אנו מודים לצ&#39;אק סקוט מק &#39;נייט מויקטור והלשכה מרכזית לסטטיסטיקה המדעית החברה Inc <a href="http://www.cbsscientific.com/" target="_blank">(www.cbsscientific.com)</a> לקבלת סיוע, הנדסה וייצור של חדר 3D, יחידת חילוף גזים, ומוסיף. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומי לבריאות (מענקי R21DK067084 וR43CA141782 לSKK).

1. הכן את הוספת העליונה ותחתונה לצמיחה תאי ציפוי על ידי קולגן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את מספר מוסיף דרושים לניסוי. הנח להכניס כל אחד בצלחת פטרי סטרילית נפרדת (35 x 10 מ&quot;מ) ולעקר על ידי הקרנה (11 Gy). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון קולגן לציפוי של ממברנות: 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל, 154 μl לכל כנס (להוסיף שטח פנים 1.54 ס&quot;מ 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כמה טיפות (~ 20 μl לכל טיפה) של פתרון קולגן במעגל על ​​פני השטח של הקרום להוסיף (אל תיתן לקצה פיפטה לגעת במשטח) ולאחר מכן להוסיף את שאר aliquot בקפידה כדי ליצור טיפה אחת גדולה על משטח הממברנה. ודא שפתרון קולגן נשאר חצי כדור ולא ניקוז מהמשטח הממברנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את צלחת פטרי עם מכסה והדגירה במשך שעת 1 בטמפרטורת חדר על משטח שטוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון קולגן ולשטוף את הממברנה פעם אחת על ידי כיסוי עם 160 PBS μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ASPIRAte PBS ולהחליף את המכסה. אם אתה משתמש באותו היום, הנח את צלחת פטרי במקום יבש בטמפרטורת חדר. אחרת, מניח את הצלחת על 4 מעלות צלזיוס ולהשתמש להכניס בתוך 7 ימים. </li></ol> 2. תאי האנדותל תרבות על הוספת העליונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן השעיה EC במדיום התרבות רצויה. להבטיח כי כדאיות התא היא&gt; 98% ולהשתמש באופן מיידי. </li></ol> הערה: אדם טבור וריד EC (HUVEC), 4 משמש x 10 5 תאים ב160 μl לכל כנס. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את צלחות פטרי עם מוסיף קולגן מצופים שהוכן בסעיף 1; לא להסיר את מוסיף מהכלים. מניחים כמה טיפות קטנות של ההשעיה התא (כ -20 μl לטיפה) במעגל על ​​פני השטח של קרום קולגן המצופה (לא נותן מגע קצה פיפטה פני השטח) ולאחר מכן להוסיף את שאר ההשעיה התא כדי ליצור זהירות טיפה אחת גדולה. להבטיח כי ההשעיה התא נשארת Hemis<html> pherical ולא ניקוז מהמשטח הממברנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את המכסים ומניחים בזהירות את הכלים ב5% CO 2 תא תרבות חממת דגירה (בלי ללחוץ) על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות על מנת לאפשר לתאים לצרף את הקרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להוסיף 5 מ&quot;ל של מדיום תרבות לכל צלחת פטרי להבטיח שההוספה נשארה בתחתית הצלחת ומכוסית לחלוטין על ידי המדיום. החלף את המכסים ובזהירות הניח את הכלים בחזרה בחממה. תרבות התאים ב 37 ° C במשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באותה גישה כדי להכין את הכנס השני (אופציונלי) נמוך יותר עם תאים המייצגים את microenvironment המקומי, אשר יהיה ממוקם מתחת להוספה המכילה שכבת EC. </li></ol> הערה: אם את מוסיף הנמוך נכללים בניסויים, מוסיף העליון ותחתון ראשונה הם מחוברים זה לזה לפני הצבת מחדירה לתוך מכשיר 3D (איור 4). דואר &quot;&gt; 3. להרכיב את מכשיר תזרים לשכת 3D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדפוק ביחד את הצלחות העליונות ותחתונות, לחבר את הצלחות ליחידת חילופי הגז באמצעות צינורות, הצב את המכשיר התאסף לתוך שקית פלסטיק נקי, ולעקר את התיק ותכולתו על ידי ההקרנה (11 Gy). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מגש מדף מתא תרבות החממה, המקום לברדס רקמת סטרילית תרבות, תרסיס עם 70% אתנול, נגב את, ואז לכסות את המגש עם מפית סטרילי גדולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את שקית הניילון המוקרנת למכסת המנוע, הסר את ההתקן מהשקית ומניח על מגש החממה סטרילית. לחבר את המכשיר למשאבת peristaltic עם צינורות שסופקו. תכנית המשאבה למהירות אופטימלית של 0.2 מ&quot;ל / דקה. </li></ol> הערה: כדי להתחבר עם שקע חשמל המשאבה, extrude חוט החשמל דרך החור בישבן של החממה. השתמש בתוסף שודד סביב החוט כדי להבטיח כי החור הוא אטום. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li&gt; מקום 7 - 5 מ&quot;ל של מדיום התרבות רצויה לתוך צינור סטרילי 15 מ&quot;ל (עבור &quot;הכניסה&quot;). </li></ol> 4. ראש התקני תזרים לשכת 3D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתק את צינורות היניקה מהשקע על ידי משיכת מחט המתכת מהצינורות (השתמש מפיות סטריליות קטנות כדי לשמור על סטריליות של הצינור). השתמש במחט המתכת המחוברת לצינורות כמו &quot;כניסה&quot; וסופו של דבר נותק מצינורות כמו &quot;שקע&quot;. הנח את כניסת מחט המתכת לתוך שפופרת 15 מ&quot;ל עם התקשורת; למקם את השקע לתוך שפופרת 15 מ&quot;ל הריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המשאבה כך הזרימה נגד כיוון השעון ולהגדיר את קצב הזרימה ב0.2 מ&quot;ל / דקה. אפשר ללחץ השלילי לצייר בינוני מצינור הכניסה 15 מ&quot;ל לתוך צינורות ולהפסיק את המשאבה כאשר בינונית מגיע לסוף הצינור באופן מיידי לפני שהוא מתחבר למכשיר (איור 2, עצירת # 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הברג החוצה את הצלחות העליונות ותחתונות של המכשיר. להסיר את הצלחת העליונה ומקום 1,500 זהירות - 1,550 μl של Mediאום (או מדיום לבד או בתוספת כמוקינים הניסיוניים) לתוך הבארות הנמוכות יותר. ודא גם מכיל בינונית מספיק כדי ליצור חצי כדור שמגיע לכ 1 - 2 מ&quot;מ מעל הצלחת נמוכה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התותב שהוכן מצלחת פטרי לבארות של הצלחת התחתונה באמצעות מלקחיים סטריליות, ולוודא כי אין בועות לכודות מתחת למוסיף. לשאוב כל מדיום שמופיע על פני השטח של הצלחת התחתונה על מנת להבטיח את הצלחת שנשארה יבשה. מניחים את צלחת גב העליונה לצלחת התחתונה ולהתחבר מחדש את הצלחות באמצעות הברגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להפעיל את משאבת peristaltic ולאפשר מדיום לזרום דרך מכשיר 3D. לרומם את סוף היציאה של המכשיר ולשמור את החדר במצב זה כדי למנוע היווצרות של בועות בתוך החלל בין הלוחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר את המדיום כדי למלא את החדר ואת צינורות המחבר את התא ליחידת חילוף הגזים. להפסיק את המשאבה מייד לפני בינוני מגיע לדואר הגזיחידת Xchange (איור 2; תפסיק # 2). מקום 3 מ&quot;ל של מדיום ליחידת חילוף הגזים, להפעיל את המשאבה, ולאפשר לבועות האוויר כדי לברוח באמצעות יחידת חילוף הגזים. לרומם את יחידת חילוף הגזים כדי לאפשר את המדיום כדי למלא את צינור יציאה מיחידת חילוף הגזים ולעצור את המשאבה כאשר מגיע בינונית 2 - 3 ס&quot;מ לפני סוף הצינור מוצא (איור 2, עצירת # 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את מחט מתכת הכניסה לפורקן באמצעות מפיות סטריליות קטנות. לתכנת מחדש את המשאבה, כך שהתזרים הבינוני בכיוון ההפוך (בכיוון השעון) לעבר יחידת חילוף הגזים ולוודא שכל בועות אוויר יוסרו ברגע שהם מגיעים ליחידת חילוף הגזים. בדוק שלא יישארו בועות אוויר במערכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתכנת מחדש את המשאבה כל כך בינוני תזרימי נגד כיוון השעון. הוסף 100 μl של ההשעיה תא הבדיקה ליחידת חילוף הגזים. סגור את המכסה של יחידת חילוף הגזים, הנח את המגש עם החלק האחורי עובד המערכת לתוך החממה, ולאפשר לתאים לבדיקת circulatדואר במכשיר 3D על 37 מעלות צלזיוס למשך הזמן הרצוי. </li></ol> שים לב: יש לנקות את חוט החשמל של המשאבה של 70% אתנול ולמקם אותו בתוך החממה. 5. לסיים את המבחן ולאסוף דגימות עבור assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המגש עם מערכת העבודה מהחממה והמקום במכסת המנוע. להפסיק את המשאבה, נתק את הכניסה ויציאה, ומקם את הקצוות לתוך צינורות 15 מ&quot;ל סטרילי ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המשאבה ולאסוף את ההשעיה התא מהמערכת; מקום ההשעיה התא על קרח, במקרים מתאימים, עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרק את התא על ידי הסרת הברגים ומרים את הצלחת העליונה. הסר את מוסיף מהצלחת התחתונה ולהעביר אותם לצלחות פטרי. </li></ol> הערה: יכול להיות מוכתם מחדיר לדמיין ולספור תאים באתרו (סגול גביש 0.05% ב DH 2 O) או trypsinized לאסוף EC לעוד יותרבדיקות. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום ותאים מהבארות הנמוכות לתוך צינורות וצנטריפוגות במשך 5 דקות ב 210 x גרם. הסר את supernatant, לשטוף וresuspend התאים המועדפים, ולעבד את התאים בהתאם למטרות הניסוי הספציפיות (נדון בהמשך). </li></ol>

