The present study was funded in part by a Research Initiation Grant (RIG) from the University of North Texas to Dr. McFarlin. The authors did not receive direct funding for the completion of this study and report no conflict of interest.

ملاحظة: تم تنفيذ جميع إجراءات جمع الدم وصفها في هذه الطريقة وفقا لإعلان هلسنكي والموافقة عليها من قبل الاتحاد الوطني للعمال المؤسسي مجلس مراجعة (IRB) للمواد الدراسية الإنسان. أعطت جميع المواد الدراسية موافقة خطية لجمع الدم، والتي كانت تستخدم في هذا الأسلوب للتأكد من أنها كانت على ما يبدو بصحة جيدة، من وزن الجسم العادي، وخالية من المرض. 1. الكاشف المصدر وإعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام CD66b-APC (استنساخ # G10F5، DF = 1: 50) وCD45-APCeFluor780 (استنساخ # 2D1، DF = 1: 50) لهذا الاختبار. ملاحظة: قبل الدراسة، وtitered CD45 وCD66b الأجسام المضادة لتحديد التخفيف الأمثل الذي المحببة حلها بوضوح (CD45 + / + 66B) من الكريات البيض الأخرى (CD45 + / 66b-) 11. على إضافة الأجسام المضادة المخفف لتلطيخ كان التخفيف النهائي في الأنبوب 875. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شراء وذوبان الجليد الأسهم S. الذهبية bioparticles المسمى مع pHrodo صبغة حمراء. تعليق بتركيز 1 مغرام من bioparticles لكل مل في برنامج تلفزيوني العقيمة. قسامة bioparticles مخفف وتخزين تجميد في -20 درجة مئوية حتى استخدامها في فحص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل dihydroethidium (DHE)، والتي يتم تحويلها إلى بروميد إيثيديوم الفلورسنت في وجود الجذور الحرة الأكسجين (أي انفجار الأكسدة)، في DMSO إلى تركيز النهائي من 10 جرام / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج N-ethylmaleimide (التي تستخدم لمنع البلعمة الإضافية التالية الفحص مدة حضانة معين) مع برنامج تلفزيوني العقيمة في التخفيف 2 خطوة من 200 ملغ / مل و 17.5 ملغ / مل على التوالي. في مقايسة، استخدم تركيز النهائي من 15 ملم. عندما يذوب N-ethylmaleimide، استخدم 37 درجة كتلة C الحرارة، كما لا تبقى N-ethylmaleimide في الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الخطوة النهائية التثبيت، استخدم 7AAD وصمة عار DNA النووي. قبل بالإضافة إلى ذلك، تمييع 7AAD الأسهم 01:10 مع برنامج تلفزيوني العقيمة. </li></ol> 2. جمع الدم عينة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طرح المواضيع للوصول إلى المختبر بعد O / N سريع (&gt; 8HR) وabstentiعلى من النشاط البدني (&gt; 12 ساعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تنظيف الجلد مع لوحة الإعدادية الكحول، اضافة الى وجود إبرة معقمة جمع الدم إلى الذراع ريد محيطي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الدم في الأنابيب المفرغة التي تمتلئ تجاريا مع الهيبارين الصوديوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد جمع وتطبيق ضمادة لاصقة لذراع في هذا الموضوع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عكس أنابيب الدم لخلط 10 مرات وبعد ذلك وضعت على الكرسي الهزاز حتى التحليل. </li></ol> 3. البلعمة الفحص تقنية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> bioparticles ذوبان الجليد البكتريا (RT)، DHE (RT)، وN-ethylmaleimide (37 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 L من bioparticles البكتريا إلى 4 الفردية 1.2 مل أنابيب بينما كان يعمل في غطاء محرك السيارة العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 40 L من DHE إلى كل أنبوب يحتوي على bioparticles. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف الاستفادة من الأنابيب على سطح مقاعد البدلاء لجمع الكواشف في الجزء السفلي من الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 L من الدم الكامل مختلطة إلى كل أنبوب الذي تم مليئة bioparticles وDHE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">مسح الحافة الداخلية من الأنابيب مع القطن يميل قضيب لإزالة أي تلوث الدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج من الدم والكواشف مع الماصة الإلكترونية المقرر أن مزيج الدم والكاشف لثلاث دورات بعد إضافة الدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنابيب الاختبار في دلو الجليد وتغطية للحماية من الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان أنابيب الاختبار لمدة 10، 20، و 40 دقيقة. نبدأ مع أنبوب 40 دقيقة لضمان جميع الأنابيب فحص تنتهي في نفس الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد N-ethylmaleimide في 37 ° C حمام حبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة 15 L من N-ethylmaleimide (المذكورة أعلاه في 1.4) في كل أنبوب الفحص، احتضان لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة 10 L من CD66b-APC و 10 L من CD45-APCeFluor780 الأجسام المضادة المخفف (المذكورة أعلاه في 1.1)، واحتضان لمدة 60 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة 750 L للإصلاح مجلس الملاكمة العالمي / RBC حل ليز إلى كل أنبوب الفحص، احتضان لمدة 60 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي (10 دقيقة في 400 x ج) فحص أنابيب لجمع بيليه الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فراغ نضح الحل ليز مجلس الملاكمة العالمي / RBC الإصلاح، وترك فلوريدا المتبقيةحجم UID (100 L) أعلاه بيليه الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة 10 L من محلول مخفف 7AAD (المذكورة أعلاه في 1.5) و 50 L من برنامج تلفزيوني في كل أنبوب الاختبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة قطرة واحدة من الخرز المعايرة (~ 25 L) إلى كل أنبوب الاختبار، والقبعات مكان على أنابيب الاختبار، وأنابيب التفاف في احباط، ومكان في الثلاجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل أنبوب العينة إلى تدفق القائم على صورة عداد الكريات وجمع ما لا يقل عن 3،000 أحداث محببة باستخدام معلمات محددة مسبقا: الاوتوماتيكى والأزرق (488 نانومتر و 60 ميغاواط) والأحمر (640 نانومتر و 100 NW)، SSC (785 نانومتر. 