ג&#39;וזף וו Ndieyira נתמכה על ידי הנדסת מדעים הפיזיקליים מועצה למחקר (EPRSC), מרכז למחקר רב תחומי בננוטכנולוגיה (IRC), חברה המלכותית (RS) וייעוץ ביאנו (BNC). אנו מודים, אלחנדרה Donoso Barrera, Dejian ג&#39;ואו, מנואל Vögtli, מתיו באצ&#39;לור, מתיו א קופר, טורסטן Strunz, טרבור Rayment וגבריאל Aeppli לדיונים מועילים.

1. הכנת cantilevers <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בטפלון פינצטה לטבול מספר הנבחר של שבבי שלוחה (כל שלוחה מדידה 500 מיקרומטר הארוך, 100 מיקרומטר רחב ו0.9 מיקרומטר עבה) לפתרון Piranha טרי (ב 1:1 H 2 SO 4 ו-H 2 O 2) במשך 20 דקות . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כ 20 דקות להסיר את שבבי שלוחה מפתרון Piranha ולשטוף אותם ביסודיות עם מים deionized ולהעביר באופן מיידי לפתרון Piranha מוכן טרי. חזור על שלב 1.1 לעיל, אם את השבבים מכילים כתמי לכלוך אחר, המשיכו לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ניקוי יסודי במי deionized, לשטוף עם אתנול טהור ולייבש את שבבי שלוחה על פלטה חמה על 75 ° C כדי להסיר כל עקבות של מים. לבדוק אותם באמצעות מיקרוסקופ אופטי כדי לאשר הניקיון שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את שבבי שלוחה ניקו לתא אידוי ולשאוב למטה, כדי להשיג מיקוד ואקוםלחץ של 10 -7 mbar. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שלחץ הוואקום הנדרש יושג, צד אחד מעיל של כל מערך שלוחה עם טיטניום 2 ננומטר ראשון שפועל כשכבת הדבקה לפני שכבה נוספת של 20 ננומטר זהב עבה. כדי לאשר את העובי שלהם, להשתמש בצג גביש קוורץ ממוקם ישירות מעל למקור היעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר שבבי חיישן שלוחה מצופים זהב בתא עבור 1-2 שעות להתקרר תחת ואקום לפני הפתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את השבבים טריים התאדו לכלי אחסון ואקום מלאים בארגון, כדי למנוע כל סוג של זיהומים. </li></ol> 2. Functionalization צ&#39;יפ שלוחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> , ראשית לארגן צינורות מייקר הנימים על במה functionalization 2 בהתאם לגודל המגרש שלוחה של 250 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן 2 מ&quot;מ פתרונות האתנולית תיאול של מולקולות מטרת משטח, mucopeptides חיידקי IE (D-עלא ו-D-Lac) להזריק, וINER &#39;alkanethiol &#39;לא מסתיים בגליקול triethylene (PEG) ידועה להתנגד biomolecular ספיחה. 16 כל אחד מtubings הנימים צריך להכיל מולקולות ללכוד שטח שונים שנקבעו באופן אקראי, כדי למנוע הטיה משתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הבאה במשך 20 דקות את cantilevers בmicrocapillaries מלאה בפתרונות המכילים מולקולות תיאול לכידת פני שטח. להבטיח כי פתרונות של המולקולות ללכוד משטח מוגבלים על כל חיישן שלוחה אדם, כדי למנוע או למזער זיהומים צולבים. אם תהליך זה הוא מועסק בצורה נכונה, הוא צריך לשנות את אופן שיטתי cantilevers מצופה הזהב שהוכן זה עתה לחיישנים כימיים פעילים שהוקמו על ידי המאפשר לטילים נ&quot;מ של מטרות mucopeptide חיידקים להיווצר על משטחי זהב מצופים כמו קולטנים. </li></ol> 3. הכנות פתרון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 0.1 מלחי פוספט נתרן מונו ודי בסיסיים-M במי ultrapure (18.2 MΩ · ס&quot;מ התנגדות) ולא לערבבo להניב ערך ה-pH של 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.002% מPS80 לפתרונות שנאגרו כדי למזער את ההשפעות שנגרמו על ידי צבירת אינטראקציות ספציפיות של מולקולות תרופה לכלי הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תרופות עם פתרונות טריים שנאגרו לריכוזים השונים הרצויים שיאפשר חישוב של K ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את פתרונות סמים המוכנים טרי באמצעות מסנני 0.2 מיקרומטר וsonicate במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר לפני הקאה עם ארגון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחזור על התהליך עם תרופה בסרום שנאגרו באמצעות כל סרום. מערבולת בעדינות במשך 15 דקות עם 5 דקות נוספות על מנת להבטיח מסיסות מלאה. </li></ol> 4. איתור מתח פני השטח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען שבב חיישן שלוחה פונקציונליות לתוך תא תא זרימת נוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את נקודת לייזר על גבי קצה החופשי של כל חיישן ולאשר את היישור על ידי חימום חדר הנוזל ל1 ° C. כל שמונה מערכי חיישן שלוחה המצופים הזהב צריכים לעבור compressive כלפי מטה כיפוף בגלל השפעת bimetallic נגרמת על ידי ההבדלים בשיעורי התרחבות של סיליקון וזהב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חימום לכ -10 דקות, לאפשר לcantilevers להתקרר במשך 10 דקות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הווריאציה כיפוף באותות כיפוף המקסימאליים בין חיישני שלוחה בודדים ואם סטיית התקן היחסית של אותות כיפוף היא ≤ 5% לאחר מכן לקבל את היישור כרצוי אחרת לחזור על התהליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, למדוד את תדרי התהודה של כל שמונה cantilevers לחשב קבועי האביב שלהם. אם הווריאציה של המעיין המתמיד בין כל חיישן שלוחה בתוך שבב היא ≤ 1% אז יקבלו את השבב כבעל תכונות מכאניות עקביות אחרת להחליף את חיישן שבב שלוחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, להשתמש במערכת fluidic (דגם Genie פלוס) דרך שסתום שש דרך להשיג תמורת הנוזל בתוך תא הזרימה בזמן צריכה להיות מושגת באמצעות רכישת נתונים LabVIEW אוטומטי כךftware. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפקח על שלוחה כיפוף נתונים, להשתמש בפרוטוקולי המדידה הבאים: I) להזריק או פתרון חיץ או בסרום ללא תרופה למדידת טווח לשליטת 5-30 דקות להקים בסיס; II) להזריק פתרון תרופה במשך 30-60 דקות, III) להזריק 10 מ&quot;מ HCl לשטוף עבור 10-60 דקות כדי לנתק מורכב תרופה חייבת; IV) סוף סוף להזריק צעד שטיפה נוסף באמצעות פתרון חיץ לדקות 5-30 אחרת להתחדש פפטידים על פני השטח ולשחזר את אות קו הבסיס. תמיד להבטיח כי כל אותותיו נרכשים תחת קצב זרימת נוזל מתמיד של 30-180 μl / דקות ובטמפרטורה קבועה של 25 מעלות צלזיוס בקבינט בטמפרטורה מבוקרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את אותות כיפוף המוחלטים של כל שמונה cantilevers צריכים להיות במעקב באמצעות זמן סדרת multiplexed שיטת אלומה אופטית עם גלאי רגיש עמדה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את אותות כיפוף מכל ריכוז של תרופה, את כפיפות דיפרנציאלי כתוצאה מכך הם הפכו לstres דיפרנציאליותים בין הצדדים העליונים והתחתונים של שלוחה באמצעות המשוואה של Stoney. </li></ol>

