وأيد CR هاردينغ من قبل studentship WT086724 يلكوم ترست.

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

غاليريا mellonella نموذج اليرقات لعدوى البكتيريا المستروحة هو أداة مفيدة لفي الدراسات المجراة المرضية. هنا يظهر أن عددا من جوانب العدوى البلاعم يمكن تلخيصها في G. نموذج mellonella، بما في ذلك دور نقطة / آي سي إم T4BSS في الفوعة وتكرار البكتيرية وتوطين دوت / آي سي إم-المستجيب صدق. بالإضافة إلى ذلك، علينا أن نظهر أن المانع من الأكتين البلمرة الكيميائية يقلل بشكل ملحوظ وفيات اليرقات، ومحاكاة النتائج التي تم الحصول عليها في 47 macophages والأدلة المؤيدة التي تدخيل البكتيريا هو مطلوب ليسبب وفيات اليرقات. سابقا، وقد ثبت أن الاختلافات في الفوعة بين L. سلالات المستروحة ينظر في النماذج عدوى أخرى يمكن التحقق منها في G. مطلوب mellonella وأن تحريض عوامل الفوعة في مرحلة النمو بعد الأسي ل الفوعة البكتيرية <suع&gt; 36، مؤكدا أن G. mellonella هو نموذج مناسب لL. عدوى المستروحة. تحديد كفو من L. المستروحة من اليرقات المصابة إما منفردة أو التهابات مختلطة يزيد كثيرا من فائدة هذا النموذج. سابقا، وقد تم اكتشاف العديد من العوامل التي لها آثار خفية على النسخ المتماثل البكتيرية في نماذج واحدة أو أكثر من العدوى 29،48-51. على الرغم من أن اليرقات لا تمتلك نظام المناعة التكيفية، وجود استجابة مناعية فطرية يوفر اختيار أقوى مقارنة الضامة وحدها، والتي قد تؤدي إلى تضخيم الظواهر خفية. وبالتالي، فمن الممكن أنه في حين أن هذه السلالات ربما لن تؤثر بشكل كبير وفيات اليرقات، فإنها قد تثبت انخفض تكرار البكتيرية أو اللياقة البدنية في G. نموذج mellonella. وكذلك تكرار L. المستروحة في اليرقات، لقد أظهرنا استنزاف كرية دموية كبيرة في وقت متأخر من العدوى. كما L.ومن المتوقع أن ليز الخلايا المضيفة في نهاية دورة النسخ المتماثل الخاص به، وقياس نضوب كرية دموية قد تكون أيضا بمثابة القياس غير المباشر النسخ المتماثل البكتيرية المستروحة. وقد سبق أن ارتبط مع نضوب كرية دموية فيات الحشرات في العدوى 3،52، على الرغم من أن النتائج الأخيرة تشير إلى أن هذه الصورة هي أكثر تعقيدا من الأولى belived 37. في الآونة الأخيرة، وقد تبين أن تجويع اليرقات يؤدي إلى زيادة التعرض للإصابة من خلال قمع الاستجابات المناعية 53. في المقايسات وصفها هنا، واليرقات لا يتغذى طوال مدة الدراسة وليس من المعروف جيدا كيف اليرقات تتغذى سترد على L. عدوى المستروحة. واحدة من مزايا G. mellonella كما كائن النموذج هو سهولة استخراج