8.5 ميغاواط) ليزر (الشكل 1). </li></ol><img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig1highres.jpg" /> الشكل 1. اكتساب الأسلوب والقالب. تم الحصول على عينات على تدفق القائم على صورة عداد الكريات (A). خلال الاستحواذ، تم إنشاؤها نقطة قطع برايت الميداني نسبة الارتفاع مقابل CD66b APC-لالمحببة فصل من الخرز المعايرة ارتفعت النقيبز INSPIRE ضد 100.2.292.0 البرمجيات (B). تم الحصول على ما لا يقل عن 5،000 المحببة لكل العينات باستخدام الاوتوماتيكى والأزرق (488 نانومتر و 60 ميغاواط) والأحمر (640 نانومتر و 100 NW)، SSC (785 نانومتر، 8.5 ميغاواط) وأشعة الليزر. يرجى ملاحظة أن عددا من رسوم بيانية موجودة خلال الاستحواذ على رصد إعدادات الليزر وغيرها من جوانب البيانات جمع. كل هذه رسوم بيانية اختيارية ويحتاج فقط إذا كانت إجراءات التشغيل القياسية المختبر يتطلب منهم عن مراقبة الجودة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig1large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> 4. اكتساب عينة وتحليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المعالج تعويض البرمجيات الآلي من البرنامج IDEAS لتطبيق مصفوفة تعويضات لملفات الصور الخام (RIF) وإنشاء تعويض الملفات المصورة (CIF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل ملفات سيف الفردية في IDEAS البرمجيات وتوليد المؤامرات التالية لتحديد مجموعات فرعية محببة: </لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء بوابات الأولية لتحديد الخلايا التي اعتبرت في التركيز باستخدام الرسم البياني للمشرق RMS التدرج الميدان (الشكل 2A). جعل هذا التحديد لكل عينة المرضى باستخدام جهاز التحكم unstimulated كمعيار مرجعي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المؤامرات الثانوية إلى خلايا منفصلة القميص من الحطام والحلل باستخدام مؤامرة نقطة من نسبة الارتفاع الحقل مشرق (نسبة ارتفاع الخلية مقابل العرض) مقابل منطقة حقل مشرق (الشكل 2B). جعل هذا التحديد لكل عينة المرضى باستخدام جهاز التحكم unstimulated كمعيار مرجعي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد تم التعرف على السكان نظيفة من الخلايا، إنشاء مؤامرة نقطة من CD45 مقابل CD66b (الشكل 2C) لتحديد إيجابيا المحببة (CD45 + / 66B +). خلق مؤامرة ابنة (الشكل 3) من شدة التفاصيل مشرقة للS. العنقودية الذهبية (محور س) مقابل كثافة التفاصيل مشرقة للالتأكسدي انفجار (DHE، المحور ص) لتحديد مجموعات فرعية من المحببة تفعيلها. جمع رصور الحقل آيت في القناة 1 و 9، bioparticles في القناة 2، DHE في القناة 4، 7AAD في قناة 5، CD66b في قناة 11، وCD45 في قناة 12. </li></ol><img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig2highres.jpg" /> الشكل 2. تحليل قالب. هذا الرقم سلسلة من المؤامرات التي تم إنشاؤها لتحديد الخلايا التي كانت في التركيز (A)، والخلايا واحدة (B)، المحببة (C). استخدمت المؤامرات إضافية لتحديد مجموعات فرعية ثلاثة من المحببة تنشيط مقابل المحببة الخاملة. تم الانتهاء من جميع تحليل ملفات الصور المكتسبة باستخدام برامج IDEAS V.6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<ol>
	<li>Kong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+alpha-fetoprotein+on+the+activation+and+phagocytosis+of+granulocytes+and+monocytes.">The effect of alpha-fetoprotein on the activation and phagocytosis of granulocytes and monocytes.</a> Hepatogastroenterology. 59, 2385-2388 (2012).</li><li>Prakash, P. S., Caldwell, C. C., Lentsch, A. B., Pritts, T. A., Robinson, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+microparticles+generated+during+sepsis+in+patients+with+critical+illness+are+neutrophil-derived+and+modulate+the+immune+response.">Human microparticles generated during sepsis in patients with critical illness are neutrophil-derived and modulate the immune response.</a> J. Trauma Acute Care Surg. 73, 401-406 (2012).</li><li>Salih, H. R., Husfeld, L., Adam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+cytofluorometric+measurement+of+phagocytosis,+burst+production+and+killing+of+human+phagocytes+using+Candida+albicans+and+Staphylococcus+aureus+as+target+organisms.">Simultaneous cytofluorometric measurement of phagocytosis, burst production and killing of human phagocytes using Candida albicans and Staphylococcus aureus as target organisms.</a> Clin. Microbiol. Infect. 6, 251-258 (2000).</li><li>Tsuji, S., Iharada, A., Taniuchi, S., Hasui, M., Kaneko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+production+of+nitric+oxide+by+phagocytic+stimulated+neutrophils+in+patients+with+chronic+granulomatous+disease.">Increased production of nitric oxide by phagocytic stimulated neutrophils in patients with chronic granulomatous disease.</a> J. Pediatr. Hematol. Oncol. 34, 500-502 (2012).</li><li>Ortyn, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+measurement+and+compensation+in+spectral+imaging.">Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging.</a> Cytometry A. 69, 852-862 (2006).</li><li>McFarlin, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one-year+school-based+diet/exercise+intervention+improves+non-traditional+disease+biomarkers+in+Mexican-American+children.">A one-year school-based diet/exercise intervention improves non-traditional disease biomarkers in Mexican-American children.