ジョセフW. Ndieyiraは工学·物理科学研究評議会（EPRSC）、ナノテクノロジーにおける学際研究センター（IRC）、王立協会（RS）とBianoコンサルタント（BNC）によってサポートされていました。我々は有用な議論のために、アレドノソバレラ、徳周、マヌエルVögtli、マシューバチェラー、マシューA.クーパー、トルステンStrunz、トレバーレイメントとガブリエルAeppliに感謝します。

1。カンチレバーの作製<ol><li>テフロンピンセット浸すカンチレバーチップの選択された番号を使用して20分間作りたてピラニア溶液（比1:1のH 2 SO 4、H 2 O 2）に（100μm幅と0.9μmの厚さの長い500ミクロンを測定する各カンチレバー） 。 </li><li>約20分後、ピラニア溶液からカンチレバーチップを除去し、脱イオン水と作りたてピラニア溶液に直ちに転送にそれらを徹底的にすすいでください。チップは他の方法で次のステップに進んで汚れのスポットが含まれている場合、上記の手順1.1を繰り返します。 </li><li>脱イオン水で徹底的に洗浄後、純エタノールで洗い流し、水の痕跡を除去するために75℃のホットプレート上にカンチレバーチップを乾燥。彼らの清浄度を確認するために、光学顕微鏡を使用してそれらを点検します。 </li><li>蒸発室に洗浄カンチレバーチップを移し、ポンプダウン、真空を達成するためにターゲティング10 -7ミリバールの圧力。 </li><li> 20nmの厚さの金の付加的な層の前に接着層として作用する第2 nmのチタン、各カンチレバーアレイの必要な真空圧力が達成されれば、コート片側。彼らの厚さを確認するために、対象となるソースの上に直接配置水晶モニターを使用しています。 </li><li>開口部の前に真空下に冷却するために1〜2時間のためにチャンバー内に金被覆カンチレバーセンサチップにしておきます。 </li><li>汚染の任意のフォームを防ぐためにアルゴンを充填した真空収納容器に新たに蒸発させて、チップを転送する。 </li></ol> 2。カンチレバーチップの機能化<ol><li>まず、250μmのカンチレバーピッチサイズに応じて2官能ステージにマイクロキャピラリーチューブを手配。 </li><li>次いで、表面の標的分子、 すなわち細菌mucopeptides（D-Alaで及びD-ラック ）、および&#39;の慣性力2mMのエタノールチオールの溶液を注入するt &#39;の生体分子の吸着に抵抗することが知られているトリエチレングリコール（PEG）で終端するアルカンチオール。16キャピラリーチューブの各々は、ユーザバイアスを回避するためにランダムに決定各種の表面捕捉分子を含むべきである。 </li><li>表面捕捉分子を含むチオールソリューションで満たさマイクロキャピラリーでカンチレバー20分間次インキュベート。表面捕捉分子のソリ​​ューションは、クロスコンタミネーションを回避または最小限にするため、個々のカンチレバーセンサに限定されていることを確認します。このプロセスが正しく使用される場合、それは系統的受容体として、金コーティングされた表面上に形成するために、細菌ムコペプチド標的の自己組織化単分子層を形成させることにより化学的に活性なセンサーに新たに調製した金被覆カンチレバーを変えるべきである。 </li></ol> 3。ソリューションの準備<ol><li>超純水（18.2MΩ·cmの抵抗率）との組合せでtの0.1 Mモノ - およびジ - 塩基性リン酸ナトリウム塩を溶解さ7.4のpH値をもたらすO。 </li><li>ガラス製品への薬物分子の非特異的な相互作用によって引き起こされる凝集効果を最小限に抑えるため緩衝溶液にPS80の0.002％を加える。 </li><li> K Dの計算を可能にする目的の異なる濃度に新たにバッファリングされたソリューションと薬を希釈します。 </li><li> 0.2μmのフィルターを用いて新たに調製した薬液をフィルタリングし、アルゴンでパージする前に室温で5分間超音波処理する。 </li><li>全血清を使用してバッファリングされた血清中の薬物と同じ手順を繰り返します。完全な溶解性を確保するため、さらに5分で15分間穏やかにボルテックス。 </li></ol> 4。表面応力の検出<ol><li>液体フローセルチャンバーに官能化されたカンチレバーセンサチップを読み込む。 </li><li>各センサの自由端にレーザスポットの位置を合わせ、1℃で液体室を加熱することにより、位置合わせを確認全8金被覆カンチレバーセンサアレイは、包括を受ける必要がありますssive下向きのため、シリコンと金の膨張率の違いによるバイメタル効果の曲げ。 </li><li>約10分間加熱した後、カンチレバーはさらに10分間冷却することができます。 </li><li>個々のカンチレバーセンサー間最大曲げ信号における曲げ変化を計算し、曲げ信号の相対標準偏差は≤5％であれば望ましいが、そうでなければ処理を繰り返すように、その後の配置を受け入れる。 </li><li>次に、それらのバネ定数を計算するためにすべての8つのカンチレバーの共振周波数を測定します。チップ内の各カンチレバーセンサー間のバネ定数の変化は≤1％が、その後一貫し機械的性質は、他の方法でカンチレバーチップセンサーを置き換えるものとしてチップを受け入れている場合。 </li><li>次に、データ取得がように、自動のLabViewを用いて達成されるべきである一方、フローセル内の液体の交換を達成するために6方弁を介して流体システムモデル（ジニープラス）を使用するftware。 </li><li> 、カンチレバーの曲げデータを監視し、以下の測定プロトコルを使用するには、次のI）をベースラインを確立するために5-30分間持続する制御測定のために薬なしで緩衝液または血清のいずれかを注入し、ii）30〜60分間、薬液を注入し、ⅲ）結合した薬物複合体を解離するために10〜60分間、10mMのHClで洗浄を注入し、iv）が、最終的に表面ペプチドを再生成し、基準信号を復元するために別の5〜30分間緩衝液を用い、さらに洗浄工程を注入する。常にすべての信号は30〜180μL/分の一定の液体流量下で温度制御キャビネット内25℃の一定温度で取得されていることを確認する。 </li><li>すべての8つのカンチレバーの絶対曲げ信号は、単一の位置敏感型検出器を用いて光ビーム方式を多重シリアル時間を使用して監視する必要があります。 </li><li>薬剤の各濃度から曲げ信号を分析するために、得られた差分曲がることが差動STRESに変換されるストーの式を用いてカンチレバーの上側と下側との間にsである。 </li></ol>