والكمي للhemocytes من اليرقات المصابة. وقد أظهرت أشرطة الفيديو السابقة أساليب مختلفة لاستخراج hemocytes من الحشرات 54،55 ومع ذلك، فإن التقىهود المقدمة هنا هي بسيطة ومناسبة لمعالجته فورا. مرة واحدة المستخرج، hemocytes يمكن قياسها كميا بسهولة، وتستخدم لالمناعي، المجهر الإلكتروني النافذ 36 أو 56 أو التدفق الخلوي مثقف وأصاب فيفو السابقين 3 السماح للاستجابة الخلايا للإصابة ليتم التحقيق في التفاصيل. هذا يزيد بشكل كبير من المرونة للنموذج. واحد التحذير إلى المناعي في G. mellonella هو إمدادات محدودة من الأجسام المضادة ضد التحقق من صحة G. البروتينات mellonella. ومع ذلك، فقد أظهرت الدراسات خلق أجسام مضادة ضد بروتينات اليرقات 57 و الأجسام المضادة ضد البروتينات المرتبطة المناعة البشري عثر على الاعتراف G. البروتينات mellonella 11 مما يدل على إمكانية المناعي على G. hemocytes mellonella. سهولة G. يسمح للعدوى mellonella السريع، شاشات الإنتاجية المتوسطة التي يمكن أنيمكن استخدامها لمقارنة الفوعة من مختلف الأنواع والسلالات والبكتيريا يمكن استخدامها لمزيد من تحليل عوامل الفوعة التي سبق تحديدها مثل جزيئات الالتصاق 58 أو نظام إفراز نوع 2 59 التي مطلوبة من أجل الفوعة في نماذج أخرى. بالإضافة إلى ذلك، سوف استخدام هذا النموذج تسمح بتحديد وتوصيف مزيد من عوامل الفوعة الرواية بما في ذلك يفرز وtranslocated البروتينات المستجيب. في الآونة الأخيرة، وقد تبين أن فسفوليباز النشاط C من L. المستروحة له دور في G. mellonella الفوعة 60 والمطلوب من البروتين المستجيب دوت / آي سي إم SdhA لالفوعة 37. بالإضافة إلى ذلك، لقد أثبتنا في الآونة الأخيرة أن هناك علاقة بين الظواهر التي لوحظت في G. وmellonella في الماوس سلالة A / J 37. هذا يؤكد قيمة هذه الأداة لتكمل الأوالي البيئية وحيدة الخلية المضيفة ومورينماذج العدوى شمال شرق. وزاي سوف نموذج mellonella تصبح أكثر قيمة في المستقبل، وبمجرد أن التسلسل الجيني اليرقات وسوف تكون متاحة ويتم وضع المزيد من الأدوات الجينية. وتشمل الخطوات في هذا الاتجاه الذي نشر مؤخرا تفاصيل Transcriptome على المناعية ذات الصلة 61 وتشكيل مبادرة للنهوض إسكات الجينات في قشريات الجناح النيابة 62. باستخدام G. mellonella اليرقات، لدينا عدد من بسيطة، قراءات السريع لالفوعة البكتيرية التي يمكن استخدامها لتحقيق التسبب في L. المستروحة. إنشاء هذه المقايسات وفحص أوسع من L. سوف سلالات المستروحة والمصليين زيادة فائدة هذه الأداة الجديدة، وسوف تسهم في فهمنا لL. المستروحة المرضية.