</a> Matern. Child Nutr. 9, 524-532 (2013).</li><li>McFarlin, B. K., Johnson, C. A., Moreno, J. P., Foreyt, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mexican-American+Children+have+differential+elevation+of+Metabolic+Biomarkers+that+is+proportional+to+Obesity+Status.">Mexican-American Children have differential elevation of Metabolic Biomarkers that is proportional to Obesity Status.</a> J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. , (2013).</li><li>Strohacker, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate-intensity,+premeal+cycling+blunts+postprandial+increases+in+monocyte+cell+surface+CD18+and+CD11a+and+endothelial+microparticles+following+a+high-fat+meal+in+young+adults.">Moderate-intensity, premeal cycling blunts postprandial increases in monocyte cell surface CD18 and CD11a and endothelial microparticles following a high-fat meal in young adults.</a> Appl. Physiol. Nutr. Metab. 37, 530-539 (2012).</li><li>Carpenter, K. C., Breslin, W. L., Davidson, T., Adams, A., McFarlin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baker's+yeast+beta-glucan+supplementation+increases+monocytes+and+cytokines+post-exercise:+implications+for+infection+risk.">Baker's yeast beta-glucan supplementation increases monocytes and cytokines post-exercise: implications for infection risk.</a> Br. J. Nutr. , 1-9 (2012).</li><li>McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst.">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (1002).</li><li>McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst.">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (2013).</li><li>Ichii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+sucrose+impairs+phagocytic+function+and+promotes+apoptosis+in+polymorphonuclear+leukocytes.">Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes.</a> Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).</li><li>Ploppa, A., George, T. C., Unertl, K. E., Nohe, B., Durieux, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageStream+cytometry+extends+the+analysis+of+phagocytosis+and+oxidative.">ImageStream cytometry extends the analysis of phagocytosis and oxidative.</a> Scand. J. Clin. Lab. Invest. 71, 362-369 (2011).</li><li>Van Amersfoort, E. S., Van Strijp, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+flow+cytometric+fluorescence+quenching+assay+of+phagocytosis+of+sensitized+sheep+erythrocytes+by+polymorphonuclear+leukocytes.">Evaluation of a flow cytometric fluorescence quenching assay of phagocytosis of sensitized sheep erythrocytes by polymorphonuclear leukocytes.</a> Cytometry. 17, 294-301 (1994).</li><li>Gullstrand, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+autoantibodies+against+different+histone+proteins+influences+complement-dependent+phagocytosis+of+necrotic+cell+material+by+polymorphonuclear+leukocytes+in+systemic+lupus+erythematosus.">Combination of autoantibodies against different histone proteins influences complement-dependent phagocytosis of necrotic cell material by polymorphonuclear leukocytes in systemic lupus erythematosus.</a> J. Rheumatol. 39, 1619-1627 (2012).</li><li>Fierro, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+phenotypical+impairment+of+polymorphonuclear+cells+in+atopic+dermatitis:+an+additional+cause+for+the+known+susceptibility+to+infections.">Functional and phenotypical impairment of polymorphonuclear cells in atopic dermatitis: an additional cause for the known susceptibility to infections.</a> Dermatology. 224, 323-330 (2012).</li><li>Gruger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+impact+of+linezolid+on+human+neutrophil+functions+in+vitro.">Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro.</a> Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).</li><li>McFarlin, B. K., Venable, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Low+Concentration+Human+Serum+Cytokines+using+a+Millipore+High-Sensitivity+Milliplex+Assay.">Measurement of Low Concentration Human Serum Cytokines using a Millipore High-Sensitivity Milliplex Assay.</a> J. Vis. Exp. , (2014).</li><li>McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Davidson, T., McFarlin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baker's+Yeast+Beta+Glucan+Supplementation+Increases+Salivary+IgA+and+Decreases+Cold/Flu+Symptomatic+Days+After+Intense+Exercise.">Baker's Yeast Beta Glucan Supplementation Increases Salivary IgA and Decreases Cold/Flu Symptomatic Days After Intense Exercise.</a> J. Diet. Suppl. 10, 171-183 (2013).</li><li>McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Strohacker, K., Breslin, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+blood+monocytes+and+adipose+tissue+macrophages+in+a+mouse+model+diet-induced+weight+gain.">Comparison of blood monocytes and adipose tissue macrophages in a mouse model diet-induced weight gain.</a> Comp. Med. 62, 462-465 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