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	<li>Ndieyira, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+detection+of+antibiotic-mucopeptide+binding+in+a+model+for+superbug+drug+resistance.">Nanomechanical detection of antibiotic-mucopeptide binding in a model for superbug drug resistance.</a> Nat. Nanotech. 3, 691-696 (2008).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+label-free+nanomechanical+detection+of+biomarker+transcripts+in+human+RNA.">Rapid and label-free nanomechanical detection of biomarker transcripts in human RNA.</a> Nat. Nanotech. 1, 214-220 (2006).</li><li>McKendry, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+label-free+biodetection+and+quantitative+DNA-binding+assays+on+a+nanomechanical+cantilever+array.">Multiple label-free biodetection and quantitative DNA-binding assays on a nanomechanical cantilever array.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 9783-9788 (2002).</li><li>Wu, G., Datar, R. H., Hansen, K. M., Thundat, T., Cote, R. J., Majumdar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioassay+of+prostate-specific+antigen+(PSA)+using+microcantilevers.">Bioassay of prostate-specific antigen (PSA) using microcantilevers.</a> Nat. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+vancomycin+group+antibiotics+to+D-alanine+and+D-lactate+presenting+self-assembled+monolayers.">Binding of vancomycin group antibiotics to D-alanine and D-lactate presenting self-assembled monolayers.</a> Bioorg. Med. Chem. 8, 2609-2616 (2000).</li><li>Rao, J., Yan, L., Xu, B., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+surface+plasmon+resonance+to+study+the+binding+of+vancomycin+and+its+dimer+to+self-assembled+monolayers+presenting+D-Ala-D-Ala.">Using surface plasmon resonance to study the binding of vancomycin and its dimer to self-assembled monolayers presenting D-Ala-D-Ala.</a> J. Am. Chem. Soc. 121, 2629-2630 (1999).</li><li>MacBeath, G., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+Proteins+as+Microarrays+for+High-Throughput+Function+Determination.">Printing Proteins as Microarrays for High-Throughput Function Determination.</a> Science. 289, 1760-1763 (2000).</li><li>Baller, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cantilever+array-based+artificial+nose.">A cantilever array-based artificial nose.</a> Ultramicroscopy. 82, 1-9 (2000).</li><li>Burg, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weighing+of+biomolecules,+single+cells+and+single+nanoparticles+in+fluid.">Weighing of biomolecules, single cells and single nanoparticles in fluid.</a> Nature. 446, 1066-1069 (2007).</li><li>Lahiri, J., Isaacs, L., Tien, J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+the+generation+of+surfaces+presenting+ligands+for+studies+of+binding+based+on+an+active+ester+as+a+common+reactive+intermediate:+A+surface+plasmon+resonance+study.">A strategy for the generation of surfaces presenting ligands for studies of binding based on an active ester as a common reactive intermediate: A surface plasmon resonance study.</a> Anal. Chem. 71, 777-790 (1999).</li><li>Nugaeva, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromechanical+cantilever+array+sensors+for+selective+fungal+immobilization+and+fast+growth+detection.">Micromechanical cantilever array sensors for selective fungal immobilization and fast growth detection.</a> Biosens. Bioelectron. 21, 849-856 (2005).</li><li>Von Muhlen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biomarker+sensing+in+undiluted+serum+with+suspended+microchannel+resonators.">Label-free biomarker sensing in undiluted serum with suspended microchannel resonators.</a> Anal. Chem. 82, 1905-1910 (2010).</li><li>Godin, M., M, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+buoyant+mass+to+measure+the+growth+of+single+cells.">Using buoyant mass to measure the growth of single cells.</a> Nat. Methods. 7, 387-390 (2010).</li><li>Mertens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+gas+trace+of+hydrofluoric+acid+using+microcantilever.">Detection of gas trace of hydrofluoric acid using microcantilever.</a> Sens. Actuators B Chem. 99, 58-65 (2004).</li><li>Porter, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+solidstate+sensor+platform+for+the+detection+of+hydrogen+cyanide+gas.">A solidstate sensor platform for the detection of hydrogen cyanide gas.</a> Sens. Actuator B Chem. 123, 313-317 (2007).</li></ol>