<ol>
	<li>Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+and+perils+of+stem+cell+therapeutics.">The promise and perils of stem cell therapeutics.</a> Cell Stem Cell. 10, 740-749 (2012).</li><li>Khaldoyanidi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+stem+cell+homing.">Directing stem cell homing.</a> Cell Stem Cell. 2, 198-200 (2008).</li><li>Laird, D. J., von Andrian, U. H., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+trafficking+in+tissue+development,+growth,+and+disease.">Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease.</a> Cell. 132, 612-630 (2008).</li><li>Lapidot, T., Kollet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain-bone-blood+triad:+traffic+lights+for+stem-cell+homing+and+mobilization.">The brain-bone-blood triad: traffic lights for stem-cell homing and mobilization.</a> Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2010, 1-6 (2010).</li><li>Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoengineering+of+HCELL,+the+human+bone+marrow+homing+receptor:+sweetly+programming+cell+migration.">Glycoengineering of HCELL, the human bone marrow homing receptor: sweetly programming cell migration.</a> Ann. Biomed. Eng. 40, 766-776 (2012).</li><li>Smart, N., Riley, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stem+cell+movement.">The stem cell movement.</a> Circ. Res. 102, 1155-1168 (2008).</li><li>Khaldoyanidi, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MDA-MB-435+human+breast+carcinoma+cell+homo-+and+heterotypic+adhesion+under+flow+conditions+is+mediated+in+part+by+Thomsen-Friedenreich+antigen-galectin-3+interactions.">MDA-MB-435 human breast carcinoma cell homo- and heterotypic adhesion under flow conditions is mediated in part by Thomsen-Friedenreich antigen-galectin-3 interactions.</a> J. Biol. Chem. 278, 4127-4134 (2003).</li><li>Le Devedec, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Intravital+Multicolour+Imaging+to+Study+Metastatic+Behaviour+of+Cancer+Cells+in+vivo.">Two-Photon Intravital Multicolour Imaging to Study Metastatic Behaviour of Cancer Cells in vivo.</a> Methods Mol. Biol. 769, 331-349 (2011).</li><li>Barakat, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responsiveness+of+vascular+endothelium+to+shear+stress:+potential+role+of+ion+channels+and+cellular+cytoskeleton+(review).">Responsiveness of vascular endothelium to shear stress: potential role of ion channels and cellular cytoskeleton (review).</a> Int. J. Mol. Med. 4, 323-332 (1999).</li><li>Fisher, A. B., Chien, S., Barakat, A. I., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cellular+response+to+altered+shear+stress.">Endothelial cellular response to altered shear stress.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281, L529-L533 (2001).</li><li>Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+force+and+its+effect+on+cell+structure+and+function.">Shear force and its effect on cell structure and function.</a> ASGSB Bull. 4, 87-94 (1991).</li><li>Topper, J. N., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+flow+and+vascular+gene+expression:+fluid+shear+stress+as+a+modulator+of+endothelial+phenotype.">Blood flow and vascular gene expression: fluid shear stress as a modulator of endothelial phenotype.</a> Mol. Med. Today. 5, 40-46 (1999).</li><li>Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+and+adhesion+of+human+tumor+cells+on+vascular+endothelium+under+physiological+flow+conditions.">Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions.</a> J. Clin. Invest. 92, 3038-3044 (1993).</li><li>Cinamon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chemokine+functions+in+lymphocyte+migration+through+vascular+endothelium+under+shear+flow.">Novel chemokine functions in lymphocyte migration through vascular endothelium under shear flow.</a> J. Leukoc. Biol. 69, 860-866 (2001).</li><li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+progenitor+cell+rolling+in+bone+marrow+microvessels:+parallel+contributions+by+endothelial+selectins+and+vascular+cell+adhesion+molecule+1.">Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1.</a> J. Exp. Med. 188, 465-474 (1998).</li><li>Arber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft+source+determines+human+hematopoietic+progenitor+distribution+pattern+within+the+CD34(+)+compartment.">Graft source determines human hematopoietic progenitor distribution pattern within the CD34(+) compartment.</a> Bone Marrow Transplant. 46, 650-658 (2012).</li><li>Fuji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+blood+as+a+preferable+source+of+stem+cells+for+salvage+transplantation+in+patients+with+graft+failure+after+cord+blood+transplantation:+a+retrospective+analysis+of+the+registry+data+of+the+Japanese+Society+for+Hematopoietic+Cell+Transplantation.">Peripheral blood as a preferable source of stem cells for salvage transplantation in patients with graft failure after cord blood transplantation: a retrospective analysis of the registry data of the Japanese Society for Hematopoietic Cell Transplantation.</a> Biol. Blood Marrow Transplant. 18, 1407-1414 (2012).</li><li>Haspel, R. L., Miller, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells:+source+matters.">Hematopoietic stem cells: source matters.</a> Curr. Stem Cell Res. Ther. 3, 229-236 (2008).</li><li>Schraufstatter, I. U., Discipio, R. G., Zhao, M., Khaldoyanidi, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C3a+and+C5a+are+chemotactic+factors+for+human+mesenchymal+stem+cells,+which+cause+prolonged+ERK1/2+phosphorylation.">C3a and C5a are chemotactic factors for human mesenchymal stem cells, which cause prolonged ERK1/2 phosphorylation.</a> J. Immunol. 182, 3827-3836 (2009).</li></ol>

