نشكر المهندسين والطلاب في مركز فراونهوفر للابتكار الصناعي. للمساعدة في تصميم، والآلات، والتشغيل الآلي للنظام التجريبي، ونحن نشكر أندرياس برينزن، هولغر فيرز، دوغ فوس، ديفيد شارجين، والدكتور سودونغ شو. نشكر جوليا كوكارتز وميلاني زيمرمان ونيكو كريتزمار وتيم غومبل وجوش فيلانويفا ومونوري شيميزو وكاتارزينا كوليغا للمساعدة في اختبار البروتوكولات التجريبية وجمع البيانات. نعترف بالدكتورتين آن كاربنتر ومارك أنتوني براي من منصة التصوير في المعهد العريض بجامعة هارفارد ومعهد ماساتشوستس للتكنولوجيا للمساعدة في تطوير روتين تحليل الصور في CellProfiler. تم دعم المشروع الموصوف جزئيا من خلال جوائز R21AI079474 و 1R01AI101446 من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية أو المعاهد الوطنية للصحة. كما تم دعم المشروع من قبل فراونهوفر الولايات المتحدة الأمريكية.

1. جعل طبقة PDMS (الشكل 1)
<ol><li>مزيج PDMS بقوة وعامل علاج في نسبة 10:1. لإزالة الفقاعات، ديغا الخليط اللزج في غرفة فراغ لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>على مقياس، صب PDMS ببطء على قالب الألومنيوم. صب من المركز والحفاظ على القالب تسويتها. تأكد من ترك دبابيس كشف. توقف عن صب مرة واحدة يتم تحقيق الوزن المستهدف. يتطلب العفن لدينا 4 غرام من PDMS و 0.4 غرام من كاشف المعالجة.
</li>
	<li>مستوى القالب داخل الفرن، وعلاج في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. أوقات المعالجة البديلة هي ساعتين عند 60 درجة مئوية أو ساعة واحدة عند 90 درجة مئوية.
</li>
	<li>تشريح طبقة PDMS الشفاء على طول حافة القالب وتقشير بعناية الخروج من سطح العفن مع زوج من ملقط. تنظيف سطح العفن مع الإيثانول 70٪ وQ-تلميح.</li>
</ol>2. تجميع خلية التدفق وفقا لل الشكل 2
يتم التجميع القياسي ل PDMS مع الشرائح الزجاجية من خلال معالجة بلازما الأكسجين لكلا السطحين ، مما يضمن الترابط الخالي من التسرب بين PDMS والانزلاق الزجاجي المجهر. في البروتوكول المقدم ، فإن علاج البلازما يدمر الطلاء الكيميائي على الشريحة الزجاجية. ولذلك فإن الشريحة هي ضغط مختومة بدلا من البلازما المعالجة.
<ol><li>ضع النافذة الزجاجية في جيب الخلية التدفق.</li>
	<li>وضع شريحة زجاجية مغلفة على النافذة الزجاجية داخل جيب الخلية تدفق مع الجانب النشط حتى، ووضع طبقة PDMS مع قنوات تواجه أسفل على أعلى من ذلك. ضع الشريحة PDMS بطريقة تتماشى بها مدخلات القناة مع الفتحات في اللوحة المعدنية. ادفع الهواء برفق من بين الطبقات.</li>
	<li>قم بقلب تجميع الشرائح PDMS/glass بحيث يواجه PDMS النافذة الزجاجية. تداخل مدخلات قناة PDMS مع الثقوب في لوحة معدنية.</li>
	<li>ضع لوحة الضغط على القمة وشد البراغي.</li>
	<li>ضع خلية التدفق المجمعة تحت المجهر. تعيين التكبير المجهر إلى 60X وprealign مواقف القناة.</li>
</ol>3. إعداد البكتيريا مرحلة السجل
<ol><li>قبل يوم من التجربة: تلقيح 50 مل من مرق مولر هينتون الذي يحتوي على 2٪ NaCl (MH2) مع مستعمرة بكتيرية. هزة في 250 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها في 37 °C. يمكن دراسة سلالة بكتيرية واحدة أو اثنتين في تجربة واحدة للترسين الموصوف.
</li>
	<li>قبل التجربة: اخلط 50 ميكرولتر من زراعة البكتيريا بين عشية وضحاها في 50 مل من وسائط MH2. هز في 250 دورة في الدقيقة لمدة 3 ساعات في 37 درجة مئوية لضمان البكتيريا في مرحلة السجل.</li>
</ol>4. دافئ مكونات الحل التجريبي على الأقل 10 دقائق قبل أن تكون هناك حاجة إليها
<ol><li>إذابة الصبغة الفلورية (5 mM الأسهم) والليسوستافين (10 ميكروغرام / مل الأسهم) في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>قم بتدفئة مسحوق الأوكسيسيلين إلى درجة حرارة الغرفة.</li>
</ol>5. إعداد وتحميل تعليق البكتيرية
<ol><li>بعد نهاية 3 ساعة من الزراعة الفرعية: تناول 10 مل من زراعة البكتيريا والطرد المركزي بمعدل 1650 × غرام لمدة دقيقتين.</li>
	<li>إزالة البكتيريا العملاقة وإعادة الإنفاق في 1 مل من وسائل الإعلام MH2 الطازجة.</li>
	<li>إرفاق طول قصير من الأنابيب إلى 1 مل لوير قفل حقنة. مسح أنابيب حقنة مع 1 مل من وسائل الإعلام. ترك قليلا من وسائل الإعلام في الأنابيب لتجنب فقاعات الهواء عند الرسم في تعليق البكتيرية.</li>
	<li>تحميل 0.7 مل من البكتيريا نوع 1 في الحقنة. ملء قناتين من الخلية تدفق مع نوع البكتيريا 1. مشاهدة السائل لتظهر على الجانب الآخر من القناة بعد كاليفورنيا. 150 ميكرولتر. تتغير شفافية القناة لأنها مليئة بالبكتيريا.
</li>
	<li>إذا جربت أنواع بكتيريا متعددة، كرر إجراء التحميل للبكتيريا من النوع 2 في القناتين المتبقيتين من خلية التدفق.</li>
	<li>ضع خلية التدفق داخل الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة للسماح بالتسوية البكتيرية والتعلق بسطح الشريحة.</li>
</ol>6. إعداد وتحميل الحلول التجريبية
<ol><li>إعداد 140 ميكرولتر من محلول صبغة فلورية 0.5 mM عن طريق خلط 14 ميكرولتر من مخزون الصبغة الفلورية (5 mM) و 126 ميكرولتر من وسائط MH2.</li>
	<li>تمييع 10 ملغ من أوكساسيلين في 40 مل من وسائل الإعلام MH2 للحصول على تركيز نهائي من 250 ميكروغرام / مل أوكساسيلين.</li>