利害の衝突は宣言されていない

分子認識パラダイムを支える生物学と医学の大帯状。薬理学では、例えば目標は、transglycoslyationまたは細菌細胞壁のペプチドの架橋を触媒するペプチド転移などの生化学的プロセスの主要な参加者を対象として病理学的経路を妨害することである。薬物設計は、したがって、完全な適合を誘導するために、特定の細菌のドッキング部位を対象とする適切な分子を画定するまで低減される。このアプローチの成功をエミュレートする典型的な例はペプチドグリカン細胞壁を標的とバンコマイシン（ バン ）、細菌の保存された構造的特徴である。初期のグラム陽性菌では、ペプチドグリカン行列はここにD-Alaで呼ばれるC55脂質リンカ8-10介してつながシーケンスリジン-D-アラニン-D-アラニンで終端ペプチドで構成されています。ペプチドグリカン前駆体上のこれらの暴露ペプチドはための基本である過酷な環境力に対する細菌細胞の機械的保護、および重要なことは、それらの抗生物質にも理想的な目標を作り、ヒト細胞で発見されていない。 バンは、具体的にはやや強いファンデペプチドを形成する細菌細胞壁のペプチドのC-末端に結合する図1に示すような複雑。 ヴァン露出したペプチドブロック、効果的に架橋するからそれらを停止するため、nanomechanically破裂1,6ことによって、その死に至る細菌細胞を弱める、細胞壁1の架橋触媒transpeptidasesとtransglycosylasesの行動、の間のこの相互作用7。 バンコマイシン耐性腸球菌 （VRE）の出現が増加医療問題11で、 腸内細菌の抵抗はアミド林の微妙な変化に起因し発生したためエステル結合8、細菌が削除の表面結合ポケットのその後の変更でヴァンのドッキング部位から単一の水素結合で、この一見単純な構造変化への影。重要なのはこのプロセスはバン-D-Lacの結合親和性での大幅な削減をもたらし、ここでD-Lacのと呼ばれる、リジン-D-アラニン-D-乳酸10,12にバンコマイシン感受性の腸内ペンタペプチド末端アラニン存在（VSE）を変更する腸球菌感染症1、抗生物質耐性菌の驚くべき成長に対する治療効果のない大きさのレンダリングバンの3桁は、したがって、耐性菌多剤に対する抗菌剤の抗菌活性またはより強力な薬の発見を加速し、復元するために革新的なアプローチの開発を推進しています感染症。 <pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;自立型カンチレバーを用いた我々の実験は、このような運動に化学エネルギーを活用した細胞のようなシステムに触発されています。機械的運動に化学エネルギーを変換するカンチレバーセンサの能力は、それらをリアルタイムで細菌細胞壁ターゲットの機械的な中断を監視するための顕著な利点を有するプローブを一意になる。カンチレバーセンサーはない記者 &#39;タグ&#39;を必要とし、生体分子は、シングルステップ反応で急速に検出されます。彼らはそのような緩衝液と全血清などの生理的な環境下において、並列に複数の薬をスクリーニングすることができる。また、カンチレバー技術は、標準的な半導体処理経路を介して、それらの製造のおかげで、それらは数千のハイスループットスクリーニングのための大量生産と並列化のために適している、それらが特異的薬物標的相互作用を検出することができ、差動測定のためにその場で参照に使用され、時間あたりの薬剤。参加者をでウラル複数カンチレバーセンサアレイは、バンコマイシンに抗生物質耐性を研究するための有用なツールである-バンコマイシンへの抵抗は、基本的に機械的な問題が1,6,7であるためです。溶液中のモデル細菌細胞壁対象とバンの間の反応は、薬物標的の結合相互作用から誘導された臨床的に関連する応力の変化を監視することによって検出することができる。カンチレバーの曲げ信号に現れる表面反応から発生する応力は、レーザビームを照射センサにより光学的に分析される。またカンチレバーセンサーの上に細菌表面の標的分子の受容コーティングを調整することにより、検体の非限られた数（ ヴァン ）、特異的な生化学的相互作用に近く、モデル細菌の細胞壁マトリックスの力学がリアルタイムで監視されます。別に分子認識イベントから、デフにカンチレバーセンサーを引き起こす可能性がありますいくつかの要因があります温度変動、非特異的な結合または溶液の屈折率の変化を - LECT含む。非特異的なシグナルを考慮して、 その場で差動測定では 、測定と基準カンチレバー両方の屈曲が連続特異的相互作用を分析するために監視されている場所に実行されます。また、表面の化学的性質および形状に依存するカンチレバーセンサの検出感度は、pがカンチレバーの上面全体領域に捕捉分子によって占有される表面積の比として定義される面密度ウェブ （調整することによって向上させることができるX線光電子分光法（XPS）1によって決定される分子の総人口によって覆われている。 ここでは、このプロトコルの詳細をどのようにバンコマイシンまたは緩衝液中で臨床的に関連する濃度で細菌細胞壁前駆体アナログ（mucopeptides）に、他の抗生物質の結合番目の血清は、ラベルフリーカンチレバー技術を用いて検出することができる。自己組織化単分子膜（SAMの）が容易にクリーンな金13,14に安定した層を形成する傾向があるため、新たな金の表面が使用される。 SAMのは、通常、他の端にある希望のキャプチャユニットを自由溶液中の分析物のターゲットと相互作用することが許されている間に共有結合的に金表面に取り付けチオール部分と短い分子で構成されています。チオールは、特に、異なる化学末端基を有する多くのチオール化合物は市販されているか、容易に実験室で合成されることを考えると柔軟なシステムを形成する。しかし、注意がチオール部分を有する分子が正しい末端基を持っている必要があることを保証するために取られるべきである、タンパク質またはペプチド共役で例えば、アミノ基につながチオール基のカルボキシル基との反応のために内側に向くように発生する表面。ここでは、チオールは、Bから細菌脂質IIのトリペプチド模倣物と直接共役あっacterial細胞壁を用いた固相方法により合成目標市販の王-D-Alaのと王-D-Lacの樹脂や標準的なFmoc保護基化学15プリロード。この説明はバンコマイシンに集束されていますが、明らかにそれは他の抗生物質に拡張することができ、実際にさらなる研究が異なる特に生化学、薬理学のフィールド、そして簡単に、独自の実験のためにこのプロトコルを採用する材料科学の研究者によって招待されています。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Items</td>
			<td>Catalog Number </td>
			<td>Company</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scentris</td>
			<td></td>
