نشكر تشاك سكوت وفيكتور ماكنايت من CBS العلمية الشركة وشركة ( <a href="http://www.cbsscientific.com/" target="_blank">www.cbsscientific.com</a> ) للحصول على المساعدة هندسة وتصنيع الدائرة 3D، وحدة تبادل الغازات، وتدرج. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (منح R21DK067084 وR43CA141782 إلى SKK).

1. إعداد إدراجات العليا والسفلى لنمو الخلايا بواسطة الكولاجين طلاء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عدد من إدراج اللازمة للتجربة. وضع كل إدراج في طبق بتري معقمة منفصلة (35 × 10 ملم) وتعقيم بواسطة التشعيع (11 جراى). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل الكولاجين لطلاء الأغشية: 50 ميكروغرام / مل، 154 ميكرولتر في إدراج (إدراج مساحة 1.54 سم 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع عدة قطرات (~ 20 ميكرولتر من كل قطرة ماء) من محلول الكولاجين في دائرة على سطح غشاء إدراج (لا تدع غيض ماصة تلمس السطح) ثم قم بإضافة بعناية بقية قسامة لتشكيل قطرة واحدة كبيرة على سطح الغشاء. ضمان أن الحل الكولاجين يبقى نصف كروية ولا تستنزف من سطح الغشاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية صحن بيتري مع غطاء واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة على سطح مستو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح الحل الكولاجين ويغسل الغشاء مرة واحدة من خلال تغطية مع 160 ميكرولتر PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ASPIRAالشركة المصرية للاتصالات في برنامج تلفزيوني واستبدال الغطاء. إذا باستخدام نفس اليوم، وضع طبق بتري في مكان جاف في درجة حرارة الغرفة. خلاف ذلك، ضع الطبق في 4 ° C واستخدام إدراج في غضون 7 أيام. </li></ol> 2. ثقافة الخلايا البطانية على إدراج العليا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تعليق EC في مستنبت المطلوب. ضمان بقاء الخلية هو&gt; 98٪ واستخدامها على الفور. </li></ol> ملاحظة: للحصول على الوريد السري الإنسان EC (HUVEC)، 4 يستخدم × 10 5 خلايا في 160 ميكرولتر لكل إدراج. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خذ أطباق بتري مع تدرج الكولاجين المغلفة أعدت في القسم 1، لا إزالة إدراج من الأطباق. ضع عدة قطرات صغيرة من تعليق الخلية (حوالي 20 ميكرولتر من كل قطرة ماء) في دائرة على سطح غشاء الكولاجين المغلفة (لا تدع طرف لمسة ماصة السطح) ثم قم بإضافة بعناية بقية تعليق خلية لتشكيل قطرة واحدة كبيرة. تأكد من أن تعليق خلية يبقى HEMIS<html> وpherical لا تستنزف من سطح الغشاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال الأغطية ووضع بعناية الأطباق في 5٪ CO 2 خلية حاضنة الثقافة واحتضان (دون أن تهتز) عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للسماح للخلايا لنعلق على الغشاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة بلطف 5 مل من مستنبت إلى كل طبق بتري ضمان إدراج يبقى على الجزء السفلي من الطبق ويتم تغطيتها بالكامل من قبل المتوسط. استبدال الأغطية وضعت بعناية الأطباق مرة أخرى في الحاضنة. ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية خلال الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام نفس النهج لإعداد الثانية (اختياري) أقل إدراج مع الخلايا التي تمثل المكروية المحلية، والتي سيتم وضعها تحت إدراج تحتوي على طبقة EC. </li></ol> ملاحظة: إذا لم يتم تضمين السفلي يدرج في التجارب، وترتبط إدراج العلوي والسفلي الأول لبعضها البعض قبل وضع إدراج في الجهاز 3D (الشكل 4B). ه &quot;&gt; 3. تجميع 3D تدفق جهاز غرفة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المسمار معا لوحات العلوي والسفلي، وربط لوحات إلى وحدة تبادل الغازات باستخدام الأنابيب، ووضع الجهاز تجميعها في كيس من البلاستيك نظيفة، وتعقيم الحقيبة ومحتوياتها من قبل التشعيع (11 جراى). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة صينية الجرف من ثقافة الخلية الحاضنة، المكان الى غطاء نسيج الثقافة العقيمة، رذاذ مع الايثانول 70٪، تمحو، ثم تغطية صينية مع منديل معقم كبيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كيس من البلاستيك المشع في غطاء محرك السيارة، إزالة الجهاز من الكيس ومكان على علبة حاضنة معقمة. قم بتوصيل الجهاز إلى مضخة تحوي أنابيب المقدمة. برنامج المضخة لسرعة الأمثل لل0.2 مل / دقيقة. </li></ol> ملاحظة: لتوصيل مضخة مع مأخذ كهربائي، بثق سلك كهربائي من خلال ثقب في الجهة الخلفية من الحاضنة. استخدام المكونات السارق حول الحبل للتأكد من أن الثقب هو محكم. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li&gt; مكان 5-7 مل من مستنبت المطلوب في العقيمة 15 مل أنبوب (ل&quot;مدخل&quot;). </li></ol> 4. رئيس جهاز 3D تدفق غرفة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الأنبوب مدخل من مخرج طريق سحب إبرة معدنية من أنابيب (استخدم المناديل المعقمة الصغيرة للحفاظ على العقم من الأنبوب). استخدام إبرة معدنية متصلة أنابيب بأنه &quot;مدخل&quot; ونهاية قطع من أنابيب ك &quot;مخرج&quot;. وضع مدخل إبرة معدنية في أنبوب مل 15 مع وسائل الإعلام؛ وضع منفذ في أنبوب فارغ 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل المضخة بحيث يتم عكس تدفق وضبط معدل تدفق في 0.2 مل / دقيقة. تسمح الضغط السلبي لرسم المتوسطة من أنبوب مدخل 15 مل في أنابيب وإيقاف المضخة عندما يكون وسيلة تصل إلى نهاية الأنبوب فورا قبل أن يربط إلى جهاز (الشكل 2، إيقاف رقم 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فك لوحات العلوي والسفلي من الجهاز. بعناية إزالة الجزء العلوي من لوحة ومكان 1،500 - 1،550 ميكرولتر من ميديأم (إما وحدها أو المتوسطة بالإضافة إلى كيموكينات التجريبية) في أسفل الآبار. تأكد من البئر يحتوي متوسطة كافية لتشكيل نصف الكرة التي تصل إلى ما يقرب من 1-2 مم فوق لوحة أقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل إدراج أعدت من طبق بيتري إلى الآبار من لوحة السفلي باستخدام ملقط معقم، والتأكد من عدم وجود فقاعات محاصرون تحت إدراج. نضح أي وسيط الذي يظهر على السطح السفلي لوحة للتأكد من أن لوحة لا تزال جافة. وضع لوحة العلوي ليعيدوه الى انخفاض لوحة وإعادة ربط لوحات باستخدام مسامير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على الفور على مضخة تحوي والسماح لتدفق المتوسطة من خلال الجهاز 3D. رفع نهاية منفذ من الجهاز والحفاظ على غرفة في هذا الموقف لمنع تشكيل فقاعات داخل الفضاء بين لوحات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح وسيلة لملء الغرفة وأنابيب يربط بين غرفة إلى وحدة تبادل الغازات. وقف ضخ مباشرة قبل متوسطة تصل إلى البريد الغازوحدة التبادل (الشكل 2؛ إيقاف رقم 2). مكان 3 مل من المتوسط ​​في وحدة تبادل الغازات، تشغيل المضخة، والسماح للفقاعات الهواء من الفرار من خلال وحدة تبادل الغازات. رفع حدة تبادل الغازات للسماح المتوسطة لملء الأنابيب التي تخرج من وحدة تبادل الغازات، ووقف ضخ عندما يكون وسيلة تصل إلى 2 - 3 سم قبل نهاية الأنبوب منفذ (الشكل 2، إيقاف # 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط الإبرة المعدنية مدخل إلى منفذ باستخدام المناديل المعقمة الصغيرة. إعادة برمجة المضخة وبالتالي فإن التدفقات المتوسطة في الاتجاه المعاكس (اتجاه عقارب الساعة) نحو وحدة تبادل الغازات والتأكد من إزالة أي فقاعات الهواء بمجرد وصولها إلى وحدة تبادل الغازات. تحقق من عدم وجود فقاعات الهواء في النظام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة برمجة المضخة وبالتالي فإن متوسط ​​التدفقات عكس اتجاه عقارب الساعة. إضافة 100 ميكرولتر من تعليق خلية اختبار لوحدة تبادل الغازات. إغلاق الغطاء وحدة تبادل الغازات، وضع صينية مع النظام مرة أخرى تعمل في الحاضنة، وتسمح للخلايا اختبار لcirculatه في الجهاز 3D عند 37 درجة مئوية لمدة الوقت المطلوب. </li></ol> ملاحظة: تنظيف سلك الكهربائي للمضخة مع الايثانول 70٪ ووضعه داخل الحاضنة. 5. إنهاء الاختبار وجمع عينات للفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة صينية مع نظام العمل من الحاضنة ومكان في غطاء محرك السيارة. إيقاف المضخة، افصل مدخل ومخرج، ووضع نهايات فارغة عقيمة إلى 15 مل أنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على مضخة وجمع تعليق خلية من النظام؛ مكان تعليق الخلية على الجليد، إذا كان ذلك مناسبا، حتى الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفكيك الدائرة عن طريق إزالة مسامير ورفع قبالة لوحة العلوي. إزالة إدراج من أسفل اللوحة ونقلها إلى أطباق بتري. </li></ol> ملاحظة: يمكن ملطخة إدراج لتصور وعد الخلايا في الموقع (البنفسجي الكريستال 0.05٪ في DH 2 O) أو trypsinized لجمع EC للمزيدالاختبار. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة والخلايا من أقل الآبار في أنابيب وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 210 ز س. إزالة طاف، ويغسل وresuspend الخلايا كما تريد، ومعالجة الخلايا وفقا للأهداف المحددة التجريبية (التي تمت مناقشتها بمزيد من التفصيل أدناه). </li></ol>