	<li>إعداد 130 مل من حل التحكم مع تركيزات النهائي من 0.25 ميكرومتر صبغة الفلورسنت و 0.7 نانوغرام / مل من اليسوستافين. للقيام بذلك، اخلط 65 ميكرولتر من الصبغة الفلورية (0.5 مللي متر)، و9.12 ميكرولتر من مخزون الليسوستافين (10 ميكروغرام/مل) و130 مل من وسائط MH2.</li>
	<li>إعداد 130 مل من محلول المضادات الحيوية مع تركيزات النهائي من 0.25 ميكرومتر صبغة الفلورسنت, 0.7 نانوغرام / مل من الليسوستافين, و 50 ميكروغرام / مل oxacillin. للقيام بذلك، قم بخلط 65 ميكرولتر من الصبغة الفلورية (0.5 مللي متر)، و9.12 ميكرولتر من مخزون الليسوستفين (10 ميكروغرام/مل)، و26 مل من الأوكسيلين (250 ميكروغرام/مل) و104 مل من وسائط MH2.</li>
	<li>ملء اثنين من المحاقن 60 مل مع حل السيطرة واثنين من المحاقن 60 مل مع محلول المضادات الحيوية. الحفاظ على حلول ملفوفة في رقائق الألومنيوم لتجنب التدهور الناجم عن الضوء من الكواشف. ملء المحاقن لحساب الخسارة بسبب التنظيف من الأنابيب.
</li>
	<li>إزالة فقاعات الهواء من المحاقن عن طريق الخفقان. إرفاق وملء أنابيب الإدخال إلى طرف مع الحل التجريبي.</li>
	<li>تركيب المحاقن على المضخة. ضع الحقنة بأصغر حجم أولا، ثم قم بقفل موضع المكبس. تناسب بقية المحاقن على المضخة، والضغط على المكبس حسب الضرورة.</li>
	<li>تعيين سرعة المضخة إلى 1 مل / دقيقة وحجم المضخة إلى 60 مل. القيام تدفق مع المضخة حتى يتم رؤية تيار ثابت من السائل من جميع المحاقن.</li>
</ol>7. إعداد خلية التدفق تحت المجهر
<ol><li>إزالة خلية التدفق من الطرد المركزي وتركيبها على مرحلة المجهر(الشكل 3).</li>
	<li>توصيل أنابيب الإدخال/الإخراج بكل قناة من قنوات خلية التدفق (مخرج واحد لكل قناة). جمع الإخراج في أربع حاويات مختلفة يسمح لقياس أحجام إخراج القناة الفردية.</li>
</ol>8. تشغيل تجربة 60 دقيقة
<ol><li>تحقق من المواضع المنحازة مسبقا من الخطوة 2.5. إذا لم يتم توسيط حقل الرؤية المجهر على القناة و/أو خارج التركيز، قم بضبط الإعدادات وحفظ المواقف الجديدة. قد لا يكون التركيز الدقيق ممكنا قبل بدء التدفق بسبب الكثافة العالية للبكتيريا المحملة.
</li>
	<li>تعيين وقت اكتساب التباين المرحلة إلى 10 msec ووقت اكتساب مضان إلى 1600 msec.</li>
	<li>احصل على تباين المرحلة وصور الفلورسينس لكل موضع قبل بدء التدفق. وهذا يعطي تقديرا نوعيا للكثافة البكتيرية المحملة.
</li>
	<li>بدء تدفق السائل والتحقق فورا من أن المجهر يركز على الجزء السفلي من القنوات.</li>
	<li>خذ تباين المرحلة وصور الفلورسينس للمناطق المستهدفة في الدقيقة الأولى من التدفق.</li>
	<li>الحصول على الصور كل 2 دقيقة بعد أول مجموعة من الصور حتى 60 دقيقة من التدفق قد حدث. إعادة التركيز حسب الضرورة.</li>
</ol>9. تطهير خلية التدفق
<ol><li>جعل محلول التبييض 10٪ في كوب (100 مل). ملء 4 × 20 مل المحاقن مع 10 مل من الخليط. قم بتكبيل المحاقن وربطها بخلية التدفق. وسوف يستغرق ~ 1-2 دقيقة للقنوات لتكون واضحة من البكتيريا.
</li>
	<li>تعيين سرعة المضخة إلى 1 مل / دقيقة وحجم المضخة إلى 3 مل. تشغيل لمدة 3 دقائق.</li>
	<li>ملء 4 × 60 مل المحاقن مع 60 مل من المياه DI. قم بتكبيل المحاقن وربطها بخلية التدفق.</li>
	<li>تعيين سرعة المضخة إلى 1 مل / دقيقة وحجم المضخة إلى 30 مل. تشغيل لمدة 30 دقيقة.</li>
	<li>مراقبة تنظيف القناة تحت المجهر.</li>
	<li>تفكيك خلية التدفق. تجاهل الشريحة الايبوكسي المستخدمة. نقع مكونات خلية التدفق في المياه DI لمدة 20 دقيقة.</li>
</ol>10. تحليل الصور وتوليد البيانات
<ol><li>عد عدد البكتيريا في كل صورة. برنامج الوصول المفتوح، CellProfiler يستخدم لتنفيذ معالجة صورة الدفعة16. يتم تلخيص مخطط تفصيلي رفيع المستوى روتين CellProfiler في الجدول 1. عدد البكتيريا الموجودة في صورة التباين المرحلة (نع)يعطي العدد البكتيري الكلي. عدد البكتيريا المرئية في صورة مضان (Nو)يعطي عدد البكتيريا الميتة.
</li>
	<li>حساب نسبة موت الخلية البكتيرية العادية كدالة للوقت.<ol>
<li>استيراد Nf و Np للصور الفردية في برنامج تحليل البيانات.</li>
		<li>حساب جزء من البكتيريا الميتة في كل قناة في نقطة زمنية محددة التي قدمها الكسر (Nو / نع)في ر = T.</li>
		<li>طرح جزء من البكتيريا الميتة الموجودة في بداية التجربة (ر = 1 دقيقة) لكل من السيطرة والقنوات التجريبية.</li>
		<li>طرح جزء من البكتيريا الميتة الموجودة في قناة التحكم من ذلك الموجود في القناة التجريبية في كل نقطة زمنية مع المعادلة التالية: <img alt="Data Analysis Equation" fo:content-width="6in" height="217" src="/files/ftp_upload/50828/Data_analysis_equation.png" width="620">
</li>
		 <li>الرسم البياني DPالقاعدة مقابل ر لمسار التجربة. لاحظ أن عينة مع خلية نسبة وفاة أكبر من 1٪ تعتبر عرضة، في حين أن أقل من 0.5٪ وفاة يدل على المقاومة. وتعتبر النسب المئوية التي تقع بين هذين الانقطاعين غير محددة ويجب اختبار العينة مرة أخرى.
</li>