אשד LifeSciences בע&quot;מ בעל זכויות בלעדיות בארה&quot;ב פטנט מס &#39;7,927,867 B2 &quot;מכשיר להערכה בנדידת תאים במבחנה בתנאי זרימה ושיטות לשימושים ממנו&quot;. SKK הוא ממציא של טכנולוגית מכשיר תא זרימת 3D והמייסד מדעי ובעל מניות של אשד LifeSciences בע&quot;מ

extravasation התא הוא תהליך שבו תאים במחזור הדם ולצאת מהוא רכיב קריטי של תגובות פיסיולוגיות רבות בגוף. התהליך חשוב גם להתחדשות רקמות, כמו למשל, כאשר תאים טיפוליים גויסו מרקמות לתוך כלי הדם (או הזרקה תוך ורידית) נודדים דרך כלי הדם ולצאת ממחזור הדם לאתרים של פציעה או ניוון. Extravasation הוא גם מרכיב קריטי של פתוגנזה של מחלות רבות, כולל דלקת, דחייה של מערכת חיסון, אוטואימוניות, וגרורות גידול. Extravasation הוא תהליך רב שלבים מורכבים שכרוכים באינטראקציה של מחזורי תאים עם תאי האנדותל (EC) בתנאים של זרימה פיזיולוגית. התהליך מורכב (א) מתגלגל תא, (ב) הידבקות חברה אל פני השטח luminal של EC, ו (ג) על פני גלגול EC. חשוב מכך, כל צעד של מפל extravasation מוסדר על ידי קבוצת משנה של גell מולקולות מינים ספציפי סוג ספציפי ו. עם זאת, המנגנונים המולקולריים המפורטים המסדירים extravasation של תת תא ספציפי אינם מובנה היטב, בעיקר בשל הקושי הטכני של משחזר את התנאים בדם. מכשיר 3D הרומן מתואר כאן נועד להתגבר על האתגרים טכניים אלה ולאפשר ניסויים שיש לבצע שישפרו את ההבנה של הביולוגיה של נדידת תאים שלנו. המולקולות שמתווכות נדידת תאים הן מטרות טיפוליות חשובות. הבנה מפורטת של האירועים המולקולריים השולטים בהגירה של תאים מסוגים ספציפיים תסייע בזיהוי מטרות חדשות לקידום הטיפולי או העיכוב של extravasation. לדוגמה, התערבויות המשפרות את הנדידה של תאי גזע טיפוליים (בין אם נובעים מרקמות עובר למבוגרים, ילוד או אפילו מ) לכיוון אתרים של פציעה או ניוון תהיה תועלת רבה בהתחדשות רקמות.יש עניין גובר והולך בדור במבחנה של תאי גזע טיפוליים, כוללים תאים שמקורם ממקורות, וpluripotent בתאים לשעבר vivo מניפולציות גזע בוגרים (הרחיב, מניפולציות גנטית, וpretreated עם אנזימים שונים) 1. לפיכך, יש צורך בטכנולוגיות חדישות כדי להעריך את איכותם של תאי גזע לפני שהם משמשים למטרות טיפוליות. בין פרמטרים אחרים, התאים חייבים להיות מסוגלים לצאת ממחזור הדם בצורה יעילה, מפני שטיפולים בהפרעות multifocal עשויים לדרוש עירוי לוריד של תאי הגזע 2. ואכן, אחד האתגרים הנוכחיים בביולוגיה של תאי גזע הוא להתגבר על היעילות הנמוכה ביותר שבה תאי גזע לאתרי הבית של נזק לרקמות 3-6, המדגיש את הצורך להתייחס לפער הזה בהבנה של נדידת תאי גזע שלנו. בניגוד לכך, אסטרטגיות שנדידת תאי בלוק על ידי מיקוד מולקולות ביות ספציפית תהיה שימושית לטיפול במחלות אוטואימוניות וflammatory כמו גם סרטן גרורתי. לפיכך, הבנת המנגנונים המולקולריים המתווכים את יחסי הגומלין בין תאים במחזור ו-EC במהלך נדידת תאים וextravasation היא רלוונטית לרפואת translational וגילוי תרופות, כמו גם למדע בסיסי. כרגע יש מספר השיטות זמינות כדי ללמוד היבטים של נדידת תאים שונים. עם זאת, יש שיטות אלה ליקויים שניתן להתגבר עם מכשיר 3D החדש. מודלים של בעלי חיים: מודלים של בעלי חיים כמו עכברי מדוכאי חיסון ועכברים מניפולציות גנטית, היו כלים שימושיים ללימודי ההגירה של תאים אנושיים in vivo. עם זאת, חסרון משמעותי אחד למודלים אלו הוא שתאים אנושיים אינטראקציה גרועה עם מולקולות הדבקה בהווה על העכבר EC, בין השאר בשל הבדלי רצף מינים ספציפיים במולקולות רבות משטח סלולרי. לפיכך, השימוש במכרסמים ללמודנדידת תאים אנושית היא לא סבירה כדי לשקף אותנטי לאירועים במיטות כלי דם איבר ספציפי לאדם. בנוסף, במודלי vivo אינם מתאימים להקרנת תפוקה גבוהה של מועמדים לסמים. הקונבנציונלי במודלי vivo באמצעות ללמוד תא ביות אינו מבחין בין מדרגות מפל extravasation השונות, ולכן קשה לזהות ולמקד את פרודות ביות רומן. גישת מיקרוסקופיה intravital פותחה כדי לתת מענה לצורך זה וכבר הסביר, עם זאת, טכניקה זו היא בזמן ומאוד עתיר עבודת 7,8. מבחני גלגול סטטי: Transwell או הגירת וידן קאמרית מבחני מדד תא על פני קרום ונקבובי נמצאים בשימוש נרחב בלימודי הגירה. יש assay יתרון שניתן להשתמש בו כדי ללמוד לא רק תנועתיות תא ותא במטריצה ​​תאית (ECM) אינטראקציות, אלא גם הגירת chemokine בתיווך של תאיםפני monolayer EC גדלה על הקרומים נקבוביים. למרבה הצער, את הפנוטיפ והתפקוד של EC בתנאים סטטיים שונים באופן משמעותי מאלה שתחת זרימה פיזיולוגית 9,10. לפיכך, באירועים המתרחשים בchemotactic מבחני Transwell לא נאמנה לחקות את יחסי הגומלין בין תאים וEC נודדים תחת מאמץ גזירה. בנוסף, הצעד &quot;מתגלגל&quot; של מפל הביות, מה שמוסיף ממד נוסף של הסלקטיביות לתהליך הכולל, אינו מתרחש במבחני Transwell סטטיים. וכך, בעוד טכנולוגיה זו אינה מאפשרת הערכה כמותית של chemokine נדידת תאים בתיווך מול monolayer EC, הוא מוגבל על ידי חוסר היכולת שלו לספק את מאמץ הגזירה המחקה את זרימת דם בגוף חי. מבחני תחת לחץ גזירה: לחץ גזירת ול ידוע לשחק תפקיד חשוב בויסות תפקוד EC 9,10. כוחות גזירה לגרום להפעלה מהירה של מפלי איתות, transcגורמי ription, ועל ביטוי גנים בהפרש EC 11,12. מידע זה הוביל לפיתוח של הדור הבא של מבחני הדבקה - תאי זרימה למינרית מקבילים ונימים - ללמוד מתגלגל והדבקה של תאים לEC בתנאים של מאמץ גזירת 7,13. הגורם המגביל עבור מבחני אלה הוא שהם יכולים למדוד רק מתגלגלים והידבקות, אך אינו מבחין בין תא חסיד שילכו על מנת מתגלגל ותא חסיד כי הוא &quot;נעצר&quot; על monolayer EC ולא מתגלגל. יתר על כן, מבחני הללו אינם יכולים למדוד את ההגירה של תאים כלפי שיפוע chemokine. מספר דיווחים תארו את יכולתם של תאים חסיד לזחול מתחת monolayer EC גדל על שקופיות זכוכית בתנאים של זרימה 14. המגבלות לטכניקת זחילה זו כוללות: הוא מנתח רק מספר מוגבל של תאים, הוא שאינן כמותי, הוא מנתח את התא זוחל על המטריצה ​​וcelמשטח L אבל לא הגירה לכיוון שיפוע chemotactic, והיא אינו מאפשר לתאי transmigrated להיות מבודדים. וכך, למרות שassay זה יש את היתרון של יישום מאמץ גזירה לmonolayer EC, זה לא יכול לכמת הגירה של תאים כלפי שיפוע chemokine. טכנולוגיית 3D הרומן המתוארת כאן מתגברת על רבים מהחסרונות הללו על ידי שילוב של כוח גזירה (תא העליון) עם שיפוע chemokine סטטי (בתא תחתון) ומאפשרת הערכה כמותית של כל שלב ושלב של מפל extravasation (איור 1). יכול לשמש גם מכשיר לחקור כיצד crosstalk בין EC וmicroenvironment משפיע על יכולתו של האיחוד האירופי לתמוך extravasation של תאים במחזור. הפרוטוקול הבא מתאר את המתודולוגיה צעד האחרת צעד לשימוש במכשיר תא זרימת 3D.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PVC tubing (bore 1.42, wall 0.8)</td>