يمثل هذا الأسلوب صقل الأساليب القائمة لتقييم وظيفة محببة باستخدام التدفق الخلوي 1،3،4،12-14. الخطوات الحاسمة من هذا الاختبار تميل إلى أن تكون ذات صلة الخلط السليم للعينة الدم مع bioparticles وDHE. سوف خلط ناقصة تؤدي إلى نتائج غير دقيقة. في حين خلط كامل أمر بالغ الأهمية، يجب أن تكون طريقة خلط لطيف في الطبيعة. ويقترح أن الاختلاط تحقيقه باستخدام الماصة الإلكترونية مع وظيفة خلط بدلا من خلاط دوامة. آخر خطوة حاسمة في مقايسة هي ضمان دائما عدم وجود الدم الملوثة في النصف العلوي من أنبوب الاختبار. ويمكن إزالة هذا الدم المتبقي باستخدام القطن ذات الرؤوس المعقم قضيب. إزالة كاملة مهمة لأن عدم القيام بذلك قد تلوث إعداد مقايسة نهائي مع خلايا الدم الحمراء هي lysed الامم المتحدة. قبل استخدام هذا الأسلوب ضوابط التعويض المناسبة ينبغي أن يضاف للسيطرة على سالتداخل ectral بين الكواشف المستخدمة للتعرف على جوانب مختلفة من وظيفة محببة. لهذا الأسلوب، وتشمل الضوابط تعويض جمع عينات الدم التي تم اقترحت 40 دقيقة فحص الحضانة ومن ثم وضع العلامات مع علامة واحدة (أي كولاي، DHE، وما إلى ذلك). بعد وضع العلامات، ويتم جمع الأحداث الإيجابية واحدة ويتم إنشاء مصفوفة التعويض باستخدام المعالج الآلي في برامج التحليل IDEAS. ومن الأهمية بمكان أن إذا تم استخدام هذا الاختبار، يتم الانتهاء من ضوابط التعويض المناسبة لضمان الأداء السليم الفحص. ويتم إنجاز التحليل باستخدام ميزة مكتشف وشارك في توطين المعالجات لتحديد أن كثافة التفاصيل مشرق هو أفضل المتغير للفصل بين السكان، وكذلك تحديد كيفية وجود الكثير من التداخل بين انفجار الأكسدة وإشارات البلعمة. على وجه التحديد، شريطة استخدام الخلوي الصورة القائمة على القدرة على فصل المحببة إلى ثلاث مجموعات فرعية تفعيلها. تيتم تحديد له فرعية انهيار باستخدام كثافة التفاصيل مشرق البلعمة مقابل الأكسدة انفجار. بالإضافة إلى دراسة هذه الوظائف خلية واحدة، وقد تم تحديد الخلايا التي عرضت كلا الحدثين في نفس الوقت في نفس الموقع التشريحي (شارك في التعريب). كانت المحببة التي سقطت في فرعية &quot;عالية النشطة&quot; النمط الظاهري الوحيد الذي أثبت بما يتفق شارك في التعريب بين البلعمة والأكسدة انفجار. هذا تحديد مجموعات فرعية محببة تفعيلها هي أكبر منطقة التي تحتاج إلى استكشاف الأخطاء وإصلاحها. من المهم جدا للمستخدم جديد إلى يستغرق وقتا طويلا لفهم إجراءات العمل عينة في الأفكار وفهم آليات النابضة السكان الخلية باستخدام عنصر التصوير. وتشمل التعديلات الأخرى التي يمكن للمستخدم أن تسعى لجعل اختيار الأوقات فحص حضانة بديلة أو إضافية. وتشير الطريقة الحالية استخدام فترات من 10-40 دقيقة. ومع ذلك، اعتمادا على النموذج التجريبي حيث هذه الطريقةلاستخدامها، قد يكون من الضروري لتحديد فترات أطول الفحص. بحاجة الى مثل هذا التعديل ليتم تقييمها على أساس فردي. وعلاوة على ذلك تقرر أن مدة الحضانة فحص له تأثير كبير على ظهور مجموعات فرعية ثلاثة تفعيلها. النهج المبينة في هذا التقرير يمثل امتدادا لما هي المعلومات التي يمكن الحصول عليها في وقت سابق بشأن محببة وظيفة 3،4،13،15. وقد أثبتت مختبرات أخرى على أهمية تقييم التغيرات في وظيفة محببة كجزء من تقييم شامل للمناعة والامراض 15-17. وعلى الرغم من إمكانات هذا الاختبار ليس من دون قيود. واحدة من القيود الرئيسية من حيث التكلفة والوقت الطلب المرتبطة عينة عالية التجهيز الإنتاجية. عندما يتطلب تصميم الدراسة على عدد كبير من العينات في يوم معين، يمكن أن تكون هذه من الصعب معالجة. هو تبسيط معالجة عن طريق استخدام pipets الإلكترونية وموزعات،ولكن هذه تميل إلى أن تكون مكلفة وليست بالضرورة متوفرة في كل مختبر. لدينا مجال البحث تركز على دراسة كيفية ممارسة الرياضة والعادات الغذائية تؤثر على الصحة الجهاز المناعي وظيفة 6،8-10،18-20. هذه الأهداف لها آثار عملية هامة لمجموعة متنوعة من مجالات صحة الإنسان. ما وراء دراسة ممارسة الرياضة والتغذية آثار طريقة البلعمة أظهر في هذه المخطوطة يمكن أن تكون مفيدة في مناطق أخرى من المناعة السريرية حيث رصد وظيفة البلعمة أمر بالغ الأهمية لنتائج العلاج. الفحص الحالي هو الأول من كثيرين أن المقايسات المناعية مع القدرة على إعادة اختراع من خلال استغلال المعلومات التصوير الفريدة التي يمكن أن تكون وسعها من تدفق القائم على صورة عداد الكريات.