<ol>
	<li>Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+and+perils+of+stem+cell+therapeutics.">The promise and perils of stem cell therapeutics.</a> Cell Stem Cell. 10, 740-749 (2012).</li><li>Khaldoyanidi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+stem+cell+homing.">Directing stem cell homing.</a> Cell Stem Cell. 2, 198-200 (2008).</li><li>Laird, D. J., von Andrian, U. H., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+trafficking+in+tissue+development,+growth,+and+disease.">Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease.</a> Cell. 132, 612-630 (2008).</li><li>Lapidot, T., Kollet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain-bone-blood+triad:+traffic+lights+for+stem-cell+homing+and+mobilization.">The brain-bone-blood triad: traffic lights for stem-cell homing and mobilization.</a> Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2010, 1-6 (2010).</li><li>Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoengineering+of+HCELL,+the+human+bone+marrow+homing+receptor:+sweetly+programming+cell+migration.">Glycoengineering of HCELL, the human bone marrow homing receptor: sweetly programming cell migration.</a> Ann. Biomed. Eng. 40, 766-776 (2012).</li><li>Smart, N., Riley, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stem+cell+movement.">The stem cell movement.</a> Circ. Res. 102, 1155-1168 (2008).</li><li>Khaldoyanidi, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MDA-MB-435+human+breast+carcinoma+cell+homo-+and+heterotypic+adhesion+under+flow+conditions+is+mediated+in+part+by+Thomsen-Friedenreich+antigen-galectin-3+interactions.">MDA-MB-435 human breast carcinoma cell homo- and heterotypic adhesion under flow conditions is mediated in part by Thomsen-Friedenreich antigen-galectin-3 interactions.</a> J. Biol. Chem. 278, 4127-4134 (2003).</li><li>Le Devedec, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Intravital+Multicolour+Imaging+to+Study+Metastatic+Behaviour+of+Cancer+Cells+in+vivo.">Two-Photon Intravital Multicolour Imaging to Study Metastatic Behaviour of Cancer Cells in vivo.</a> Methods Mol. Biol. 769, 331-349 (2011).</li><li>Barakat, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responsiveness+of+vascular+endothelium+to+shear+stress:+potential+role+of+ion+channels+and+cellular+cytoskeleton+(review).">Responsiveness of vascular endothelium to shear stress: potential role of ion channels and cellular cytoskeleton (review).</a> Int. J. Mol. Med. 4, 323-332 (1999).</li><li>Fisher, A. B., Chien, S., Barakat, A. I., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cellular+response+to+altered+shear+stress.">Endothelial cellular response to altered shear stress.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281, L529-L533 (2001).</li><li>Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+force+and+its+effect+on+cell+structure+and+function.">Shear force and its effect on cell structure and function.</a> ASGSB Bull. 4, 87-94 (1991).</li><li>Topper, J. N., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+flow+and+vascular+gene+expression:+fluid+shear+stress+as+a+modulator+of+endothelial+phenotype.">Blood flow and vascular gene expression: fluid shear stress as a modulator of endothelial phenotype.</a> Mol. Med. Today. 5, 40-46 (1999).</li><li>Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+and+adhesion+of+human+tumor+cells+on+vascular+endothelium+under+physiological+flow+conditions.">Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions.</a> J. Clin. Invest. 92, 3038-3044 (1993).</li><li>Cinamon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chemokine+functions+in+lymphocyte+migration+through+vascular+endothelium+under+shear+flow.">Novel chemokine functions in lymphocyte migration through vascular endothelium under shear flow.</a> J. Leukoc. Biol. 69, 860-866 (2001).</li><li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+progenitor+cell+rolling+in+bone+marrow+microvessels:+parallel+contributions+by+endothelial+selectins+and+vascular+cell+adhesion+molecule+1.">Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1.</a> J. Exp. Med. 188, 465-474 (1998).</li><li>Arber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft+source+determines+human+hematopoietic+progenitor+distribution+pattern+within+the+CD34(+)+compartment.">Graft source determines human hematopoietic progenitor distribution pattern within the CD34(+) compartment.</a> Bone Marrow Transplant. 46, 650-658 (2012).</li><li>Fuji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+blood+as+a+preferable+source+of+stem+cells+for+salvage+transplantation+in+patients+with+graft+failure+after+cord+blood+transplantation:+a+retrospective+analysis+of+the+registry+data+of+the+Japanese+Society+for+Hematopoietic+Cell+Transplantation.">Peripheral blood as a preferable source of stem cells for salvage transplantation in patients with graft failure after cord blood transplantation: a retrospective analysis of the registry data of the Japanese Society for Hematopoietic Cell Transplantation.</a> Biol. Blood Marrow Transplant. 18, 1407-1414 (2012).</li><li>Haspel, R. L., Miller, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells:+source+matters.">Hematopoietic stem cells: source matters.</a> Curr. Stem Cell Res. Ther. 3, 229-236 (2008).</li><li>Schraufstatter, I. U., Discipio, R. G., Zhao, M., Khaldoyanidi, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C3a+and+C5a+are+chemotactic+factors+for+human+mesenchymal+stem+cells,+which+cause+prolonged+ERK1/2+phosphorylation.">C3a and C5a are chemotactic factors for human mesenchymal stem cells, which cause prolonged ERK1/2 phosphorylation.</a> J. Immunol. 182, 3827-3836 (2009).</li></ol>