وقد أثبتت النماذج الحيوانية للعدوى لا تقدر بثمن في تحديد عوامل الفوعة البكتيرية. ومع ذلك، فقد اكتسبت نماذج اللافقارية اهتماما متزايدا كبديل عملي لنماذج الثدييات التقليدية للعدوى. يرقات عثة الشمع، يتزايد استخدام غاليريا mellonella لدراسة عدد من مسببات الأمراض البشرية الهامة، بما في ذلك إيجابية الجرام 1 والبكتيريا سالبة الجرام 2،3 والعديد من الفطريات المسببة للأمراض 4،5. باستخدام نموذج الحشرات لديها عدد من المزايا على نماذج الثدييات التقليدية، باعتبارها اللافقارية، G. mellonella لا تخضع لقيود أخلاقية من نماذج الثدييات. بالإضافة إلى ذلك، اليرقات يمكن الحفاظ بسهولة، المصابين عن طريق الحقن بدون تخدير، والخضوع المعالجة مع مثبطات الكيميائية 6 والحفاظ الحضانة عند 37 درجة مئوية 7. ومن المثير للاهتمام، وجود علاقة جيدة بين تسببها العديد من الكائنات الحية الدقيقة في G. ميلوقد أنشئت lonella ونماذج الثدييات العدوى 2،8. زيادة فهم نظام المناعة من G. mellonella ساعدت أيضا في توصيف هذا النموذج الحي. على الرغم من أن الحشرات لم يكن لديك جهاز المناعة التكيفية كما وجدت في الثدييات، لديهم الدفاعات الخلوية وعضدي متطورة بما في ذلك إنتاج الببتيدات المضادة للميكروبات 9. Hemocytes هي الوسيط الرئيسي للدفاعات الخلوية وهم الأكثر عددا نوع من الخلايا الموجودة في الدملمف (أو الدم) من G. mellonella 10، هذه الخلايا هي البالعات المهنية وتؤدي وظائف مشابهة لالضامة الإنسان والعدلات من قبل كل من تناول والمهينة البكتيريا في البلعمة؛ الأكل-الليزوزومية مقصورة 10،11 وتشكيل عقيدات حول غزو البكتيريا، وتقييد النسخ المتماثل جسديا البكتيرية 12. الليجيونيلا المستروحة هو الممرض في الجهاز التنفسي التي تسبب pneumoni شديدةو(مرض الفيالقة) في فئات سكانية حساسة مثل كبار السن أو ضعف المناعة 13. تم العثور على البكتيريا بتواجد مطلق في مصادر المياه من الناحيتين البيئية والتي من صنع الإنسان، حيث هو الممرض الأنواع المختلفة من المياه العذبة الأميبات 14،15. يبقى البكتيريا و يعيد ضمن هذه البالعات المهنية من خلال الاستفادة من مجمع متعدد البروتين المعروف باسم نقطة / آي سي إم (خلل في الاتجار عضية / تكاثر الخلايا) اكتب 4 نظام إفراز (T4SS) لنقل من أكثر من 275 البروتينات المستجيب في الخلية المضيفة 16-20. هذه البروتينات تعمل على تخريب طبيعية مسارات أكلة الخلية المضيفة، مما أدى إلى خلق فجوة تحتوي على البكتيريا (LCV). وLCV يتجنب الانصهار مع الجسيمات الحالة وتجند الشبكة الإندوبلازمية بدلا من ذلك (ER) الحويصلات المشتقة، مما أدى إلى حجرة المتخصصة التي تمثل ER الخام 21،22. L. يعتبر المستروحة مسار عرضي الإنسانogen، ونفس الاستراتيجيات التي تسمح لها لتكرار داخل الأميبات، كما تسمح تكرارها في الضامة السنخية الإنسان 23. وقد اتسمت المضيفين الثدييات كنماذج لعدوى البكتيريا الإنسان بما في ذلك الفئران والخنازير الغينية 24،25. ومع ذلك، فإن الغالبية العظمى من سلالات الفئران المقاومة للعدوى البكتيريا 26 مع استثناء من الفطرية البيضاء A / J الماوس، الذي يتطور، والعدوى ومحدودة ذاتيا خفيفة 24. على الرغم من أن نموذج خنزير غينيا أكثر شبها المرض الإنسان 25، وعدم وجود طفرات وزيادة تكلفة يشجع استخدامها 27. بالإضافة إلى ذلك، تم تطوير عدة نماذج اللافقارية للعدوى البكتيريا المستروحة بما في ذلك انواع معينة ايليجانس 28، الدروسوفيلاميلانوجاستر 29 وعدة أنواع من الأميبات 30-32. ومع ذلك، فإن هذه النماذج لديها نقاط ضعف، الفوعة في C. ايليجانس </em&gt; النظام ليس نقطة / آي سي إم تعتمد 28، مما يحد من فائدة هذا الطراز. وقد أثبت نموذج ذبابة الفاكهة فعالة في التحقيق في عوامل الفوعة البكتيرية 29 ويبدو أن واعدة ولكن هذا النموذج لم تتميز بشكل كامل. الأميبات الخلية واحد من المضيفين البيئية للL. المستروحة وتعتبر مثالية للتحقيق في عمل عوامل الفوعة على المستوى الجزيئي 33 ومع ذلك فهناك العديد من الوسطاء هامة للاستجابة الخلية المضيفة للإصابة الثدييات مثل caspases 34. نقاط الضعف في النماذج القائمة، جنبا إلى جنب مع ارتفاع تكلفة والشواغل الأخلاقية المتصلة التجريب الثدييات، أدى إلى البحث عن غيرها من الكائنات النموذج المناسب 29،35. لقد أثبتنا مؤخرا أن G. mellonella هو نموذج مناسب لL. المستروحة المرضية 36،37. هذا البروتوكول تفاصيل التقنيات التجريبية المستخدمة لتصيبG. جي mellonella اليرقات، وتحليل الأخلاق اليرقات، واستخراج hemocytes عن العد والمناعي وتحديد التكرار من قبل قابلة للحياة كفو يهم من اليرقات المصابة.

<table border="1">
