Biz CBS Bilimsel Company Inc (Chuck Scott ve Victor McKnight teşekkür <a href="http://www.cbsscientific.com/" target="_blank">www.cbsscientific.com</a> mühendislik yardım ve 3D odası, gaz değişimi ünitesi, ve ekler üretimi için). Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (hibe R21DK067084 ve R43CA141782 için SKK) tarafından desteklenmiştir.

1. Kollajen Kaplama ile Hücre Büyüme için Yukarı ve Aşağı Uçlar hazırlayın <ol><li> Deney için gerekli ekler sayısını hesaplayın. Ayrı bir steril Petri kabı (35 x 10 mm) her koyunuz ve radyoterapi (11 Gy) ile sterilize edin. </li><li> 50 mg / ml, uç başına 154 ul (yüzey alanı 1.54 cm 2 yerleştirin): membran kaplama için kollajen çözüm hazırlayın. </li><li> Ekleme membran (pipet yüzeyine izin vermeyin) yüzeyinde ve sonra dikkatlice üzerinde büyük bir damla oluşturmak için kısım geri kalanı ekleyin bir daire içinde kollajen çözüm birkaç damla (damla başına ~ 20 ul) yerleştirin membran yüzey. Kollajen çözüm yarım küre kalır ve membran yüzeyinden tahliye yok emin olun. </li><li> Bir kapak ile Petri kabı kapak ve düz bir yüzey üzerinde, oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> Kollajen çözüm aspire ve 160 ul PBS ile kaplayarak bir kez membran yıkayın. </li><li> Aspirasyonute PBS ve kapağı değiştirin. Aynı gün kullanıyorsanız, oda sıcaklığında kuru bir yerde Petri kabı yerleştirin. Aksi takdirde, 4 ° C de çanak yerleştirmek ve 7 gün içinde uç kullanın. </li></ol> 2. Üst ekler Kültür Endotel Hücreleri <ol><li> Istenilen kültür ortamında EC süspansiyonu hazırlayın. Hücre canlılığı&gt;% 98 olduğundan emin olun ve hemen kullanın. </li></ol> Not: insan umbilikal ven EC (HUVEC), 4 için uç başına 160 ul x 10 5 hücre kullanılır. <ol start="2"><li> Bölüm 1 hazırlanan kollajen kaplı ekler ile Petri kapları atın; yemekleri ekler çıkarmayın. Kollajen kaplı zar (pipet dokunmatik yüzey izin vermeyin) yüzeyi üzerinde bir daire içinde hücre süspansiyonu (damla başına yaklaşık 20 ul) çeşitli küçük damla koyun ve daha sonra dikkatli bir şekilde oluşturmak için hücre süspansiyonu geri kalanını ekleyin büyük bir damla. Hücre süspansiyonu Hemis kalmasını sağlamak<html> pherical ve membran yüzeyinden tahliye yok. </li><li> Kapakları değiştirin ve dikkatle hücreleri membran eklemek için izin 30 dakika 37 ° C&#39;de (sallayarak olmadan) bir% 5 CO 2 hücre kültürü inkübatör ve inkübe yemekleri yerleştirin. </li><li> Yavaşça eklemek çanak alt kalır ve tamamen orta ile kaplıdır sağlamak her Petri kabı kültür ortamı 5 ml ekleyin. Kapakları değiştirin ve dikkatle inkübatör geri yemekleri koydu. 37 ° C&#39;de gece boyunca kültür hücreleri. </li><li> AK katmanı içeren eklemek altına alınacaktır yerel mikro, temsil hücreleri ile ikinci (isteğe bağlı) alt uç hazırlamak için aynı yöntemi kullanın. </li></ol> Not: alt uçlar deneyler dahil olması durumunda, üst ve alt uçlar ilk olarak 3B cihazı (Şekil 4B) içine yerleştirmeden önce uçlar birbirine bağlanır. e &quot;&gt; 3. 3D Akış Odası Cihaz monte <ol><li> , Üst ve alt plakalar birlikte vida boru kullanılarak gaz değişimi ünitesine plakaları bağlamak, temiz bir plastik torba içine monte cihazı yerleştirin ve ışınlama ile çanta ve içindekiler (11 Gy) sterilize edin. </li><li> % 70 etanol ile steril doku kültürü kaputu, sprey içine hücre kültürü inkübatör, yerden bir tepsi-raf çıkarın, silin ve daha sonra büyük bir steril peçete ile tepsi kapağı. </li><li> Kaputun içine ışınlanmış plastik torba yerleştirin, steril inkübatör tepsi çanta ve yerden aygıtı kaldırın. Resim boru ile peristaltik pompaya bağlayın. 0.2 ml / dk &#39;lık bir en uygun hızda için program pompası. </li></ol> Not: elektrik soketi ile pompa bağlamak için, kuluçka arka delikten elektrik kablosu a&#39;ya. Delik hava geçirmez olduğundan emin olmak için kabloyu etrafında soyguncu fişi kullanın. <ol start="4"><li&gt; Sıra 5 - Bir steril 15 ml tüp (&quot;giriş&quot; için) olarak arzu edilen kültür ortamı 7 ml. </li></ol> 4. Başbakan 3D Akış Odası Cihazı <ol><li> Boru (boru kısırlık korumak için küçük steril peçeteler kullanın) gelen metal iğne çekerek prizden giriş hortumu çıkarın. Bir &quot;giriş&quot; ve &quot;çıkış&quot; olarak boru bağlantısı olmayan son olarak boru bağlı metal iğne kullanın. Medya ile 15 ml tüp içine metal iğne giriş yerlerde, boş 15 ml tüp içine çıkış yerleştirin. </li><li> Akış 0.2 ml / dk &#39;da saat yönünün tersine ve akış hızı ayarlanır, böylece pompa açın. Bu cihaz (Şekil 2, Durdur # 1) bağlanır önce orta hemen boru sonuna ulaştığında tüp içine 15 ml giriş tüpünden orta çizmek ve pompa durdurmak için negatif basınç sağlar. </li><li> Sökün cihazın üst ve alt plakalar. Medi 1.550 ul - dikkatlice üst plakası ve yeri 1500 kaldırmakalt kuyulara (orta ya da tek başına ya da deneysel kemokinler artı) um. Alt plaka üzerinde 2 mm - iyi yaklaşık 1 ulaşan bir yarımkürede oluşturmak için yeterli orta içerdiğinden emin olun. </li><li> Hava kabarcığı ekler altında sıkışıp emin, Petri kabı steril forseps kullanarak alt plaka kuyu için hazırlanan ekleme aktarın. Plaka kuru kalmasını sağlamak için alt plaka yüzeyinde görünen herhangi bir ortamda aspire. Alt plaka üzerine geri üst plakası yerleştirin ve vidaları kullanarak plakaları yeniden bağlayın. </li><li> Hemen peristaltik pompa açmak ve 3D cihaz akmasına orta sağlar. Cihazın çıkış ucunu yükseltmek ve plaka arasındaki boşluk içinde kabarcık oluşumunu önlemek için bu konumda muhafaza haznesi. </li><li> Orta gaz değişim birimi için bölme odasına bağlayan ve boru dolmasına izin verin. Orta gaz e ulaşmadan önce hemen pompayı durdurxchange ünitesi (Şekil 2; 2. Durdur). Gaz değişimi ünitesine orta yerine 3 ml, pompa açın ve hava kabarcıkları gaz değişimi birimi yoluyla kaçmasına izin. Çıkış borusu (Şekil 2, durdurma # 3) sonuna kadar 3 cm - ortamı 2 ulaştığında, ortam gaz alış-veriş ünitesinin çıkış tüp doldurmak ve pompa durdurmak için izin vermek için, gaz alış-veriş ünitesinin yükseltebilir. </li><li> Küçük steril peçeteler kullanarak prize giriş metal iğne bağlayın. Bu, gaz alış-veriş ünitesinin ulaştığında, ortam gaz alış-veriş ünitesinin doğru ters yönde akar (saat yönünde) ve hava kabarcıkları kaldırılır sağlamak böylece pompa programlayın. Hava kabarcığı sistemde kalır emin olun. </li><li> Orta tersine akar böylece pompa programlayın. Gaz alış-veriş ünitesinin için test hücre süspansiyonu 100 ul ekleyin. Gaz değişimi ünitesinin kapağını kapatın, kuvöz içine çalışma sistemi arka tepsiyi yerleştirin ve test hücreleri dolaşımdaki izinİstenen süre boyunca 37 ° C &#39;de 3 boyutlu cihazda örn. </li></ol> Not:% 70 etanol ile pompanın elektrik kablosu temizleyin ve kuluçka içine yerleştirin. 5. Test sona ve Testi için Örnekler toplayın <ol><li> Inkübatör ve kaputu yerden çalışma sistemi ile tepsisini çıkarın. Pompayı durdurmak, giriş ve çıkış çıkarın ve boş steril 15 ml tüpler içine biter yerleştirin. </li><li> Uygunsa kullanımı kadar, buz üzerinde yer hücre süspansiyonu, pompa açın ve sistemden hücre süspansiyonu toplamak. </li><li> Vidaları çıkarmadan ve üst plaka kaldırarak odası sökün. Alt plakadan ekler çıkarın ve Petri kapları aktarabilirsiniz. </li></ol> Not: ekler görselleştirmek ve (kristal viyole dH 2 O% 0.05) in situ hücreleri saymak lekeli veya daha fazla için AB toplamak için tripsinize olabilirtest. <ol start="4"><li> Orta ve alt gözleri hücreleri tüpler içine ve 210 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj çıkarın. Süpernatantı, yıkama ve istendiği gibi hücreler tekrar süspansiyon ve spesifik deneysel hedefleri (aşağıda ayrıntılı olarak ele alınmaktadır), hücrelerin işlem. </li></ol>