سلسلة علوم الحياة وشركة تمتلك الحقوق الحصرية لبراءة الاختراع رقم 7927867 الولايات المتحدة B2 &quot;جهاز لتقييم في الهجرة الخلية المختبر تحت ظروف تدفق وسائل للاستخدامات منها&quot;. SKK هو مخترع تدفق غرفة تكنولوجيا جهاز 3D والمؤسس المشارك علمي ومساهم في شركة كاسكيد علوم الحياة

التسرب الخلية هي العملية التي من خلالها الخلايا المنتشرة الخروج من مجرى الدم، وهي عنصر حاسم في العديد من الاستجابات الفسيولوجية في الجسم. عملية المهم أيضا لتجديد الأنسجة، وعلى سبيل المثال، عندما الخلايا العلاجية حشد من الأنسجة في الأوعية الدموية (أو حقنها في الوريد) تهاجر من خلال الأوعية الدموية والخروج من الدورة الدموية إلى مواقع الإصابة أو الضمور. التسرب هو أيضا عنصرا حاسما في التسبب في الكثير من الأمراض، بما في ذلك الالتهاب، والرفض المناعي، المناعة الذاتية، والانبثاث ورم. التسرب هو عملية متعددة الخطوات المعقدة التي تنطوي على التفاعل بين تعميم الخلايا مع الخلايا البطانية (EC) في ظل ظروف تدفق الفسيولوجية. وتضم عملية (أ) المتداول الخلية، (ب) التصاق شركة إلى السطح اللمعية من EC، و (ج) التهجير عبر EC. الأهم من ذلك، يتم تنظيم كل خطوة من سلسلة التسرب من قبل مجموعة فرعية من جالذراع نوع محددة والجزيئات أنواع محددة. ومع ذلك، فإن الآليات الجزيئية المفصلة التي تنظم التسرب من مجموعات فرعية معينة من الخلايا ليست مفهومة جيدا، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى صعوبة التقنية لتلخص الأوضاع في مجرى الدم. الجهاز 3D الرواية الموصوفة هنا يهدف إلى التغلب على هذه التحديات التقنية والسماح التجارب التي يتعين القيام بها من شأنها أن تحسن فهمنا للبيولوجيا الخلية الهجرة. الجزيئات التي توسط الهجرة الخلية هي الأهداف العلاجية الهامة. وهناك فهم مفصل من الأحداث الجزيئية التي تتحكم في الهجرة من أنواع معينة من الخلايا المساعدة في تحديد أهداف جديدة لتعزيز العلاجية أو تثبيط التسرب. على سبيل المثال، فإن التدخلات التي تعزز هجرة الخلايا الجذعية العلاجية (سواء كانت مستمدة من الكبار، والأطفال حديثي الولادة أو حتى من أنسجة الجنين) نحو مواقع الإصابة أو الضمور يكون من فائدة كبيرة في تجديد الأنسجة.هناك اهتمام متزايد في في المختبر جيل من الخلايا الجذعية العلاجية، بما في ذلك الخلايا المشتقة من مصادر المحفزة، والتلاعب في الجسم الحي الخلايا الجذعية البالغة EX (توسع، التلاعب بها وراثيا، وسابقة التجهيز مع الإنزيمات المختلفة) 1. وبالتالي، هناك حاجة لتقنيات جديدة لتقييم نوعية الخلايا الجذعية قبل استخدامها لأغراض علاجية. بين غيرها من المعالم، ويجب أن تكون الخلايا قادرة على الخروج بكفاءة تداول، لأن العلاجات لاضطرابات متعددة البؤر قد تتطلب الوريد من الخلايا الجذعية 2. في الواقع، واحدة من التحديات الراهنة في بيولوجيا الخلايا الجذعية هو التغلب على كفاءة منخفضة للغاية مع الخلايا الجذعية التي تضم مواقع من تلف الأنسجة 3-6، وتسليط الضوء على الحاجة إلى معالجة هذه الفجوة في فهمنا للهجرة الخلايا الجذعية. في المقابل، الاستراتيجيات التي من شأنها أن الهجرة الخلية كتلة باستهداف جزيئات معينة صاروخ موجه تكون مفيدة لعلاج فيالأمراض الالتهابية والمناعة الذاتية وكذلك السرطان المنتشر. وبالتالي، فهم الآليات الجزيئية التي تتوسط التفاعلات بين الخلايا وتعميم EC أثناء الهجرة الخلية والتسرب هو ذات الصلة إلى الطب بالحركة واكتشاف المخدرات فضلا عن العلوم الأساسية. هناك حاليا عددا من الطرق المتاحة لدراسة مختلف جوانب الهجرة الخلية. ومع ذلك، هذه الطرق لها أوجه القصور التي يمكن التغلب عليها مع الجهاز 3D جديدة. النماذج الحيوانية: وكانت النماذج الحيوانية، مثل الفئران والجرذان المناعة التلاعب وراثيا، أدوات مفيدة لدراسة الهجرة من الخلايا البشرية في الجسم الحي. ومع ذلك، عيب واحد كبير لهذه النماذج هو أن الخلايا البشرية تتفاعل مع جزيئات الالتصاق سيئة موجودة على الماوس EC، ويرجع ذلك جزئيا إلى الاختلافات تسلسل أنواع محددة في كثير من جزيئات سطح الخلية. وهكذا، فإن استخدام هذه القوارض للدراسةمن غير المرجح أن تعكس أصلي الأحداث في سرير الأوعية الدموية الجهاز محددة الإنسان الهجرة الخلية البشرية. وبالإضافة إلى ذلك، في النماذج الحية ليست مناسبة لفحص عالية الإنتاجية من المرشحين المخدرات. التقليدية في النماذج الحية تستخدم لدراسة الخلية صاروخ موجه لا تميز بين مختلف الخطوات من تتالي التسرب، مما يجعل من الصعب تحديد واستهداف جزيئات صاروخ موجه الرواية. وقد تم تطوير هذا النهج intravital المجهري لتلبية هذه الحاجة، وكانت غنية بالمعلومات، ولكن هذا الأسلوب هو الوقت وللغاية كثيفة العمالة 7،8. ثابت المقايسات التهجير: وتستخدم على نطاق واسع Transwell أو بويدن غرفة فحوصات قياس الهجرة الخلية عبر غشاء مسامي ودراسات في الهجرة. مقايسة لديه ميزة أنه يمكن استخدامها لدراسة ليس فقط حركية الخلية ومصفوفة خارج الخلية الخلية (ECM) التفاعلات، ولكن أيضا الهجرة chemokine بوساطة الخلاياعبر أحادي الطبقة EC نمت على أغشية مسامية. وللأسف، فإن النمط الظاهري وظيفة EC في ظل ظروف ثابتة تختلف كثيرا عن تلك التي تحت تدفق الفسيولوجية 9،10. وهكذا، فإن الأحداث الكيميائي التي تحدث في المقايسات Transwell لا تحاكي بأمانة التفاعلات بين الخلايا المهاجرة وEC تحت إجهاد القص. وبالإضافة إلى ذلك، لا يتم إجراء الخطوة &quot;المتداول&quot; من تتالي صاروخ موجه، وهو ما يضيف بعدا جديدا من الانتقائية في العملية الشاملة، في المقايسات Transwell ثابت. وهكذا، في حين أن هذه التكنولوجيا لا تسمح التقييم الكمي للهجرة الخلايا chemokine بوساطة عبر أحادي الطبقة EC، محدودة بسبب عدم قدرته على توفير إجهاد القص الذي يحاكي تدفق الدم في الجسم الحي. المقايسات تحت إجهاد القص: ومن المعروف إجهاد القص للجدران أن تلعب دورا هاما في تنظيم وظيفة EC 9،10. قوى القص تتسبب في تنشيط السريع من أجهزة الطرد المركزي يشير، transcالعوامل ription، والفرق التعبير الجيني في EC 11،12. أدت هذه المعلومات إلى تطوير الجيل المقبل من فحوصات التصاق - غرف موازية تدفق الصفحي والشعيرات الدموية - لدراسة المتداول والتصاق الخلايا لEC تحت ظروف إجهاد القص 7،13. العامل المحدد لهذه المقايسات هو أنها يمكن أن قياس المتداول والتصاق فقط، ولكن لا تفرق بين الخلايا الملتصقة التي من شأنها أن تذهب إلى transmigrate والخلايا الملتصقة التي يتم &quot;القبض&quot; على أحادي الطبقة EC ولن transmigrate. وعلاوة على