<ol>
	<li>Ndieyira, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+detection+of+antibiotic-mucopeptide+binding+in+a+model+for+superbug+drug+resistance.">Nanomechanical detection of antibiotic-mucopeptide binding in a model for superbug drug resistance.</a> Nat. Nanotech. 3, 691-696 (2008).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+label-free+nanomechanical+detection+of+biomarker+transcripts+in+human+RNA.">Rapid and label-free nanomechanical detection of biomarker transcripts in human RNA.</a> Nat. Nanotech. 1, 214-220 (2006).</li><li>McKendry, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+label-free+biodetection+and+quantitative+DNA-binding+assays+on+a+nanomechanical+cantilever+array.">Multiple label-free biodetection and quantitative DNA-binding assays on a nanomechanical cantilever array.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 9783-9788 (2002).</li><li>Wu, G., Datar, R. H., Hansen, K. M., Thundat, T., Cote, R. J., Majumdar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioassay+of+prostate-specific+antigen+(PSA)+using+microcantilevers.">Bioassay of prostate-specific antigen (PSA) using microcantilevers.</a> Nat. Biotech. 19, 856-860 (2001).</li><li>Fritz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+biomolecular+recognition+into+nanomechanics.">Translating biomolecular recognition into nanomechanics.</a> Science. 288, 316-318 (2000).</li><li>Dwyer, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic-induced+bacterial+cell+death+exhibits+physiological+and+biochemical+hallmarks+of+apoptosis.">Antibiotic-induced bacterial cell death exhibits physiological and biochemical hallmarks of apoptosis.</a> Mol. Cell. 46, 561-572 (2012).</li><li>Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Wierzbowski, J., Cottarel, G., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mistranslation+of+membrane+proteins+and+two-component+system+activation+trigger+antibiotic-mediated+cell+death.">Mistranslation of membrane proteins and two-component system activation trigger antibiotic-mediated cell death.</a> Cell. 135, 679-690 (2008).</li><li>Kahne, D., Leimkuhler, C., Wei, L., Walsh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycopeptide+and+lipoglycopeptide+antibiotics.">Glycopeptide and lipoglycopeptide antibiotics.</a> Chem. Revs. 105, 425-448 (2005).</li><li>Williams, D. H., Maguire, A. J., Tsuzuki, W., Westwell, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+origins+of+a+cooperative+binding+energy+of+dimerization.">An analysis of the origins of a cooperative binding energy of dimerization.</a> Science. 280, 711-714 (1998).</li><li>Bugg, T. D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular-basis+for+vancomycin+resistance+in+enterococcus+faecium+BM4147-+biosynthesis+of+a+depsipeptide+peptidoglycan+precursor+by+vancomycin+resistance+proteins+VanH+and+VanA.">Molecular-basis for vancomycin resistance in enterococcus faecium BM4147- biosynthesis of a depsipeptide peptidoglycan precursor by vancomycin resistance proteins VanH and VanA.</a> Biochem. 30, 10408-10415 (1991).</li><li>Neu, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crisis+in+antibiotic+resistance.">The crisis in antibiotic resistance.</a> Science. 257, 1064-1073 (1992).</li><li>Walsh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+that+confer+antibacterial+drug+resistance.">Molecular mechanisms that confer antibacterial drug resistance.</a> Nature. 406, 775-781 (2000).</li><li>Xu, J., Li, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemistry+of+self-assembled+long-chain+alkanethiol+monolayers+on+gold.">The chemistry of self-assembled long-chain alkanethiol monolayers on gold.</a> J. Colloid Interface Sci. 176, 138-149 (1995).</li><li>Wink, T., van Zuilen, S. J., Bult, A., van Bennekom, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+monolayers+for+biosensors.">Self-assembled monolayers for biosensors.</a> Analyst. 122, 43-50 (1997).</li><li>Cho, Y. R., Entress, R. M., Williams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+cell-wall+analogues+of+vancomycin-resistant+enterococci+using+solid+phase+peptide+synthesis.">Synthesis of cell-wall analogues of vancomycin-resistant enterococci using solid phase peptide synthesis.</a> Tetrahedron Lett. 38, 5229-5232 (1997).</li><li>Prime, K. L., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+organic+monolayers+-+model+systems+for+studying+adsorption+of+proteins+at+surfaces.">Self-assembled organic monolayers - model systems for studying adsorption of proteins at surfaces.</a> Science. 252, 1164-1167 (1991).</li><li>Rotschafer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetics+of+Vancomycin:+Observations+in+28+Patients+and+Dosage+Recommendations.">Pharmacokinetics of Vancomycin: Observations in 28 Patients and Dosage Recommendations.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 22, 391-394 (1982).</li><li>Cooper, M. A., Fiorini, M. T., Abell, C., Williams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+vancomycin+group+antibiotics+to+D-alanine+and+D-lactate+presenting+self-assembled+monolayers.">Binding of vancomycin group antibiotics to D-alanine and D-lactate presenting self-assembled monolayers.</a> Bioorg. Med. Chem. 8, 2609-2616 (2000).</li><li>Rao, J., Yan, L., Xu, B., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+surface+plasmon+resonance+to+study+the+binding+of+vancomycin+and+its+dimer+to+self-assembled+monolayers+presenting+D-Ala-D-Ala.">Using surface plasmon resonance to study the binding of vancomycin and its dimer to self-assembled monolayers presenting D-Ala-D-Ala.</a> J. Am. Chem. Soc. 121, 2629-2630 (1999).</li><li>MacBeath, G., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+Proteins+as+Microarrays+for+High-Throughput+Function+Determination.">Printing Proteins as Microarrays for High-Throughput Function Determination.</a> Science. 289, 1760-1763 (2000).</li><li>Baller, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cantilever+array-based+artificial+nose.">A cantilever array-based artificial nose.</a> Ultramicroscopy. 82, 1-9 (2000).</li><li>Burg, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weighing+of+biomolecules,+single+cells+and+single+nanoparticles+in+fluid.">Weighing of biomolecules, single cells and single nanoparticles in fluid.</a> Nature. 446, 1066-1069 (2007).</li><li>Lahiri, J., Isaacs, L., Tien, J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+the+generation+of+surfaces+presenting+ligands+for+studies+of+binding+based+on+an+active+ester+as+a+common+reactive+intermediate:+A+surface+plasmon+resonance+study.">A strategy for the generation of surfaces presenting ligands for studies of binding based on an active ester as a common reactive intermediate: A surface plasmon resonance study.</a> Anal. Chem. 71, 777-790 (1999).</li><li>Nugaeva, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromechanical+cantilever+array+sensors+for+selective+fungal+immobilization+and+fast+growth+detection.">Micromechanical cantilever array sensors for selective fungal immobilization and fast growth detection.</a> Biosens. Bioelectron. 21, 849-856 (2005).</li><li>Von Muhlen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biomarker+sensing+in+undiluted+serum+with+suspended+microchannel+resonators.">Label-free biomarker sensing in undiluted serum with suspended microchannel resonators.</a> Anal. Chem. 82, 1905-1910 (2010).</li><li>Godin, M., M, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+buoyant+mass+to+measure+the+growth+of+single+cells.">Using buoyant mass to measure the growth of single cells.</a> Nat. Methods. 7, 387-390 (2010).</li><li>Mertens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+gas+trace+of+hydrofluoric+acid+using+microcantilever.">Detection of gas trace of hydrofluoric acid using microcantilever.</a> Sens. Actuators B Chem. 99, 58-65 (2004).</li><li>Porter, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+solidstate+sensor+platform+for+the+detection+of+hydrogen+cyanide+gas.">A solidstate sensor platform for the detection of hydrogen cyanide gas.</a> Sens. Actuator B Chem. 123, 313-317 (2007).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים מוצהר