 <td>Watson-Marlow Limitid</td>
 <td>981.0142.000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3D Chamber</td>
 <td>C.B.S.Scientific</td>
 <td>FC-1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gas exchange unit</td>
 <td>C.B.S.Scientific</td>
 <td>FCR-1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inserts</td>
 <td>C.B.S.Scientific</td>
 <td>FCI-1005U</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagen Bovine,Type I</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>354231</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrochloric Acid 0.1M</td>
 <td>VWR</td>
 <td>BDH3200-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>14190</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HUVEC</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC- 2517</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EGM Bullet Kit (cc - 3121 &#38; cc - 4133)</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC - 3124</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin Neutralizing Solution</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC-5002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC-5012</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC-5024</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SDF-1</td>
 <td>R7D System</td>
 <td>460-SD</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Extracel Trial 2.5 Kit</td>
 <td>Glycosam Byosystems</td>
 <td>GS211</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fibronectin, human , nature</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>356008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-D-lysine</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>A-003-E</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BD Matrigel</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>354277</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Human Brain Microvascular Endothelial Cells</td>
 <td>ScienCell</td>
 <td>1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Endotelial Cell Medium (ECM) for brain cells</td>
 <td>ScienCell</td>
 <td>1001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypan Blue</td>
 <td>StemCells Tecnologies</td>
 <td>7050</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TNF-alfa, 10 &mu;g</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>PHC3015</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>VCAM-1, mouse anti-human, CD106-FITC</td>
 <td>Southern Bioteck</td>
 <td>9519-02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Propidium Iodide Staining Solutuion</td>
 <td>BD Pharmingen</td>
 <td># 556463</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Frozen Human Cord Blood CD34+ cells</td>
 <td>StemCell</td>
 <td>CB007F</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Frozen Human Cord Blood CD34+ cells</td>
 <td>Zenbio</td>
 <td>SER - CD34-F</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MethoCult GF M3434</td>
 <td>StemCells Tecnologies</td>
 <td>GFM3434</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse Methylcellulose complete media</td>
 <td>R&#38;D</td>
 <td>HSC007</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-Von Willibrand Factor antibody</td>
 <td>abcam</td>
 <td>C# ab11713</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petry dish (35 x 10 mm)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>CA25373-041</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml tubes</td>
 <td>VWR Fisher</td>
 <td>21008 - 918</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue culture flasks 75cm2</td>
 <td>VWR</td>
 <td>BD353136</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cristal violet</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>C-3886-25G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissecting forceps, curved</td>
 <td>VWR</td>
 <td>82027-384</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1,000 &mu;l Pipette tips</td>
 <td>VWR</td>
 <td>83007-380</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 - 200 &mu;l Pipette tips</td>
 <td>VWR</td>
 <td>37001-530</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Peristaltic pump</td>
 <td>Watson-Marlow Limitid</td>
 <td>403U/VM3</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a novel three-dimensional flow chamber device to study chemokine-directed extravasation of cells circulating under physiological flow conditions