ذلك، يمكن لهذه المقايسات لا قياس الهجرة من الخلايا نحو الانحدار chemokine. وقد وصفت عدة تقارير قدرة الخلايا الملتصقة على الزحف تحت أحادي الطبقة EC نمت على الشرائح الزجاجية تحت ظروف تدفق 14. القيود المفروضة على هذه التقنية الزحف ما يلي: يقوم بتحليل عدد محدود فقط من الخلايا، بل هو غير الكمي، بل يحلل خلية الزحف على مصفوفة وسللا يسمح والخلايا transmigrated أن تكون معزولة؛ سطح L ولكن ليس الهجرة نحو التدرج الكيميائي. وهكذا، على الرغم من أن هذا الاختبار لديه ميزة لتطبيق إجهاد القص لأحادي الطبقة EC، فإنه لا يمكن قياس الهجرة من الخلايا نحو الانحدار chemokine. تكنولوجيا 3D الرواية الموصوفة هنا يتغلب على العديد من أوجه القصور هذه من خلال الجمع بين قوة القص (المقصورة العليا) مع التدرج chemokine ثابت (أقل مقصورة) ويسمح التقييم الكمي من كل خطوة من سلسلة التسرب (الشكل 1). ويمكن أيضا أن تستخدم الجهاز للتحقيق في كيفية الحديث المتبادل بين المفوضية الأوروبية والمكروية يؤثر على قدرة EC لدعم التسرب من الخلايا المنتشرة. يصف بروتوكول التالي على منهجية خطوة بخطوة لاستخدام جهاز 3D غرفة التدفق.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PVC tubing (bore 1.42, wall 0.8)</td>
 <td>Watson-Marlow Limitid</td>
 <td>981.0142.000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3D Chamber</td>
 <td>C.B.S.Scientific</td>
 <td>FC-1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gas exchange unit</td>
 <td>C.B.S.Scientific</td>
 <td>FCR-1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inserts</td>
 <td>C.B.S.Scientific</td>
 <td>FCI-1005U</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagen Bovine,Type I</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>354231</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrochloric Acid 0.1M</td>
 <td>VWR</td>
 <td>BDH3200-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>14190</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HUVEC</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC- 2517</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EGM Bullet Kit (cc - 3121 &#38; cc - 4133)</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC - 3124</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin Neutralizing Solution</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC-5002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC-5012</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC-5024</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SDF-1</td>
 <td>R7D System</td>
 <td>460-SD</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Extracel Trial 2.5 Kit</td>
 <td>Glycosam Byosystems</td>
 <td>GS211</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fibronectin, human , nature</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>356008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-D-lysine</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>A-003-E</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BD Matrigel</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>354277</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human Brain Microvascular Endothelial Cells</td>
 <td>ScienCell</td>
 <td>1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Endotelial Cell Medium (ECM) for brain cells</td>
 <td>ScienCell</td>
 <td>1001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypan Blue</td>
 <td>StemCells Tecnologies</td>
 <td>7050</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TNF-alfa, 10 &mu;g</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>PHC3015</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>VCAM-1, mouse anti-human, CD106-FITC</td>
 <td>Southern Bioteck</td>
 <td>9519-02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Propidium Iodide Staining Solutuion</td>
 <td>BD Pharmingen</td>
 <td># 556463</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Frozen Human Cord Blood CD34+ cells</td>
 <td>StemCell</td>
 <td>CB007F</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Frozen Human Cord Blood CD34+ cells</td>
 <td>Zenbio</td>
 <td>SER - CD34-F</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MethoCult GF M3434</td>
 <td>StemCells Tecnologies</td>
 <td>GFM3434</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse Methylcellulose complete media</td>
 <td>R&#38;D</td>
 <td>HSC007</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-Von Willibrand Factor antibody</td>
 <td>abcam</td>
 <td>C# ab11713</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petry dish (35 x 10 mm)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>CA25373-041</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml tubes</td>
 <td>VWR Fisher</td>
 <td>21008 - 918</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue culture flasks 75cm2</td>
 <td>VWR</td>
 <td>BD353136</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cristal violet</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>C-3886-25G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissecting forceps, curved</td>
 <td>VWR</td>
 <td>82027-384</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1,000 &mu;l Pipette tips</td>
 <td>VWR</td>
 <td>83007-380</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 - 200 &mu;l Pipette tips</td>
 <td>VWR</td>
 <td>37001-530</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peristaltic pump</td>
 <td>Watson-Marlow Limitid</td>
 <td>403U/VM3</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a novel three-dimensional flow chamber device to study chemokine-directed extravasation of cells circulating under physiological flow conditions