<ol>
	<li>Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+and+perils+of+stem+cell+therapeutics.">The promise and perils of stem cell therapeutics.</a> Cell Stem Cell. 10, 740-749 (2012).</li><li>Khaldoyanidi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+stem+cell+homing.">Directing stem cell homing.</a> Cell Stem Cell. 2, 198-200 (2008).</li><li>Laird, D. J., von Andrian, U. H., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+trafficking+in+tissue+development,+growth,+and+disease.">Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease.</a> Cell. 132, 612-630 (2008).</li><li>Lapidot, T., Kollet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain-bone-blood+triad:+traffic+lights+for+stem-cell+homing+and+mobilization.">The brain-bone-blood triad: traffic lights for stem-cell homing and mobilization.</a> Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2010, 1-6 (2010).</li><li>Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoengineering+of+HCELL,+the+human+bone+marrow+homing+receptor:+sweetly+programming+cell+migration.">Glycoengineering of HCELL, the human bone marrow homing receptor: sweetly programming cell migration.</a> Ann. Biomed. Eng. 40, 766-776 (2012).</li><li>Smart, N., Riley, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stem+cell+movement.">The stem cell movement.</a> Circ. Res. 102, 1155-1168 (2008).</li><li>Khaldoyanidi, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MDA-MB-435+human+breast+carcinoma+cell+homo-+and+heterotypic+adhesion+under+flow+conditions+is+mediated+in+part+by+Thomsen-Friedenreich+antigen-galectin-3+interactions.">MDA-MB-435 human breast carcinoma cell homo- and heterotypic adhesion under flow conditions is mediated in part by Thomsen-Friedenreich antigen-galectin-3 interactions.</a> J. Biol. Chem. 278, 4127-4134 (2003).</li><li>Le Devedec, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Intravital+Multicolour+Imaging+to+Study+Metastatic+Behaviour+of+Cancer+Cells+in+vivo.">Two-Photon Intravital Multicolour Imaging to Study Metastatic Behaviour of Cancer Cells in vivo.</a> Methods Mol. Biol. 769, 331-349 (2011).</li><li>Barakat, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responsiveness+of+vascular+endothelium+to+shear+stress:+potential+role+of+ion+channels+and+cellular+cytoskeleton+(review).">Responsiveness of vascular endothelium to shear stress: potential role of ion channels and cellular cytoskeleton (review).</a> Int. J. Mol. Med. 4, 323-332 (1999).</li><li>Fisher, A. B., Chien, S., Barakat, A. I., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cellular+response+to+altered+shear+stress.">Endothelial cellular response to altered shear stress.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281, L529-L533 (2001).</li><li>Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+force+and+its+effect+on+cell+structure+and+function.">Shear force and its effect on cell structure and function.</a> ASGSB Bull. 4, 87-94 (1991).</li><li>Topper, J. N., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+flow+and+vascular+gene+expression:+fluid+shear+stress+as+a+modulator+of+endothelial+phenotype.">Blood flow and vascular gene expression: fluid shear stress as a modulator of endothelial phenotype.</a> Mol. Med. Today. 5, 40-46 (1999).</li><li>Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+and+adhesion+of+human+tumor+cells+on+vascular+endothelium+under+physiological+flow+conditions.">Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions.</a> J. Clin. Invest. 92, 3038-3044 (1993).</li><li>Cinamon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chemokine+functions+in+lymphocyte+migration+through+vascular+endothelium+under+shear+flow.">Novel chemokine functions in lymphocyte migration through vascular endothelium under shear flow.</a> J. Leukoc. Biol. 69, 860-866 (2001).</li><li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+progenitor+cell+rolling+in+bone+marrow+microvessels:+parallel+contributions+by+endothelial+selectins+and+vascular+cell+adhesion+molecule+1.">Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1.</a> J. Exp. Med. 188, 465-474 (1998).</li><li>Arber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft+source+determines+human+hematopoietic+progenitor+distribution+pattern+within+the+CD34(+)+compartment.">Graft source determines human hematopoietic progenitor distribution pattern within the CD34(+) compartment.</a> Bone Marrow Transplant. 46, 650-658 (2012).</li><li>Fuji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+blood+as+a+preferable+source+of+stem+cells+for+salvage+transplantation+in+patients+with+graft+failure+after+cord+blood+transplantation:+a+retrospective+analysis+of+the+registry+data+of+the+Japanese+Society+for+Hematopoietic+Cell+Transplantation.">Peripheral blood as a preferable source of stem cells for salvage transplantation in patients with graft failure after cord blood transplantation: a retrospective analysis of the registry data of the Japanese Society for Hematopoietic Cell Transplantation.</a> Biol. Blood Marrow Transplant. 18, 1407-1414 (2012).</li><li>Haspel, R. L., Miller, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cells:+source+matters.">Hematopoietic stem cells: source matters.</a> Curr. Stem Cell Res. Ther. 3, 229-236 (2008).</li><li>Schraufstatter, I. U., Discipio, R. G., Zhao, M., Khaldoyanidi, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C3a+and+C5a+are+chemotactic+factors+for+human+mesenchymal+stem+cells,+which+cause+prolonged+ERK1/2+phosphorylation.">C3a and C5a are chemotactic factors for human mesenchymal stem cells, which cause prolonged ERK1/2 phosphorylation.</a> J. Immunol. 182, 3827-3836 (2009).</li></ol>

Cascade Doğal Bilimler Inc &quot;akış koşulları ve bunların kullanım yöntemleri altında in vitro hücre göç değerlendirmek için Aygıt&quot; Patent No ABD 7.927.867 B2 için özel haklar sahiptir. SKK 3D akış odasının cihaz teknolojisi bir mucit ve Cascade Doğal Bilimler Inc kurucularından bilimsel ve hissedarı