		<li>استخدم جدول بيانات لتلخيص وتحليل النتائج من تجارب مختلفة.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mairhofer, J., Roppert, K., Ertl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+systems+for+pathogen+sensing:+a+review.">Microfluidic systems for pathogen sensing: a review.</a> Sensors. 9, 4804-4823 (2009).</li><li>Yager, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+diagnostic+technologies+for+global+public+health.">Microfluidic diagnostic technologies for global public health.</a> Nature. 442, 412-418 (2006).</li><li>Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+bacteria+and+determining+their+susceptibility+to+antibiotics+by+stochastic+confinement+in+nanoliter+droplets+using+plug-based+microfluidics.">Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics.</a> Lab Chip. 8, 1265-1272 (2008).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+toxicological+complexity+by+multi-dimensional+screenings+in+microsegmented+flow:+modulation+of+antibiotic+interference+by+nanoparticles.">Uncovering toxicological complexity by multi-dimensional screenings in microsegmented flow: modulation of antibiotic interference by nanoparticles.</a> Lab Chip. 12, 474-484 (2012).</li><li>Chen, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+susceptibility+testing+using+high+surface-to-volume+ratio+microchannels.">Antimicrobial susceptibility testing using high surface-to-volume ratio microchannels.</a> Anal. Chem. 82, 1012-1019 (2010).</li><li>Churski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+screening+of+antibiotic+toxicity+in+an+automated+microdroplet+system.">Rapid screening of antibiotic toxicity in an automated microdroplet system.</a> Lab Chip. 12, 1629-1637 (2012).</li><li>Eun, Y. J., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulating+bacteria+in+agarose+microparticles+using+microfluidics+for+high-throughput+cell+analysis+and+isolation.">Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation.</a> ACS Chem. Biol. 6, 260-266 (2011).</li><li>Kim, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+monitoring+of+antibiotic+susceptibility+of+bacterial+biofilms+in+a+microfluidic+device.">In situ monitoring of antibiotic susceptibility of bacterial biofilms in a microfluidic device.</a> Lab Chip. 10, 3296-3299 (2010).</li><li>Peitz, I., van Leeuwen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+bacteria+growth+monitoring+by+automated+DEP-facilitated+image+analysis.">Single-cell bacteria growth monitoring by automated DEP-facilitated image analysis.</a> Lab Chip. 10, 2944-2951 (2010).</li><li>Kalashnikov, M., Lee, J. C., Campbell, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+rapid,+stress-induced+antibiotic+susceptibility+testing+of+Staphylococcus+aureus.">A microfluidic platform for rapid, stress-induced antibiotic susceptibility testing of Staphylococcus aureus.</a> Lab Chip. 12, 4523-4532 (2012).</li><li>McDonald, J. C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(dimethylsiloxane)+as+a+material+for+fabricating+microfluidic+devices.">Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices.</a> Acc. Chem. Res. 35, 491-499 (2002).</li><li>Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+viability+and+antibiotic+susceptibility+testing+with+SYTOX+green+nucleic+acid+stain.">Bacterial viability and antibiotic susceptibility testing with SYTOX green nucleic acid stain.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 2421-2431 (1997).</li><li>Francius, G., Domenech, O., Mingeot-Leclercq, M. P., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+Staphylococcus+aureus+cell+wall+digestion+by+lysostaphin.">Direct observation of Staphylococcus aureus cell wall digestion by lysostaphin.</a> J. Bacteriol. 190, 7904-7909 (2008).</li><li>Jordan, S., Hutchings, M. I., Mascher, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+envelope+stress+response+in+Gram-positive+bacteria.">Cell envelope stress response in Gram-positive bacteria.</a> FEMS Microbiol. Rev. 32, 107-146 (2008).</li><li>Koch, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+wall+as+target+for+attack:+past,+present,+and+future+research.">Bacterial wall as target for attack: past, present, and future research.</a> Clin. Microbiol. Rev. 16, 673-687 (2003).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100 (2006).</li><li>Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+antibiotics+kill+bacteria:+from+targets+to+networks.">How antibiotics kill bacteria: from targets to networks.</a> Nat. Rev. Microbiol. 8, 423-435 (2010).</li><li>Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Hayete, B., Lawrence, C. A., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+mechanism+of+cellular+death+induced+by+bactericidal+antibiotics.">A common mechanism of cellular death induced by bactericidal antibiotics.</a> Cell. 130, 797-810 (2007).</li></ol>