التسرب من تعميم الخلايا من مجرى الدم يلعب دورا محوريا في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض، بما في ذلك الخلايا الجذعية ورم خبيث صاروخ موجه والورم. ثلاثي الأبعاد تدفق الجهاز غرفة (الآخرة الجهاز 3D) هي رواية في تكنولوجيا المختبر الذي يجسد إجهاد القص الفسيولوجية ويسمح لكل خطوة من سلسلة التسرب الخلية ليكون كميا. يتكون الجهاز 3D من المقصورة العليا في الخلايا التي تهم تعمم تحت إجهاد القص، وحجرة أقل من الآبار التي تحتوي على ثابت chemoattractants من الفائدة. يتم فصل القسمين عن طريق إدراج مسامية مغطاة أحادي الطبقة من الخلايا البطانية (EC). تضاف الاختياري الثاني مع الخلايا microenvironmental من الفائدة يمكن وضعها مباشرة تحت طبقة EC. وحدة تبادل الغازات يسمح للCO 2 الأمثل التوتر إلى الحفاظ عليها وتوفر نقطة وصول لإضافة أو سحب الخلايا أو مركبات خلالالتجربة. الخلايا اختبار تعمم في المقصورة العليا في إجهاد القص المطلوب (معدل التدفق) التي تسيطر عليها مضخة تمعجية. في نهاية التجربة، يتم جمع الخلايا المنتشرة وهاجرت لمزيد من التحليلات. الجهاز 3D يمكن استخدامها لدراسة الخلية المتداول على والتصاق إلى EC تحت إجهاد القص، التهجير ردا على التدرجات chemokine، ومقاومة للإجهاد القص، تشكيل الكتلة، وبقاء الخلية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن إدراج الثاني اختياري يسمح للآثار الحديث المتبادل بين المفوضية الأوروبية والخلايا microenvironmental لفحصها. تطبيقات متعدية للجهاز 3D تشمل اختبار المرشحين المخدرات أن الهجرة الخلية المستهدفة والتنبؤ في السلوك المجراة من الخلايا بعد الحقن في الوريد. وهكذا، فإن جهاز 3D الرواية هو أداة مرنة وغير مكلفة لدراسة الآليات الجزيئية التي تتوسط التسرب الخلوية.