3D Cihaz kök hücre biyolojisi, vasküler biyoloji, hematoloji, onkoloji, otoimmünite ve inflamasyon dahil olmak üzere çeşitli alanlarda araştırma için yararlı bir teknoloji olabilir. 3D cihaz araştırmacılar kök hücre ekstravazasyon çağlayan her adımı düzenleyen moleküler mekanizmalarının araştırılması hematopoetik, mezenkimal, sinir ve diğer kök hücre çalışmaları için özellikle faydalı olacaktır. Hücre göçü okuyan araştırmacılar da T-ve B-lenfositler, monositler, nötrofiller, eozinofiller, NK hücreleri ve diğer göçmen hücrelerin farklı göç mekanizmaları incelemek için bu cihazı kullanabilirsiniz. Vasküler biyoloji, cihaz hücre toplanması desteklemek ve in vitro kan-beyin bariyerini taklit etmek EC yeteneği yerel mikro etkisini değerlendirmek için faydalı olacaktır. Hastalığının patogenezinde odaklanan araştırmacılar için, aygıt tip I diyabet, mil boyunca pankreas içine, sitotoksik T hücrelerinin göç incelemek için kullanılabilirastım hastaları, nötrofil göçü, monositler ve bozukluklar, çeşitli siteler yara iyileşmesi için bir hücre alımı, yeni damar ile sitotoksik T hücrelerinin etkileşimini inflamasyonun sitelerine lenfositlerin akciğerlere eozinofil vasıfları ve işe tümörlerinde, sitotoksik T hücrelerinin. Yeni 3D Cihaz aynı zamanda öteleme bilim ve klinik öncesi ilaç geliştirme ve tarama için yararlı bir araç olacaktır. Örneğin, aygıt, intravenöz uygulama için terapötik hücre süspansiyonları hazırlanmasında optimize etmek için normal dokulara karşı yaralı doku tedavi edici hücrelerin alım test etmek için, ve özel bir organ veya doku bu endotelyum ve mikro rolünü incelemek için kullanılabilir süreç. Ilaç geliştirme için, aygıt, bu hedef tümör hücrelerinin ilaç adayları test etmek ve ekstravazasyonu kaskad her adımda blok, bir ilaç teslim olarak göç eden hücrelerin test etmek için kullanılabilecektümör sitelere y araç, insan organ-spesifik endotel veya lokal doku özgü mikro fonksiyonu düzenleyen ve homing kaskad farklı adımlar düzenleyen ilaçların kombinasyonları test etmek için ilaçların test etmek için. Son olarak, yüksek verimli bir sisteme dönüştürülen, cihaz hedef moleküllerin hücre trafiğini aracılık bu küçük moleküller, peptitler, antikorlar ve taranması için kullanılabilir. Teknik detaylar ve ipuçları Akışı altında Rolling ve yapışma ekstravazasyon kaskad kritik adımlar ve in vivo hücre göçü verimini önemli katkı sağlamaktadır. Özellikle şu adımları in vitro statik deneyleri katkı yoktur. Ancak, statik göçü deneyleri düşük afinite etkileşimleri (haddeleme) ve sağlam yapışma destek EC yeteneği dahil olmak üzere hücre sağkalım ve işlevi, üzerinde kayma stresin etkilerini test deneylerde negatif kontrol olarak yararlıdır. 3D cihaz deneyler için ortamın seçimi önemlidir. Ortam özellikle uzun inkübasyon süreleri esnasında dolaşan hücrelerin canlılığı etkileyebilir farklı büyüme faktörlerinin içerir. Buna ek olarak, Ca 2 + ve Mg konsantrasyonu 2 +, fizyolojik akış koşulları altında yapışma etkileşimlerini etkileyebilecek olan ticari bir kültür ortamı içinde önemli ölçüde farklılık gösterir. 3D cihaz ile deneyler planlarken dikkate alınması gereken diğer teknik detayları aşağıda açıklanmıştır. AB tek tabaka seçimi AT&#39;nin hücre yüzeyi imza deney tasarımında dikkate alınmalıdır türleri, kaynak ve hücre kültürü koşullarının dokusu da dahil olmak üzere çeşitli parametreler, etkilenir. Bazı sık kullanılan EC akciğer kaynaklı mikrovasküler EC (LDMVEC), kemik EC (BMDEC), beyin kaynaklı EC (BDEC) iliği kaynaklı ve HUVEC içerir.Avrupa Komisyonu özellikleri de kökenlerine göre değişir. Örneğin, çelik ve yapışma sorumludur BMDEC yapısal olarak ifade selektinler ve VCAM-1, BDEC, LDMVEC ve HUVEC Normal koşullar altında, bu moleküllerin ifade böyle değildir. Bu nedenle, BDEC, LDMVEC ve HUVEC ile kaplanmış uçlar TNF α (10 ng / ml, 4 saat) taklit etmek veya inflamasyon ve yerleşme moleküllerinin ekspresyonunu teşvik etmek için diğer faktörler ile tedavi edilebilir. Yerel mikro ile karışma Test Yerel mikro AT fonksiyonlarını düzenler ve hücre ekstravazasyon katılımını anlamada artan bir ilgi vardır. Sonuçlarımız EC tek tabaka altında stromal hücre tek tabaka yerleştirilmesi önemli ölçüde hücreleri dolaşımdaki damar dışına artırdığını göstermektedir. Bu bulgu, EC ve stroma arasında karışma dolaşan hücrelerin damar dışına desteklemek için Avrupa Komisyonu yeteneğini artırır göstermektedir. Moreover, farklı mikroçevrelerde (örneğin mezenkimal kök hücreler, akciğer fibroblast, tümör hücreleri, astrositler) hücreleri ekleme belirli vasküler yatak taklit için yardımcı olabilir. Özellikle, beyin türevli AT ve astrositler bir arada, kan-beyin bariyerini taklit etmek için yararlı bir yaklaşım olabilir. Benzer şekilde, hastalar, ya da in vitro olarak manipüle normal hücrelerden elde edilen hücreler, belirli bir hasta mikro taklit yardımcı olabilir. Çalışmalarda, biz% 50 izdiham büyüdü stromal hücreleri ile alt ekler kullanılır. Uçlarda mikroçevredeki hücrelerin optimum yoğunluk çalışmanın hedeflerine bağlı olsa da, bu kolayca manipüle ve kontrol edilebilir. Bir kayma gerilmesi hızı seçerek Bu Von Andrian ve arkadaşları tarafından gösterilmiştir çünkü 0,8 dyn / cm 2 kayma gerilmesi burada kullanılmıştır. kemik iliği microvasculatur içinde kayma gerilmesi içinhematopoetik progenitör hücrelerin dolaşım çıkmak ve normal fizyolojik koşullar 15 altında dokulara girerler e,. Bunun aksine, kesme stresi yüksek düzeyde hücre ekstravazasyonu sınırlıdır daha büyük kaplar, gözlenir. Bu nedenle, yüksek kesme kuvveti oranları, çeşitli hücre tipleri ekstravazasyonu inceleyen deneyler için ilave kontroller olarak kullanılabilir. Kayma gerilimi altında hücrelerin hayatta kalma hücre tipi ve ex vivo hücre tedavileri (Goncharova ve ark., Yayınlanmamış gözlem) dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlıdır ve bu nedenle dikkatli bir şekilde test sırasında değerlendirilmelidir. Kayma stres düzeyleri farklı (kayma gerilmesi direnç) Hücre hassasiyeti 0,8 dyn / cm 2 ile 6 dyn / cm 2 aşamalı kayma gerilmesi oranı artırmak için peristaltik pompa programlanarak değerlendirilebilir. Bu testler sırasında, hücreler olarak kullanarak hücre ölümü izlemek için gaz değişimi odasından periyodik olarak alınabilirBu tripan mavi dışlama, anneksin V ve PI boyama ve apoptoz işaret ifadesi olarak söylüyor. Deneyler parankimi türetilen ex vivo olarak işlenmiş hücreler veya hücre kayma stres direnci test etmek için tasarlanmıştır, bu, kan yoluyla bulaşan hücreleri gibi ek bir pozitif kontroller, deneyler dahil edilmesi tavsiye edilir. Uç gözenek büyüklüğü ve ECM kaplamanın seçimi Ekler çeşitli gözenek boyut (3, 5, ve 8 mikron) mevcuttur. Gözenek boyutunun seçimi, dolaşımdaki testi hücrelerinin boyutu ve özelliklerine bağlı olacaktır, bu da statik transwell tahliller için de geçerlidir. Bir büyük gözenek boyutu (8 mikron) ile ekler gibi epitel kökenli tümör hücreleri gibi büyük hücrelerin damar dışına test etmek için tavsiye edilir. Lökosit veya hematopoetik kök hücrelerin daha yaygın 5 mikron gözenek ekler ile test edilir, ve 3 mikron gözenek ekler iyi s damar dışına test için ayrılmıştırMaller hücreleri. Ancak, tek başına test hücre boyutu tek önemli faktör değildir ve biz birkaç gözenek boyutları ile ekler test tavsiye