Extravasation של מחזורי תאים מהדם ממלא תפקיד מרכזי בתהליכים פיסיולוגיים וpathophysiological רבים, לרבות גרורות ביות וגידול בתאי גזע. מכשיר תא הזרימה תלת ממדים (להלן מכשיר 3D) הוא רומן בטכנולוגית מבחנה המשחזר מאמץ גזירה פיסיולוגי ומאפשר לכל צעד של מפל extravasation התא לכימות. מכשיר 3D מורכב מתא עליון שבו התאים של עניין לזרום תחת מאמץ גזירה, ותא תחתון של בארות סטטי המכילות את chemoattractants של עניין. שני התאים מופרדים באמצעות מוסיף נקבובי מצופים monolayer של תאי האנדותל (EC). ניתן להציב הוספה שנייה אופציונלית עם תאי microenvironmental עניין מייד מתחת לשכבת EC. יחידה מאפשרת חילוף גזי המתח האופטימלי CO 2 להישמר ומספקת נקודת גישה להוסיף או למשוך תאים או תרכובות במהלךניסוי. תאי הבדיקה לזרום בתא עליון בלחץ הגזירה הרצויה (קצב זרימה) הנשלט על ידי משאבת peristaltic. בסופו של הניסוי, התאים במחזור והגרו נאספים לניתוח נוסף. ניתן להשתמש במכשיר 3D לבחון תא ומתגלגל על ​​הידבקות לEC תחת לחץ גזירה, גלגול בתגובה לchemokine הדרגתיים, התנגדות ללחץ גזירה, היווצרות אשכול והישרדות תא. בנוסף, הוספה השנייה אופציונלית מאפשרת את ההשפעות של crosstalk בין האיחוד האירופי ובתאי microenvironmental כדי להיבחן. יישומי translational של מכשיר 3D כוללים בדיקה של תרופות מועמדות שנדידת תאי היעד וחיזוי בהתנהגות vivo של תאים לאחר הזרקה תוך ורידית. לכן, מכשיר 3D הרומן הוא כלי תכליתי וזול כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים המתווכים extravasation הסלולרי.