وقد نمت العظام الفئران نخاع المستمدة من خط EC STR-12 على إدراج مع 5 المسام ميكرون. تم رصد معدل النمو EC تحت المجهر وعندما كانت EC 100٪ متموجة، تم نقل إدراج في الآبار في المقصورة السفلي من الجهاز 3D. فورا قبل وضع تدرج، وامتلأت الآبار من أسفل مقصورة مع مستنبت وحده (مراقبة سلبية) أو مع المتوسطة تستكمل مع انسجة الخلايا المشتقة عامل-1 (SDF-1، 5 نانوغرام / مل و 50 نانوغرام / مل). بعد ذلك، تم تجميع الجهاز 3D وامتلأت الغرفة مع المتوسطة كما هو موضح في البروتوكول. الخلايا اختبار لتعمم في المقصورة العلوية من الجهاز تم حصادها حديثا الفئران خلايا نخاع العظم (3.5 × 10 6 خلايا لكل غرفة). تم تطبيق إجهاد القص محددة من 0.8 DYN / سم 2 عن طريق تعيين سرعة مضخة تحوي على 0.2 مل / دقيقة. ثم وضعت نظام العمل بأكمله في 5٪ CO 2 حاضنة عند 37 درجة مئوية ومسمح LLS أن تعمم والتفاعل مع أحادي الطبقة EC لمدة 4 ساعة. في نهاية ذلك الوقت، وقد تم جمع الخلايا المنتشرة، تم تفكيكها الدائرة، وأزيلت إدراج كما هو موضح في البروتوكول. وكان حصاد الخلايا transmigrated من أقل الآبار، وغسلها، معلق في متوسطة جديدة، ونقل إلى الثقافات ميثيل تستكمل مع عوامل النمو المكونة للدم للخلية المكونة للمستعمرة (CFC) مقايسة (الشكل 3). كما هو متوقع، وجدنا أن عددا أكبر بكثير من مركبات الكربون الكلورية فلورية هاجروا عبر أحادي الطبقة EC إلى الآبار التي تحتوي على 50 نانوغرام / مل SDF-1 من لآبار تحتوي على 5 نانوغرام / مل SDF-1 أو المتوسطة وحدها. كما وصفنا في وقت سابق، فإن أيا من الحالي في تقنيات المختبر المتاحة لدراسة الهجرة الخلية قادرة على اختبار تأثير المكروية المحلية على قدرة EC لدعم التسرب من الخلايا المهاجرة. لتوضيح كيف يمكن أن يتحقق هذا مع الجهاز 3D، ونحنالتسرب فحص تعميم الخلايا المكونة للدم عبر طبقة من EC وطبقة من العظام خلايا انسجة نخاع. لهذا، كان جنبا إلى جنب في الثانية (انخفاض) إدراج تحتوي على طبقة من الخلايا اللحمية إلى إدراج العلوي الذي يحتوي على أحادي الطبقة EC في الجزء الأسفل من لوحة (الشكل 4). تم إجراء التجربة ثم كما هو موضح أعلاه وكانت تحصد الخلايا transmigrated من الآبار وعدها. أظهرت النتائج أن الإدراج من طبقة إضافية من الخلايا اللحمية تحت أحادي الطبقة EC زيادة كبيرة في الهجرة من الخلايا المكونة للدم نحو SDF-1 (الشكل 4). هذه النتيجة تتفق مع فكرة أن المكروية المحلية يساهم في تجنيد تعميم الخلايا إلى الأنسجة. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig1.jpg" /> <stroنانوغرام&gt; الشكل 1. و3D جهاز غرفة التدفق. ج: يتكون الجهاز 3D مغلقة بإحكام من اثنين من مقصورات مفصولة غشاء مسامي استبدال (PM). تزرع EC على الغشاء، والتي تشكل ثم حاجزا بين المقصورات العلوية والسفلية. يتم تطبيق اجهادات القص تعريف للمقصورة العلوية من الجهاز 3D من قبل وسائل الإعلام perfusing باستخدام مضخة التسريب المستمر تحوي. الخلايا المنتشرة إما أن تكون غير متفاعلة (NIC)، والتفاعل مع المفوضية الأوروبية عابر (&#39;لفة&#39;؛ RC)، أو الانضمام إلى المجموعة الأوروبية (AC). جزء من السكان من الخلايا الملتصقة transmigrates عبر طبقة EC إلى المقصورة انخفاض ثابت من الجهاز (TM) B: A الرسم العرض من أعلى (اللوحة العليا) للجهاز 3D. ترى قطاعات أفقية (اللوحة السفلى) يوضح موقف الغشاء العلوي (الحمراء)، وانخفاض غشاء (الأخضر)، والجزء السفلي من البئر (الازرق) C:. وisometriج عرض يوضح جزءا لا يتجزأ من الجهاز: أربعة مسامير، وهو أعلى كتلة الاكريليك، وختم الغرفة العليا، العلوي والسفلي الأغشية، أسفل يا الدائري، و 3 آبار الاكريليك كتلة أسفل D:. صورة لتدفق 3D غرفة متصلة مضخة تحوي وحدة تبادل الغازات. يتم تجميع النظام في غطاء العقيمة، ثم نقل إلى ثقافة الخلية الحاضنة. <img alt="الشكل 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig2.jpg" /> الشكل 2. تمثيل تخطيطي لنظام الجهاز 3D. يبين الرسم توقف ثلاثة المطلوبة لتجميع النظام. ويوجه مستنبت في من مدخل من الضغط السلبي إنشاؤها بواسطة مضخة تحوي. يتم إيقاف تدفق المتوسطة قبالة عن طريق إيقاف رقم 1 للسماح للإدراج لتوضع في الجهاز. بعد إغلاق الدائرة، المضخة هو SWITجنة التعليم العالي مرة أخرى ويملأ الغرفة على الفور مع المتوسط ​​لمنع جفاف الخلايا نمت على إدراج. وقف رقم 2 يسمح المتوسطة لتوضع في وحدة تبادل الغازات. وقف # 3 يسمح للتدفق إلى أن تتوقف عن الاتصال من مدخل ومخرج. تدفق يمكن توجيهها في اتجاه عقارب الساعة أو عكس اتجاه عقارب الساعة لإزالة فقاعات الهواء من خلال وحدة تبادل الغازات باستخدام التبديل على المضخة. <img alt="الشكل (3)" fo:content-width="5.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig3.jpg" /> الشكل (3). ويدعم الجهاز 3D التهجير SDF-1-بوساطة من الأسلاف المكونة للدم في ظل ظروف إجهاد القص الفسيولوجية. ج: تم تجميع ثلاثة أجهزة (تحتوي كل منها على 3 آبار في الطبقة السفلى من المقصورة) وتشغيل في نفس الوقت. تم ادراج المتوسطة وحدها أو المتوسطة التي تحتوي على SDF-1 في 5 أو 50 نانوغرام / مل إلى آبار مقصورة أقل. الفئران بوسمح شمال شرق خلايا نخاع أن تعمم في الأجهزة لمدة 4 ساعة. بعد ذلك، تم تفكيكها كل جهاز وتم جمع الخلايا التي قد transmigrated نحو SDF-1 (الأصفر) من أقل الآبار وعدها، ومثقف في ميثيل تستكمل مع عوامل النمو المكونة للدم (GF). بعد أربعة عشر يوما، وسجل المستعمرات تحت المجهر B:. عدد من الأسلاف (الخلايا المكونة للمستعمرة، CFC) تعافى من أقل المقصورات وكما هو مبين يعني ± SD من ثلاث آبار في حالة. * P &lt;0.05. <img alt="الشكل 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig4.jpg" /> الشكل 4. تأثير المكروية على التفاعلات بين الخلايا المكونة للدم والخلايا البطانية. ج: يبين الرسم التوضيحي موقف غشاء مسامي الثانية مع سانت مثقفالخلايا الليفية romal (SF) تحت الغشاء العلوي مع المفوضية الأوروبية. الاختصارات الأخرى كما هو موضح الشكل 1A B: إن غشاء إضافية (أقل إدراج) مع أدرجت SF مثقف تحت الغشاء العلوي C: تم تشغيل ثلاثة أجهزة (تحتوي كل منها على 3 آبار) في نفس الوقت. تم ادراج المتوسطة وحدها أو المتوسطة التي تحتوي على SDF-1 في 50 نانوغرام / مل SDF-1 إلى الآبار مقصورة أقل. دوائر مراقبة سلبية حذف SC، SDF-1، أو كليهما. وسمح خلايا نخاع العظم ليعمم لمدة 4 ساعة على 37 درجة مئوية. بعد ذلك، تم تفكيكها كل جهاز وتم جمع الخلايا transmigrated من الآبار مقصورة الدنيا وعدها. يظهر عدد من الخلايا transmigrated تعافى كما يعني ± SD من ثلاث آبار في حالة. * P &lt;0.05.

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions at JoVE.com

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

ثلاثي الأبعاد الجهاز غرفة التدفق هي رواية<em&gt; في المختبر</em&gt; التكنولوجيا من أجل التقييم الكمي وخطوة حكيمة من تتالي التسرب من الخلايا المنتشرة تحت ظروف إجهاد القص الفسيولوجية. ولذلك يملأ جهاز حاجة ماسة للدراسات الأساسية، قبل السريرية، والسريرية للهجرة الخلية.

رواية ثلاثي الأبعاد التدفق جهاز الدائرة لدراسة Chemokine الموجه التسرب من خلايا اعارة تحت ظروف تدفق الفسيولوجي

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

a-novel-three-dimensional-flow-chamber-device-to-study-chemokine

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.3K Views.  Torrey Pines Institute for Molecular Studies. ثلاثي الأبعاد الجهاز غرفة التدفق هي رواية في المختبر التكنولوجيا من أجل التقييم الكمي وخطوة حكيمة من تتالي التسرب من الخلايا المنتشرة تحت ظروف إجهاد القص الفسيولوجية. ولذلك يملأ جهاز حاجة ماسة للدراسات الأساسية، قبل السريرية، والسريرية للهجرة الخلية.

