وقد تم تمويل هذا العمل (جزئيا) من قبل التحالف هيلمهولتز ICEMED - التصوير والأمراض الاستقلابية علاج البيئة، من خلال صندوق مبادرة وشبكة جمعية هيلمهولتز، منحة من مؤسسة أخرى Kroener-فريزينيوس، ومنحة من جمعية الألمانية للبحوث ( SFB 655: خلايا في الأنسجة).

العمل تتمسك إعلان Helsinski وبيان الحيوان ARVO. واستخدمت الحيوانات لجمع الأنسجة وتم اتباع جميع أساليب ذات الصلة وفقا للتعليمات للمنشأة الحيوان في جامعة درسدن. وقد تم التعامل مع الحيوانات، ويضم وفقا للمبادئ التوجيهية الاتحادية الألمانية للاستخدام ورعاية الحيوانات المختبرية، وتمت الموافقة على الدراسة من قبل Landesdirektion درسدن. يرجى التشاور مع سياسة البيطرية مؤسستكم (IACUC أو لوحة أخرى) بشأن منهجية القتل الرحيم المناسبة. الأسهم محددة وتركيزات عمل الكواشف يمكن العثور عليها في جداول الكاشف المصاحبة لهذا البروتوكول. 1. إعداد طبق الثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أطباق معطف مع حجم كاف من 75 ميكروغرام / مل بولي-L-الأورنيثين (أي 2 مل / بئر من لوحة 6 جيدا) بين عشية وضحاها في حاضنة الثقافة الخلية 2 أيام قبل تاريخ تشريح المقرر. </li><li&gt; نضح بولي-L-الأورنيثين النهار، وغسل كل 2X جيدا مع 3 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة غسل النهائي، ثم يضاف فبرونيكتين (المخفف 1:250، 4 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني) لوحة ووضع الأطباق في الحاضنة بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح فبرونيكتين يوم تشريح وغسل الأطباق 2X مع برنامج تلفزيوني. العودة لوحات لا تزال تحتوي على برنامج تلفزيوني النهائي غسل إلى الحاضنة حتى الأنسجة فصلها جاهز للزراعة. في ذلك الوقت، وإزالة برنامج تلفزيوني قبل الطلاء الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متجر لوحات المغلفة مع بولي-L-ornithinein الحاضنة لمدة تصل إلى 3 أسابيع. لوحات مغلفة مع فبرونيكتين يمكن تخزينها لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع. ويمكن أن يتم طلاء فبرونيكتين في اقل من 2 ساعة إذا عاجلة. فبرونيكتين هو عرضة لتمسخ، لا تستنهض الهمم الحل أو السماح الأطباق تجف. </li></ol> 2. تشريح / تصفيح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينطبق هذا البروتوكول لاستخدام 3 الفئران الكبار (3-6 أشهر من العمر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشيلل الدماغ باجتزاء كتلة على الجليد قبل القتل الرحيم الفئران. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 15 مل فالكون الأنبوب الذي يحتوي على 5 مل من N2 المتوسطة مع إضافة bFGF على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الفئران وفقا لسياسة البيطرية مؤسستكم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الدماغ من الجمجمة عن طريق شق أسفل خط الوسط من الرأس. استخدام ملقط لقشر بعيدا العظم مما يسمح للدماغ لاستخراجها بعناية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الدماغ في طبق بتري 10 سم تحتوي على الجليد الباردة PBS. سيؤدي هذا إلى إزالة أي المتبقية الشعر والدم. (الشكل 1A) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الدماغ في الكتلة باجتزاء مبردة. (الشكل 1B) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج واحد جديد شفرة حلاقة نظيفة في كتلة كما في الصورة في الشكل 1C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج الثانية حلاقة نظيفة شفرة 3 مم الذيلية لأول كما هو موضح في الشكل 1D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع بعناية ريش من الكتلة، آخذين معهم قسم من الفائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعويم ثانيةنشوئها قبالة شفرة بغمر في برنامج تلفزيوني. (الشكل 1E) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصاد الأنسجة من منطقة الفائدة (في هذا المثال استخدمنا الصوار الأمامي، (الأمامي) ACA، الشكل 1F) باستخدام # 5 ملقط وجمع في أنبوب 15 مل المخروطية التي تحتوي على 1 مل المتوسطة N2 التي تحتوي على bFGF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل أنبوب في غطاء تدفق الصفحي ثقافة الخلية، واستمرار ما تبقى من بروتوكول تحت ظروف معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ميكانيكيا فصل الأنسجة باستخدام ماصة غيض 1 مل تعلق على pipettor P1000. ماصة صعودا وهبوطا عدة مرات (حوالي 20x وبمعدل 1 pipetting لدورة في الثانية)، في حين الضغط على افتتاح غيض ماصة ضد الجزء السفلي من أنبوب مخروطي (أرقام 1G 1-3). وقف سحن عندما يصبح الحل متجانسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسمح الحل للجلوس لمدة 2 دقيقة للسماح أي نوع من الأنسجة nondissociated أكبر لتستقر في القاع. (الشكل 1G 4) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع homogeneous طاف ووضع في أنبوب مخروطي يحتوي 8.5 مل من وسائل الإعلام N2 بالإضافة إلى 20 نانوغرام / مل bFGF، 500 نانوغرام / مل Dll4، 500 نانوغرام / مل Ang2، و 200 nMJAK المانع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة منها إلى 3 آبار من لوحة 6 جيدا باستخدام 3 مل من محلول الخلية المخففة / جيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة في حاضنة ترطيب الخلايا عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2، 5٪ O 2. </li></ol> 3. العناية اليومية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال المتوسطة في أطباق الثقافة مع N2 متوسطة تحتوي على bFGF، Ang2، Dll4، والمانع JAK 24 ساعة بعد الطلاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة البلعة من bFGF، Dll4، Ang2، والمانع JAK في اليوم التالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تستمر هذه العملية بالتناوب من التغييرات والاضافات وسائل الإعلام عامل أي ما مجموعه 10-14 يوما. </li></ol> 4. تحريض التمايز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب bFGF، Dll4، Ang2، والمانع JAK تحتوي المتوسطة واستبدالها المتوسطة N2 أن لا يحتوي على أية عوامل إضافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير متوسطة كل يوم الثاني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الخلايا بعد 10 يوما وإجراء مناعية. </li></ol> 5. كشف Immunocytochemical <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المتوسطة وإصلاح لوحات ثقافة الخلية مع 2 مل من 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 2X مع 3 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح PBS، ثم permeabilize ومنع الخلايا بإضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 5٪ مصل طبيعي حمار (NDS) و 0.1٪ تريتون X-100 لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير مزيج الأجسام المضادة الأولية في برنامج تلفزيوني تحتوي على 5٪ NDS. الأجسام المضادة لمكافحة nestin يمكن استخدامها لتحديد المنبوذة، في حين TuJ1 (الطبقة الثالثة β-تويولين)، والأجسام المضادة GFAP، وCNPase يمكن استخدامها معا من أجل تلطيخ الثلاثي من علامات التمايز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح عرقلة الحل وإضافة 1.5 مل من الخليط الأجسام المضادة الأولية إلى كل بئر. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأجسام المضادة الأولية وغسل 2X مع 3 مل من برنامج تلفزيوني، و 1X مع 3 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 5٪ NDS لمدة 5 دقائق لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Preparه الأجسام المضادة الثانوية في برنامج تلفزيوني يحتوي على 5٪ NDS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح غسل النهائي وإضافة 1.5 مل من محلول الأجسام المضادة الثانوية إلى كل بئر. احتضان في الظلام لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة حل الأجسام المضادة الثانوية وإضافة 2 مل من دابي وصمة عار الطازجة (500 نانوغرام / مل في برنامج تلفزيوني). احتضان لمدة 3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح الحل دابي ثم يغسل 3X مع 3 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما. ويمكن الآن خلايا يمكن تصور مع المجهر مضان. </li></ol>