ederiz. Bizim ilk çalışmalarda, biz ekler üzerinde AT büyümeyi desteklemek ve&gt; 4 saat kayma gerilmesi dayanma kabiliyetlerini için çeşitli ECM test. ECM Matrigel, poli-D-lizin, fibronektin, laminin, yazın dahil test edilen I kollajen, Hidrojel, Meta-keratin I, II, III, IV, ve Extracel. EM büyümesi için en iyi sonuçlar Extracel, fibronektin ve kollajen ile elde edilmiştir. Ancak, bizim ellerde, 0.8 mg / cm 2 Extracel önemli ölçüde zarından testi hücrelerinin göçü azalır. Bu nedenle şimdi ekler kaplama için fibronektin (5 mg / cm 2) veya kollajen (5 mg / cm 2) kullanın. Bununla birlikte, ECM&#39;nin optimum seçimi muhtemelen AT türüne ve test hücrelerinin transmigratory özellikleri hem de etkilenir. Bir ön deney Integri test etmek için gerekenAB tek tabaka ty seçilen ECM yetişen. Örneğin, kültür ortamı ile doldurulmuş petri levhalar içinde EM mono tabakaları ile yerine önceden kaplanmış uçlar, makaslama kuvveti (düşük ayar) oluşturmak için, bir çalkalayıcı üzerinde yemekleri yerleştirmek, ve 37 ° C&#39;de inkübe edin ve% 5 12 saat boyunca CO2. Kesme stresine maruz kaldıktan sonra EM bütünlüğü kristal mor boyama ile değerlendirilebilir. Optimal test hücre konsantrasyonları seçimi Dolaşım çıkmak için Test hücreleri yeteneği, her bir hücre tipine özgü bir çok özelliklerine bağlıdır. Istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar üretmek için, dolaşan hücre yoğunluğu hücre yeterli sayıda pozitif kontrol kuyularına geçiş sağlamak için optimize edilmelidir. Bu nedenle, sisteme yüklenen hücre sayısı ve arasındaki ilişkiyi anlamak için hücre yoğunlukları bir dizi (örneğin 10 3 / ml 10 7 / ml) ile ilk testleri tavsiyegöçü geçmesi hücre sayısı. Buna ek olarak, en iyi dolaşımdaki konsantrasyonunu farklı kaynaklardan elde edilen aynı hücre tipi için farklı olabilir. Örneğin, CD34 + hücreler hematopoetik kök hücre ve kararlı soy özel ataları hem içeren heterojen bir hücre popülasyonu vardır. Bunlar kemik iliğinden elde edilebilir, periferik kan harekete ve göbek kordon kanı. Bu üç kaynaklardan elde edilen CD34 + hücreleri, farklı hedef arama ve yerleştirilmesiyle özellikler 16-18 sahiptirler, bu nedenle cihazın 3B, bu hücreler test etmek için koşullar tam ölçekli bir çalışma öncesi optimize edilmelidir. Optimum hücre dolaşım süresi seçimi Optimal dolaşım süresi her bir hücre tipi için ampirik olarak belirlenmelidir. Dolaşım için gereken minimum zaman statik göç deneyleri sonuçlarından çıkarım olabilir, ancak bu exten olabilirHücrelerin kesme stresine tabi tutulduğunda ded. 4 ve 96 saatleri arasında dolaşımı kez test pilot çalışmalar önerilir. Gaz alış-veriş ünitesinin Gaz alış-veriş ünitesinin ana amacı, standart bir doku kültürü kuluçka ayarları benzer 3D aygıt içinde dolaşan orta bölgesi CO2 optimum konsantrasyonu elde etmektir. Gaz alış-veriş ünitesinin ayrıca Test hücreleri ve bileşikler ilave edilmesi için ve test sırasında prob ve numune toplamak için kullanılabilir. Test hücre sayıları Değerlendirilmesi Sirkülasyon hücreleri gaz değişimi ünitesi ile deney sırasında farklı zamanlarda tadına bakabilirsiniz. Deneyin sonunda, dolaşımda kalan hücreler çıkışında toplanan edilebilir. 3D cihaz deney sonunda demonte edildiğinde, transmigrated hücreleri alt kuyulardan toplandı ve f toplanabilirya da daha fazla analizi. Giriş hücreleri etiketsiz ise, transmigrated hücreleri tripan mavi ve mikroskobik sayılan canlı / ölü hücreleri ile boyanmış olabilir. Alternatif olarak, giriş hücreleri 3D cihazın içine yerleştirmeden önce canlı hücre görüntüleme için çok &quot;hücre izci&quot; bir boya ile işaretlenmiş olabilir, bu durumda, hücreler hasat floresans ölçümü için lize edilmelidir transmigrated. En uygun örneklem büyüklüğü seçimi Istatistiksel analiz izin vermek için, bir örneklem büyüklüğü iki taraflı t-testi ile 0.05 anlamlılık düzeyinde test iki grup arasında ortalama yüzde değişiklikler varsayımsal farkı tespit etmek için yaklaşık% 80 güç sağlayacak seçilmelidir. Kemik iliği hücreleri ile deneyimlere dayanarak, biz 3 boyutlu cihaz deneyler için deney durumu başına üç kuyu kullanın. Bununla birlikte, en iyi örnek büyüklüğü, deney amacı ile değişir ve e belirlenmelidirmpirically. Çoklu regresyon istatistiksel testler, iki taraflı t-testi ve varyans analizi sonuçlarının istatistiksel önemi doğrulamak için kullanılabilir. Kemokinlerin seçimi Tüm tahliller göçü için olduğu gibi, kemoatraktan seçimi test hücrelerinin özelliklerini ve çalışmanın amacı tarafından dikte edilir. SDF-1 hematopoietik hücreler için iyi bilinen bir kimyasal çekicidir. Bizim ellerde, 50 ng / ml, SDF-1 &#39;lik bir konsantrasyon kemik iliğinden türetilmiş hematopoetik projenitör hücrelerin ekstravazasyon uyarmak için uygun olmuştur. Ayrıca mezenkimal kök hücreler 19 için chemoattractants olarak C3a ve bFGF kullanın. Ancak, tam ölçekli bir çalışma önce en uygun konsantrasyon aralığı tanımlamak için kemokin her kemokin ve çapraz titrasyonu kombinasyonları titre tavsiye ederiz. Belirli hücre tipleri için kemotaktik faktörlerin bir arada yararlı olabilir. Özel test hücreleri için kemokinleri con, bilinmeyen veya mevcut değilseuyarılmış lenfositler, fibroblastlar ve diğer hücrelerden ditioned ortam Kemo-çekiciler arasında bir kaynak olarak kullanılabilir. Okuma parametrelerin seçimi 3D cihazın çok yönlülük yapılabilir göçü deneyler türünü genişleyecektir ve deneylerin başarısı okuma parametrelerinin düşünceli dikkate ve tasarım bağlıdır. Bir kural olarak, hücrelerin üst (dolaşımdaki) bölmesi toplandı ve alt (statik) bölmesi hücre sayımı ile aynı anda canlılığı için test edilmelidir. Bazı hücreler mikrovasküler gözlenen fizyolojik kayma gerilmesi için düşük toleransı sahip. Bu durumda, ölü hücrelerin sayısı üst bölmesine artırılacaktır. EC katmanda (veya tuzak) tutuklandı yapışık hücre sayısını test hücreleri tarafından özellikle ifade belirteçleri immünsitokimya tarafından değerlendirilebilir. CD31 ve vWF için spesifik antikorları kullanılabilirEC tespit etmek ve test hücreleri ve AB arasında ayrımcılığa izin vermek. Buna ek olarak, EM tek tabaka bütünlüğünü her test sonunda izlenmelidir. Toplanan hücreler ile yapılan analiz türleri araştırmacılar &#39;deneysel hedeflerine bağlı olacaktır, ancak mikroarrayler ve qPCR, FACS analizi ile yüzey molekülü ifade FACS ve batı blot sinyal yollarının aktivasyonu, ve faktör gen ifade analiz değişiklikleri içerebilir ELISA ile salgı. Biz transmigrated kemik iliği hücreleri hematopoetik progenitör hücreler (Şekil 3) sıralamak için kültüre hangi kendi çalışma ile kanıtlandığı gibi fonksiyonel testlerin muazzam bir dizi, in vitro toplanan hücreleri üzerinde mümkündür. Toplanan numuneler, aynı zamanda in vivo deneyler, çeşitli test edilebilir. In vivo test hücrelerin davranışını tahmin etmek için yardımcı olabilir önemli bir parametre eğilimindedirkayma gerilmesi farklı oranlarda altında agrega oluşturmak için bazı hücrelerin ency. Örneğin, 3 boyutlu cihazda toplam oluşumu tabi tedavi hücreleri intravenöz uygulamadan sonra kümeleri oluşturmak ve in vivo (Gonçarov ve ark., Yayınlanmamış gözlemler) akut damar tıkanıklığı neden daha büyük bir eğilim olabilir. Agrega oluşumu 3D cihaz deney tamamlanması sırasında veya sonrasında test hücreleri örnekleyerek mikroskobik olarak takip edilebilir.