Video: A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells behave differently when they are grown within a 3D extra-cellular matrix and also interact with other cells (1-5). Mouse models have been broadly utilized to study tissue morphogenesis in vivo. However mouse and human skin have significant differences in cellular architecture and physiology, which makes it difficult to extrapolate mouse studies to humans. Since melanocytes in mouse skin are mostly localized in hair follicles, they have distinct biological properties from those of humans, which locate primarily at the basal layer of the epidermis. The recent development of 3D human skin reconstruct models has enabled the field to investigate cell-matrix and cell-cell interactions between different cell types. The reconstructs consist of a "dermis" with fibroblasts embedded in a collagen I matrix, an "epidermis", which is comprised of stratified, differentiated keratinocytes and a functional basement membrane, which separates epidermis from dermis. Collagen provides scaffolding, nutrient delivery, and potential for cell-to-cell interaction. The 3D skin models incorporating melanocytic cells recapitulate natural features of melanocyte homeostasis and melanoma progression in human skin. As in vivo, melanocytes in reconstructed skin are localized at the basement membrane interspersed with basal layer keratinocytes. Melanoma cells exhibit the same characteristics reflecting the original tumor stage (RGP, VGP and metastatic melanoma cells) in vivo. Recently, dermal stem cells have been identified in the human dermis (6). These multi-potent stem cells can migrate to the epidermis and differentiate to melanocytes.

In this report, we describe the three-dimensional skin reconstruct model which mimics human skin in architecture and composition. Melanocyte physiology, melanoma progression and the fate of dermal stem cells have been investigated using the skin reconstruct model. The model is also useful as a preclinical tool for drug assessment.

الجلد ثلاثي الأبعاد إعادة بناء الإنسان النموذجي : أداة لدراسة بشرة العادية والتقدم الميلانوما

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well quantifiable fluid shear stresses1.
Our flow chamber design and flow circuit (Fig. 1) contains a transparent viewing region that enables testing of cell adhesion and imaging of cell morphology immediately before flow (Fig. 11A, B), at various time points during flow (Fig. 11C), and after flow (Fig. 11D). These experiments are illustrated with human umbilical cord blood-derived endothelial progenitor cells (EPCs) and porcine EPCs2,3.
This method is also applicable to other adherent cell types, e.g. smooth muscle cells (SMCs) or fibroblasts.
The chamber and all parts of the circuit are easily sterilized with steam autoclaving. In contrast to other chambers, e.g. microfluidic chambers, large numbers of cells (&gt; 1 million depending on cell size) can be recovered after the flow experiment under sterile conditions for cell culture or other experiments, e.g. DNA or RNA extraction, or immunohistochemistry (Fig. 11E), or scanning electron microscopy5. The shear stress can be adjusted by varying the flow rate of the perfusate, the fluid viscosity, or the channel height and width. The latter can reduce fluid volume or cell needs while ensuring that one-dimensional flow is maintained. It is not necessary to measure chamber height between experiments, since the chamber height does not depend on the use of gaskets, which greatly increases the ease of multiple experiments. Furthermore, the circuit design easily enables the collection of perfusate samples for analysis and/or quantification of metabolites secreted by cells under fluid shear stress exposure, e.g. nitric oxide (Fig. 12)6.

We are describing a method to subject adherent cells to laminar flow shear stress in a sterile continuous flow circuit. The cells' adhesion, morphology can be studied through the transparent chamber, samples obtained from the circuit for metabolite analysis and cells harvested after shear exposure for future experiments or culture.

موازية لوحة الدائرة التدفق المستمر وحلبة لتقييم تدفق الخلايا الاصلية تحت تدفق رقائقي غشائي إجهاد القص

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling in the tumor microenvironment 1. Previously, research on the tumor microenvironment has focused primarily on tumor-stromal interactions 1-2. However, the tumor microenvironment also includes a variety of biophysical forces, whose effects remain poorly understood. These forces are biomechanical consequences of tumor growth that lead to changes in gene expression, cell division, differentiation and invasion3. Matrix density 4, stiffness 5-6, and structure 6-7, interstitial fluid pressure 8, and interstitial fluid flow 8 are all altered during cancer progression.
Interstitial fluid flow in particular is higher in tumors compared to normal tissues 8-10. The estimated interstitial fluid flow velocities were measured and found to be in the range of 0.1-3 &mu;m s-1, depending on tumor size and differentiation 9, 11. This is due to elevated interstitial fluid pressure caused by tumor-induced angiogenesis and increased vascular permeability 12. Interstitial fluid flow has been shown to increase invasion of cancer cells 13-14, vascular fibroblasts and smooth muscle cells 15. This invasion may be due to autologous chemotactic gradients created around cells in 3-D 16 or increased matrix metalloproteinase (MMP) expression 15, chemokine secretion and cell adhesion molecule expression 17. However, the mechanism by which cells sense fluid flow is not well understood. In addition to altering tumor cell behavior, interstitial fluid flow modulates the activity of other cells in the tumor microenvironment. It is associated with (a) driving differentiation of fibroblasts into tumor-promoting myofibroblasts 18, (b) transporting of antigens and other soluble factors to lymph nodes 19, and (c) modulating lymphatic endothelial cell morphogenesis 20.
The technique presented here imposes interstitial fluid flow on cells in vitro and quantifies its effects on invasion (Figure 1). This method has been published in multiple studies to measure the effects of fluid flow on stromal and cancer cell invasion 13-15, 17. By changing the matrix composition, cell type, and cell concentration, this method can be applied to other diseases and physiological systems to study the effects of interstitial flow on cellular processes such as invasion, differentiation, proliferation, and gene expression.

Interstitial fluid flow is elevated in solid tumors and can modulate tumor cell invasion. Here we describe a technique to apply interstitial fluid flow to cells embedded in a matrix and then measure its effects on cell invasion. This technique can be easily adapted to study other systems.

نموذج ثلاثي الأبعاد للخلية ثقافة قياس آثار تدفق السائل الخلالي على غزو الخلايا السرطانية

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. Polyps and nodules, which are geometric abnormalities that form on the medial surface of the vocal folds, can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Our laboratory has reported particle image velocimetry (PIV) measurements, within an investigation of a model polyp located on the medial surface of an in&#160;vitro driven vocal fold model, which show that such a geometric abnormality considerably disrupts the glottal jet behavior. This flow field adjustment is a likely reason for the severe degradation of the vocal quality in patients with polyps. A more complete understanding of the formation and propagation of vortical structures from a geometric protuberance, such as a vocal fold polyp, and the resulting influence on the aerodynamic loadings that drive the vocal fold dynamics, is necessary for advancing the treatment of this pathological condition. The present investigation concerns the three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted prolate hemispheroid with a 2:1 aspect ratio in cross flow, i.e. a model vocal fold polyp, using an oil-film visualization technique. Unsteady, three-dimensional flow separation and its impact of the wall pressure loading are examined using skin friction line visualization and wall pressure measurements.