الأسلوب microfluidic هو براءة اختراع معلقة: ساور بودج A, شارون A, كلاشنيكوف M, فيرز H, المخترعين; طريقة وجهاز للكشف السريع عن مقاومة المضادات الحيوية البكتيرية / براءة اختراع القابلية PCT/US10/33523.

تم التحقق من صحة البروتوكول المقدم وتحسينه في مجموعة من التجارب مع سلالات المكورات العنقودية المقاومة للميثيسيلين والميثيسيلين10. لذلك ، يجب أن ينطبق هذا البروتوكول دون تعديل بشكل مباشر على سلالات أخرى من S. aureus والمضادات الحيوية الأخرى مع آليات العمل التي تؤثر على التمثيل...

يؤدي ظهور المقاومة البكتيرية إلى تكثيف الحاجة إلى اختبارات سريعة للحساسية للمضادات الحيوية القائمة على النمط الظاهري من أجل حماية أدويتنا الملاذ الأخير. وتستند اختبارات قابلية القياسية على تثبيط النمو البكتيري في وجود المضادات الحيوية التي تستغرق عدة (8-24) ساعات لإكمال. لقد طورنا اختبار قابلية جديدة للمضادات الحيوية على منصة microfluidic التي تعتمد على تنشيط الإجهاد من المسارات التركيب الحيوي لتسريع عمل المضادات الحيوية.
تحمل اختبارات قابلية المضادات الحيوية على مقياس microfluidic ميزة الاستخدام الفعال للعينة ، لأنها تتطلب أعدادا صغيرة من البكتيريا. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تكون أجهزة microfluidic متعددة من أجل اختبار عينات متعددة في ظل ظروف متعددة1،2. في الآونة الأخيرة ، تم الإبلاغ عن عدد من الطرق الدقيقة لاختبار قابلية المضادات الحيوية3-9. في هذه الطرق، تزرع البكتيريا داخل نانو وقطرات بيكوليتر3،7،في الحجم الكامل للقناة microfluidic4-6،8،أو كبكتيريا واحدة مترجمة كهربائيا إلى السطح السفلي للقناة9. على الرغم من أن هذه الاختبارات تتم في قنوات microfluidic ، إلا أنها تراقب جميعا النمو الميكروبي في وجود وعدم وجود مضادات حيوية مماثلة للطرق التقليدية. يتم أخذ قياسات النمو عن طريق الكثافة البصرية، والأصباغ الحساسة لhh، أو تباين المجال / المرحلة الساطعة أو صور الفلورسينس. على الرغم من أن بعض هذه الاختبارات أسرع من الطرق التقليدية، إلا أن كل منها يكتشف مقاومة المضادات الحيوية بشكل سلبي. وبعبارة أخرى، لا تزال هذه الأساليب تتطلب من المستخدم الانتظار للنمو البكتيري كمقروءة نهائية.
في المقابل، قمنا بتطوير طريقة تستخدم مزيجا من القص والإجهاد الأنزيمي لتنشيط المسارات الكيميائية الحيوية الحساسة للمضادات الحيوية10. تحدي البكتيريا وشدد مع تلك المضادات الحيوية يخلق اختبار قابلية أكثر سرعة. البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية قادرة على تحمل الظروف العصيبة. البكتيريا المعرضة، من ناحية أخرى، تقتل بسرعة من الضغوط مجتمعة. تحدد النسبة المئوية لوفيات الخلايا بعد ساعة واحدة، التي تقاس بالمنظار الدقيق باستخدام بقعة الخلايا الميتة الفلورية، النمط الظاهري للبكتيريا (المقاومة مقابل المعرضة).
من أجل التنفيذ الناجح لطريقتنا ، يجب شل حركة البكتيريا على السطح السفلي للقناة الدقيقة. وبهذه الطريقة، يمكن أن تتعرض البكتيريا لضغوط مختلفة وصورت في وقت واحد تحت المجهر في طائرة واحدة. يتم استخدام شريحة زجاجية مجهرية مغلفة لشل حركة البكتيريا. الشريحة هو precoated من قبل الشركة المصنعة مع مجموعات epoxide لربط البروتين غير محددة. الربط غير المحدد لهذه البيروكسيدات إلى البروتينات السطحية البكتيرية يعلق بشكل مشترك البكتيريا على سطح الشريحة.
يتم اختبار السلالات في ظل ظروف مماثلة (القص + الإجهاد الأنزيمي) في غياب (التحكم) ووجود (تجربة) المضادات الحيوية. يتم التقاط صور الطور والمجهر الفلوري لكل قناة تلقائيا كل دقيقتين لمدة ساعة واحدة. ثم يتم إجراء تسميات المقاومة من خلال مقارنة نسبة البكتيريا الميتة في القناة التجريبية بتلك الموجودة في قناة التحكم. بعد ساعة واحدة، تعتبر عينة مع نسبة وفيات الخلايا أكبر من 1٪ عرضة، في حين أن أقل من 0.5٪ وفاة يدل على المقاومة. وتعتبر النسب المئوية التي تقع بين هذين الانقطاعين غير محددة ويجب اختبار العينة مرة أخرى.
يتم تعريف القنوات الدقيقة في PDMS ، وهي مادة مفضلة للأجهزة الدقيقة11. وتكتسي نسبة PDMS شفافية بصرية في مجموعة واسعة من الأطوال الموجية، وهي متوافقة بيولوجيا، وغير خاملة، ووافرة بالنسبة للغازات، ولها نفاذية منخفضة للسوائل؛ لذلك هو مناسبة جيدا ل هذا تجارب.
يتم إنشاء الإجهاد الميكانيكية / القص من خلال تدفق وسائل الإعلام درجة حرارة الغرفة على البكتيريا المشلومة. (ملاحظة: ارتفاع درجة حرارة الوسائط إلى 37 درجة مئوية ليس له تأثير كبير على نتيجة الفحص.) مضخات حقنة الآلي قوة وسائل الإعلام (التي تحتوي على بقعة الخلية الميتة +/- المضادات الحيوية، فضلا عن الضغوطات الأنزيمية الاختيارية) من خلال قنوات microfluidic (200 ميكرومتر × 400 ميكرومتر) بمعدل تدفق 1 مل / دقيقة لإعطاء 6.25 كيلو باسكال من قوة القص أو معدل القص من 6000ثانية -1. هذا المعدل يساوي أو يتجاوز ضغوط القص التي تمت دراستها مسبقا على المكورات العنقودية.
تم اختيار الإنزيم ، ليسوستوفين ، للتجارب الأولية لأنه يسبب ضررا مباشرا لجدار خلية المكورات العنقودية. كان تركيز الليسوستافين (0.7 نانوغرام /مل) كافيا للتسبب في تلف جدار الخلية البكتيرية ، ولكنه لم يكن كافيا للتسبب في موت الخلايا البكتيرية دون مضاد حيوي في الإطار الزمني للتجربة. ليس مطلوبا ليسوستافين للتسمية الصحيحة للحساسية البكتيرية لكنه لا يزيد من النتيجة، مما يؤدي إلى زيادة موت الخلايا في سلالات عرضة. في المقابل، إجهاد القص أمر بالغ الأهمية لوظيفة المقايسة. عندما يتم التعامل مع سلالات المكورات العنقودية المراسية الحساسة للميثيسيلين مع الليسوستوفين والأوكسيسيلين في غياب التدفق ، لا يتم تسجيل أي موت خلية على مدار التجربة.
يتم رصد صلاحية الخلية مع بقعة خلية ميتة الفلورسنت12. واستند اختيار الصبغة على قدرتها على وصم الخلايا التالفة فقط بشكل انتقائي، وعدم سمية للخلايا الحية، وفلورسينس خلفيتها المنخفضة، مما سمح بإضافتها المباشرة إلى وسائط الخلية دون خطوات إضافية. وكان اختيار تركيز صبغة فلورية من 0.25 ميكرومتر لتحقيق مستويات إشارة مقبولة خلال 1.6 ثانية التعرض للضوء الإثارة الفلورية.
بيتا لاكتام، أوكساسيلين، استخدمت في دراساتنا الأولية. مقاومة للميثيسيلين S. أوريوس (MRSA) الأنواع مقاومة لأوكسيسيلين ولن تظهر أي موت خلية ملحوظ في الإطار الزمني للتجربة. تم تحديد تركيز 50 ميكروغرام /مل في الدراسات الأولية. أعطى انخفاض تركيزات المضادات الحيوية فصلا أقل بين السلالات المقاومة والمعرضة للإصابة ، في حين أن التركيزات الأعلى لم تسبب فرقا ملموسا في النتائج التجريبية.
وقد سبق لنا أن أبلغنا عن نجاح تطوير الاختبار الذي يجمع بين الضغوط الميكانيكية والانزيمية التي تؤثر بشكل مباشر على جدار الخلية البكتيرية13 مع مضاد حيوي يمنع التركيب الحيوي لجدار الخلية14,15. وقد أجريت هذه التجارب إثبات المبدأ على لوحة من MRSA وحساسة للميثيسيلين S. أوريوس (MSSA). ومع ذلك ، مع اختيار المعلمات التجريبية المناسبة ، يجب أن تكون طريقتنا قابلة للتطبيق على أنواع متعددة من البكتيريا وفئات متعددة من المضادات الحيوية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">SYTOX Green</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Invitrogen Corporation</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">S7020</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Dead cell fluorescence stain</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Sigma Aldrich, Inc</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">A9418-5G</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Used for lysostaphin storage</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">Sodium Acetate</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Sigma Aldrich, Inc</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">S8750-500G</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Used for lysostaphin storage</td>