הפרדיגמה נתחים המולקולריים ההכרה ניצבת בבסיס גדול של ביולוגיה ורפואה. בפרמקולוגיה, למשל המטרה היא להפריע למסלול פתולוגית על ידי מיקוד משתתף מרכזי בתהליך ביוכימי כגון transglycoslyation או transpeptidation שמזרז crosslinking של פפטידים קיר תא חיידק. תכנון התרופות מצטמצם ולכן להגדרת מולקולה מתאימה כדי למקד את אתר עגינה חיידקים ספציפי כדי לגרום להתאמה מושלמת. דוגמה קלאסי לחיקוי ההצלחה של גישה זו היא ונקומיצין (ואן), אשר מטרות דופן תא פפטידוגליקן, תכונה מבנית שימור של חיידק. בחיידק גראם חיובי המתהווה, מטריצת פפטידוגליקן מורכבת של פפטידים המסתיימים ברצף ליזין-D-אלנין-D-אלנין, קשורים באמצעות C55 8-10 מקשר שומנים כאן מכונה D-עלא. פפטידים אלו שנחשפו על מבשרי peptidoglycan הם יסוד להגנה מכאנית של התאים חיידקיים נגד כוחות סביבתיים קשים, וחשוב מכך, לא נמצא בתאים אנושיים, מה שהופך אותם למטרות אידיאליות לתרופות אנטיביוטיות. אן במיוחד נקשר לC-הסופית של פפטידים קיר תא החיידק יוצרים ואן-פפטיד חזק בינוני מורכב, כפי שמוצג באיור 1. אינטראקציה זו בין ואן ואת אבני פפטידים שנחשפו מעשיו של transpeptidases וtransglycosylases, אשר לזרז cross-linking של קירות תא 1, ביעילות לעצור אותם מcrosslinking ולכן nanomechanically מחליש את תא החיידק שהוביל למותה על ידי קרע 1,6, 7. הופעתה של vancomycin עמיד אנטרוקוקוס (VRE) היא בעיה בריאות 11 גוברת ובגלל עמידות החיידקים בEnterococci מתעוררת עקב השינוי העדין של לין אמיד<html> Kage להצמדת אסתר 8, שינוי מבני פשוט מטעה זה על פני השטח של החיידק מוחק קשר מימן אחד מאתר עגינה של ואן עם השינוי הבא של הכיס המחייב. חשוב לציין את התהליך הזה משנה את הווה אלאנין מסוף pentapeptide בונקומיצין רגיש אנטרוקוקוס (VSE) ליזין 10,12-D-אלנין-D-חומצת חלב, המכונה כאן D-Lac, מניב לירידה משמעותית בזיקה מחייבת ואן-D-Lac ידי שלושה סדרי הגודל ואן טיוח טיפולי יעילה נגד זיהומי Enterococcal 1, הצמיחה המדאיגה של חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה הוא נוהגים פיתוח גישות חדשניות אפוא להאיץ ולשחזר את הפעילות אנטיבקטריאלי של סוכנים אנטיבקטריאלי או גילוי של תרופות יותר חזקות נגד חיידקים עמידים multidrug זיהומים. = &quot;Jove_content&quot; כיתה&gt; הניסויים שלנו באמצעות cantilevers שעמד חופשי בהשראת המערכות כגון תאים אשר לרתום אנרגיה כימית לתנועה. היכולת של חיישני שלוחה לתרגם אנרגיה כימית לתנועה מכאנית גורמת להם בדיקות ייחודיות עם יתרונות רבים לניטור הפרעות מכאניות של מטרות קיר תא חיידק בזמן אמת. את חיישני שלוחה דורשים &#39;תגים&#39; לא כתב וביומולקולות מזוהות במהירות בתגובה בשלב יחידה. הם יכולים להקרין תרופות מרובות במקביל בסביבות פיסיולוגיות כגון פתרונות שנאגרו וכל סרום. בנוסף, הטכנולוגיה משתמשת בשלוחת התייחסות אתר למדידות דיפרנציאלי המאפשרים להם לזהות באופן ספציפי אינטראקציות סמים והיעד, מכוח הייצור שלהם באמצעות מסלולים מוליכים למחצה לעיבוד סטנדרטי, הם נוחים לייצור המוני ועמות להקרנת תפוקה גבוהה של אלפי של תרופות לשעה. בparticחיישן מערכים מרובים שלוחה ular הם כלים שימושיים לחקר עמידות לאנטיביוטיקה לונקומיצין - בגלל התנגדות לוונקומיצין היא בעיקרו בעיה מכאנית 1,6,7. התגובות שבין מודל יעד חיידקי דופן תא ואן בפתרון יכולות להיות מזוהות על ידי מעקב אחר השינויים במתח רלוונטי קליני הנגרמים מתגובות בין תרופתי מחייבות גבוהה מהיעד. המתח שנוצר משטח תגובות אשר באו לידי ביטוי באות כיפוף שלוחה מנותח על ידי חיישנים אופטי מאירים עם קרן לייזר. יתרה מזאת על ידי התאמת הציפוי פתוח של מולקולות מטרת משטח חיידקים על גבי חיישן שלוחה, קרוב למספר בלתי מוגבל של analytes (ואן), האינטראקציות ביוכימיות הספציפיות וביומכניקה של תא חיידק מודל קיר מטריצה ​​מנוטרת בזמן אמת. מלבד אירוע ההכרה המולקולרי, ישנם מספר גורמים שיכולים לגרום לחיישני שלוחה defבוחר בי, הכולל - וריאציות טמפרטורה, מחייב נוקבים או שינויים של מקדם שבירה של הפתרון. כדי להסביר את אותות ספציפיים, במדידות באתרו דיפרנציאלי מבוצעים בו הכיפוף של שניהם המדידה וcantilevers התייחסות מנוטרים באופן רציף כדי לנתח אינטראקציות ספציפיות. יתר על כן, ניתן לשפר את זיהוי של רגישויות חיישני שלוחה הנשען על פני השטח וגיאומטרית chemistries ידי כוונון צפיפות השטח עמ &#39;(עמ&#39; שבו מוגדר כיחס בין שטח הפנים שנכבש על ידי מולקולות לכידה לאזור המשטח העליון של כל שלוחה מכוסה על ידי האוכלוסייה של מולקולות, כפי שנקבע על ידי X-Ray Photoelectron ספקטרוסקופיה (XPS) 1. הנה פרטי פרוטוקול זה איך ונקומיצין או כל אנטיביוטיקה אחרת מחייב אנלוגים חיידקי דופן תא מבשר (mucopeptides) בריכוזים רלוונטיים קליני בפתרון שנאגרונסיוב דם ND יכול להיות מזוהה על ידי טכנולוגיית שלוחה תווית ללא שימוש. משטחי זהב טריים משמשים כי monolayers עצמית התאספו (Sams) נוטות ליצור שכבות יציבות בקלות