<ol>
	<li>Cajal, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Comparative Study of Sensory Areas of the Human Cortex. , (1899).</li><li>Altman, J., Das, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoradiographic+and+histological+evidence+of+postnatal+hippocampal+neurogenesis+in+rats.">Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats.</a> J. Comp. Neurol. 124, 319-335 (1965).</li><li>Kaplan, M. S., Hinds, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+adult+rat:+electron+microscopic+analysis+of+light+radioautographs.">Neurogenesis in the adult rat: electron microscopic analysis of light radioautographs.</a> Science. 197, 1092-1094 (1977).</li><li>Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+replacement+in+adulthood.">Neuronal replacement in adulthood.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 457, 143-161 (1985).</li><li>Gould, E., Reeves, A. J., Graziano, M. S., Gross, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+neocortex+of+adult+primates.">Neurogenesis in the neocortex of adult primates.</a> Science. 286, 548-552 (1999).</li><li>Kornack, D. R., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuation+of+neurogenesis+in+the+hippocampus+of+the+adult+macaque+monkey.">Continuation of neurogenesis in the hippocampus of the adult macaque monkey.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5768-5773 (1999).</li><li>Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heterogeneity+of+adult+neural+stem+cells+and+the+emerging+complexity+of+their+niche.">The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 73, 357-365 (2008).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li><li>Luskin, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restricted+proliferation+and+migration+of+postnatally+generated+neurons+derived+from+the+forebrain+subventricular+zone.">Restricted proliferation and migration of postnatally generated neurons derived from the forebrain subventricular zone.</a> Neuron. 11, 173-189 (1993).</li><li>Lendahl, U., Zimmerman, L. B., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNS+stem+cells+express+a+new+class+of+intermediate+filament+protein.">CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein.</a> Cell. 60, 585-595 (1990).</li><li>Androutsellis-Theotokis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+neural+precursors+in+the+adult+brain+rescues+injured+dopamine+neurons.">Targeting neural precursors in the adult brain rescues injured dopamine neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13570-13575 (2009).</li><li>Jin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+dentate+subgranular+zone+and+rostral+subventricular+zone+after+focal+cerebral+ischemia+in+the+rat.">Neurogenesis in dentate subgranular zone and rostral subventricular zone after focal cerebral ischemia in the rat.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4710-4715 (2001).</li><li>Zhang, R. L., Zhang, Z. G., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemic+stroke+and+neurogenesis+in+the+subventricular+zone.">Ischemic stroke and neurogenesis in the subventricular zone.</a> Neuropharmacology. 55, 345-352 (2008).</li><li>Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+are+MSCs+therapeutic?+New+data:+new+insight.">Why are MSCs therapeutic? New data: new insight.</a> J. Pathol. 217, 318-324 (2009).</li><li>Goldman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+and+progenitor+cell-based+therapy+of+the+human+central+nervous+system.">Stem and progenitor cell-based therapy of the human central nervous system.</a> Nat. Biotechnol. 23, 862-871 (2005).</li><li>Sun, N., Longaker, M. T., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPS+cell-based+therapy:+considerations+before+clinical+applications.">Human iPS cell-based therapy: considerations before clinical applications.</a> Cell Cycle. 9, 880-885 (2010).</li><li>Amariglio, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-derived+brain+tumor+following+neural+stem+cell+transplantation+in+an+ataxia+telangiectasia+patient.">Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient.</a> PLoS Med. 6, e1000029 (2009).</li><li>Lindvall, O., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapeutics+in+Parkinson's+disease.">Cell therapeutics in Parkinson's disease.</a> Neurotherapeutics. 8, 539-548 (2011).</li><li>Kittappa, R., Bornstein, S. R., Androutsellis-Theotokis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+eNSCs+in+Neurodegenerative+Disease.">The Role of eNSCs in Neurodegenerative Disease.</a> Mo.l Neurobiol. , (2012).</li><li>Cattaneo, E., McKay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+and+manipulating+neuronal+stem+cells.">Identifying and manipulating neuronal stem cells.</a> Trends Neurosci. 14, 338-340 (1991).</li><li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengths+and+limitations+of+the+neurosphere+culture+system.">Strengths and limitations of the neurosphere culture system.</a> Mol. Neurobiol. 34, 153-161 (2006).</li><li>Duarte, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dosage-sensitive+requirement+for+mouse+Dll4+in+artery+development.">Dosage-sensitive requirement for mouse Dll4 in artery development.</a> Genes Dev. 18, 2474-2478 (2004).</li><li>Maisonpierre, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiopoietin-2,+a+natural+antagonist+for+Tie2+that+disrupts+in+vivo+angiogenesis.">Angiopoietin-2, a natural antagonist for Tie2 that disrupts in vivo angiogenesis.</a> Science. 277, 55-60 (1997).</li><li>Androutsellis-Theotokis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signalling+regulates+stem+cell+numbers+in+vitro+and+in+vivo.">Notch signalling regulates stem cell numbers in vitro and in vivo.</a> Nature. 442, 823-826 (2006).</li><li>Alderson, R. F., Alterman, A. L., Barde, Y. A., Lindsay, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-derived+neurotrophic+factor+increases+survival+and+differentiated+functions+of+rat+septal+cholinergic+neurons+in+culture.">Brain-derived neurotrophic factor increases survival and differentiated functions of rat septal cholinergic neurons in culture.</a> Neuron. 5, 297-306 (1990).</li><li>Johe, K. K., Hazel, T. G., Muller, T., Dugich-Djordjevic, M. M., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+factors+direct+the+differentiation+of+stem+cells+from+the+fetal+and+adult+central+nervous+system.">Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system.</a> Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996).</li><li>Ourednik, J., Ourednik, V., Lynch, W. P., Schachner, M., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+display+an+inherent+mechanism+for+rescuing+dysfunctional+neurons.">Neural stem cells display an inherent mechanism for rescuing dysfunctional neurons.</a> Nat. Biotechnol. 20, 1103-1110 (2002).</li><li>Ryu, J. K., Cho, T., Wang, Y. T., McLarnon, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+progenitor+cells+attenuate+inflammatory+reactivity+and+neuronal+loss+in+an+animal+model+of+inflamed+AD+brain.">Neural progenitor cells attenuate inflammatory reactivity and neuronal loss in an animal model of inflamed AD brain.</a> J. Neuroinflammation. 6, 39 (2009).</li><li>Androutsellis-Theotokis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+factors+stimulate+growth+of+adult+neural+stem+cells.">Angiogenic factors stimulate growth of adult neural stem cells.</a> PLoS One. 5, e9414 (2010).</li><li>Park, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hes3+regulates+cell+number+in+cultures+from+glioblastoma+multiforme+with+stem+cell+characteristics.">Hes3 regulates cell number in cultures from glioblastoma multiforme with stem cell characteristics.</a> Sci. Rep. 3, 1095-1010 (2013).</li><li>Poser, S. W., Shostak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+5.">Ch. 5.</a> Cancer Stem Cells - The Cutting. , 89-110 (2011).</li><li>Androutsellis-Theotokis, A., Rueger, M. A., Mkhikian, H., Korb, E., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+controlling+neural+stem+cells+slow+progressive+brain+disease.">Signaling pathways controlling neural stem cells slow progressive brain disease.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 73, 403-410 (2008).</li></ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