עצם Murine מח נגזר קו EC STR-12 שגדל במוסיף עם 5 מיקרומטר נקבוביות. קצב צמיחת EC היה פיקוח תחת מיקרוסקופ וכאשר EC היו 100% ומחוברות, מוסיף הועברו לבארות בתא התחתון של מכשיר 3D. מייד לפני הצבת מוסיפה, הבארות של התא התחתון היו מלאות במדיום התרבות לבד (בקרה שלילית) או עם מדיום השלים עם תאים שמקורם גורם-1 סטרומה (SDF-1; 5 ng / ml ו50 ng / ml). לאחר מכן, הורכב מכשיר 3D וחדר היה מלא במדיום כפי שתואר בפרוטוקול. תאי הבדיקה להיות שהופץ בתא העליון של מכשיר שזה עתה נקצרו תאי מח עצם Murine (3.5 x 10 6 תאים לכל תא). לחץ גזירה מוגדרת של 0.8 dyn / 2 ס&quot;מ יושם על ידי קביעת מהירות משאבת peristaltic ב0.2 מ&quot;ל / דקה. המערכת עובד כולה הייתה ממוקמת אז ב5% CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס וcells הורשו להסתובב ולתקשר עם monolayer EC ל4 שעות. בתום הזמן הזה, את התאים במחזור נאספו, האולם היה מפורק, ומוסיפה הוסרו כפי שתואר בפרוטוקול. תאי transmigrated נקצרו מהבארות הנמוכות יותר, שטף, resuspended במדיום טרי, והועברו לתרבויות methylcellulose השלימו עם גורמי גדילת hematopoietic לתא (CFC) assay מושבה יוצרים (איור 3). כצפוי, מצאנו מספר גבוה יותר באופן משמעותי של CFC נדד על פני monolayer EC לבארות המכילות 50 ng / ml SDF-1 מאשר לבארות המכילות 5 ng / ml SDF-1 או בינונית בלבד. כפי שתוארנו קודם לכן, אף אחד מהנוכחי בטכניקות מבחנה זמינות ללמוד נדידת תאים מסוגל בודק את ההשפעה של microenvironment המקומי ביכולת של האיחוד האירופי לתמוך extravasation של תאים נודדים. כדי להמחיש איך זה יכול להיות מושג באמצעות מכשיר 3D, אנובדק extravasation של מחזורי תאי hematopoietic פני שכבה של האיחוד האירופי ובשכבה של תאי סטרומה מח עצם. לשם כך, הוספה (נמוכה יותר) שנייה המכילה שכבה של תאי סטרומה הייתה בצמוד להוספה העליונה המכילה את monolayer EC בצלחת נמוכה יותר (איור 4). הניסוי נערך לאחר מכן בוצע כפי שתואר לעיל ואת תאי transmigrated נקצרו מהבארות והספר. התוצאות הראו כי החדרה של שכבה נוספת של תאי סטרומה מתחת monolayer EC גדלה הגירה של תאי hematopoietic כלפי SDF-1 (איור 4) באופן משמעותי. ממצא זה עולה בקנה אחד עם הרעיון שmicroenvironment המקומי תורם לגיוס של מחזורי תאים לרקמה. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig1.jpg" /> <strong&gt; איור 1. מכשיר תא הזרימה 3D. : מכשיר 3D ההרמטי מורכב משני תאים מופרדים על ידי קרום נקבובי להחלפה (PM). EC גדלים על הקרום, אשר לאחר מכן יוצר מחסום בין התאים העליונים ותחתונים. לחצי גזירה מוגדרים מוחלים תא העליון של מכשיר 3D על ידי תקשורת המרוססת באמצעות משאבת peristaltic עירוי קבועה. תאים במחזור הם גם ללא אינטראקציה (NIC), מתקשרים עם EC transiently (&#39;רול&#39;; RC), או לדבוק בEC (AC). Subpopulation של תאים חסיד transmigrates פני שכבת EC לתא סטטי התחתון של המכשיר (TM) של B:. ציור מבט מלמעלה (פנל העליון) של מכשיר 3D. להציג החתך האופקי (פנל תחתון) מדגים את מיקומו של הקרום העליון (אדום), קרום התחתון (ירוק), ותחתית הבאר (כחול) C:. Isometriג תצוגה ממחישה את החלקים אינטגרליים של המכשיר: ארבעה ברגים, לחסום אקריליק עליון, חותם חדר עליון, עליון וקרומים נמוכים יותר, תחתון O-טבעת, ובלוק תחתון אקריליק 3-D: כן. תצלום של זרימת 3D תא מחובר למשאבת peristaltic ויחידת חילוף גזים. המערכת מורכבת בשכונת סטרילי ולאחר מכן הועברה לתא תרבות חממה. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig2.jpg" /> איור 2. ייצוג סכמטי של מערכת מכשיר 3D. הציור מציג את שלוש תחנות הנדרשות להרכיב את המערכת. מדיום התרבות נמשך מהכניסה על ידי לחץ השלילי שנוצר על ידי משאבת peristaltic. הזרימה של מדיום היא כבה בעצירת # 1 כדי לאפשר את מוסיף להיות מושם לתוך המכשיר. לאחר התא סגור, המשאבה היא switCHED שוב וחדר מתמלא באופן מיידי עם מדיום כדי למנוע התייבשות של התאים הגדלים במוסיף. תפסיקו # 2 מאפשר מדיום כדי להיות ממוקם ביחידת חילוף הגזים. תפסיק # 3 מאפשר הזרימה שעצרה לחיבור של הכניסה והיציאה. הזרימה יכולה להיות מופנה בכיוון השעון או נגד כיוון השעון כדי להסיר בועות אוויר באמצעות יחידת חילוף הגזים באמצעות מתג על המשאבה. <img alt="איור 3" fo:content-width="5.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig3.jpg" /> איור 3. המכשיר תומך 3D גלגול SDF-1 בתיווך של אבות היווצרות דם בתנאים של לחץ גזירה פיסיולוגי. : שלושה מכשירים (המכילות כל 3 בארות בתא התחתון) נאספו ולרוץ במקביל. בינוני לבד או בינונית המכיל SDF-1 בשעה 5 או 50 ng / ml נוסף לבארות התא התחתונות. Murine בותאי מח ne הורשו להסתובב בהתקנים עבור 4 שעות. לאחר מכן, היה מפורק כל מכשיר ואת התאים שtransmigrated כלפי SDF-1 (צהוב) נאספו מהבארות הנמוכות יותר, נספרו, ותרבית methylcellulose השלים עם גורמי גדילת hematopoietic (GF). ארבע עשרה ימים מאוחר יותר, במושבות היו קלע מתחת למיקרוסקופ B:. מספר אבות (תאי מושבה יוצרי, CFC) התאושש מהתאים התחתונים מוצגת כממוצע ± SD של שלוש בארות במצב. * P &lt;0.05. <img alt="איור 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig4.jpg" /> איור 4. ההשפעה של microenvironment על ​​יחסי גומלין בין תאי hematopoietic ותאי האנדותל. : האיור מציג את עמדתו של קרום נקבובי שני עם ST תרבותיfibroblasts רומאל (SF) מתחת הקרום העליון עם הנציבות האירופית. קיצורים אחרים כפי שתוארו עבור איור 1 א &#39;ב&#39;:.. קרום הנוסף (הוספה נמוכה יותר) במדע הבדיוני בתרבית הוכנס מתחת הקרום העליון C: שלושה מכשירים (המכילות כל אחד מהם 3 בארות) היו לרוץ במקביל. בינוני לבד או בינונית המכיל SDF-1 ב 50 ng / ml SDF-1 נוספה לבארות התא התחתונות. תאי הבקרה השליליים הושמטו SC, SDF-1, או שניהם. תאי מח עצם הורשו להסתובב במשך 4 שעות ב 37 ° C. לאחר מכן, היה מפורק כל מכשיר ואת תאי transmigrated נאספו מהבארות התא התחתונות ונספרו. מספר תאי transmigrated התאוששו מוצג כממוצע ± סטיית התקן של שלוש בארות במצב. * P &lt;0.05.

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions at JoVE.com

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

מכשיר תא הזרימה תלת ממדים הוא רומן<em&gt; במבחנה</em&gt; טכנולוגיה להערכה כמותית וצעד חכם של מפל extravasation של תאים במחזור בתנאים של לחץ גזירה פיסיולוגי. המכשיר לכן ממלא את צורך קריטי במחקרים בסיסיים, פרה, וקליניים של נדידת תאים.

התקן תזרים הלשכה תלת ממדי רומן ללמוד chemokine ביים-extravasation של תאים במחזור בתנאי זרימה פיסיולוגיים

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

a-novel-three-dimensional-flow-chamber-device-to-study-chemokine

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.3K Views.  Torrey Pines Institute for Molecular Studies. מכשיר תא הזרימה תלת ממדים הוא רומן במבחנה טכנולוגיה להערכה כמותית וצעד חכם של מפל extravasation של תאים במחזור בתנאים של לחץ גזירה פיסיולוגי. המכשיר לכן ממלא את צורך קריטי במחקרים בסיסיים, פרה, וקליניים של נדידת תאים.