על זהב נקי 13,14. טילים נ&quot;מ מורכב בדרך כלל ממולקולות קצרות עם מחצית תיאול המצורפת קוולנטית במשטח הזהב בזמן שיחידת לכידה הרצויה בצד השני מותרת להגיב בחופשיות עם המטרות אנליטי בתמיסה. Thiols ליצור מערכת גמישה במיוחד בהתחשב כי תרכובות תיאול רבות עם קבוצות קצה כימיות שונות זמינות באופן מסחרי או מסונתזים בקלות במעבדה. עם זאת, יש להקפיד על מנת להבטיח שמולקולות עם מחצית תיאול חייבת את קבוצות הקצה הנכונות, לדוגמה בחלבון או נטיה פפטיד, הקבוצה אמינית צריכה להתמודד פנימה לתגובה עם קבוצת carboxylic של מחצית תיאול קשורה על פני השטח כדי להתעורר. הנה, את thiols היה מצומדת ישירות עם mimetics tripeptide של חיידקי שומנים משניים בדופן תא acterial יעדים מסונתזת על ידי המתודולוגיה שלב מוצקה באמצעות זמין מסחרי מראש וואנג-D-עלא וואנג-D-Lac שרפים והסטנדרטי Fmoc הגנת קבוצת הכימיה 15. למרות שתיאור זה מתמקד לוונקומיצין, ברור שזה יכול להתארך לאנטיביוטיקה אחרות, ואכן מחקרים נוספים מוזמנים על ידי חוקרים מתחומים שונים ובמיוחד בביוכימיה, פרמקולוגיה, מדעי חומר ולאמץ פרוטוקול זה לניסויים שלהם בקלות.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Items</td>
			<td>Catalog Number </td>
			<td>Company</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scentris</td>
			<td></td>
			<td>Scentris, Veeco Instruments, Inc</td>
			<td>Not in production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-way valve</td>
			<td></td>
			<td>MVP, Hamilton, Reno, NV</td>
			<td>Enables multiple concentration injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EB Evaporator</td>
			<td></td>
			<td>BOC Edwards Auto 500, UK</td>
			<td>Electron beam is preferable because of deformation of cantilevers caused by thermal heating problems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage vessel</td>
			<td></td>
			<td>Agar Scientific, UK</td>
			<td>Keeps gold coated films fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary</td>
			<td></td>
			<td>King Precision Glass, Claremont, CA, USA</td>
			<td>For capillary functionalization of the cantilever arrays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump</td>
			<td></td>
			<td>Model Genie Plus, Kent Scientific, Torrington, CT, USA</td>
			<td>Good for controlled flow rate of liquid samples in microfluidic channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2-4.5 &#956;m Filters</td>
			<td>1511940001</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>For sample filtering</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilever chips</td>
			<td></td>
			<td>London Centre for Nanotechnology (LCN)</td>
			<td>Highly sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>For making buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>For making buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 80 (PS80) or Tween 80</td>
			<td>9005-65-6</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>Used in buffer solutions to prevent nonspecific interactions on glassware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DI water</td>
			<td></td>
			<td>Millipore Co., Billerica, MA, USA</td>
			<td>Used for making solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whole serum</td>
			<td>GEM-700-110-H</td>
			<td>Sera Laboratories International Ltd, UK</td>
			<td>Used in measurements that mimic physiological conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin (Van)</td>
			<td>1404-93-9</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>Drug used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>7664-93-9</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>Used for glassware cleaning procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>7722-84-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>Used for glassware cleaning procedures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Ala and D-Lac</td>
			<td></td>
			<td>London Centre for Nanotechnology (LCN)</td>
			<td>Surface receptors coated on the cantilever for detecting drug-target interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabView</td>
			<td></td>
			<td>National Instruments Co., Austin, TX, USA</td>
			<td>Software used for instrumental interface to allow controlled measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanomechanics of drug-target interactions and antibacterial resistance detection