			<td>Scentris, Veeco Instruments, Inc</td>
			<td>Not in production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-way valve</td>
			<td></td>
			<td>MVP, Hamilton, Reno, NV</td>
			<td>Enables multiple concentration injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EB Evaporator</td>
			<td></td>
			<td>BOC Edwards Auto 500, UK</td>
			<td>Electron beam is preferable because of deformation of cantilevers caused by thermal heating problems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage vessel</td>
			<td></td>
			<td>Agar Scientific, UK</td>
			<td>Keeps gold coated films fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary</td>
			<td></td>
			<td>King Precision Glass, Claremont, CA, USA</td>
			<td>For capillary functionalization of the cantilever arrays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump</td>
			<td></td>
			<td>Model Genie Plus, Kent Scientific, Torrington, CT, USA</td>
			<td>Good for controlled flow rate of liquid samples in microfluidic channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2-4.5 &#956;m Filters</td>
			<td>1511940001</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>For sample filtering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilever chips</td>
			<td></td>
			<td>London Centre for Nanotechnology (LCN)</td>
			<td>Highly sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>For making buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>For making buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 80 (PS80) or Tween 80</td>
			<td>9005-65-6</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>Used in buffer solutions to prevent nonspecific interactions on glassware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td>Millipore Co., Billerica, MA, USA</td>
			<td>Used for making solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whole serum</td>
			<td>GEM-700-110-H</td>
			<td>Sera Laboratories International Ltd, UK</td>
			<td>Used in measurements that mimic physiological conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin (Van)</td>
			<td>1404-93-9</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>Drug used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>7664-93-9</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>Used for glassware cleaning procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>7722-84-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>Used for glassware cleaning procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Ala and D-Lac</td>
			<td></td>
			<td>London Centre for Nanotechnology (LCN)</td>
			<td>Surface receptors coated on the cantilever for detecting drug-target interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabView</td>
			<td></td>
			<td>National Instruments Co., Austin, TX, USA</td>
			<td>Software used for instrumental interface to allow controlled measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanomechanics of drug-target interactions and antibacterial resistance detection