		</tr>
		<tr height="98">
			<td dir="LTR" height="98" style="height:98px;width:195px;">Lysostaphin&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Cell Sciences</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">CRL309A</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Arrives as 1 mg solid. For storage: Dissolve in 20 mM sodium acetate. Mix with BSA solution to final concentration of 1% BSA and 100 &#181;g/ml &#160;lysostaphin for storage&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">Oxacillin salt</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Sigma Aldrich, Inc</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">28221-1G</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">Mueller Hinton Broth</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">DF0757-17-6</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:195px;">Sodium chloride</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Sigma Aldrixh</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">S3014-500G</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">2% added to Mueller-Hilton broth prior to autoclaving</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:195px;">1 ml, Luer-lock syringe&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">BD (Beckton, Dickinson and Comp.)</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">14-823-2F</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:195px;">2 oz, Luer-lock syringe</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">BD (Beckton, Dickinson and Comp.)</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">309653 - 60 mL</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Overfill to ~65 ml</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Microscope</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Inverted Fluoresccence Microscope Olympus IX-70</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Cambridge Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">9349</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">60X, Fluorescence/Phase contrast objective</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Olympus Corp.</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">LCPlan F1 60x/0.70 Ph2</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Retiga 12-bit monochrome CCD camera</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">QImaging</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">RET-4000R-F-M-12-C&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Microscope automation</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Shutters phase contrast/fluorescence</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">H204/H202</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">X/Y Stage&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">H107AENN</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Focus motor</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">H122</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Joystick for XYZ control</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">CS152EF</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Proscan Controller</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">H3-XY2</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Image Acquisition Software</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Flow Cell Assembly and PDMS</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Flow Cell</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1044</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;">Engineering drawings were produced by Fraunhofer CMI</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td dir="LTR" height="33" style="height:33px;width:329px;">Glass window</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1054</td>
			<td dir="LTR" rowspan="2" style="width:269px;">Glass window was cut to the proper size at Fraunhofer CMI</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td dir="LTR" height="33" style="height:33px;width:329px;">BOROFLOAT Window 50 mm x 50 mm</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Edmund Optics Inc.</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">NT48-543</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td dir="LTR" height="50" style="height:50px;width:329px;">Sealing plate</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">BU Scientific Instruments Facility</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1045</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Epoxide glass slide</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Arrayit Corporation</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">SuperEpoxy 2</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td dir="LTR" height="45" style="height:45px;width:329px;">PDMS master</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1053</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;">Master machined in aluminum or brass with UPM-0005 (ultrapresicion fly-cutting machine)</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">PDMS slide design</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1053</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Tubing</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td dir="LTR" height="50" style="height:50px;width:329px;">Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16 in, PEEK, green&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">M-644-03</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;">Flow cell inputs/outputs are tapped for this ferrule</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Ferrule, Tinytight, 1/16 in, 6-40, .030 in TH, PEEK w/ SS lock ring, black</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">M-657</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16-1/32 in, 1/4-28, PEEK, natural</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">P-255</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Ferrule, Super Falngeless, 1/16 in, Tefzel (ETFE), yellow</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">P-259</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;">Fits Luer-lock adapter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Tubing, Teflon FEP, .030 in x 1/16 in x 20 ft, green&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">1520G</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Adapter, quick connect female Luer to female 1/4-28, PEEK, red&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">P-658</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stress-induced antibiotic susceptibility testing on a chip

