiently once proficiency is achieved. Benefits of the model include elimination of the neutropenic requirement, increased robustness and reproducibility, ability to study more pathogens and isolates, improved flexibility in study design and establishment of a challenging infection in an immunocompetent host.

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.

نموذج الالتهاب الرئوي القوي في مناعيا القوارض لتقييم مضاد للبكتيريا فعالية ضد<i&gt; S. الرئوية</i&gt;،<i&gt; H. النزلية</i&gt;،<i&gt; K. الرئوية</i&gt;،<em&gt; P. الزنجارية</em&gt; أو<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

منصة الفائق لفحص السالمونيلا spp./دوسنتاريا spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this challenge, dereplication, which is the process of identifying known compounds, is performed on samples of interest. Methods for dereplication such as analytical separation followed by mass spectrometry are time-consuming and resource-intensive. To improve the dereplication process, we have developed the antibiotic resistance platform (ARP). The ARP is a library of approximately 100 antibiotic resistance genes that have been individually cloned into Escherichia coli. This strain collection has many applications, including a cost-effective and facile method for antibiotic dereplication. The process involves the fermentation of antibiotic-producing microbes on the surface of rectangular Petri dishes containing solid medium, thereby allowing for the secretion and diffusion of secondary metabolites through the medium. After a 6 day fermentation period, the microbial biomass is removed, and a thin agar-overlay is added to the Petri dish to create a smooth surface and enable the growth of the E. coli indicator strains. Our collection of ARP strains is then pinned onto the surface of the antibiotic-containing Petri dish. The plate is next incubated overnight to allow for E. coli growth on the surface of the overlay. Only strains containing resistance to a specific antibiotic (or class) grow on this surface enabling rapid identification of the produced compound. This method has been successfully used for the identification of producers of known antibiotics and as a means to identify those producing novel compounds.

We describe a platform that utilizes a library of isogenic antibiotic resistant Escherichia coli for the dereplication of antibiotics. The identity of an antibiotic produced by bacteria or fungi can be deduced by the growth of E. coli expressing its respective resistance gene. This platform is economically effective and time-efficient.

المضادات الحيوية Dereplication باستخدام منصة مقاومه المضادات الحيوية

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...

Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant advantage over other methods. To prepare these probes, azide derivatives of antibiotics are synthesized, then coupled with alkyne-fluorophores using azide-alkyne dipolar cycloaddition by click chemistry. Following purification, the antibiotic activity of the fluorescent antibiotic is tested by minimum inhibitory concentration assessment. In order to study bacterial accumulation, either spectrophotometry or flow cytometry may be used, allowing for much simpler analysis than methods relying on radioactive antibiotic derivatives. Furthermore, confocal microscopy can be used to examine localization within the bacteria, affording valuable information about mode of action and changes that occur in resistant species. The use of fluorescent antibiotic probes in the study of antimicrobial resistance is a powerful method with much potential for future expansion.

Fluorescently tagged antibiotics are powerful tools that can be used to study multiple aspects of antimicrobial resistance. This article describes the preparation of fluorescently tagged antibiotics and their application to studying antibiotic resistance in bacteria. Probes can be used to study mechanisms of bacterial resistance (e.g., efflux) by spectrophotometry, flow cytometry, and microscopy.