تمثل المحببة عنصر واحد من نظام المناعة الفطري في الجسم، والذي يوفر خط الدفاع الأول ضد المستضدات الغازية. ركزت الطرق السابقة لتقييم وظيفة محببة على قدرة البلعمة أو الأكسدة انفجار باستخدام طرق منفصلة، ​​مما يجعل من الصعب التأكد بشكل جماعي كيف تغيرت المحببة 1-4. الخلوي وقد أدت التطورات في مجال التدفق في إنتاج الأدوات الفوق قادرة على عالية الدقة، والتصوير متعدد الألوان الخلايا بطريقة إنتاجية عالية 5. القدرة على الجمع بين التصوير مع التدفق التقليدي يمثل الخلوي والتقدم الذي يوفر منصة التكنولوجية اللازمة للابتكار في التدفق الخلوي الحاليين الأساليب واستخراج معلومات جديدة عن جهاز المناعة. على مدى السنوات العشر الماضية، مختبرنا، من بين أمور أخرى، وقد تركز تماما على تأثير مختلف patte الغذائية والعلاجات ممارسةRNS على وظيفة المناعة الفطرية 6-9. الأسلوب هو موضح في هذه المخطوطة له آثار عملية في مجال علم المناعة السريرية. الطريقة الحالية تعزز من قوة الصورة القائمة على التدفق الخلوي لقياس في وقت واحد من جسيمات البلعمة البكتيرية والأكسدة انفجار. باستخدام هذا النهج، واحد قادر على فصل المحببة تفعيلها باستخدام المتغيرات التي تقدمها الجزء القائم على صورة التحليل. وكانت هذه المجموعات الفرعية يمكن تحديدها إلا بعد تقييم الصور الخلوية على المحببة الفردية. المزيد من الوقت فحص حضانة أثرت على الانتقال بين مجموعات فرعية تفعيل ثلاثة 10. وبالتالي، فمن المعقول أن استخدام مرات حضانة متعددة قد تسمح طريقة لاختبار تغيير في وظيفة محببة بعد العلاج التجريبي محددة. وكان الغرض من هذه المخطوطة لإثبات وسيلة لتقييم وظيفة محببة باستخدام الصورة القائمة على التدفق الخلوي لقياس البلعمة في وقت واحد مع oxidatانفجار إيف.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="627">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:125px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vacutainers</td>
			<td style="width:125px;">BD Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for blood collection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">WBC Fixative / RBC Lysis solution</td>
			<td style="width:125px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">00-5333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD66b-APC</td>
			<td style="width:125px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">clone G10F5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD45-APCeFluor780</td>
			<td style="width:125px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">clone 2D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">s.aureus bioparticles</td>
			<td style="width:125px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A10010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dihydroethidium</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D7008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-ethylmalemide</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">4259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">7AAD</td>
			<td style="width:125px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hematology Analyzer</td>
			<td style="width:125px;">Mindray</td>
			<td style="width:119px;">BC-3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-channel pipet</td>
			<td style="width:125px;">Integra Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">ViaFlo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bead Bath Incubator</td>
			<td style="width:125px;">LabArmour</td>
			<td style="width:119px;">BeadBath</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Imaging Flow Cytometer</td>
			<td style="width:125px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">Amnis FlowSight</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">INSPIRE Software</td>
			<td style="width:125px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">Amnis INSPIRE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IDEAS Software</td>
			<td style="width:125px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">Amnis IDEAS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">X-Pierce Piercable Plate Sealer</td>
			<td style="width:125px;">Excel Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">X-Pierce</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dell Precision Workstation</td>
			<td style="width:125px;">Dell Computers</td>
			<td style="width:119px;">Various</td>
			<td>Used for IDEAS analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).