لقد طورنا طريقة ميكروفلويديك سريعة لاختبار قابلية المضادات الحيوية في بيئة قائمة على الإجهاد. يتم تمرير السوائل بسرعات عالية على البكتيريا التي شلت حركتها في الجزء السفلي من قناة microfluidic. في وجود الإجهاد والمضادات الحيوية ، تموت سلالات البكتيريا المعرضة بسرعة. ومع ذلك، البكتيريا المقاومة البقاء على قيد الحياة هذه الظروف العصيبة. الفرضية وراء هذه الطريقة جديدة: تنشيط الإجهاد للمسارات الكيميائية الحيوية، والتي هي أهداف للمضادات الحيوية، يمكن تسريع اختبار قابلية المضادات الحيوية. بالمقارنة مع طرق اختبار قابلية المضادات الحيوية القياسية ، يتم حذف الخطوة المقيدة للمعدل - النمو البكتيري - أثناء تطبيق المضادات الحيوية. ويندمج التنفيذ التقني للطريقة في مزيج من التقنيات المعيارية والنهج المبتكرة. وتشمل الأجزاء القياسية من هذه الطريقة بروتوكولات الثقافة البكتيرية، وتحديد قنوات microfluidic في البوليديميثيلسيلوكسيان (PDMS)، ورصد صلاحية الخلية مع الفلورسينس، ومعالجة الصور دفعة لعد البكتيريا. أجزاء مبتكرة من هذه الطريقة هي في استخدام تدفق وسائل الإعلام الثقافة لتطبيق الإجهاد الميكانيكية، واستخدام الإنزيمات لتلف ولكن ليس قتل البكتيريا، واستخدام الركائز microarray للتعلق البكتيري. يمكن استخدام المنصة المطورة في تطوير واختبار الأدوية ذات الصلة بالمضادات الحيوية وغير الحيوية. بالمقارنة مع تجارب التعليق البكتيري القياسية ، يمكن تشغيل تأثير الدواء وإيقافه مرارا وتكرارا خلال فترات زمنية خاضعة للرقابة. الملاحظة المتكررة لنفس السكان البكتيرية ممكنة على مدار التجربة نفسها.

تظهر البيانات المعروضة في الشكل 4 استجابة سلالة المكورات العنقودية المردية المعرضة للخطر بمرور الوقت في قناة ميكروفلويديك تحتوي على المضادات الحيوية. تظهر صور تباين المرحلة المكتسبة في دقيقة واحدة وفي نهاية تجربة الساعة 1 في الشكلين 4A و B. تظهر بيانا?...

Watch this Scientific Journal Video about Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip at JoVE.com

Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip

لقد طورنا منصة microfluidic لاختبار قابلية المضادات الحيوية السريعة. يتم تمرير السوائل بسرعات عالية على البكتيريا التي شلت حركتها في الجزء السفلي من قناة microfluidic. في وجود الإجهاد والمضادات الحيوية ، تموت سلالات البكتيريا المعرضة بسرعة. ومع ذلك، يمكن للبكتيريا المقاومة البقاء على قيد الحياة هذه الظروف العصيبة.

اختبار قابلية المضادات الحيوية الناجم عن الإجهاد على رقاقة

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over ...

stress-induced-antibiotic-susceptibility-testing-on-a-chip

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.3K Views.  Fraunhofer USA Center for Manufacturing Innovation. لقد طورنا منصة microfluidic لاختبار قابلية المضادات الحيوية السريعة. يتم تمرير السوائل بسرعات عالية على البكتيريا التي شلت حركتها في الجزء السفلي من قناة microfluidic. في وجود الإجهاد والمضادات الحيوية ، تموت سلالات البكتيريا المعرضة بسرعة. ومع ذلك، يمكن للبكتيريا المقاو?...

Video: Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip

Lensless Fluorescent Microscopy on a Chip

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for high-throughput screening applications. This emerging technology platform has the potential to eliminate the need for bulky and/or costly optical components through the help of novel theories and digital reconstruction algorithms. Along the same lines, here we demonstrate an on-chip fluorescent microscopy modality that can achieve e.g., &lt;4&mu;m spatial resolution over an ultra-wide field-of-view (FOV) of &gt;0.6-8 cm2 without the use of any lenses, mechanical-scanning or thin-film based interference filters. In this technique, fluorescent excitation is achieved through a prism or hemispherical-glass interface illuminated by an incoherent source. After interacting with the entire object volume, this excitation light is rejected by total-internal-reflection (TIR) process that is occurring at the bottom of the sample micro-fluidic chip. The fluorescent emission from the excited objects is then collected by a fiber-optic faceplate or a taper and is delivered to an optoelectronic sensor array such as a charge-coupled-device (CCD). By using a compressive-sampling based decoding algorithm, the acquired lensfree raw fluorescent images of the sample can be rapidly processed to yield e.g., &lt;4&mu;m resolution over an FOV of &gt;0.6-8 cm2. Moreover, vertically stacked micro-channels that are separated by e.g., 50-100 &mu;m can also be successfully imaged using the same lensfree on-chip microscopy platform, which further increases the overall throughput of this modality. This compact on-chip fluorescent imaging platform, with a rapid compressive decoder behind it, could be rather valuable for high-throughput cytometry, rare-cell research and microarray-analysis.