ويجري تقاسم العديد من الخطوات الحاسمة لنجاح العزلة، والتوسع، وتمايز الخلايا الجذعية العصبية من الدماغ الكبار من القواسم المشتركة مع تقنيات زراعة الأنسجة القياسية. الهدف أن نضع في الاعتبار هو أن NSCs معزولة عن الدماغ الكبار يجب أن نحافظ على أكبر عدد ممكن من هذه الخصائ?...

العقيدة المركزية لعلم الأعصاب، التي وضعتها الملاحظات الأساسية للالتهندس الخلوي الدماغ التي أدلى بها رامون كاجال Y. منذ أكثر من قرن، رأت أن من غير المرجح تكوين الخلايا العصبية بعد المراهقة نظرا لتعقيد الشبكات العصبية الموجودة في الجهاز العصبي المركزي 1. على الرغم من عمل التمان في 1960s، وبعد كابلان، مما يدل على أن 3 H-ثيميدين يمكن العثور عليها في الخلايا العصبية الناضجة مشيرا إلى أنه في الواقع يجري إنشاؤها الخلايا العصبية في مناطق متميزة من الدماغ الكبار، واصل العقيدة لعقد 2، 3. واصلت الأدلة لجبل مع البحث نوتيبوم التي تصف التغيرات الموسمية في عدد الخلايا العصبية الموجودة في أدمغة الطائر المغرد 4. لم يكن حتى عام 1999، عندما جولد وآخرون. الأعمال المنشورة على جيل من الخلايا العصبية في قرن آمون مع الزيادات أداء مهام التعلم النقابي في الفئران، فضلا عن ملاحظات Kornack والبرهان راكيتشواصلت تينغ تكوين الخلايا العصبية في المكاك الكبار أن مفهوم الدماغ أقل صرامة وأكثر من البلاستيك، واعترف 5، 6. البحث عن مصدر الخلوية لهذه العصبونات ولدت من جديد يؤدي إلى اكتشاف عدد سكانها منفصلة من الخلايا الجذعية (المنبوذة) التي تتواجد في مناطق من الدماغ ويشار إلى الكوات 7. وتعتبر منطقة ومنطقة الحبيبية subventricular الفرعية الحصين أن تكون المنطقتين العصبية الرئيسي 8،9. خلايا معزولة من هذه المواقع عرض مميز الكلاسيكية المنبوذة المستمدة الجنينية أو الجنين، وتجديد الذات والتمايز المحتملة. في حالة الخلايا الجذعية العصبية (NSCs)، فإنها يمكن أن تكون متمايزة في الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، و oligodendrocytes. بالإضافة إلى ذلك، هذه وصمة عار المنبوذة إيجابية للعلامات الجنين مجلس الأمن القومي مثل البروتين وسيطة خيوط nestin 10. يسلط الضوء على المزيد من العمل الأخيرة التي المنبوذة قد لا تقتصر على هذه رالتعليم الجامعي المجالات، ويتم في الواقع المترجمة في جميع أنحاء الدماغ كما يبلغ عدد سكانها هادئة إلى حد كبير من الخلايا المرتبطة بشكل وثيق مع الأوعية الدموية 11. الملاحظات التي يتم تعبئتها المنبوذة في استجابة لإصابة يشير إلى احتمال أن تكون قادرة على الاستفادة من هذه الخلايا لأغراض التجديدي للمساعدة في التعافي من اضطراب الاعصاب والسكتة الدماغية 12، 13. هذا هو لا يختلف عن الدور الذي تلعبه الخلايا الجذعية الوسيطة (اللجان الدائمة) في شفاء الأنسجة الضامة، والتي توجد الخلايا المحيطة بالأوعية كما أن لديها القدرة على أن تصبح بانيات، غضروفية، والخلايا الدهنية 14. ومع ذلك، NSCs لا يمكن حصادها في بنفس الطريقة اللجان الدائمة من نخاع العظام بواسطة طموح الروتينية وكثافة تقنيات الطرد المركزي التدرج والاستفادة منها لاحقا في علاجات الخلايا استنادا ذاتي. ونتيجة لذلك، ومصادر أخرى من الخلايا، مثل استخدام NSCs الجنين أو السلائف الخلايا العصبية المشتقة من الإدارة الانتخابيةالخلايا الجذعية ryonic تم استكشاف نطاق واسع في الأمراض الحيوانية ونماذج إصابة بدرجات متفاوتة من النجاح 15. تقنيات الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها استخدام مصادر خلية جسدية تقدم سبيلا محتملا آخر لإنتاج العلاجات المستندة إلى الخلايا مفيدة علاجيا لمجموعة واسعة من التطبيقات، والتغلب على محدودية والمخاوف الأخلاقية بشأن استخدام الخلايا الجنينية والأنسجة الجنينية 16. ومع ذلك، فقد ثبت الترجمة السريرية لهذه النتائج أن يكون مهمة صعبة، كما هو موضح في نضالات علاج الحالات العصبية المختلفة مع العلاجية استنادا SC-النهج 17،18، فضلا عن مسار متعرج لإزالة التنظيمية. كنهج بديل، يمكن إدخال العلاجات الدوائية محددة تعدل أرقام مجلس الأمن القومي وتسهيل الانتعاش في نماذج من مرض الشلل الرعاش والسكتة الدماغية 19. مهما كانت الاستراتيجية قد يكون، فهم كيفية التعامل مع هذه الخلايا بشكل فعاليتطلب النظام في المختبر يمكن الوصول إليها. ثقافات NSCs لا يمكن أن يؤديها إما الثقافات الكلي، المعروف أيضا باسم neurospheres، أو على شكل أحادي الطبقة 8،20. وقد استخدمت على نطاق واسع على حد سواء التقنيات، مما يتيح لتهيئة الظروف ثقافة محددة، أي استخدام عامل نمو البشرة (صندوق تعديل العولمة الأوروبي) أو عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF) كمصدر mitogen، التي تنص على توسيع السلائف متعددة القدرات. بينما الثقافات neurosphere قد تكون أكثر ملاءمة لدراسة إمكانية نشر نسيلي من نوع من الخلايا المعزولة، وقد تبين هذا النظام لإنتاج يسكنها خليط من الخلايا خلال التوسع 21. بالإضافة إلى ذلك، بنية مغلقة من neurospheres يجعل التلاعب الدوائية من خلايا غير عملي، ويمكن أن يكون مرتبك تفسير تأثير هذه العوامل قد يكون بسبب المكروية التي أنشئت داخل neurosphere نفسها. الثقافات أحادي الطبقة، من ناحية أخرى، يمكن أن يكونالمستخدمة في شاشات إنتاجية عالية من مكتبات جزيء صغير، وتوفير أداة قوية لاستكشاف آليات نقل الإشارة التي تنظم نمو وتمايز SC ويفتح الفرصة لاكتشاف مركبات جديدة تستهدف تحديدا هذه الفئة من السكان الخلية. ونتيجة لذلك، والقدرة على توليد بتكاثر ثقافات NSCs الكبار من مناطق مختلفة من الاهتمام في الدماغ يمكن استخدامها في مجموعة واسعة من التطبيقات البحثية، بدءا من الدراسات التنموية من الجهاز العصبي المركزي (CNS) لاستكشاف نهج الطب التجديدي رواية . بروتوكول المعروضة هنا يوضح كيفية تشريح وتقييم إمكانية التفريق بين الطوائف المنبوذة CNS المعزولة من الدماغ القوارض الكبار.