חיישן שלוחה, הפועל כמתמר של תגובות בין מודל חיידקי דופן תא משותקת על פני השטח שלו ותרופות אנטיביוטיות בפתרון מטריצה, הראה פוטנציאל רב ביישומי חישה ביוכימיים ברגישות וסגוליות 1-5 חסר תקדים. את אינטראקציות סמים היעד ליצור מתח פני השטח, וגרם שלוחה להתכופף, והאות ניתן לנתח אופטי כאשר הוא מואר על ידי לייזר. השינוי במשטח לחץ נמדד בדייקנות בקנה מידה ננו מאפשר שיבושים בביומכניקה של קיר תא חיידק מודל המטרות כדי להיות במעקב בזמן אמת. למרות מציע יתרונות משמעותיים, חיישן מערכי שלוחה מרובים מעולם לא יושמו בכימות אינטראקציות מחייבות סמים היעד. כאן אנו מדווחים על השימוש במערכים מרובים שלוחה סיליקון מצופה עצמית התאספו monolayers alkanethiol מחקה חיידקי קיר מטריצת תא כמותית לסטהאינטראקציות מחייבות אנטיביוטיות dy. כדי להבין את ההשפעה של ונקומיצין על המכניקה של מבני קיר תא חיידק 1,6,7. אנחנו פיתחה מודל חדש שמציע 1 שלוחה כיפוף שיכולה להיות מתוארת על ידי שני גורמים בלתי תלויים; I) כלומר גורם כימי, אשר ניתן על ידי ספיחת האיזותרמה אנגמיור קלסית, שממנו אנו מחשבים את שיווי משקל תרמודינמי ניתוק הקבוע (K ד) ו ii) גורם גיאומטרי, למעשה מדד של כמה קולטנים פפטיד חיידקים מופצים על פני שלוחה. משטח ההפצה של קולטנים פפטיד (עמ &#39;) משמשת כדי לחקור את התלות של גיאומטריה וטעינה ליגנד. הוא הראה כי ערך סף של p ~ 10% הוא קריטי ליישומי חישה. שמתחתיו אין אות זיהוי תוך כיפוף מעל ערך זה, אות הכיפוף מגדילה כמעט ליניארי, חושפת כי לחץ הוא תוצר של חומר כימי מקומי מחייבים facטור וגורם גיאומטרי בשילוב של הקישוריות מכאנית של אזורים הגיבו ומספק פרדיגמה חדשה לעיצוב של סוכנים רבי עוצמה כדי להילחם בזיהומי superbug.