Hücre ekstravazasyon dolaşan hücreler kan çıkmak ve vücutta birçok fizyolojik tepkiler önemli bir bileşeni olan süreçtir. Süreç örnek olarak, doku rejenerasyonu için de önemlidir, kan damarları (veya intravenöz enjekte) içine dokulardan seferber tedavi hücreler damar yoluyla göç ve yaralanma veya dejenerasyon sitelere dolaşımını çıktığınızda. Ekstravazasyon da inflamasyon, bağışıklık ret, otoimmünite ve tümör metastazı dahil olmak üzere birçok hastalığın, patogenezinde önemli bir bileşenidir. Ekstravazasyon fizyolojik akış koşulları altında endotel hücreleri ile hücreleri (EC) dolaşımdaki etkileşimi içeren karmaşık bir çok adımlı bir işlemdir. Bu süreç (a) hücre çelik, AT luminal yüzeye (b) firma yapışma ve AB genelinde (c) göçü oluşmaktadır. Önemli olarak, ekstravazasyon kaskad her aşama c bir alt kümesi tarafından düzenlenirell tip-spesifik ve türe özel moleküller. Ancak, belirli bir hücre alt gruplarının damar dışına düzenleyen ayrıntılı moleküler mekanizmalar tam olarak büyük ölçüde kan koşulları yansıtan teknik zorluk, anlaşılamamıştır. Yeni 3D cihaz bu teknik zorlukların üstesinden gelmek ve hücre göç biyoloji anlayışımızı artıracak yapılacak deneyler izin vermek için tasarlanmıştır burada açıklanan. Hücre göçü aracılık molekülleri önemli tedavi hedeflerdir. Özel hücre tiplerinin göç kontrol moleküler olayların detaylı bir anlaşılması tedavi promosyon veya ekstravazasyon inhibisyonu için yeni hedefler belirlenmesinde yardımcı olacaktır. Örneğin, yaralanma veya dejenerasyon siteleri doğru tedavi kök hücrelerin göç (, yetişkin neonatal hatta fetal dokulardan elde edilen olsun) geliştirmek müdahaleler doku rejenerasyonu büyük yarar olacaktır.Pluripotent kaynaklardan elde edilen hücreler de dahil olmak üzere tedavi kök hücreler, in vitro üretimi ve ex vivo manipüle erişkin kök hücreler (, genişletilmiş genetik manipüle ve çeşitli enzimler ile ön işlem) 1 de artan bir ilgi vardır. Böylece, terapötik amaçlar için kullanılır önce kök hücrelerin kalitesini değerlendirmek için yeni teknolojileri için bir ihtiyaç vardır. Diğer parametreler arasında, hücreler, multifokal bozuklukların tedavisinde kök hücreleri 2 arasında intravenöz gerektirebileceğinden, verimli bir şekilde dolaşım çıkmak mümkün olmalıdır. Gerçekten de, kök hücre biyolojisi mevcut zorluklardan biri son derece düşük verimlilik üstesinden gelmek için hangi doku hasarı 3-6 sitelere kök hücre ev, kök hücre göç anlayışımızda bu boşluğu konuşulması gerektiğini vurgulayarak ile. Bunun aksine, stratejiler spesifik hedef arama molekülleri hedef bloğu tarafından hücre göçü de tedavisinde yararlı olacağıinflamatuar ve oto-immün hastalıklar ve metastatik kanser gibi. Böylece, hücre göçü ve damar dışına boyunca piyasada bulunan hücreler ve AB arasındaki etkileşimleri arabuluculuk moleküler mekanizmaları anlamak öteleme tıp ve ilaç keşfi yanı sıra temel bilim alakalı. Hücre göçü farklı yönlerini incelemek için kullanılabilir bir dizi yöntem yok. Ancak, bu yöntemler yeni 3D cihazla aşılabilir eksiklikleri var. Hayvan modelleri: Bu immün sistemi baskılanmış fareler ve genetik olarak manipüle fare gibi hayvan modelleri, in vivo insan hücrelerinin göç incelemek için yararlı araçlar olmuştur. Ancak, bu modeller bir önemli dezavantajı insan hücrelerinde birçok hücre yüzey molekülleri türe özgü dizisi farklılıklar nedeniyle kısmen, fare EC mevcut adezyon molekülleri ile kötü etkileşim olmasıdır. Böylece kemirgenler kullanımı çalışmainsan hücre göçü otantik insan organ-spesifik vasküler yataklarda olayları yansıtmak pek mümkün değildir. Buna ek olarak, in vivo modellerde ilaç adayları yüksek verimli tarama için uygun değildir. Homing hücre incelemek için kullanarak in vivo modellerde geleneksel zor roman homing molekülleri belirlemek ve hedef yapmak, ekstravazasyon kademeli farklı adımlar arasında ayrımcılık yok. Intravital mikroskopi yaklaşım bu ihtiyacı gidermek için geliştirilmiştir ve bilgilendirici olmuştur, ancak, bu teknik son derece zaman ve 7,8 emek yoğundur. Statik göçü deneyleri: Transwell ya da gözenekli bir membran ve çapraz Boyden odasının ölçümlerde, hücre göçü yaygın olarak göç çalışmalarında kullanılmaktadır. Tahlil, hücre aracılı kemokin göç da hücre motilitesi ve hücre-hücre dışı matris (ECM), etkileşimleri sadece incelemek için kullanılabilir ki avantajına sahiptir, fakatgözenekli zarlar yetişen bir AT tek tabaka üzerinde. Ne yazık ki, statik koşullar altında fenotip ve AT fonksiyonu fizyolojik akışı 9,10 altında olanlardan önemli ölçüde farklıdır. Böylece, Transwell deneyleri meydana gelen kemotaktik olayları sadakatle kayma stres altında göç hücreleri ve AB arasındaki etkileşimleri taklit yok. Buna ek olarak, genel sürecine seçicilik ekstra bir boyut katıyor homing çağlayan &quot;haddeleme&quot; adım, statik Transwell deneyleri oluşmaz. Bu teknoloji ile, AT tek tabaka üzerinde çeşitli kemokin aracılı hücre göçü niceliksel değerlendirilmesi izin verir iken Böylece, bu in vivo kan akışını taklit olarak kesme baskısı sağlamak için kendi yetersizlik ile sınırlıdır. Kayma stres altında Tahliller: Duvar kayma gerilmesi EC fonksiyonu 9,10 düzenlenmesinde önemli bir rol oynadığı bilinmektedir. Kesme kuvvetlerinin sinyal kaskadlar hızlı aktivasyon, transc nedenription faktörler ve EC 11,12 diferansiyel gen ekspresyonu. Bu bilgiler yapışma deneyleri bir sonraki nesil gelişmesine yol açmıştır - paralel laminer akış odaları ve kılcal - haddeleme çalışma ve kayma gerilmesi 7,13 koşulları altında EC hücrelerinin yapışma için. Bu deneyleri için sınırlayıcı faktör sadece haddeleme ve yapışma ölçebilirsiniz olduğunu, ancak göç etmek için giderdim bir yapışık hücre ve AB tek tabaka üzerinde &quot;tutuklandı&quot; ve transmigrate olmaz bir yapışık hücre arasında ayrım yoktur. Ayrıca, bu testlerin bir kemokin degrade doğru hücrelerinin göçü ölçemezsiniz. Çeşitli raporlar akış 14. koşullarında cam slaytlar yetişen bir AT tek tabaka altında tarama yapışık hücrelerinin yeteneği tarif var. Bu tarama tekniği şu sınırlamaları içerir: bu hücrelerin sadece sınırlı sayıda analiz, olmayan-nicel değil, matris ve cel üzerinde tarama hücre analizl yüzey değil bir kemotaktik degrade doğru göç, ve transmigrated hücreleri izole izin vermez. Bu tahlil, AT tek tabaka makaslama kuvveti uygulanarak avantajına sahip olmasına rağmen, böylece, bir kemokin gradyan doğru hücre migrasyonu ölçmek olamaz. Burada açıklanan yeni 3D teknolojisi, statik bir kemokin degrade (alt bölmesi) ile kesme kuvveti (üst bölme) birleştirerek bu eksikliklerin çoğu üstesinden gelir ve ekstravazasyon kaskad (Şekil 1) her aşamasında nicel değerlendirmesi izin verir. Cihaz aynı zamanda AK ve mikro arasındaki karışma dolaşan hücrelerin damar dışına desteklemek için Avrupa Komisyonu yeteneği nasıl etkilediğini araştırmak için kullanılabilir. Aşağıdaki protokol, 3B akış odası cihazı kullanmak için adım adım yöntem açıklanmaktadır.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagent/Material&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>PVC tubing (bore 1.42, wall 0.8)</td><td>Watson-Marlow Limitid</td><td>981.0142.000</td><td></td></tr><tr><td>3D Chamber</td><td>C.B.S.Scientific</td><td>FC-1000</td><td></td></tr><tr><td>Gas exchange unit</td><td>C.B.S.Scientific</td><td>FCR-1000</td><td></td></tr><tr><td>Inserts</td><td>C.B.S.Scientific</td><td>FCI-1005U</td><td></td></tr><tr><td>Collagen Bovine,Type I</td><td>BD Biosciences</td><td>354231</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid 0.1M</td><td>VWR</td><td>BDH3200-1</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>Lonza</td><td>CC- 2517</td><td></td></tr><tr><td>EGM Bullet Kit (cc - 3121 &amp;amp; cc - 4133)</td><td>Lonza</td><td>CC - 3124</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin Neutralizing Solution</td><td>Lonza</td><td>CC-5002</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Lonza</td><td>CC-5012</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Lonza</td><td>CC-5024</td><td></td></tr><tr><td>SDF-1</td><td>R7D System</td><td>460-SD</td><td></td></tr><tr><td>Extracel Trial 2.5 Kit</td><td>Glycosam Byosystems</td><td>GS211</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin, human , nature</td><td>BD Biosciences</td><td>356008</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Millipore</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Human Brain Microvascular Endothelial Cells</td><td>ScienCell</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td>Endotelial Cell Medium (ECM) for brain cells</td><td>ScienCell</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>StemCells Tecnologies</td><td>7050</td><td></td></tr><tr><td>TNF-alfa, 10 &amp;mu;g</td><td>Invitrogen</td><td>PHC3015</td><td></td></tr><tr><td>VCAM-1, mouse anti-human, CD106-FITC</td><td>Southern Bioteck</td><td>9519-02</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodide Staining Solutuion</td><td>BD Pharmingen</td><td># 556463</td><td></td></tr><tr><td>Frozen Human Cord Blood CD34&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; cells</td><td>StemCell</td><td>CB007F</td><td></td></tr><tr><td>Frozen Human Cord Blood CD34&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; cells</td><td>Zenbio</td><td>SER - CD34-F</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult GF M3434</td><td>StemCells Tecnologies</td><td>GFM3434</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Methylcellulose complete media</td><td>R&amp;amp;D</td><td>HSC007</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Von Willibrand Factor antibody</td><td>abcam</td><td>C# ab11713</td><td></td></tr><tr><td>Petry dish (35 x 10 mm)</td><td>VWR</td><td>CA25373-041</td><td></td></tr><tr><td>15 ml tubes</td><td>VWR Fisher</td><td>21008 - 918</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture flasks 75cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>VWR</td><td>BD353136</td><td></td></tr><tr><td>Cristal violet</td><td>Sigma</td><td>C-3886-25G</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting forceps, curved</td><td>VWR</td><td>82027-384</td><td></td></tr><tr><td>1,000 &amp;mu;l Pipette tips</td><td>VWR</td><td>83007-380</td><td></td></tr><tr><td>1 - 200 &amp;mu;l Pipette tips</td><td>VWR</td><td>37001-530</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Watson-Marlow Limitid</td><td>403U/VM3</td><td></td></tr></tbody></table>