استخدام الصورة القائمة على التدفق الخلوي سمح لنا لفصل السكان متجانسة من المحببة إلى ثلاث مجموعات فرعية تنشيط تفعيل مختلفة (الشكل 3). في هذه الطريقة، والطريقة الأكثر فعالية لحل فرعية تفعيل الثلاثة هو عن طريق التآمر كثافة التفاصيل مشرقة للالبلعمة (S. الذهبية) مقابل الأكسدة انفجار (DHE) (الشكل 3؛ الشكل 4). أيضا، سوف استخدام المعالج شارك في التعريب في IDEAS البرمجيات تسمح لتقدير حجم وجود البلعمة في وقت واحد والأكسدة انفجار، الذي هو علامة السمة المميزة لتنشيط المحببة للغاية. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig3highres.jpg" /> الشكل 3. تحديد المنشط الحبيبية مجموعات فرعية. وبعد تحديد المحببة باستخدام علامات سطح الخلية (CD45 + / 66B +)، ولدت مؤامرة ابنة مع مشرق inten التفاصيلSITY لالبلعمة مقابل كثافة التفاصيل مشرقة للالتأكسدي انفجار. باستخدام هذا النهج، نسبة غير نشط (الأرجواني)، وانخفاض النشط (أحمر، A)، معتدلة نشط (الأزرق، B)، وتم تحديد العالية نشطة (الصفراء، C) المحببة. تم استخدام هذه التقنية النابضة أيضا لتقييم تأثير من الزمن فحص الحضانة على الوفرة النسبية لمختلف مجموعات فرعية محببة تفعيلها. وكانت أعلى نسبة المحببة &quot;عالية نشطة&quot; الحالية بعد حضانة 40 دقيقة. تم الانتهاء من جميع تحليل ملفات الصور المكتسبة باستخدام برامج IDEAS V.6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> بالإضافة إلى إثبات وجود ثلاث مجموعات فرعية متميزة من المحببة تفعيلها، وقد تبين أن فترة حضانة الفحص أثرت الوفرة النسبية لكل المحببة فرعية تفعيلها. على وجه التحديد، والمؤتمر الوطني العراقي 40 دقيقةأدى ubation في النسبة الأكبر من المحببة &quot;عالية نشطة&quot;. من قبل بما لا يقل عن ثلاث فترات حضانة الفحص قد يكون من الممكن تحديد كيف يغير من العلاج السريري نظرا لحالة التنشيط الزمني للالمحببة. هذا هو الأسلوب نشرت أول استخدام الصورة القائمة على التدفق الخلوي لتحديد مجموعات فرعية مختلفة محببة تفعيلها بوصفها وظيفة من القياسات في وقت واحد من البلعمة والأكسدة انفجار. <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig4highres.jpg" /> ويقدم الشكل 4. الصور التمثيلية للعلامات الخلوية. إن معرض الصورة من خلايا تصنف على أنها عالية نشط (A)، معتدلة نشط (B)، والمنخفضة النشط (C) في هذا الرقم. bioparticles البكتريا هي في Ch03 ، التأكسدي انفجار في Ch04، 7AAD للنواة في Ch05، والجانب مبعثر في Ch06، CD66b فيCH11، وCD45 في Ch12. أيضا، يتم عرض صورة دمج مترجمة شارك البلعمة (Ch03) مقابل الأكسدة انفجار (Ch04). مجالات الأصفر في الصورة دمج تدل على أن البلعمة والأكسدة انفجار تحدث في نفس المكان التشريحي في نفس الوقت. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro at JoVE.com