שינוי המתח נמדד באמצעות דיוק בקנה מידה ננו עם רגישות חסרת תקדים למחיקת H-אג&quot;ח בודד, מנוצל כדי לעקוב אחר השיבושים ביומכניקה קיר תא חיידק מודל בזמן אמת (איורים 2 א, ד). המגבלה של רגישות גילוי סמים ולאן נחקרה על ידי דילול סדרה ריכוזיה בצעדים מ1,000 מיקרומטר ≤ 10 ננומטר, חושף 10 ננומטר (~ 15 ng / ml) כריכוז הנמוך ביותר לזיהוי והוליד ממוצע של ~ -9 ± 2 ננומטר כמו כיפוף אותות דיפרנציאליים (איור 2 ג). היכולת לזהות אנטיביוטיקה תחת הסביבה פיזיולוגית הייתה עוד יותר נחקר בסרום בטווח ריכוז רלוונטי קליני של 3-27 מיקרומטר 17. על הזריקה של 7 מיקרומטר ואן בסרום (90% נסיוב עגל העוברי בתוספת 10% pH חיץ פוספט נתרן 7.4) על פני כל cantilevers בתנאים זהים, את אות ההפרש עבורDala בסרום היה 105 ± 4 ננומטר ואילו עבור cantilevers מצופה DLac, לא נצפה כיפוף (איור 3). את אותות כיפוף הניכרים שנצפו למצופה dala (vancomycin רגישה) cantilevers נגרמים על ידי יחסי גומלין מחייבים תרופה היעד החזקים. עם זאת למצופה DLac (vancomycin עמיד) cantilevers, הנוכחות של דחיית מצב קרקע של הזוג הבודד חמצן ואת קשר NH המופחת בכיס 10,12 vancomycin המחייבת תורם להיחלשות של אינטראקציות מחייבות סמים היעד שהתוצאה פחות או כיפוף לא שלוחה, במיוחד לריכוזים נמוכים יותר vancomycin (איור 3). עם זאת, לריכוז גבוה וונקומיצין, אנו צופים אותות כיפוף מדידים לDLac. יתר על כן, עיצוב הניסיון שלנו הוא חשוב להתייחסות באתר שבו כל cantilevers מצופה שניהם dala וDLac חשוף בו זמנית לאותו אנליטי בזמן אמת. כדי להבין את תפקידו המדויק של כימיה וגיאומטריה, תכננו 1 מודל המתאר את הקשר בין אינטראקציות ממס משטח מכניקה. זה מייצר את מתח פני השטח: <img alt="משוואת 1" src="/files/ftp_upload/50719/50719eq1.jpg" /> עבור p&gt; מחשב ואפס אחר (1) כהונתו הראשונה במשוואה (1) היא אנגמיור ספיחת Isotherm, והיווה אירועים מחייבים סמים היעד והקדנציה השנייה היא צורת שלטון החוק המתארת ​​את ההשלכות מכאניות בקנה מידה גדולה של היווצרות רשת לחוץ. הקבועה מתאים למתח פני השטח מרבי כאשר כל אתרי הקישור הנגישים הם כבושים וK D הוא חסרונות דיסוציאציה שיווי המשקל על פני השטחTANT על שלוחה. הניתוח כפי שמוצג באיור 4 הוא התוצאה של ההתאמה הגלובלית של משוואה (1) על גבי אותות מתח דיפרנציאלי מדודים חושפים; ~ 29.7 ± 1.0 או 14.1 ± 3.0 Mn / מ &#39;ו-K ד ~ 1.0 ± 0.3 או 800 ± 310 מיקרומטר לפפטידים DLac D-עלא או, שבו מקביל מידה של משטח לחץ, כאשר כל אתרי הקישור הנגישים תפוסים. הרגישות המוגברת של שלוחה הייתה מכוונת על ידי שיטתי משתנה עמ צפיפויות פפטיד תוך ניטור נתוני הלחץ כפונקציה של p קבוע ואילו ריכוזי אנטיביוטיקה בגיל 10, 100, ו -250 מיקרומטר, בהתאמה (איור 5). התהליך חזר על עצמו עם מצבי לחץ כפונקציה של ריכוז ואן בזמן קבוע את צפיפויות פפטיד בעמ &#39;~ 100%. &lt;IMG alt = &quot;איור 1&quot; עבור: תוכן-width = src &quot;5IN&quot; = &quot;/ files/ftp_upload/50719/50719fig1.jpg&quot; /&gt; איור 1. גילוי שלוחה של אינטראקציות מחייבות משטח אנטיביוטי. ייצוג סכמטי) של מערך שלוחה חיישן והמצב שבו אינטראקציות סמים היעד מזוהות nanomechanically. ב) מחייבת אינטראקציה כימית בין מולקולת תרופה (ואן) והאנלוגי mucopeptide החיידקים (D-עלא או D-Lac). ג) המנגנון שבו מוטציה חיידקים רגישים Vancomycin (VSE) רוכש עמידות לוונקומיצין ידי מחיקת H-אג&quot;ח בודד בכיס המחייב. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50719/50719fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig2.jpg" /&gt; איור 2. מעקב אחר השיבושים ביומכניקה קיר תא חיידק המודל בזמן אמת. א) אותות כיפוף מוחלטים של cantilevers מצופה PEG בחיץ פוספט וונקומיצין 250 מיקרומטר D-עלא, D-Lac ו. את אותות התייחסות PEG דיפרנציאלי מוצגים בקווים שחורים. ב) אותות כיפוף הפרש של cantilevers מצופי D-Lac בחיץ פוספט וונקומיצין 250 מיקרומטר. ג) סטיית שלוחה ההפרש של אות תלויה במינון כפונקציה של זמן D-עלא ו בנוכחות ריכוזי vancomycin בבסדר הגודל של 10 ננומטר (קו צהוב), 100 ננומטר (קו אדום) ו -1,000 ננומטר (קו אדום כהה) בהתאמה. ד) אותות סטיית שלוחה ההפרש לשלושה חיישני שלוחה מצופי D-עלא כ פונקציה של זמן בנוכחות 10vancomycin ננומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50719/50719fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig3.jpg" /> איור 3. מעקב של השיבושים ביומכניקה מודל חיידקי דופן התא בזמן אמת לcantilevers מצופי D-Lac בנוכחות vancomycin מיקרומטר 7 בסרום עוברי עגל D-עלא ו. <img alt="איור 4" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig4.jpg" /> איור 4. חוקר את nanomechanics של אינטראקציות סמים היעד. מגרש מראה את תגובת לחץ משטח ההפרש הנמדדת עבור D-עלא (עיגולים שחורים) וcantilevers מצופה כפונקציה של ונקומיצין D-Lac (עיגולים אדומים)ריכוז בתמיסה [אן]. הנתונים שתוארו על ידי משוואה (1) (קווים מוצקים). 1 <img alt="איור 5" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig5.jpg" /> איור 5. אופטימיזציה של רגישות זיהוי nanomechanical של קולטן ליגנד אינטראקציות על ידי חוקר את התלות של העמסת קולט וגיאומטריה באמצעות monolayers מעורבת. תגובות דחק משטח דיפרנציאלי המדודות של חיישני שלוחה כפונקציה של D-עלא פני השטח כיסוי, עמ &#39;בנוכחות ריכוזים קבועים בvancomycin פתרון ב10 מיקרומטר (קו שחור), 100 מיקרומטר (קו אדום), וכ -250 מיקרומטר (קו ירוק).