a novel three-dimensional flow chamber device to study chemokine-directed extravasation of cells circulating under physiological flow conditions

Kan hücreleri, dolaşımdaki ekstravazasyonu kök hücre hedef arama ve tümör metastaz da dahil olmak üzere bir çok fizyolojik ve patofizyolojik işlemlerde, merkezi bir rol oynar. Üç boyutlu akış odası cihazı (bundan sonra 3 boyutlu cihaz) fizyolojik kayma gerilmesi yeniden ve hücre ekstravazasyon kaskad her adımı miktarının belirlenmesine imkân tanır in vitro teknolojisinde bir roman. 3D Cihaz ilgi hücreleri kayma gerilimi altında sirküle edildiği bir üst bölme ve ilgilenilen Kemo-atraktanlar içeren statik gözenekli bir alt bölme oluşur. Iki bölme endotel hücreleri (EC) bir tek tabaka ile kaplanmış gözenekli uçlar ile ayrılır. Ilgi microenvironmental hücreleri ile isteğe bağlı ikinci ekleme EC tabakası altında hemen yerleştirilebilir. Bir gaz değişimi birimi en uygun CO2 gerilim muhafaza sağlar ve sırasında hücreleri veya bileşikler eklemek veya çekilme için bir erişim noktası sağlardeney. Test hücreleri, bir peristaltik pompa ile kontrol istenilen kesme stresi (akış oranı) üst bölmesine dolaşır. Deneyin sonunda, dolaşan ve göç eden hücreler ileri analiz için toplanır. 3D Cihaz kemokin gradyanlar, kayma stresine direnç, kümelenme oluşumu ve hücre yaşamını tepki olarak kesme baskısı altında EC göçü ve yapışması haddeleme hücre incelemek için kullanılabilir. Buna ek olarak, isteğe bağlı ikinci uç EC ve mikroçevredeki hücreleri arasındaki karışma etkisi incelenmiştir sağlar. 3D cihazın translasyonel uygulamaları ilaç adayları test içeren hedef hücre göçü ve damardan bir enjeksiyondan sonra hücrelerin in vivo davranış tahmin. Böylece, yeni 3D cihazın cep ekstravazasyon aracılık moleküler mekanizmaları incelemek için çok yönlü ve ucuz bir araçtır.

Fare kemik iliği kaynaklı EC hat STR-12 5 mikron gözenekli ekler üzerinde yetiştirildi. EM büyüme oranı, bir mikroskop altında kontrol edildi ve AT 100% konfluent olduğunda, ekler 3D cihazın alt bölmeye kuyu içine transfer edildi. Hemen ekler yerleştirmeden önce, alt bölmenin kuyu Kültür ortamında tek başına (negatif kontrol) ya da stromal hücre türevli faktör-1 (, 5 ng / ml ve 50 ng / ml, SDF-1) ile takviye edilmiş ortam ile doldurulmuştur. Bundan sonra, 3D Cihaz monte edildi ve protokolde tarif edildiği gibi orta bölmesi ile dolduruldu. Cihazın üst bölmesine sirküle edilecek Test hücreleri taze fare kemik iliği hücreleri (hazne başına 3.5 x 10 6 hücre) hasat edilmiştir. 0.8 dyn / cm 2 tanımlanmış bir kesme gerilimi, 0.2 ml / dk &#39;da peristaltik pompa hızını ayarlayarak uygulanmıştır. Tüm çalışma sistemi daha sonra 37 ° C ve ce de% 5 CO 2 inkübatör yerleştirildills 4 saat için AB tek tabaka ile dolaşımını ve etkileşim için izin verildi. Bu süre sonunda, dolaşımdaki hücreleri odası sökülme, toplandı ve protokolde tarif edildiği gibi ekler çıkarıldı. Transmigrated hücreler taze ortam içinde yeniden süspansiyon haline getirildi yıkanmış alt gözleri, hasat ve koloni-oluşturucu hücre (CFC) analizi (Şekil 3), hematopoietik büyüme faktörleri ile desteklenmiş metil kültürleri aktarılmıştır. Beklendiği gibi, CFC belirgin bir şekilde daha fazla sayıda kuyu başına 5 ng / ml, SDF-1 içeren ortamda veya daha 50 ng / ml, SDF-1 içeren oyuklara EM tek tabaka üzerinde göç ettiğini bulduk. Daha önce tarif edildiği gibi, hücre göçü incelemek için kullanılabilir in vitro teknikler mevcut hiçbiri göç eden hücre ekstravazasyon desteklemek için EC yeteneği üzerindeki yerel mikro etkisini test etmek yeteneğine sahiptir. Bu, 3B cihazı ile elde edilebilir nasıl göstermek için,EM tabakası ve kemik iliği stromal hücreleri üzerinde bir tabaka hematopoetik hücreler dolaşımdaki incelenmiştir ekstravazasyon. Bunun için, stromal hücreler bir tabaka ihtiva eden bir ikinci (alt) uç alt plaka (Şekil 4), AT tek tabaka içeren, üst uç yan yana edildi. Yukarıda tarif edilen ve transmigrated hücreleri kuyulardan hasat ve sayılmıştır gibi Deney daha sonra gerçekleştirildi. Sonuçlar, AT tek tabaka altında stromal hücreler ek bir tabakanın yerleştirilmesi önemli ölçüde SDF-1 doğru hematopoietik hücreleri (Şekil 4) arasında geçiş arttığını gösterdi. Bu bulgu, yerel mikro doku hücreleri dolaşımdaki işe katkıda kavramı ile tutarlıdır. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig1.jpg" /> <strong&gt; Şekil 1. 3D akış odası cihaz. A: hava geçirmez 3D cihaz, değiştirilebilir bir gözenekli membran (PM) ile ayrılmış iki bölme oluşur. EM sonra, üst ve alt bölmeler arasında bir bariyer oluşturur membran üzerinde yetiştirilir. Tanımlı kayma gerilmeleri sürekli bir infüzyon peristaltik pompa kullanılarak Perfüze medya 3D cihazının üst bölmesi uygulanır. Veya EC (AC) bağlı; dolaşan hücreleri ya olmayan etkileşim (NIC), (RC &#39;rulo&#39;) geçici AT ile etkileşim vardır. Yapışık hücrelerin bir alt cihazının (TM) bölgesinin alt statik bölmesine EM tabaka boyunca transmigrates B:. 3D cihazının bir üstten görünümünü çizimi (üst panel). . Yatay kesit görünüşünü (alt panel) üst zarı (kırmızı) konumunu, alt zar (yeşil) ve de (mavi) C altındaki gösterir: isometriDört vidayı, bir üst akrilik üst blok, bir üst oda mühür ve düşük membranlar, alt o-ring, ve 3-de akrilik alt blok D:. 3D akışının bir fotoğraf c görünüm cihazın ayrılmaz bir parçası göstermektedir peristaltik bir pompa odası ve bir gaz değişim ünitesine bağlanır. Sistem, bir steril bir başlık içinde monte edilmiş ve daha sonra bir hücre kültürü inkübatöründe aktarılır. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig2.jpg" /> Şekil 2. 3D cihaz sisteminin şematik. Çizim sistemi oluşturmak için gerekli olan üç durak gösterir. Kültür ortamı, peristaltik pompa tarafından oluşturulan negatif basınç girişinden içeri çekilir. Orta akışını ekler cihaza yerleştirilmesini sağlamak için Durdur # 1 kesilir. Odası kapatıldıktan sonra, pompa şalterleri olduğunutekrar dür ve odanın hemen ekler üzerinde yetiştirilen hücre kurumasını önlemek için ortam ile doldurulur. Durdurma 2. gaz alış-veriş ünitesinin yerleştirilmesini ortam sağlar. 3. durdurma akışı giriş ve çıkış bağlantısı için durdurulması için izin verir. Akış pompa üzerinde bir anahtar kullanarak gaz değişimi ünitesi ile hava kabarcıklarını çıkarmak için bir saat yönünde veya tersi yönde yönlendirilebilir. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig3.jpg" /> Şekil 3,. 3D Cihaz fizyolojik Gerilmenin koşullarda hematopoietik progenitörlerin SDF-1-dolayımlı göçü destekler. A: Üç cihazları (alt bölmesinde her birinde 3 kuyu) montajı ve paralel olarak çalıştırılmıştır. Tek başına ortam veya 5 veya 50 ng / ml &#39;de SDF-1 içeren ortamda alt bölme oyuklara ilave edildi. Fare boNE kemik iliği hücreleri, 4 saat boyunca cihazlar dolaşmasına izin verildi. Bundan sonra, her bir cihaz sökülme ve SDF-1 (sarı) doğru transmigrated olan hücreler, alt kuyularından sayılır ve hematopoietik büyüme faktörleri (GF) ile desteklenmiş metilselüloz içinde kültürlendi. On dört gün sonra, koloniler mikroskop altında skorlandı B:. Alt bölmeleri kurtarıldı atalarıdır sayısı (koloni oluşturan hücreler, CFC) ± ortalama durumu başına üç kuyu SD olarak gösterilir. * P &lt;0.05. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig4.jpg" /> Şekil 4. Hematopoietik hücrelerin ve endotel hücreler arası etkileşimleri üzerinde mikro etkisi. A: Çizim kültürlü st ile ikinci bir gözenekli membran konumunu gösterirAB ile üst membran altında romal fibroblast (SF). . Diğer kısaltmalar Şekil 1A B açıklanmıştır:. Kültürlü SF üst membran altında yerleştirildi ile ek membran (alt uç) C: Üç cihazlar (her birinde 3 kuyu) paralel olarak çalıştırılmıştır. Tek başına ortam veya 50 ng / ml, SDF-1 SDF-1 içeren ortamda alt bölme oyuklara ilave edildi. Negatif kontrol odaları SC, SDF-1, ya da her ikisi de ihmal. Kemik iliği hücreleri 37 ° C de 4 saat için dolaşmaya bırakılmıştır Bundan sonra, her bir cihaz sökülme ve transmigrated hücreleri alt bölme kuyulardan toplanmış ve sayılmıştır. Geri transmigrated hücre sayısı koşulu başına üç kuyu ± ortalama SD olarak gösterilir. * P &lt;0.05.