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="596">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">6-well tissue culture dishes</td>
			<td style="width:95px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">353934</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="190" rowspan="1" style="height:190px;width:216px;">Poly-L-ornithine</td>
			<td rowspan="1" style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="1" style="width:119px;">P-3655</td>
			<td style="width:167px;">
			5 mg/ml stock solution prepared in double distilled water (Stable for several months at -20 &#176;C).
			Working concentration 0.5 mg/ml in water (Stable for 1 month at 4 &#176;C).
			</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:95px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">1030-Fn</td>
			<td style="width:167px;">Do not agitate stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Filtration Apparatus</td>
			<td style="width:95px;">Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">430769</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">DMEM/F-12</td>
			<td style="width:95px;">Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">10-090-CV</td>
			<td style="width:167px;">See note below for complete N2 media preparation</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Apo-transferrin</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T-2036</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Insulin</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I-0516</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:216px;">Putrescine</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P-5780</td>
			<td style="width:167px;">1 M stock solution in ddH2O (Stable at 20 &#176;C for 6 months)</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:216px;">Sodium Selenite</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S-5261</td>
			<td style="width:167px;">500 &#181;M stock solution in ddH2O (Stable at -20 &#176;C for 6 months)</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Progesterone</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P-8783</td>
			<td style="width:167px;">100 &#181;M stock solution in ethanol (Stable at -20&#176;C for 6 months)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:95px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:95px;">Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">21-040-CV</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)</td>
			<td style="width:95px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">233-FB</td>
			<td style="width:167px;">Working concentration 20 ng/ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Delta4 (Dll4)</td>
			<td style="width:95px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">1389-D4</td>
			<td style="width:167px;">Working concentration&#160; 500 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Angiopoetin 2 (Ang2)</td>
			<td style="width:95px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">623-AN</td>
			<td style="width:167px;">Working concentration&#160; 500 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">JAK Inhibitor</td>
			<td style="width:95px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">420099</td>
			<td style="width:167px;">Working concentration 200 nM&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A-2058</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">15- and 50-ml Conical tubes</td>
			<td style="width:95px;">Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">430053, 430829</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="243">