Watch this Scientific Journal Video about Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection at JoVE.com

Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection

רכשה עמידות לאנטיביוטיקה היא בעיה בריאות ציבורית גדולה והיא מדורגת כיום על ידי ארגון הבריאות העולמי כאחת הסכנות הגדולות ביותר לחיי אדם. כאן אנו מתארים את השימוש בטכנולוגית שלוחה לכמת התנגדות אנטיבקטריאלי, קריטית לגילוי של סוכני רומן ורבי עוצמה נגד multidrug חיידקים עמידים.

Nanomechanics של אינטראקציות סמים היעד ואיתור התנגדות אנטיבקטריאלי

The cantilever sensor, which acts as a transducer of reactions between model bacterial cell wall matrix immobilized on its surface and antibiotic drugs in ...

nanomechanics-drug-target-interactions-antibacterial-resistance

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.1K Views.  University College London. רכשה עמידות לאנטיביוטיקה היא בעיה בריאות ציבורית גדולה והיא מדורגת כיום על ידי ארגון הבריאות העולמי כאחת הסכנות הגדולות ביותר לחיי אדם. כאן אנו מתארים את השימוש בטכנולוגית שלוחה לכמת התנגדות אנטיבקטריאלי, קריטית לגילוי של סוכני רומן ורבי עוצמה נגד multidrug חיידקי...

Video: Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

שילוב של הדגימה דבק קלטת מבוססי פלואורסצנטי באתרו הכלאה עבור איתור מהיר של סלמונלה על תוצרת טרייה

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below 50-75 copies/ml) is necessary to gain insight to viral dynamics and virus host interactions in patients who naturally control the infection and those who are on combination antiretroviral therapy (cART). 
Here we describe how to amplify viral genomes by single genome sequencing (the SGS protocol) 13, 19 and how to accurately quantify HIV-1 RNA in patients with low viral loads (the single-copy assay (SCA) protocol) 12, 20. 
The single-copy assay is a real-time PCR assay with sensitivity depending on the volume of plasma being assayed. If a single virus genome is detected in 7 ml of plasma, then the RNA copy number is reported to be 0.3 copies/ml. The assay has an internal control testing for the efficiency of RNA extraction, and controls for possible amplification from DNA or contamination. Patient samples are measured in triplicate.
The single-genome sequencing assay (SGS), now widely used and considered to be non-labor intensive 3, 7, 12, 14, 15,is a limiting dilution assay, in which endpoint diluted cDNA product is spread over a 96-well plate. According to a Poisson distribution, when less than 1/3 of the wells give product, there is an 80% chance of the PCR product being resultant of amplification from a single cDNA molecule. SGS has the advantage over cloning of not being subjected to resampling and not being biased by PCR-introduced recombination 19. However, the amplification success of SCA and SGS depend on primer design. Both assays were developed for HIV-1 subtype B, but can be adapted for other subtypes and other regions of the genome by changing primers, probes, and standards.

Quantifying levels of HIV-1 RNA in plasma and sequencing single HIV-1 genomes from individuals with viral loads below the limit of detection (50-75 copies/ml) is difficult. Here we describe how to extract and quantify plasma viral RNA using a real time PCR assay that reliably measures HIV-1 RNA down to 0.3 copies/ml and how to amplify viral genomes by single genome sequencing, from samples with very low viral loads.