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions at JoVE.com

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Üç boyutlu akış odası cihaz bir roman<em&gt; In vitro</emGerilmenin fizyolojik koşullar altında dolaşan hücre ekstravazasyonu çağlayan nicel ve adım adım değerlendirilmesi için&gt; teknoloji. Cihaz bu nedenle hücre göçü temel, klinik öncesi ve klinik çalışmalar için önemli bir ihtiyaç doldurur.

Fizyolojik Akış Koşullarında Sirkülasyon Hücre Kemokin-yönettiği Ekstravazasyon Eğitim Bir Roman Üç boyutlu Akış Odası Cihazı

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

a-novel-three-dimensional-flow-chamber-device-to-study-chemokine

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.3K Görüntüleme.  Torrey Pines Institute for Molecular Studies. Üç boyutlu akış odası cihaz bir roman In vitro teknoloji. Cihaz bu nedenle hücre göçü temel, klinik öncesi ve klinik çalışmalar için önemli bir ihtiyaç doldurur.

Video: A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well quantifiable fluid shear stresses1.
Our flow chamber design and flow circuit (Fig. 1) contains a transparent viewing region that enables testing of cell adhesion and imaging of cell morphology immediately before flow (Fig. 11A, B), at various time points during flow (Fig. 11C), and after flow (Fig. 11D). These experiments are illustrated with human umbilical cord blood-derived endothelial progenitor cells (EPCs) and porcine EPCs2,3.
This method is also applicable to other adherent cell types, e.g. smooth muscle cells (SMCs) or fibroblasts.
The chamber and all parts of the circuit are easily sterilized with steam autoclaving. In contrast to other chambers, e.g. microfluidic chambers, large numbers of cells (&gt; 1 million depending on cell size) can be recovered after the flow experiment under sterile conditions for cell culture or other experiments, e.g. DNA or RNA extraction, or immunohistochemistry (Fig. 11E), or scanning electron microscopy5. The shear stress can be adjusted by varying the flow rate of the perfusate, the fluid viscosity, or the channel height and width. The latter can reduce fluid volume or cell needs while ensuring that one-dimensional flow is maintained. It is not necessary to measure chamber height between experiments, since the chamber height does not depend on the use of gaskets, which greatly increases the ease of multiple experiments. Furthermore, the circuit design easily enables the collection of perfusate samples for analysis and/or quantification of metabolites secreted by cells under fluid shear stress exposure, e.g. nitric oxide (Fig. 12)6.

We are describing a method to subject adherent cells to laminar flow shear stress in a sterile continuous flow circuit. The cells' adhesion, morphology can be studied through the transparent chamber, samples obtained from the circuit for metabolite analysis and cells harvested after shear exposure for future experiments or culture.

Laminer Akış Kesme Stres altında endotel progenitör hücrelerin değerlendirin Paralel plakalı Akış Odası ve Sürekli Akış Devre

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Biyomühendislik

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling in the tumor microenvironment 1. Previously, research on the tumor microenvironment has focused primarily on tumor-stromal interactions 1-2. However, the tumor microenvironment also includes a variety of biophysical forces, whose effects remain poorly understood. These forces are biomechanical consequences of tumor growth that lead to changes in gene expression, cell division, differentiation and invasion3. Matrix density 4, stiffness 5-6, and structure 6-7, interstitial fluid pressure 8, and interstitial fluid flow 8 are all altered during cancer progression.
Interstitial fluid flow in particular is higher in tumors compared to normal tissues 8-10. The estimated interstitial fluid flow velocities were measured and found to be in the range of 0.1-3 &mu;m s-1, depending on tumor size and differentiation 9, 11. This is due to elevated interstitial fluid pressure caused by tumor-induced angiogenesis and increased vascular permeability 12. Interstitial fluid flow has been shown to increase invasion of cancer cells 13-14, vascular fibroblasts and smooth muscle cells 15. This invasion may be due to autologous chemotactic gradients created around cells in 3-D 16 or increased matrix metalloproteinase (MMP) expression 15, chemokine secretion and cell adhesion molecule expression 17. However, the mechanism by which cells sense fluid flow is not well understood. In addition to altering tumor cell behavior, interstitial fluid flow modulates the activity of other cells in the tumor microenvironment. It is associated with (a) driving differentiation of fibroblasts into tumor-promoting myofibroblasts 18, (b) transporting of antigens and other soluble factors to lymph nodes 19, and (c) modulating lymphatic endothelial cell morphogenesis 20.
The technique presented here imposes interstitial fluid flow on cells in vitro and quantifies its effects on invasion (Figure 1). This method has been published in multiple studies to measure the effects of fluid flow on stromal and cancer cell invasion 13-15, 17. By changing the matrix composition, cell type, and cell concentration, this method can be applied to other diseases and physiological systems to study the effects of interstitial flow on cellular processes such as invasion, differentiation, proliferation, and gene expression.