 <tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material/ Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ACES yeast extract (AYE) broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4 g ACES, 4 g yeast extract, 0.4 g &alpha;-ketoglutarate, pH 6.9, 400 ml H2O, autoclaved, 4 ml iron solution*, 4 ml cysteine solution* 
		 *add sterile ingredients after autoclaving</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Charcoal buffered yeast extract (CYE) plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>As above, with the addition of 0.6 g activated charcoal and 6 g agar</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sterile iron solution (Ferric Pyrophosphate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6526 </td>
			<td>0.6 mM solution, sterile filtered</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sterile cysteine solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7880</td>
			<td>3.3 mM solution, sterile filtered</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>G. mellonella (waxworms)</td>
			<td>Livefood UK</td>
			<td>W250</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-HA-Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate (TRITC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9037</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-Legionella LPS</td>
			<td>Cambridge Biosciences</td>
			<td>PA1-7227 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-Rabbit IgG Alexa488</td>
			<td>Jackson Immunoreach</td>
			<td>711-485-152</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dulbeccos phosphate buffered saline (D-PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>R1026</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D141</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cytochalasin D</td>
			<td>Biomol International</td>
			<td>BML-T109-0001</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
		 <td></td>
		 <td></td>
		 <td></td>
		 <td>[header]</td>
 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microtiter Syringe</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>24544</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cell counter, double, Improved Neubauer </td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0926</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For centrifuging plates </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any microscope with appropriate filters for the required fluorophores</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For viable cell counting </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Puncture-proof glove</td>
			<td>Turtleskin </td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
 </tbody>
 </table>

use of galleria mellonella as a model organism to study legionella pneumophila infection

الليجيونيلا المستروحة، العامل المسبب لالتهاب رئوي حاد يدعى مرض المحاربين &quot;، هو الممرض الذي يصيب الإنسان مهما ويعيد داخل الضامة السنخية. الفوعة، يتوقف على نظام نقطة / آي سي إم إفراز النوع الرابع (T4SS)، وهو أمر ضروري لإنشاء فجوة متساهلة تكرار المعروفة باسم البكتيريا التي تحتوي على فجوة (LCV). L. يمكن أن تكون على غرار العدوى المستروحة في الفئران ولكن معظم سلالات الفئران ليست متساهلة، مما أدى إلى البحث عن نماذج العدوى الرواية. أظهرنا مؤخرا أن يرقات عثة الشمع من غاليريا mellonella هي مناسبة للتحقيق في L. عدوى المستروحة. G. يستخدم mellonella متزايد لتكون نموذجا للعدوى مسببات الأمراض البشرية وجود علاقة جيدة بين الفوعة العديد من الأنواع البكتيرية في الحشرات والثدييات في النماذج. ومن المكونات الرئيسية من الدفاعات المناعية اليرقات هي hemocytes، والمهنةالبالعات القاعدة الذي يستغرق وتدمير الغزاة. L. المستروحة قادرة على إصابة، تشكيل LCV وتكرار داخل هذه الخلايا. نحن هنا لشرح البروتوكولات لتحليل L. الفوعة المستروحة في G. نموذج mellonella، بما في ذلك كيفية زراعة المعدية L. المستروحة، يمهد للمعالجة اليرقات مع مثبطات، تصيب اليرقات وكيفية استخراج الخلايا المصابة لتقدير والمناعي المجهري. نحن أيضا تصف كيفية قياس تكرار البكتيرية واللياقة البدنية في المقايسات المنافسة. هذه الأساليب تسمح للفحص السريع للالمسوخ لتحديد العوامل الهامة في L. الفوعة المستروحة، واصفا أداة جديدة لمساعدة فهمنا لهذا الممرض المعقدة.