הגברה וכימות HIV-1 RNA אצל אנשים שנדבקו ב-HIV עם המון ויראלי מתחת לגבול של זיהוי על ידי מבחני קלינית רגילה

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. Therefore, rapid administration of adequate antibiotic therapy is of foremost importance in the treatment of bloodstream infections. The critical element in this process is timing, heavily dependent on the results of bacterial identification and antibiotic susceptibility testing. Both of these parameters are routinely obtained by culture-based testing, which is time-consuming and takes on average 24-48 hours2, 4. The aim of the study was to develop DNA-based assays for rapid identification of bloodstream infections, as well as rapid antimicrobial susceptibility testing. The first assay is a eubacterial 16S rDNA-based real-time PCR assay complemented with species- or genus-specific probes5. Using these probes, Gram-negative bacteria including Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli as well as Gram-positive bacteria including Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp., and Streptococcus pneumoniae could be distinguished. Using this multiprobe assay, a first identification of the causative micro-organism was given after 2 h.
Secondly, we developed a semi-molecular assay for antibiotic susceptibility testing of S. aureus, Enterococcus spp. and (facultative) aerobe Gram-negative rods6. This assay was based on a study in which PCR was used to measure the growth of bacteria7. Bacteria harvested directly from blood cultures are incubated for 6 h with a selection of antibiotics, and following a Sybr Green-based real-time PCR assay determines inhibition of growth. The combination of these two methods could direct the choice of a suitable antibiotic therapy on the same day (Figure 1). In conclusion, molecular analysis of both identification and antibiotic susceptibility offers a faster alternative for pathogen detection and could improve the diagnosis of bloodstream infections.

The design of a straightforward one-day workflow scheme for bacterial pathogen diagnostics enables the rapid recognition of bloodstream infections. The inclusion of eight clinically relevant bacterial targets and their antibiotic resistance profiles offers the clinician an initial insight on the same day, which can lead to more adequate therapy.

יום אחד זרימת עבודה עבור תוכנית זיהוי פתוגן חיידקי ובדיקות ההתנגדות Antimicrobial מתרבויות דם

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

איתור של פלורסנט אינטראקציות Nanoparticle עם אוכלוסיות ראשוניות של תא חיסון על ידי זרימת cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

הקרנה מהירה של HIV ההפוך טרנסקריפטאז וintegrase המעכבים

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

שיטה חדשה לניתוח איכותי רב היקף של Biofilms חיידקית על פילמנטיות פטרייתיים המושבות Confocal שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, preferably in models which mimic the intended clinical indication. A method for inducing robust lung infections in immunocompetent rats and mice is described which allows for the assessment of treatments in a model of serious pneumonia caused by S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae or A. baumannii. Animals are anesthetized, and an agar-based inoculum is deposited deep into the lung via nonsurgical intratracheal intubation. The resulting infection is consistent, reproducible, and stable for at least 48 h and up to 96 h for most isolates. Studies with marketed antibacterials have demonstrated good correlation between in vivo efficacy and in vitro susceptibility, and concordance between pharmacokinetic/pharmacodynamic targets determined in this model and clinically accepted targets has been observed. Although there is an initial time investment when learning the technique, it can be performed quickly and efficiently once proficiency is achieved. Benefits of the model include elimination of the neutropenic requirement, increased robustness and reproducibility, ability to study more pathogens and isolates, improved flexibility in study design and establishment of a challenging infection in an immunocompetent host.

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.

מודל דלקת ריאות חזק במכרסמי immunocompetent להערכת יעילות אנטיבקטריאלי נגד<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. אינפלואנזה</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; או<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

פלטפורמה תפוקה גבוהה להקרנה של סלמונלה spp /שיגלה spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this challenge, dereplication, which is the process of identifying known compounds, is performed on samples of interest. Methods for dereplication such as analytical separation followed by mass spectrometry are time-consuming and resource-intensive. To improve the dereplication process, we have developed the antibiotic resistance platform (ARP). The ARP is a library of approximately 100 antibiotic resistance genes that have been individually cloned into Escherichia coli. This strain collection has many applications, including a cost-effective and facile method for antibiotic dereplication. The process involves the fermentation of antibiotic-producing microbes on the surface of rectangular Petri dishes containing solid medium, thereby allowing for the secretion and diffusion of secondary metabolites through the medium. After a 6 day fermentation period, the microbial biomass is removed, and a thin agar-overlay is added to the Petri dish to create a smooth surface and enable the growth of the E. coli indicator strains. Our collection of ARP strains is then pinned onto the surface of the antibiotic-containing Petri dish. The plate is next incubated overnight to allow for E. coli growth on the surface of the overlay. Only strains containing resistance to a specific antibiotic (or class) grow on this surface enabling rapid identification of the produced compound. This method has been successfully used for the identification of producers of known antibiotics and as a means to identify those producing novel compounds.

We describe a platform that utilizes a library of isogenic antibiotic resistant Escherichia coli for the dereplication of antibiotics. The identity of an antibiotic produced by bacteria or fungi can be deduced by the growth of E. coli expressing its respective resistance gene. This platform is economically effective and time-efficient.

אנטיביוטי Dereplication באמצעות פלטפורמת עמידות לאנטיביוטיקה

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...

Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant advantage over other methods. To prepare these probes, azide derivatives of antibiotics are synthesized, then coupled with alkyne-fluorophores using azide-alkyne dipolar cycloaddition by click chemistry. Following purification, the antibiotic activity of the fluorescent antibiotic is tested by minimum inhibitory concentration assessment. In order to study bacterial accumulation, either spectrophotometry or flow cytometry may be used, allowing for much simpler analysis than methods relying on radioactive antibiotic derivatives. Furthermore, confocal microscopy can be used to examine localization within the bacteria, affording valuable information about mode of action and changes that occur in resistant species. The use of fluorescent antibiotic probes in the study of antimicrobial resistance is a powerful method with much potential for future expansion.

Fluorescently tagged antibiotics are powerful tools that can be used to study multiple aspects of antimicrobial resistance. This article describes the preparation of fluorescently tagged antibiotics and their application to studying antibiotic resistance in bacteria. Probes can be used to study mechanisms of bacterial resistance (e.g., efflux) by spectrophotometry, flow cytometry, and microscopy.