			<td colspan="4" height="243" style="height:243px;width:596px;">Other necessary items include: General dissection instruments, including razor blade and forceps, Adult rat (3-6 months old; Sprague-Dawley or Long Evans), CO2 intoxication chamber, Laminar flow hood for cell culture and incubator Incubator (humidified, 37 &#176;C, 5% CO2, 5% O2). Note: For complete N2 media preparation, to one bottle of DMEM/F-12 (500 ml) add 0.05 g of apotransferin, 0.0125 g of insulin (freshly predissolved in 1 ml of 10 mM NaOH), 50 &#956;l of putrescine, 30 &#956;l of sodium selenite, 100 &#956;l of progesterone stocks, and 5 ml of penicillin/streptomycin solution.&#160; Adjust pH to 7.2, if needed. Filter-sterilize and store at 4 &#176;C for up to 3 weeks and protect from light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="2" height="22" style="height:22px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Immunofluorescence Reagents Table</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:95px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">15719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Normal Donkey Serum (NDS)</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D-9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T-8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D-8417</td>
			<td style="width:167px;">5 mg/ml stock solution in methanol</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Primary Antibody Table</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="1" style="height:43px;width:216px;">Nestin</td>
			<td rowspan="1" style="width:95px;">Chemicon</td>
			<td rowspan="1" style="width:119px;">MAB353</td>
			<td style="width:167px;">
			Dilution Factor: 1:400
			Species: Mouse IgG1
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="1" style="height:43px;width:216px;">Hes3</td>
			<td rowspan="1" style="width:95px;">Santa Cruz</td>
			<td rowspan="1" style="width:119px;">sc-25393</td>
			<td style="width:167px;">
			Dilution Factor: 1:100
			Species: Rabbit IgG
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="1" style="height:43px;width:216px;">Sox2</td>
			<td rowspan="1" style="width:95px;">R&#38;D Systems</td>
			<td rowspan="1" style="width:119px;">MAB2018&#160;</td>
			<td style="width:167px;">
			Dilution Factor: 1:100
			Species: Mouse IgG2a
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="1" style="height:43px;width:216px;">CNPase</td>
			<td rowspan="1" style="width:95px;">Chemicon</td>
			<td rowspan="1" style="width:119px;">MAB326</td>
			<td style="width:167px;">
			Dilution Factor: 1:200
			Species: Mouse IgG1
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="1" style="height:43px;width:216px;">&#946;-tubulin III (TUJ1)</td>
			<td rowspan="1" style="width:95px;">R&#38;D Systems</td>
			<td rowspan="1" style="width:119px;">MAB1195</td>
			<td style="width:167px;">
			Dilution Factor: 1:500
			Species: Mouse IgG2a
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="1" style="height:43px;width:216px;">Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)</td>
			<td rowspan="1" style="width:95px;">Dako North America</td>
			<td rowspan="1" style="width:119px;">Z0334</td>
			<td style="width:167px;">
			Dilution Factor 1:500
			Species: Rabbit
			</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;"></td>
			<td style="width:95px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Secondary Antibody Table</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="1" style="height:64px;width:216px;">Alexa&#160;&#160; 568</td>
			<td rowspan="1" style="width:95px;">Invitrogen</td>
			<td rowspan="1" style="width:119px;">A-21124</td>
			<td style="width:167px;">
			Dilution Factor: 1:200
			Species: Goat anti Mouse IgG1
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="1" style="height:64px;width:216px;">Alexa 488</td>
			<td rowspan="1" style="width:95px;">Invitrogen</td>
			<td rowspan="1" style="width:119px;">A-21131</td>
			<td style="width:167px;">
			Dilution Factor: 1:200
			Species: Goat anti Mouse IgG2a
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="1" style="height:64px;width:216px;">Cy5</td>
			<td rowspan="1" style="width:95px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td rowspan="1" style="width:119px;">59883</td>
			<td style="width:167px;">
			Dilution Factor: 1:200
			Species: Goat anti Rabbit
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