Video: A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells behave differently when they are grown within a 3D extra-cellular matrix and also interact with other cells (1-5). Mouse models have been broadly utilized to study tissue morphogenesis in vivo. However mouse and human skin have significant differences in cellular architecture and physiology, which makes it difficult to extrapolate mouse studies to humans. Since melanocytes in mouse skin are mostly localized in hair follicles, they have distinct biological properties from those of humans, which locate primarily at the basal layer of the epidermis. The recent development of 3D human skin reconstruct models has enabled the field to investigate cell-matrix and cell-cell interactions between different cell types. The reconstructs consist of a "dermis" with fibroblasts embedded in a collagen I matrix, an "epidermis", which is comprised of stratified, differentiated keratinocytes and a functional basement membrane, which separates epidermis from dermis. Collagen provides scaffolding, nutrient delivery, and potential for cell-to-cell interaction. The 3D skin models incorporating melanocytic cells recapitulate natural features of melanocyte homeostasis and melanoma progression in human skin. As in vivo, melanocytes in reconstructed skin are localized at the basement membrane interspersed with basal layer keratinocytes. Melanoma cells exhibit the same characteristics reflecting the original tumor stage (RGP, VGP and metastatic melanoma cells) in vivo. Recently, dermal stem cells have been identified in the human dermis (6). These multi-potent stem cells can migrate to the epidermis and differentiate to melanocytes.

In this report, we describe the three-dimensional skin reconstruct model which mimics human skin in architecture and composition. Melanocyte physiology, melanoma progression and the fate of dermal stem cells have been investigated using the skin reconstruct model. The model is also useful as a preclinical tool for drug assessment.

עור תלת ממדי האדם לשחזר דגם: ככלי מחקר עור רגיל התקדמות מלנומה

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well quantifiable fluid shear stresses1.
Our flow chamber design and flow circuit (Fig. 1) contains a transparent viewing region that enables testing of cell adhesion and imaging of cell morphology immediately before flow (Fig. 11A, B), at various time points during flow (Fig. 11C), and after flow (Fig. 11D). These experiments are illustrated with human umbilical cord blood-derived endothelial progenitor cells (EPCs) and porcine EPCs2,3.
This method is also applicable to other adherent cell types, e.g. smooth muscle cells (SMCs) or fibroblasts.
The chamber and all parts of the circuit are easily sterilized with steam autoclaving. In contrast to other chambers, e.g. microfluidic chambers, large numbers of cells (&gt; 1 million depending on cell size) can be recovered after the flow experiment under sterile conditions for cell culture or other experiments, e.g. DNA or RNA extraction, or immunohistochemistry (Fig. 11E), or scanning electron microscopy5. The shear stress can be adjusted by varying the flow rate of the perfusate, the fluid viscosity, or the channel height and width. The latter can reduce fluid volume or cell needs while ensuring that one-dimensional flow is maintained. It is not necessary to measure chamber height between experiments, since the chamber height does not depend on the use of gaskets, which greatly increases the ease of multiple experiments. Furthermore, the circuit design easily enables the collection of perfusate samples for analysis and/or quantification of metabolites secreted by cells under fluid shear stress exposure, e.g. nitric oxide (Fig. 12)6.

We are describing a method to subject adherent cells to laminar flow shear stress in a sterile continuous flow circuit. The cells' adhesion, morphology can be studied through the transparent chamber, samples obtained from the circuit for metabolite analysis and cells harvested after shear exposure for future experiments or culture.

במקביל, צלחת תזרים לשכת ואת מעגל זרימה רציפה להערכת ובתאים אנדותל תחת מתח זרימה למינרית שאר

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling in the tumor microenvironment 1. Previously, research on the tumor microenvironment has focused primarily on tumor-stromal interactions 1-2. However, the tumor microenvironment also includes a variety of biophysical forces, whose effects remain poorly understood. These forces are biomechanical consequences of tumor growth that lead to changes in gene expression, cell division, differentiation and invasion3. Matrix density 4, stiffness 5-6, and structure 6-7, interstitial fluid pressure 8, and interstitial fluid flow 8 are all altered during cancer progression.
Interstitial fluid flow in particular is higher in tumors compared to normal tissues 8-10. The estimated interstitial fluid flow velocities were measured and found to be in the range of 0.1-3 &mu;m s-1, depending on tumor size and differentiation 9, 11. This is due to elevated interstitial fluid pressure caused by tumor-induced angiogenesis and increased vascular permeability 12. Interstitial fluid flow has been shown to increase invasion of cancer cells 13-14, vascular fibroblasts and smooth muscle cells 15. This invasion may be due to autologous chemotactic gradients created around cells in 3-D 16 or increased matrix metalloproteinase (MMP) expression 15, chemokine secretion and cell adhesion molecule expression 17. However, the mechanism by which cells sense fluid flow is not well understood. In addition to altering tumor cell behavior, interstitial fluid flow modulates the activity of other cells in the tumor microenvironment. It is associated with (a) driving differentiation of fibroblasts into tumor-promoting myofibroblasts 18, (b) transporting of antigens and other soluble factors to lymph nodes 19, and (c) modulating lymphatic endothelial cell morphogenesis 20.
The technique presented here imposes interstitial fluid flow on cells in vitro and quantifies its effects on invasion (Figure 1). This method has been published in multiple studies to measure the effects of fluid flow on stromal and cancer cell invasion 13-15, 17. By changing the matrix composition, cell type, and cell concentration, this method can be applied to other diseases and physiological systems to study the effects of interstitial flow on cellular processes such as invasion, differentiation, proliferation, and gene expression.

Interstitial fluid flow is elevated in solid tumors and can modulate tumor cell invasion. Here we describe a technique to apply interstitial fluid flow to cells embedded in a matrix and then measure its effects on cell invasion. This technique can be easily adapted to study other systems.

תלת מימדי תרבית תאים מודל למדידת השפעת זרימת הנוזל ביניים על הפלישה תאים סרטניים

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. Polyps and nodules, which are geometric abnormalities that form on the medial surface of the vocal folds, can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Our laboratory has reported particle image velocimetry (PIV) measurements, within an investigation of a model polyp located on the medial surface of an in&#160;vitro driven vocal fold model, which show that such a geometric abnormality considerably disrupts the glottal jet behavior. This flow field adjustment is a likely reason for the severe degradation of the vocal quality in patients with polyps. A more complete understanding of the formation and propagation of vortical structures from a geometric protuberance, such as a vocal fold polyp, and the resulting influence on the aerodynamic loadings that drive the vocal fold dynamics, is necessary for advancing the treatment of this pathological condition. The present investigation concerns the three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted prolate hemispheroid with a 2:1 aspect ratio in cross flow, i.e. a model vocal fold polyp, using an oil-film visualization technique. Unsteady, three-dimensional flow separation and its impact of the wall pressure loading are examined using skin friction line visualization and wall pressure measurements.