Vocal fold polyps can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted model polyp and its impact on the wall pressure loading are examined using particle image velocimetry, skin friction line visualization, and wall pressure measurements.

التحقيق في فصل التدفق ثلاثي الأبعاد الناجم عن نموذج بوليب أضعاف الصوتية

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

الغضروف الإنسان الأنسجة التصنيع باستخدام ثلاثي الأبعاد تكنولوجيا الطباعة النافثة للحبر

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury leading to permanent pathological damage. Existing conventional assays allow the analysis of leukocyte adhesion molecules only after the extraction of leukocytes from the blood. This requires the blood to undergo several steps before peripheral blood leukocytes (PBLs) can be ready for analysis, which in turn can stimulate PBLs influencing the research findings. The autoperfused micro flow chamber assay, however, allows scientists to study early leukocytes functional dysregulation using the systemic flow of a live mouse while having the freedom of manipulating a coated chamber. Through a disease model, the functional expression of leukocyte adhesion molecules can be assessed and quantified in a micro-glass chamber coated with immobilized endothelial adhesion molecules ex vivo. In this model, the blood flows between the right common carotid artery and left external jugular vein of a live mouse under anesthesia, allowing the interaction of native PBLs in the chamber. Real-time experimental analysis is achieved with the assistance of an intravital microscope as well as a Harvard Apparatus pressure device. The application of a flow regulator at the input point of the glass chamber allows comparable physiological flow conditions amongst the experiments. Leukocyte rolling velocity is the main outcome and is measured using the National Institutes of Health open-access software ImageJ. In summary, the autoperfused micro flow chamber assay provides an optimal physiological environment to study leukocytes endothelial interaction and allows researchers to draw accurate conclusions when studying inflammation.

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Here, we present a protocol that allows the investigator to assess leukocyte recruitment dynamics ex vivo by connecting a chamber coated with endothelial-derived adhesion molecules to the circulatory system of a mouse. This method offers significant advantages since it allows for leukocyte assessment under relative biological conditions.

تقييم التفاعلات الكريات البيض البطانية تحت ظروف التدفق في<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; الفحص Autoperfused غرفة Microflow

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards vascular disease pathologies. Unhealthy arteries often present with wall stiffening, scarring, or partial stenosis which may all affect fluid flow rates, and the magnitude of pulsatile flow, or pulsatility index. Replication of various flow conditions is the result of tuning a flow pressure damping chamber downstream of a blood pump. Introduction of air within a closed flow system allows for a compressible medium to absorb pulsatile pressure from the pump, and therefore vary the pulsatility index. The method described herein is simply reproduced, with highly controllable input, and easily measurable results. Some limitations are recreation of the complex physiological pulse waveform, which is only approximated by the system. Endothelial cells, smooth muscle cells, and fibroblasts are affected by the blood flow through the artery. The dynamic component of blood flow is determined by the cardiac output and arterial wall compliance. Vascular cell mechano-transduction of flow dynamics may trigger cytokine release and cross-talk between cell types within the artery. Co-culture of vascular cells is a more accurate picture reflecting cell-cell interaction on the blood vessel wall and vascular response to mechanical signaling. Contribution of flow dynamics, including the cell response to the dynamic and mean (or steady) components of flow, is therefore an important metric in determining disease pathology and treatment efficacy. Through introducing an in vitro co-culture model and pressure damping downstream of blood pump which produces simulated cardiac output, various arterial disease pathologies may be investigated.

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

This protocol replicates physiological or pathological blood flow in vitro to aid in determining cell response in disease pathologies. By introducing a pressure damping chamber downstream of a blood pump, blood flow across the vasculature can be recapitulated and imposed on a monolayer of vascular endothelium or a mimetic co-culture.

في المختبر نموذج الفسيولوجية والمرضية تدفق الدم مع التطبيق على التحقيقات الأوعية الدموية إعادة عرض خلية

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper presents a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device capable of generating water/oil/water double emulsions using a coaxial flow focusing geometry that can be fabricated entirely using soft lithography. Similar to emulsion devices using glass capillaries, double emulsions can be formed in channels with uniform wettability and with dimensions much smaller than the channel sizes. Three dimensional flow focusing geometry is achieved by casting a pair of PDMS slabs using two layer soft lithography, then mating the slabs together in a clamshell configuration. Complementary locking features molded into the PDMS slabs enable the accurate registration of features on each of the slab surfaces. Device testing demonstrates formation of double emulsions from 14 &#181;m to 50 &#181;m in diameter while using large channels that are robust against fouling and clogging.

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

Microfluidic double emulsions generation typically involves devices with patterned wettability or custom-fabricated glass components. Here we describe the fabrication and testing of an all polydimethylsiloxane (PDMS) double emulsion generator that does not require surface treatment or complicated fabrication processes, and is capable of producing double emulsions down to 14 &#181;m.

ضعف مستحلب الجيل باستخدام Polydimethylsiloxane (PDMS) المشارك المحوري تدفق التركيز الأجهزة

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

تطوير عضوي نموذج متعددة الخلايا ثلاثي الأبعاد من الأمعاء الغشاء المخاطي الإنسان نمت في ظل الجاذبية

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as atomic force microscopy have limited temporal resolution, while F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) only allow conformations to be inferred. Fluorescence microscopy, on the other hand, allows real-time in situ visualization of single molecules in various flow conditions. Our protocol describes the steps to capture conformational changes of single biomolecules under different shear flow environments using fluorescence microscopy. The shear flow is created inside microfluidic channels and controlled by a syringe pump. As demonstrations of the method, von Willebrand factor (VWF) and lambda DNA are labeled with biotin and fluorophore and then immobilized on the channel surface. Their conformations are continuously monitored under variable shear flow using total internal reflection (TIRF) and confocal fluorescence microscopy. The reversible unraveling dynamics of VWF are useful for understanding how its function is regulated in human blood, while the conformation of lambda DNA offers insights into the biophysics of macromolecules. The protocol can also be widely applied to study the behavior of polymers, especially biopolymers, in varying flow conditions and to investigate the rheology of complex fluids.

We present a protocol for immobilizing single macromolecules in microfluidic devices and quantifying changes in their conformations under shear flow. This protocol is useful for characterizing the biomechanical and functional properties of biomolecules such as proteins and DNA in a flow environment.

توصيف التغيرات التشكيلية أحادية الجزيء تحت تدفق القص مع المجهر الفلوري

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...