growing neural stem cells from conventional and nonconventional regions of the adult rodent brain

يوضح العمل الأخيرة التي الجهاز العصبي المركزي (CNS) تجديد وتكون الأورام ينطوي السكان من الخلايا الجذعية (المنبوذة) المقيم في الدماغ الكبار. ومع ذلك، فإن آليات هذه الخلايا عادة هادئة توظف لضمان حسن سير العمل في الشبكات العصبية، فضلا عن دورها في التعافي من الإصابة والتخفيف من عمليات الاعصاب مفهومة قليلا. هذه الخلايا الموجودة في المناطق المشار إليها باسم &quot;منافذ&quot; التي توفر بيئة مكتفية التي تنطوي على إشارات تغييري من كل من الأوعية الدموية وجهاز المناعة. العزلة، والصيانة، والتفريق بين الطوائف المنبوذة CNS في ظل ظروف ثقافة المعرفة التي تستبعد العوامل غير معروف، يجعلها في متناول العلاج بالوسائل الدوائية أو وراثية، وبالتالي توفير نظرة ثاقبة سلوكهم في الجسم الحي. هنا نقدم معلومات مفصلة عن طرق لتوليد ثقافات المنبوذة CNS من مناطق مختلفة من الدماغ الكبار ونهج لتقييم د بهمifferentiation المحتملة في الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، و oligodendrocytes في المختبر. هذه التقنية تعطي السكان خلية متجانسة بوصفها ثقافة أحادي الطبقة التي يمكن أن تصور لدراسة الفردية المنبوذة وذريتها. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن تطبيقها عبر أنظمة مختلفة نموذج حيواني والعينات السريرية، التي كانت تستخدم في السابق للتنبؤ ردود التجدد في الكبار الجهاز العصبي التالفة.