溶液中のその表面と抗生物質上に固定化されたモデル細菌の細胞壁マトリックスとの間の反応の変換器として作用するカンチレバーセンサは、前例のない感度と特異1-5と生化学的検知用途において大きな可能性を示している。薬物標的相互作用は、カンチレバーが曲がることを引き起こして、表面応力を生成し、それがレーザによって照射されるときの信号は、光学的に分析することができる。ナノスケールの精度で測定された表面応力の変化は、リアルタイムで追跡するモデル細菌細胞壁対象の生体力学の中断を可能にする。かなりの利点は、複数のカンチレバーセンサアレイを提供するにもかかわらず、薬物標的結合相互作用の定量化に適用されていない。 ここでは、定量的STUに細菌細胞壁マトリックスを模倣するアルカンチオール自己組織化単分子膜でコーティングされたシリコン複数のカンチレバーアレイの使用について報告DY抗生物質結合相互作用。細菌の細胞壁構造1,6,7の力学上のバンコマイシンの影響を理解する。我々は、湾曲そのカンチレバーは、2つの独立した要因によって説明することができる提案する新しいモデル1を開発し、i）は、即ち古典的なラングミュア吸着等温線により与えられる化学的因子は、そこから我々は、熱力学的平衡解離定数を算出する（K d）およびⅱ）幾何学的要因、細菌ペプチド受容体はカンチレバー表面に分布されている方法の本質的尺度。ペプチド受容体の表面分布（p）は形状およびリガンドローディングの依存性を調査するために使用される。これは、pのしきい値〜10％が検出アプリケーションにとって重要であることが示されている。この値を超えて、曲げ信号はそのストレスを明らかにし、ほぼ直線的に増加している間は検出曲げ信号がありませんこれを下回ると、局所的な化学結合FACの産物である器と反応した地域の機械的な接続性によって結合幾何要因と超強力な感染症に対抗するための強力な薬剤の設計のための新しいパラダイムを提供します。