Vocal fold polyps can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted model polyp and its impact on the wall pressure loading are examined using particle image velocimetry, skin friction line visualization, and wall pressure measurements.

חקירת הפרדת הזרימה התלת מימדית הנגרמת על ידי מודל פוליפ קיפול ווקאלי

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

ייצור רקמת סחוס אנושי באמצעות שלושה ממדי הזרקת דיו טכנולוגיית הדפסה

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury leading to permanent pathological damage. Existing conventional assays allow the analysis of leukocyte adhesion molecules only after the extraction of leukocytes from the blood. This requires the blood to undergo several steps before peripheral blood leukocytes (PBLs) can be ready for analysis, which in turn can stimulate PBLs influencing the research findings. The autoperfused micro flow chamber assay, however, allows scientists to study early leukocytes functional dysregulation using the systemic flow of a live mouse while having the freedom of manipulating a coated chamber. Through a disease model, the functional expression of leukocyte adhesion molecules can be assessed and quantified in a micro-glass chamber coated with immobilized endothelial adhesion molecules ex vivo. In this model, the blood flows between the right common carotid artery and left external jugular vein of a live mouse under anesthesia, allowing the interaction of native PBLs in the chamber. Real-time experimental analysis is achieved with the assistance of an intravital microscope as well as a Harvard Apparatus pressure device. The application of a flow regulator at the input point of the glass chamber allows comparable physiological flow conditions amongst the experiments. Leukocyte rolling velocity is the main outcome and is measured using the National Institutes of Health open-access software ImageJ. In summary, the autoperfused micro flow chamber assay provides an optimal physiological environment to study leukocytes endothelial interaction and allows researchers to draw accurate conclusions when studying inflammation.

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Here, we present a protocol that allows the investigator to assess leukocyte recruitment dynamics ex vivo by connecting a chamber coated with endothelial-derived adhesion molecules to the circulatory system of a mouse. This method offers significant advantages since it allows for leukocyte assessment under relative biological conditions.

הערכת אינטראקציות יקוציט-האנדותל תחת תנאי זרימה ב<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Assay Autoperfused Microflow הקאמרי

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards vascular disease pathologies. Unhealthy arteries often present with wall stiffening, scarring, or partial stenosis which may all affect fluid flow rates, and the magnitude of pulsatile flow, or pulsatility index. Replication of various flow conditions is the result of tuning a flow pressure damping chamber downstream of a blood pump. Introduction of air within a closed flow system allows for a compressible medium to absorb pulsatile pressure from the pump, and therefore vary the pulsatility index. The method described herein is simply reproduced, with highly controllable input, and easily measurable results. Some limitations are recreation of the complex physiological pulse waveform, which is only approximated by the system. Endothelial cells, smooth muscle cells, and fibroblasts are affected by the blood flow through the artery. The dynamic component of blood flow is determined by the cardiac output and arterial wall compliance. Vascular cell mechano-transduction of flow dynamics may trigger cytokine release and cross-talk between cell types within the artery. Co-culture of vascular cells is a more accurate picture reflecting cell-cell interaction on the blood vessel wall and vascular response to mechanical signaling. Contribution of flow dynamics, including the cell response to the dynamic and mean (or steady) components of flow, is therefore an important metric in determining disease pathology and treatment efficacy. Through introducing an in vitro co-culture model and pressure damping downstream of blood pump which produces simulated cardiac output, various arterial disease pathologies may be investigated.

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

This protocol replicates physiological or pathological blood flow in vitro to aid in determining cell response in disease pathologies. By introducing a pressure damping chamber downstream of a blood pump, blood flow across the vasculature can be recapitulated and imposed on a monolayer of vascular endothelium or a mimetic co-culture.

במבחנה הדגם של פיזיולוגי ופתולוגיים זרימת דם עם בקשה לחקירות של שיפוץ תא דם

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper presents a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device capable of generating water/oil/water double emulsions using a coaxial flow focusing geometry that can be fabricated entirely using soft lithography. Similar to emulsion devices using glass capillaries, double emulsions can be formed in channels with uniform wettability and with dimensions much smaller than the channel sizes. Three dimensional flow focusing geometry is achieved by casting a pair of PDMS slabs using two layer soft lithography, then mating the slabs together in a clamshell configuration. Complementary locking features molded into the PDMS slabs enable the accurate registration of features on each of the slab surfaces. Device testing demonstrates formation of double emulsions from 14 &#181;m to 50 &#181;m in diameter while using large channels that are robust against fouling and clogging.

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

Microfluidic double emulsions generation typically involves devices with patterned wettability or custom-fabricated glass components. Here we describe the fabrication and testing of an all polydimethylsiloxane (PDMS) double emulsion generator that does not require surface treatment or complicated fabrication processes, and is capable of producing double emulsions down to 14 &#181;m.

זוגי אמולסיה דור שימוש בהתקן זרימת פוקוס Co-הצירית polydimethylsiloxane (PDMS)

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

פיתוח תאיים תלת ממד Organotypic דגם של אדם המעיים הריריים Grown במיקרוגרבטיציה

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as atomic force microscopy have limited temporal resolution, while F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) only allow conformations to be inferred. Fluorescence microscopy, on the other hand, allows real-time in situ visualization of single molecules in various flow conditions. Our protocol describes the steps to capture conformational changes of single biomolecules under different shear flow environments using fluorescence microscopy. The shear flow is created inside microfluidic channels and controlled by a syringe pump. As demonstrations of the method, von Willebrand factor (VWF) and lambda DNA are labeled with biotin and fluorophore and then immobilized on the channel surface. Their conformations are continuously monitored under variable shear flow using total internal reflection (TIRF) and confocal fluorescence microscopy. The reversible unraveling dynamics of VWF are useful for understanding how its function is regulated in human blood, while the conformation of lambda DNA offers insights into the biophysics of macromolecules. The protocol can also be widely applied to study the behavior of polymers, especially biopolymers, in varying flow conditions and to investigate the rheology of complex fluids.

We present a protocol for immobilizing single macromolecules in microfluidic devices and quantifying changes in their conformations under shear flow. This protocol is useful for characterizing the biomechanical and functional properties of biomolecules such as proteins and DNA in a flow environment.

אפיון מולקולה חד-מולקולות באמצעות זרימת הטיה במיקרוסקופיה פלואורסצנטית

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...