هنا يتجلى أن G. mellonella هو النموذج المناسب، وسهلة الاستخدام لدراسة L. عدوى المستروحة. سابقا وقد تبين أن L. الفوعة المستروحة في الضامة، ونماذج الأميبات الثدييات يعتمد على وجود نظام إفراز دوت / آي سي إم 41-43. G. أصيب mellonella يرقات كما هو موضح أعلاه والفوعة من نوع البرية (WT) وسلالة دوت / آي سي إم التي تعاني من نقص مقارنة. العدوى مع 10 7 كفو من L. أسفرت سلالة المستروحة 130B في وفيات 100٪ في غضون 24 ساعة بعد العدوى (بي). ومع ذلك، فإن L. المستروحة Δ DOTA السلالة، التي ليس لديها نظام إفراز دوت / آي سي إم T4SS وظيفية، وكان عديم الفوعة في هذا الاختبار (الشكل 1). هذا يدل على أن L. الفوعة في المستروحة G. mellonella يعتمد على إزفاء من المستجيبات دوت / آي سي إم، مما يجعل هذا النموذج مناسبة لتوصيفوظيفة هذه البروتينات. في الآونة الأخيرة، فقد تبين أن تثبيط البلعمة بواسطة العلاج مثبط حركة الخلايا زاد susceptibly من اليرقات للعدوى الخميرة المبيضات البيض 6. كما L. المستروحة هو الممرض داخل الخلايا، فقد تقرر تحديد ما إذا كان الإقبال على البكتيريا هو أمر حاسم في التسبب في هذا النموذج. كانت سابقة التجهيز اليرقات مع 10 ميكرولتر من 100 ميكرومتر مثبط حركة الخلايا D (التنمية الشبابية المجتمعية) لمدة 4 ساعة عند 37 درجة مئوية، ثم المصابين 10 7 كفو من WT L. لم 130B المستروحة وفيات رصدها على مدار 24 ساعة العلاج بي مع المانع وحدها لا تؤثر على بقاء اليرقات. ومع ذلك، سابقة التجهيز، اليرقات المصابة عرض أكبر بكثير البقاء على قيد الحياة (P = 0.0066، المفردة T-اختبار) مقارنة مع المعالجة DMSO والحشرات المصابة (الشكل 2). تم إلغاء تأثير العلاج التنمية الشبابية المجتمعية بنسبة 48 بي ساعة (النتائج غير معروضة)، وهذا قد يكون راجعا إلى نصف عمر الدواء في G.mellonella. هذا يدل على أن الإقبال على L. المستروحة إلى G. mellonella hemocytes هو جانب هام من الفوعة الجرثومية. من أجل التحقق من صحة التعبير وتحديد توطين التحت خلوية من البروتين المستجيب في G. mellonella، تم استخراج hemocytes ومعالجتها لالمناعي المجهري. أصيب اليرقات مع WT وΔ DOTA L. المستروحة 130B تعبر عن جزء من المستجيب T4SS محددة جيدا، صدق 41-918، تنصهر إلى 4 علامات HA N-محطة. وقد تجلى هذا المستجيب لربط LCV عبر مجال ملزمة فسفوإينوزيتيد-4-44-الفوسفات. استخدام الألغام المضادة للHA (الحمراء)، ومكافحة البكتيريا (الأخضر) الأجسام المضادة، 4HA-صدق 41-918 مترجمة إلى LCV في hemocytes المصابة (الشكل 3). وقد