単H結合の削除に前例のない感度でナノスケールの精度を使用して測定された応力変化をリアルタイム（ 図2a-d）は 、モデル細菌細胞壁のバイオメカニクスの中断を追跡するために利用される。 バンのための薬剤の検出感度の限界が直列〜-9の平均値±を生じる最低検出濃度としては10nM（約15 ngの/ ml）を明らかにし、1,000μMから≤10 nMでのステップで、その濃度を希釈することにより調べた2差曲げ信号（ 図2c）のようなNM。生理的環境下で抗生物質を検出する能力は、さらに3-27μM17の臨床的に関連する濃度範囲において血清を調べた。同一の条件の下で、すべての片持ち梁の両端血清17.78μM ヴァン （90％ウシ胎児血清プラス10％のリン酸ナトリウム緩衝液pH 7.4）用の差動信号の注入の際血清中のダラだった 105±4nmのDLacコーティングカンチレバーのため、全く曲げます（ 図3）が観察されなかった。 ダラ被覆（バンコマイシン感受性の）カンチレバーに対して観察かなり曲げ信号が強い薬物標的の結合相互作用によって引き起こされます。しかしDLacの被覆（バンコマイシン耐性）カンチレバー、バンコマイシン結合ポケット10,12の酸素孤立電子対と減少NH結合の基底状態の反発力の存在をより少なく、その結果、薬物標的結合相互作用の弱体化に貢献または全くカンチレバーは特に低バンコマイシン濃度（ 図3）のために、曲げない。しかし、高バンコマイシン濃度のために、我々はDLacため測定可能曲げ信号を観測。さらに、我々の実験的なデザインは、 その場で参照のために重要であるすべてのCAダラとDLac両方でコーティングntileversを同時にリアルタイムで同じ検体にさらされている。 化学とジオメトリの正確な役割を理解するために、我々は、溶媒の相互作用と表面力学の間の相関関係を記述するモデル1を設計しました。これは、表面応力を生成します。 <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/50719/50719eq1.jpg" /> P&gt; PCとそうでない場合はゼロ（1） 式の最初の項（1）は、ラングミュア吸着等温線、薬剤標的結合事象の会計処理であり、第2項は、ストレスを受けたネットワーク形成の大規模な機械的な影響を記述べき乗則フォームです。すべてのアクセス可能な結合部位が占有されている時定数は最大表面応力に対応し、K dは表面の平衡解離短所ですカンチレバーに重要。 図4に示すように、分析は明らかに測定された応力差動信号に重畳式のグローバルフィッティング（1）の結果である。〜29.7±1.0または14.1±3.0 MN / mおよびK dは 1.0〜0.3±または800±310表面応力の測定に対応し、すべてのアクセス可能な結合部位が占有されているD-アラまたはDLacペプチド用μM。 ウェブの関数として応力データを監視しながら抗生物質濃度はそれぞれ10,100、および250μM、（ 図5）に固定しながら、カンチレバーの感度の向上を系統的ペプチド濃度pを変化させることによって調整した。ペプチド密度が pに固定しながらプロセスがヴァン濃度の関数としてストレスを繰り返した〜100％。 &lt;IMG ALT = &quot;図1&quot;のfo：コンテンツ幅= &quot;5インチ&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/50719/50719fig1.jpg&quot; /&gt; 図1。抗生物質の表面結合相互作用のカンチレバー検出。薬物標的相互作用がnanomechanically検出されることによりカンチレバーセンサアレイ及びモード）模式図。b）は、薬物分子（ バン ）および細菌ムコペプチドアナログ（D-Alaで又はD-ラク ）との間の化学的結合相互作用。 c）の変異バンコマイシン感受性の細菌によるメカニズム（VSE）が結合ポケット内の単一の水素結合を削除することによって、バンコマイシンに対する耐性を獲得します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50719/50719fig1large.jpg" target="_blank">より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig2.jpg" /&gt; 図2。リアルタイムでモデル細菌細胞壁バイオメカニクスの中断を追跡。 A）D-Alaの、D-LACとリン酸緩衝液と250μMバンコマイシンにおけるPEGコーティングカンチレバーの絶対曲げ信号。差動PEG基準信号は、黒線で示されている。b）のD-Alaでリン酸緩衝液および250μMのバンコマイシンでD-Lacの被覆カンチレバー時間の関数としての用量依存信号。c）の差動カンチレバーのたわみの差曲げ信号10 nMの（黄色の線）、100 nMの（赤線）と、それぞれ1,000 NM（濃い赤線）の順にバンコマイシン濃度の存在下で、D）の差動カンチレバー偏向信号3 D-Alaでコーティングされたカンチレバーセンサー用として10の存在下における、時間の関数nmのバンコマイシンは<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50719/50719fig2large.jpg" target="_blank">大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig3.jpg" /> 図3。牛胎児血清で7μMバンコマイシンの存在下でD-アラとD-Lacのコーティングされたカンチレバーをリアルタイムでモデル細菌細胞壁のバイオメカニクスの混乱の追跡。 <img alt="図4" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig4.jpg" /> 図4。薬物ターゲット相互作用のナノメカニクスを調査。バンコマイシンの関数として測定差表面応力のD-Alaのための応答（黒丸）とD-Lacのを示すプロット（赤丸）コーティングされたカンチレバーは溶液中の濃度[バン]。データは、（1）式（実線）に記載されている。1 <img alt="図5" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig5.jpg" /> 図5。混合された単層を介して受容体の負荷および形状の依存性を調べることにより、受容体-リガンド相互作用のナノメカニカル検出感度の最適化D-Alaで表面被覆率の関数として、カンチレバーセンサの測定差動表面応力応答は、の固定バンコマイシン濃度の存在下におけるp 10μM（黒線）、100μM（赤線）、および250μM（緑の線）での解。