تحديد المنطقة ذات الاهتمام التي لحصاد الخلايا الجذعية العصبية هو خطوة أولى حاسمة وستحدد مقدار الوقت المستغرق للحصول على لوحة متكدسة من الخلايا. على سبيل المثال، هي منطقة SVZ العصبية الكلاسيكية ويحتوي على نسبة أعلى من نسبة الخلايا الجذعية العصبية لذلك. ومع ذلك، فإن تق...

Watch this Scientific Journal Video about Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain at JoVE.com

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

حصاد الخلايا الجذعية العصبية من الدماغ الكبار تتزايد استخدامها في تطبيقات تتراوح بين البحوث الأساسية لتطوير النظام العصبي لاستكشاف التطبيقات السريرية المحتملة في مجال الطب التجديدي. وهذا يجعل رقابة صارمة في ظروف العزلة وزراعة المستخدمة لزراعة هذه الخلايا حاسمة لصوت النتائج التجريبية.

تزايد الخلايا الجذعية العصبية من المناطق التقليدية وغير التقليدية من الدماغ الكبار القوارض

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

growing-neural-stem-cells-from-conventional-nonconventional-regions

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.1K Views.  University of Dresden.  حصاد الخلايا الجذعية العصبية من الدماغ الكبار تتزايد استخدامها في تطبيقات تتراوح بين البحوث الأساسية لتطوير النظام العصبي لاستكشاف التطبيقات السريرية المحتملة في مجال الطب التجديدي. وهذا يجعل رقابة صارمة في ظروف العزلة وزراعة المستخدمة...

Video: Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These animals also resist ischemic injury to the brain in vivo 2,3 and oxygen-glucose deprivation in vitro 4,5. These unique qualities provided the impetus to isolate AGS neurons to examine inherent neuronal characteristics that could account for the capacity of AGS neurons to resist injury and cell death caused by ischemia and extremely cold temperatures. Identifying proteins or gene targets that allow for the distinctive properties of these cells could aid in the discovery of effective therapies for a number of ischemic indications and for the study of cold tolerance. Adult AGS hippocampus contains neural stem cells that continue to proliferate, allowing for easy expansion of these stem cells in culture. We describe here methods by which researchers can utilize these stem cells and differentiated neurons for any number of purposes. By closely following these steps the AGS neural stem cells can be expanded through two passages or more and then differentiated to a culture high in TUJ1-positive neurons (~50%) without utilizing toxic chemicals to minimize the number of dividing cells. Ischemia induces neurogenesis 6 and neurogenesis which proceeds via MEK/ERK and PI3K/Akt survival signaling pathways contributes to ischemia resistance in vivo7 and in vitro 8 (Kelleher-Anderson, Drew et al., in preparation). Further characterization of these unique neural cells can advance on many fronts, using some or all of these methods.