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

الصورة القائمة على التدفق الخلوي وتقنيات لتقييم التغيرات في الحبيبية وظيفة<em&gt; في المختبر</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

image-based-flow-cytometry-technique-to-evaluate-changes-granulocyte

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

12.3K Views.  University of North Texas. This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

Video: Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

قياس نشاط خلايا في Calpain الثابتة والعيش من خلال التدفق الخلوي

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

الإنسان في المختبر قمع وأداة الكشف عن الاعتراف للدولة في وقت مبكر من الخلل المناعي

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

في المختبر الفحص لتقييم أثر مناعة مقررات تمهيدية بشأن فيروس نقص المناعة CD4 T محددة المستجيب خلية وظيفة

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to clonal proliferation of only those T cells that bear a receptor that recognizes the antigen. Chromatin decondensation is a hallmark of T cell activation and is required for T cells to acquire the ability to proliferate after antigen engagement. This change in chromatin condensation can be detected using antibodies raised against histone proteins. These antibodies cannot bind to their epitopes in na&#239;ve T cells as well as they can in activated T cells. We describe how to simultaneously stain T cell-specific surface markers, track viability with a fixable dead cell stain, and measure chromatin status via intracellular staining of Histone H3 proteins. Stained cells are analyzed by flow cytometry and chromatin condensation status is measured as the mean fluorescence intensity (MFI) of the Histone H3 stain. Chromatin decondensation during T cell activation is demonstrated as an increase in the MFI

Flow cytometry can be utilized to assess the state of chromatin within T cells. This protocol allows scientists to interpret evidence of chromatin decondensation during T cell activation demonstrated by an increase in the mean florescence intensity (MFI) of fluorescent Histone H3 antibodies