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Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection

抗生物質に対する獲得耐性は、主要な公共医療問題であり、現在は人間の生命への最大の脅威の一つとしてWHOによってランク付けされています。ここでは、多剤耐性菌のに対して新規かつ強力な薬剤の発見に重要な、抗菌性を定量化するカンチレバー技術の使用を記載している。

薬物ターゲット相互作用と抗菌抵抗検出のナノメカニクス

The cantilever sensor, which acts as a transducer of reactions between model bacterial cell wall matrix immobilized on its surface and antibiotic drugs in ...

nanomechanics-drug-target-interactions-antibacterial-resistance

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.1K ビュー.  University College London. 抗生物質に対する獲得耐性は、主要な公共医療問題であり、現在は人間の生命への最大の脅威の一つとしてWHOによってランク付けされています。ここでは、多剤耐性菌のに対して新規かつ強力な薬剤の発見に重要な、抗菌性を定量化するカンチレバー技術の使用を記載している。

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Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

粘着テープベースのサンプリングと蛍光の組み合わせその場で</emの迅速検出のための>ハイブリダイゼーションサルモネラ生鮮食品について

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

免疫・感染学

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below 50-75 copies/ml) is necessary to gain insight to viral dynamics and virus host interactions in patients who naturally control the infection and those who are on combination antiretroviral therapy (cART). 
Here we describe how to amplify viral genomes by single genome sequencing (the SGS protocol) 13, 19 and how to accurately quantify HIV-1 RNA in patients with low viral loads (the single-copy assay (SCA) protocol) 12, 20. 
The single-copy assay is a real-time PCR assay with sensitivity depending on the volume of plasma being assayed. If a single virus genome is detected in 7 ml of plasma, then the RNA copy number is reported to be 0.3 copies/ml. The assay has an internal control testing for the efficiency of RNA extraction, and controls for possible amplification from DNA or contamination. Patient samples are measured in triplicate.
The single-genome sequencing assay (SGS), now widely used and considered to be non-labor intensive 3, 7, 12, 14, 15,is a limiting dilution assay, in which endpoint diluted cDNA product is spread over a 96-well plate. According to a Poisson distribution, when less than 1/3 of the wells give product, there is an 80% chance of the PCR product being resultant of amplification from a single cDNA molecule. SGS has the advantage over cloning of not being subjected to resampling and not being biased by PCR-introduced recombination 19. However, the amplification success of SCA and SGS depend on primer design. Both assays were developed for HIV-1 subtype B, but can be adapted for other subtypes and other regions of the genome by changing primers, probes, and standards.

Quantifying levels of HIV-1 RNA in plasma and sequencing single HIV-1 genomes from individuals with viral loads below the limit of detection (50-75 copies/ml) is difficult. Here we describe how to extract and quantify plasma viral RNA using a real time PCR assay that reliably measures HIV-1 RNA down to 0.3 copies/ml and how to amplify viral genomes by single genome sequencing, from samples with very low viral loads.

標準的な臨床アッセイによる検出限界以下のウイルス量とHIV感染個体におけるHIV - 1 RNAを増幅して定量化

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. Therefore, rapid administration of adequate antibiotic therapy is of foremost importance in the treatment of bloodstream infections. The critical element in this process is timing, heavily dependent on the results of bacterial identification and antibiotic susceptibility testing. Both of these parameters are routinely obtained by culture-based testing, which is time-consuming and takes on average 24-48 hours2, 4. The aim of the study was to develop DNA-based assays for rapid identification of bloodstream infections, as well as rapid antimicrobial susceptibility testing. The first assay is a eubacterial 16S rDNA-based real-time PCR assay complemented with species- or genus-specific probes5. Using these probes, Gram-negative bacteria including Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli as well as Gram-positive bacteria including Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp., and Streptococcus pneumoniae could be distinguished. Using this multiprobe assay, a first identification of the causative micro-organism was given after 2 h.
Secondly, we developed a semi-molecular assay for antibiotic susceptibility testing of S. aureus, Enterococcus spp. and (facultative) aerobe Gram-negative rods6. This assay was based on a study in which PCR was used to measure the growth of bacteria7. Bacteria harvested directly from blood cultures are incubated for 6 h with a selection of antibiotics, and following a Sybr Green-based real-time PCR assay determines inhibition of growth. The combination of these two methods could direct the choice of a suitable antibiotic therapy on the same day (Figure 1). In conclusion, molecular analysis of both identification and antibiotic susceptibility offers a faster alternative for pathogen detection and could improve the diagnosis of bloodstream infections.