Interstitial fluid flow is elevated in solid tumors and can modulate tumor cell invasion. Here we describe a technique to apply interstitial fluid flow to cells embedded in a matrix and then measure its effects on cell invasion. This technique can be easily adapted to study other systems.

Tümör Hücre Invasion üzerine İnterstisyel Akışkan Etkilerinin Ölçülmesi için üç boyutlu Hücre Kültürü Modeli

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which impose a polarized phenotype to cells by physical constraints. Once inside channels, cells have only two possibilities: move forward or backward. This simplified migration in which directionality is restricted facilitates the automatic tracking of cells and the extraction of quantitative parameters to describe cell movement. These parameters include cell velocity, changes in direction, and pauses during motion. Microchannels are also compatible with the use of fluorescent markers and are therefore suitable to study localization of intracellular organelles and structures during cell migration at high resolution. Finally, the surface of the channels can be functionalized with different substrates, allowing the control of the adhesive properties of the channels or the study of haptotaxis. In summary, the system here described is intended to analyze the migration of large cell numbers in conditions in which both the geometry and the biochemical nature of the environment are controlled, facilitating the normalization and reproducibility of independent experiments.

A quantitative method to study spontaneous migration of cells in a one-dimensional confined microenvironment is described. This method takes advantage of microfabricated channels and can be used to study migration of large number of cells under different conditions in single experiments.

Microfabricated Kanallar Hücre Göç Çalışması

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury leading to permanent pathological damage. Existing conventional assays allow the analysis of leukocyte adhesion molecules only after the extraction of leukocytes from the blood. This requires the blood to undergo several steps before peripheral blood leukocytes (PBLs) can be ready for analysis, which in turn can stimulate PBLs influencing the research findings. The autoperfused micro flow chamber assay, however, allows scientists to study early leukocytes functional dysregulation using the systemic flow of a live mouse while having the freedom of manipulating a coated chamber. Through a disease model, the functional expression of leukocyte adhesion molecules can be assessed and quantified in a micro-glass chamber coated with immobilized endothelial adhesion molecules ex vivo. In this model, the blood flows between the right common carotid artery and left external jugular vein of a live mouse under anesthesia, allowing the interaction of native PBLs in the chamber. Real-time experimental analysis is achieved with the assistance of an intravital microscope as well as a Harvard Apparatus pressure device. The application of a flow regulator at the input point of the glass chamber allows comparable physiological flow conditions amongst the experiments. Leukocyte rolling velocity is the main outcome and is measured using the National Institutes of Health open-access software ImageJ. In summary, the autoperfused micro flow chamber assay provides an optimal physiological environment to study leukocytes endothelial interaction and allows researchers to draw accurate conclusions when studying inflammation.

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Here, we present a protocol that allows the investigator to assess leukocyte recruitment dynamics ex vivo by connecting a chamber coated with endothelial-derived adhesion molecules to the circulatory system of a mouse. This method offers significant advantages since it allows for leukocyte assessment under relative biological conditions.

Bir Flow Koşullarında lökosit-endotel Etkileşimleri değerlendirilmesi<em&gt; Ex vivo</em&gt; Autoperfused Microflow Odası Deneyi

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Planar Gradient Difüzyon Sistemi 3D Kollajen Matrix Kemotaksis Araştırma

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

Nötrofil Hicret altında Fizyolojik Akış sırasında endotel hücre-hücre Eklemlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted in the concept of the leukocyte adhesion cascade. However, the exact molecular mechanisms involved in leukocyte recruitment have not yet been fully identified. Since leukocyte recruitment remains an important subject in the field of infection, inflammation, and (auto-) immune research, we present a straightforward laminar flow-based assay to study underlying mechanisms of the adhesion, de-adhesion, and transmigration of leukocytes under venous and arterial flow regimes. The in vitro assay can be used to study the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners in different models of vascular inflammation. This protocol describes a laminar flow-based assay using a parallel-flow chamber and an inverted phase contrast microscope connected to a camera to study the interactions of leukocytes and endothelial cells or platelets, which can be visualized and recorded then analyzed offline. Endothelial cells, platelets, or leukocytes can be pretreated with inhibitors or antibodies to determine the role of specific molecules during this process. Shear conditions, i.e. arterial or venous shear stress, can be easily adapted by the viscosity and flow rate of the perfused fluids and the height of the channel.

Leukocytes avidly interact with vascular cells and platelets after vessel wall injury or during inflammation. Here, we describe a straightforward laminar flow-based assay to characterize the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners.

Lökosit işe kültürlü damar hücreleri ve yapışık trombositler üzerinde araştırmak için Laminar akış tabanlı deneyleri

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, MZBs must migrate up the shear force of blood flow. We present here a method for analyzing this flow-induced MZB migration in vitro. First, MZBs are isolated from the mouse spleen. Second, MZBs are settled on integrin ligands in flow chamber slides, exposed to shear flow, and imaged under a microscope while migrating. Third, images of the migrating MZBs are processed using the MTrack2 automatic cell tracking plugin for ImageJ, and the resulting cell tracks are quantified using the Ibidi chemotaxis tool. The migration data reveal how fast the cells move, how often they change direction, whether the shear flow vector affects their migration direction, and which integrin ligands are involved. Although we use MZBs, the method can easily be adapted for analyzing migration of any leukocyte that responds to the force of shear flow.

Marginal zone B cells (MZBs) respond to the force of shear flow by re-orienting their migration path up the flow. This protocol shows how to record and analyze the migration using a fluidics unit, pump, microscope imaging system, and free software.

Yamultma akış kaynaklı geçiş antikorundan marjinal bölge B hücrelerinin in Vitro analizine

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of activated leukocytes across the vascular endothelium into key organs can lead to organ failure. A physiologically relevant biomimetic microfluidic assay (bMFA) has been developed and validated using several experimental and computational techniques, which can reproduce the entire leukocyte rolling/adhesion/migration cascade to study leukocyte-endothelial cell interactions. Microvascular networks obtained from in vivo images in rodents were digitized using a Geographic Information System (GIS) approach and microfabricated with polydimethylsiloxane (PDMS) on a microscope slide. To study the effect of shear rate and vascular topology on leukocyte-endothelial cell interactions, a Computational Fluid Dynamics (CFD) model was developed to generate a corresponding map of shear rates and velocities throughout the network. The bMFA enables the quantification of leukocyte-endothelial cells interactions, including rolling velocity, number of adhered leukocytes in response to different shear rates, number of migrated leukocytes, endothelial cell permeability, adhesion molecule expression and other important variables. Furthermore, by using human-related samples, such as human endothelial cells and leukocytes, bMFA provides a tool for rapid screening of potential therapeutics to increase their clinical translatability.

In this protocol, a biomimetic microfluid assay, which can reproduce a physiologically relevant microvascular environment and reproduce the entire leukocyte adhesion/migration cascade, is employed to study leukocyte-endothelial cell interactions in inflammatory disease.

Enflamasyon Sırasında Lökosit-Endotelyal Hücre Etkileşimini İnceleyen Mikrofizyolojik Bir Sistem

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of ...

A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between cells, the extracellular matrix, and soluble and non-soluble chemical factors (e.g., chemoattractants). Standard methods for measuring the migration of cells, such as the Boyden chamber assay, work by counting cells on either side of a divider. These techniques are easy to use; however, they offer little geometric modification for different applications. In contrast, microfluidic devices can be used to observe cell migration with customizable concentration gradients of soluble factors1,2. However, methods for making microfluidics based assays can be difficult to learn.
Here, we describe an easy method for creating cell culture chambers to measure cell migration in response to chemical concentration gradients. Our cell migration chamber method can create different linear concentration gradients in order to study cell migration for a variety of applications. This method is relatively easy to use and is typically performed by undergraduate students.
The microchannel chamber was created by placing an acrylic insert in the shape of the final microchannel chamber well into a Petri dish. After this, poly(dimethylsiloxane) (PDMS) was poured on top of the insert. The PDMS was allowed to harden and then the insert was removed. This allowed for the creation of wells in any desired shape or size. Cells may be subsequently added to the microchannel chamber, and soluble agents can be added to one of the wells by soaking an agarose block in the desired agent. The agarose block is added to one of the wells, and time-lapse images can be taken of the microchannel chamber in order to quantify cell migration. Variations to this method can be made for a given application, making this method highly customizable.

This protocol details a customizable method to measure cell migration in response to chemoattractants that may also be used to determine the diffusion rate of a drug out of a polymer matrix.

Ölçme Hücre Göç Bir Özelleştirilebilir Odası

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between ...