استخدام التدفق الخلوي لتقييم حالة لونين في خلايا T

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

تقييم الشبكية دبقية أكلة وظيفة<em&gt; في فيفو</em&gt; باستخدام الفحص القائمة على الخلوي التدفق

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to stimulate cell migration. Importantly, cell migration is a rate-limiting event during the wound-healing process to re-establish the integrity and normal function of tissue layers after injury. The advantage of this method over the classical assay, which is based on a manually made scratch in a cell monolayer, is the usage of special silicone culture inserts providing two compartments to create a cell-free pseudo-wound field with a well-defined width (500 &#956;m). In addition, due to an automated image analysis platform, it is possible to rapidly obtain quantitative data on the speed of wound closure and cell migration. More precisely, the effect of two frog-skin AMPs on the migration of bronchial epithelial cells will be shown. Furthermore, pretreatment of these cells with specific inhibitors will provide information on the molecular mechanisms underlying such events.

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Here, we present a protocol to evaluate the effect of peptides on the migration of bronchial epithelial cells. This method allows for the rapid and highly reproducible obtainment of quantitative data on the speed of cell migration and wound closure.

رواية في المختبر الجرح المقايسة الشفاء لتقييم الهجرة الخلية

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

العزلة والثقافة في المختبر من البلاعم السنخية مورين والبشرية

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity of antibodies or serum to enhance infection in impermissible cell lines have relied on using viral output in the media followed by plaque assays to quantify infection. More recently, these assays have examined Dengue virus (DENV) infection in the cell lines using fluorescently labeled antibodies. Both these approaches have limitations that restrict the widespread use of these techniques. Here, we describe a simple in vitro assay using Dengue virus reporter viral particles (RVPs) that express green fluorescent protein and K562 cells to examine antibody dependent enhancement (ADE) of DENV infection using serum that was obtained from rhesus macaques 16 weeks after infection with Zika virus (ZIKV). This technique is reliable, involves minimal manipulation of cells, does not involve the use of live replication competent virus, and can be performed in a high throughput format to get a quantitative readout using flow cytometry. Additionally, this assay can be easily adapted to examine antibody dependent enhancement (ADE) of other flavivirus infections such as Yellow Fever virus (YFV), Japanese Equine Encephalitis virus (JEEV), West Nile virus (WNV) etc. where RVPs are available. The ease of setting up the assay, analyzing the data, and interpreting results makes it highly amenable to most laboratory settings.

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

We describe a simple and easy protocol for measuring antibody dependent enhancement of infection by Zika virus convalescent serum using Dengue virus Reporter Viral Particles.

قياس تدفق بسيط على أساس التحليل تحديد في المختبر جسم تعزيز التابعة لفيروس حمى الضنك باستخدام مصل فيروس Zika النقاهة

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single cell level and statistical image analysis at a populational level. To overcome this difficulty, we used imaging flow cytometry and transcriptomic profiling (RNA-seq) to determine altered subcellular localization of the cluster of differentiation 1d protein (CD1d) associated with impaired endocytic gene expression in human dendritic cells (DCs), which were exposed to the common lipophilic air pollutant benzo[a]pyrene. The colocalization of CD1d and endocytic marker Lamp1 proteins from thousands of cell images captured with imaging flow cytometry was analyzed using IDEAS and ImageJ-Fiji programs. Numerous cellular images with co-stained CD1d and Lamp1 proteins were visualized after gating on CD1d+Lamp1+ DCs using IDEAS. The enhanced CD1d and Lamp1 colocalization upon BaP exposure was further demonstrated using thresholded scatterplots, tested with Mander&#39;s coefficients for co-localized intensity, and plotted based on the percentage of co-localized areas using ImageJ-Fiji. Our data provide an advantageous instrumental and bioinformatic approach to measure protein colocalization at both single and populational cellular levels, supporting an impaired functional outcome of transcriptomic alteration in pollutant-exposed human DCs.

Imaging flow cytometry provides an ideal approach to detect the morphological and functional alteration of cells at individual and populational levels. Disrupted endocytic function for lipid antigen presentation in pollutant-exposed human dendritic cells was demonstrated with a combined transcriptomic profiling of gene expression and morphological demonstration of protein trafficking.

دمج تصوير التدفق الخلوي والتنميط لتقييم الاتجار بتغيير CD1d اندوسيتيك ترانسكريبتوميك

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

في اختبار فيترو ELISA لتقييم قوة لقاح داء الكلب

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...