A lensless on-chip fluorescent microscopy platform is demonstrated that can image fluorescent objects over an ultra-wide field-of-view of e.g., &#62;0.6-8 cm2 with &#60;4&#956;m resolution using a compressive sampling based decoding algorithm. Such a compact and wide-field fluorescent on-chip imaging modality could be valuable for high-throughput cytometry, rare-cell research and microarray-analysis.

نيون الميكروسكوب Lensless على رقاقة

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for ...

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial dysfunction. However, early functional changes in endothelium that signify an individual's level of risk are not directly assessed clinically to help guide therapeutic strategy. Moreover, the regulation of inflammation by local hemodynamics contributes to the non-random spatial distribution of atherosclerosis, but the mechanisms are difficult to delineate in vivo. We describe a lab-on-a-chip based approach to quantitatively assay metabolic perturbation of inflammatory events in human endothelial cells (EC) and monocytes under precise flow conditions. Standard methods of soft lithography are used to microfabricate vascular mimetic microfluidic chambers (VMMC), which are bound directly to cultured EC monolayers.1 These devices have the advantage of using small volumes of reagents while providing a platform for directly imaging the inflammatory events at the membrane of EC exposed to a well-defined shear field. We have successfully applied these devices to investigate cytokine-,2 lipid-3, 4 and RAGE-induced5 inflammation in human aortic EC (HAEC). Here we document the use of the VMMC to assay monocytic cell (THP-1) rolling and arrest on HAEC monolayers that are conditioned under differential shear characteristics and activated by the inflammatory cytokine TNF-&alpha;. Studies such as these are providing mechanistic insight into atherosusceptibility under metabolic risk factors.

Microfluidic flow chambers etched by photolithography and fabricated from PDMS are applied to probe functional outcomes associated with EC dysfunction and inflammation. In a representative experiment, the ability of differential shear stress to modulate monocytic cell adhesion to cytokine activated EC monolayers is demonstrated.

على رقاقة Phenotyping التهاب غشائي

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, and observation and quantification are very challenging. However, conventional in vitro microvessel assays have limitations when representing in vivo microvessels with respect to three-dimensional (3D) geometry and providing continuous fluid flow. Using a combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics, we have developed a multi-depth circular cross-sectional endothelialized microchannels-on-a-chip, which mimics the 3D geometry of in vivo microvessels and runs under controlled continuous perfusion flow. A positive reflowable photoresist was used to fabricate a master mold with a semicircular cross-sectional microchannel network. By the alignment and bonding of the two polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels replicated from the master mold, a cylindrical microchannel network was created. The diameters of the microchannels can be well controlled. In addition, primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) seeded inside the chip showed that the cells lined the inner surface of the microchannels under controlled perfusion lasting for a time period between 4 days to 2 weeks.

A microchannels-on-a-chip platform was developed by the combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics. The endothelialized microchannels platform mimics the three-dimensional (3D) geometry of in vivo microvessels, runs under controlled continuous perfusion flow, allows for high-quality and real-time imaging&#160;and can be applied for microvascular research.

الإجراء لتنمية متعدد عمق التعميم مستعرضة Endothelialized Microchannels على واحد في رقاقة

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

بيب على رقاقة: دراسة خالية من التسمية من التفاعلات البروتين فسفوانوسيتيد

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An easy-to-use and low-cost sensor platform is highly desired to measure various types of analytes (e.g., biomarkers, hormones, and drugs) quantitatively and specifically. For this reason, dry film photoresist technology - enabling cheap, facile, and high-throughput fabrication - was used to manufacture the microfluidic biosensor presented here. Depending on the bioassay used afterwards, the versatile platform is capable of detecting various types of biomolecules. For the fabrication of the device, platinum electrodes are structured on a flexible polyimide (PI) foil in the only clean-room process step. The PI foil serves as a substrate for the electrodes, which are insulated with an epoxy-based photoresist. The microfluidic channel is subsequently generated by the development and lamination of dry film photoresist (DFR) foils onto the PI wafer. By using a hydrophobic stopping barrier in the channel, the channel is separated into two specific areas: an immobilization section for the enzyme-linked assay and an electrochemical measurement cell for the amperometric signal readout.
The on-chip bioassay immobilization is performed by the adsorption of the biomolecules to the channel surface. The glucose oxidase enzyme is used as a transducer for electrochemical signal generation. In the presence of the substrate, glucose, hydrogen peroxide is produced, which is detected at the platinum working electrode. The stop-flow technique is applied to obtain signal amplification along with rapid detection. Different biomolecules can quantitatively be measured by means of the introduced microfluidic system, giving an indication of different types of diseases, or, in regard to therapeutic drug monitoring, facilitating a personalized therapy.

A microfluidic biosensor platform was designed and fabricated using low-cost dry film photoresist technology for the rapid and sensitive quantification of various analytes. This single-use system allows for the electrochemical readout of on-chip-immobilized enzyme-linked assays by means of the stop-flow technique.

الفيلم الجافة على أساس مقاوم الضوء Biosensor موائع جزيئية الكهروكيميائية منصة: تصنيع الجهاز وإعداد مقايسة على شريحة، ونظام التشغيل

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

تلفيق والتحقق من صحة نظام الجهاز على رقاقة مع أقطاب متكاملة لقياس المقاومة الكهربائية ترانسيندوثيليال مباشرة

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling

Bone remodeling is a tightly regulated process that is required for skeletal growth and repair as well as adapting to changes in the mechanical environment. During this process, mechanosensitive osteocytes regulate the opposing responses between the catabolic osteoclasts and anabolic osteoblasts. To better understand the highly intricate signaling pathways that regulate this process, our lab has developed a foundationary lab-on-a-chip (LOC) platform for analyzing functional outcomes (formation and resorption) of bone remodeling within a small scale system. As bone remodeling is a lengthy process that occurs on the order of weeks to months, we developed long-term cell culturing protocols within the system. Osteoblasts and osteoclasts were grown on functional activity substrates within the LOC and maintained for up to seven weeks. Afterward, chips were disassembled to allow for the quantification of bone formation and resorption. Additionally, we have designed a 3D printed mechanical loading device that pairs with the LOC platform and can be used to induce osteocyte mechanotransduction by deforming the cellular matrix. We have optimized cell culturing protocols for osteocytes, osteoblasts, and osteoclasts within the LOC platform and have addressed concerns of sterility and cytotoxicity. Here, we present the protocols for fabricating and sterilizing the LOC, seeding cells on functional substrates, inducing mechanical load, and disassembling the LOC to quantify endpoint results. We believe that these techniques lay the groundwork for developing a true organ-on-a-chip for bone remodeling.