Neural stem cells were prepared from the hippocampus of adult non-hibernating yearling Arctic ground squirrels (AGS). These neural stem cells can be expanded through numerous passages, differentiated and maintained as a nearly 50:50 neuron to glial culture.

نمو وتمايز الخلايا القطب الشمالي الأرضي الكبار السنجاب الجذعية العصبية الحصين

Arctic ground squirrels (Urocitellus parryii, AGS) are unique in their ability to hibernate with a core body temperature near or below freezing 1. These ...

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

العزل والتوسع في الخلايا الجذعية العصبية الكبار باستخدام الفحص Neurosphere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

العزلة والثقافة من الخلايا العصبية كريست من الأنبوبة العصبية الجنينية الفئران

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

ماوس واحدة، واثنين من الثقافات: العزلة وثقافة الكبار الخلايا الجذعية العصبية من المناطق العصبية اثنان من الفئران الفردية

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

خالية من التغذية اشتقاق الخلايا العصبية كريست السلف من افرة القوة البشرية الخلايا الجذعية

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

فرز خلية العصبية الجذعية وخلايا السلف من الفأر Subventricular المنطقة الكبار وحية على التصوير من حيوية دورة الخلية الخاصة

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

العزلة والثقافة من الخلايا الجذعية البالغة العصبية من المنطقة تحت الثفني ماوس

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Use of Synaptic Zinc Histochemistry to Reveal Different Regions and Laminae in the Developing and Adult Brain

Characterization of anatomical and functional brain organization and development requires accurate identification of distinct neural circuits and regions in the immature and adult brain. Here we describe a zinc histochemical staining procedure that reveals differences in staining patterns among different layers and brain regions. Others have utilized this procedure not only to reveal the distribution of zinc-containing neurons and circuits in the brain, but also to successfully delineate areal and laminar boundaries in the developing and adult brain in several species. Here we illustrate this staining procedure with images from developing and adult ferret brains. We reveal a zinc-staining pattern that serves as an anatomical marker of areas and layers, and can be reliably used to distinguish visual cortical areas in the developing and adult visual cortex. The main goal of this protocol is to present a histochemical method that allows the accurate identification of layers and regions in the developing and adult brain where other methods fail to do so. Secondarily, in conjunction with densitometric image analysis, this method allows one to assess the distribution of synaptic zinc to reveal potential changes throughout development. This protocol describes in detail the reagents, tools, and steps necessary to successively stain frozen brain sections. Although this protocol is described using ferret brain tissue, it can easily be adapted for use in rodents, cats, or monkeys as well as in other brain regions.

We describe a histochemical procedure that reveals characteristic laminar and areal zinc staining patterns in different brain regions. The zinc-staining pattern may be used in conjunction with other anatomical markers to reliably distinguish layers and regions in the developing and adult brain.

استخدام هيستوتشيميستري الزنك متشابك للكشف عن مختلف المناطق وعن في الدماغ النامي والكبار

Characterization of anatomical and functional brain organization and development requires accurate identification of distinct neural circuits and regions ...

Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses

As our understanding of neurobiology has progressed, molecular analyses are often performed on small brain areas such as the medial prefrontal cortex (mPFC) or nucleus accumbens. The challenge in this work is to dissect the correct area while preserving the microenvironment to be examined. In this paper, we describe a simple, low-cost method using resources readily available in most labs. This method preserves nucleic acid and proteins by keeping the tissue frozen throughout the process. Brains are cut into 0.5&#8211;1.0 mm sections using a brain matrix and arranged on a frozen glass plate. Landmarks within each section are compared to a reference, such as the Allen Mouse Brain Atlas, and regions are dissected using a cold scalpel or biopsy punch. Tissue is then stored at -80 &#176;C until use. Through this process rat and mouse mPFC, nucleus accumbens, dorsal and ventral hippocampus and other regions have been successfully analyzed using qRT-PCR and Western assays. This method is limited to brain regions that can be identified by clear landmarks.

This procedure describes the collection of discrete frozen brain regions to obtain high-quality protein and RNA using inexpensive and commonly available tools.

مجموعة من مناطق الدماغ القوارض المجمدة لتحليلات المصب

As our understanding of neurobiology has progressed, molecular analyses are often performed on small brain areas such as the medial prefrontal cortex ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

التسليم داخل الشرايين للخلايا الجذعية العصبية إلى الدماغ الفئران والفأر: تطبيق على الإقفاري الدماغي

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...