The design of a straightforward one-day workflow scheme for bacterial pathogen diagnostics enables the rapid recognition of bloodstream infections. The inclusion of eight clinically relevant bacterial targets and their antibiotic resistance profiles offers the clinician an initial insight on the same day, which can lead to more adequate therapy.

血液培養から細菌性病原体の検出および抗菌剤耐性テストのための一日のワークフロースキーム

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

フローサイトメトリーによる一次免疫細胞亜集団との蛍光ナノ粒子の相互作用を検出

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

HIV逆転写酵素及びインテグラーゼ阻害剤の迅速なスクリーニング

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

遺伝子または薬物療法で使用するためのHIV-1産生を標的RNAの有効性および毒性の評価

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

共焦点顕微鏡および電子顕微鏡を用いて糸状菌コロニー上の細菌のバイオフィルムの定性的マルチスケール解析のための新しい方法

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, preferably in models which mimic the intended clinical indication. A method for inducing robust lung infections in immunocompetent rats and mice is described which allows for the assessment of treatments in a model of serious pneumonia caused by S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae or A. baumannii. Animals are anesthetized, and an agar-based inoculum is deposited deep into the lung via nonsurgical intratracheal intubation. The resulting infection is consistent, reproducible, and stable for at least 48 h and up to 96 h for most isolates. Studies with marketed antibacterials have demonstrated good correlation between in vivo efficacy and in vitro susceptibility, and concordance between pharmacokinetic/pharmacodynamic targets determined in this model and clinically accepted targets has been observed. Although there is an initial time investment when learning the technique, it can be performed quickly and efficiently once proficiency is achieved. Benefits of the model include elimination of the neutropenic requirement, increased robustness and reproducibility, ability to study more pathogens and isolates, improved flexibility in study design and establishment of a challenging infection in an immunocompetent host.

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.

免疫担当げっ歯類で堅牢な肺炎モデルはに対して抗菌有効性を評価するために<i&gt; S。ニューモニエ</i&gt;、<i&gt; H。インフルエンザ</i&gt;、<i&gt; K。ニューモニエ</i&gt;、<em&gt; P。緑膿菌</em&gt;または<em&gt; A。バウマニ</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

サルモネラ属菌のスクリーニングのための高スループット プラットフォーム/赤痢菌属

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this challenge, dereplication, which is the process of identifying known compounds, is performed on samples of interest. Methods for dereplication such as analytical separation followed by mass spectrometry are time-consuming and resource-intensive. To improve the dereplication process, we have developed the antibiotic resistance platform (ARP). The ARP is a library of approximately 100 antibiotic resistance genes that have been individually cloned into Escherichia coli. This strain collection has many applications, including a cost-effective and facile method for antibiotic dereplication. The process involves the fermentation of antibiotic-producing microbes on the surface of rectangular Petri dishes containing solid medium, thereby allowing for the secretion and diffusion of secondary metabolites through the medium. After a 6 day fermentation period, the microbial biomass is removed, and a thin agar-overlay is added to the Petri dish to create a smooth surface and enable the growth of the E. coli indicator strains. Our collection of ARP strains is then pinned onto the surface of the antibiotic-containing Petri dish. The plate is next incubated overnight to allow for E. coli growth on the surface of the overlay. Only strains containing resistance to a specific antibiotic (or class) grow on this surface enabling rapid identification of the produced compound. This method has been successfully used for the identification of producers of known antibiotics and as a means to identify those producing novel compounds.

We describe a platform that utilizes a library of isogenic antibiotic resistant Escherichia coli for the dereplication of antibiotics. The identity of an antibiotic produced by bacteria or fungi can be deduced by the growth of E. coli expressing its respective resistance gene. This platform is economically effective and time-efficient.

抗生物質耐性プラットフォームを用いた抗生物質脱複製

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...