Here, we present protocols for analyzing bone remodeling within a lab-on-a-chip platform. A 3D printed mechanical loading device can be paired with the platform to induce osteocyte mechanostransduction by deforming the cellular matrix. The platform can also be used to quantify bone remodeling functional outcomes from osteoclasts and osteoblasts (resorption/formation).

منصة مختبر على رقاقة لتحفيز العظام Mechanotransduction وتحليل النتائج الوظيفية لإعادة عرض العظام

Bone remodeling is a tightly regulated process that is required for skeletal growth and repair as well as adapting to changes in the mechanical ...

3D Cell-Printed Hypoxic Cancer-on-a-Chip for Recapitulating Pathologic Progression of Solid Cancer

Cancer microenvironment has a significant impact on the progression of the disease. In particular, hypoxia is the key driver of cancer survival, invasion, and chemoresistance. Although several in vitro models have been developed to study hypoxia-related cancer pathology, the complex interplay of the cancer microenvironment observed&#160;in vivo has not been reproduced yet owing to the lack of precise spatial control. Instead, 3D biofabrication approaches have been proposed to create microphysiological systems for better emulation of cancer ecology and accurate anticancer treatment evaluation. Herein, we propose a 3D cell-printing approach to fabricate a hypoxic cancer-on-a-chip. The hypoxia-inducing components in the chip were determined based on a computer simulation of the oxygen distribution. Cancer-stroma concentric rings were printed using bioinks containing glioblastoma cells and endothelial cells to recapitulate a type of solid cancer. The resulting chip realized central hypoxia and aggravated malignancy in cancer with the formation of representative pathophysiological markers. Overall, the proposed approach for creating a solid-cancer-mimetic microphysiological system is expected to bridge the gap between in vivo and in vitro models for cancer research.

Hypoxia is a hallmark of tumor microenvironment and plays a crucial role in cancer progression. This article describes the fabrication process of a hypoxic cancer-on-a-chip based on 3D cell-printing technology to recapitulate a hypoxia-related pathology of cancer.

3D الخلية المطبوعة سرطان نقص الأكز على رقاقة لتلخيص التقدم المرضي للسرطان الصلب

Cancer microenvironment has a significant impact on the progression of the disease. In particular, hypoxia is the key driver of cancer survival, invasion, ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of concept, a simplified and undifferentiated human skin containing a dermal (stromal) and an epidermal (epithelial) compartment has been modelled. To accomplish this, a versatile and robust, vinyl-based device divided into two chambers has been developed, overcoming some of the drawbacks present in microfluidic devices based on polydimethylsiloxane (PDMS) for biomedical applications, such as the use of expensive and specialized equipment or the absorption of small, hydrophobic molecules and proteins. Moreover, a new method based on parallel flow was developed, enabling the in situ deposition of both the dermal and epidermal compartments. The skin construct consists of a fibrin matrix containing human primary fibroblasts and a monolayer of immortalized keratinocytes seeded on top, which is subsequently maintained under dynamic culture conditions. This new microfluidic platform opens the possibility to model human skin diseases and extrapolate the method to generate other complex tissues.

Here, we present a protocol to generate a three-dimensional simplified and undifferentiated skin model using a micromachined microfluidic platform. A parallel flow approach allows the in situ deposition of a dermal compartment for the seeding of epithelial cells on top, all controlled by syringe pumps.

جيل من نموذج مبسط ثلاثي الأبعاد للبشرة على رقاقة في منصة Micromachined Microfluidic

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs

The high prevalence of debilitating joint diseases like osteoarthritis (OA) poses a high socioeconomic burden. Currently, the available drugs that target joint disorders are mostly palliative. The unmet need for effective disease-modifying OA drugs (DMOADs) has been primarily caused by the absence of appropriate models for studying the disease mechanisms and testing potential DMOADs. Herein, we describe the establishment of a miniature synovial joint-mimicking microphysiological system (miniJoint) comprising adipose, fibrous, and osteochondral tissue components derived from human mesenchymal stem cells (MSCs). To obtain the three-dimensional (3D) microtissues, MSCs were encapsulated in photocrosslinkable methacrylated gelatin before or following differentiation. The cell-laden tissue constructs were then integrated into a 3D-printed bioreactor, forming the miniJoint. Separate flows of osteogenic, fibrogenic, and adipogenic media were introduced to maintain the respective tissue phenotypes. A commonly shared stream was perfused through the cartilage, synovial, and adipose tissues to enable tissue crosstalk. This flow pattern allows the induction of perturbations in one or more of the tissue components for mechanistic studies. Furthermore, potential DMOADs can be tested via either &#34;systemic administration&#34; through all the medium streams or &#34;intraarticular administration&#34; by adding the drugs to only the shared &#34;synovial fluid&#34;-simulating flow. Thus, the miniJoint can serve as a versatile in vitro platform for efficiently studying disease mechanisms and testing drugs in personalized medicine.

We provide detailed methods for generating four types of tissues from human mesenchymal stem cells, which are used to recapitulate the cartilage, bone, fat pad, and synovium in the human knee joint. These four tissues are integrated into a customized bioreactor and connected through microfluidics, thus generating a knee joint-on-a-chip.

إنشاء مفصل الركبة على رقاقة لنمذجة أمراض المفاصل واختبار الأدوية

The high prevalence of debilitating joint diseases like osteoarthritis (OA) poses a high socioeconomic burden. Currently, the available drugs that target ...