سبق عرض هذا التعريب في discoideum الأميبات Dictyostelium والضامة في الثدييات 44،45 تؤكد جomparability من هذا الطراز. عادة ما يتم تحديد أهمية البروتينات لالفوعة بمقارنة حركية النمو من النوع البري والبكتيريا متحولة. من أجل متابعة حركية تكرار البكتيرية على مدى الإصابة، تم التضحية ثلاثة اليرقات في كل نقطة زمنية (0، 5، 18، و 24 ساعة بي)، الدملمف جمع وتجميع وCFU/0.1g من الدملمف المستخرج يحدد فيما بعد. بعد تراجع الأولي في 5 ساعة بي، وكفو من البكتيريا WT زيادات تصل إلى 24 ساعة بي ومع ذلك، فإن سلالة Δ DOTA لا يقع تحت تكرارها ويتم مسح في 18 ساعة بي (الشكل 4). قدرة L. منذ فترة طويلة وثقت المستروحة أن يسبب تحلل الضامة في الطريقة التي تعتمد على T4SS 46، ومع ذلك تم إجراء أي دراسات مشابهة في الجسم الحي. تم تحديد تركيز hemocytes المتداولة بنسبة 5، 18، و 24 ساعة بي أصيبوا اليرقات مع WT أو Δ <eم&gt; DOTA L. المستروحة 130B، hemocytes المستخرجة من الحشرات المصابة خلايا قابلة للحياة وعدها باستخدام أسلوب الاستبعاد التريبان الأزرق. في 5 ساعة بي يمكن أن ينظر لا فرق في التهم كرية دموية بين سلالات (الشكل 5). ومع ذلك، في 18 ساعة بي كان هناك انخفاض كبير في تركيز كرية دموية في WT، ولكن ليس Δ DOTA، اليرقات المصابة. هذا الفرق لا تزال قائمة في 24 ساعة بي الانخفاض في عدد كرية دموية، جنبا إلى جنب مع وجود البكتيريا داخل الخلايا كما يراها المناعي، يوحي بأن L. المستروحة يعيد داخل hemocytes ثم lyses لهم، مما يسمح للبكتيريا للخضوع لعدة جولات من النسخ المتماثل. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig1.jpg" /> الشكل 1. الإصابة L. المستروحة يدفع دوت / آي سي إم التي تعتمد على وفيات اليرقات. أصيب 10 يرقات مع برنامج تلفزيوني وحدها أو 10 <sتصل&gt; 7 كفو من النوع البري (WT) أو Δ DOTA L. المستروحة 130B، حضنت في 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة ووقت وفاة سجلت اليرقات. جميع اليرقات المصابة مع WT يستسلم للإصابة خلال 24 ساعة آخر العدوى (بي)، ولكن كان ينظر أي وفيات في اليرقات تلقيح مع برنامج تلفزيوني وحدها أو سلالة Δ DOTA. النتائج هي متوسط ​​ثلاثة تجارب منفصلة، ​​± الانحراف المعياري. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig2.jpg" /> الشكل 2. وفيات تعتمد على استيعاب البكتيرية. L. 10 كانت سابقة التجهيز المستروحة اليرقات مع 10 ميكرولتر من 100 ميكرومتر مثبط حركة الخلايا D (التنمية الشبابية المجتمعية) لمدة 4 ساعة عند 37 درجة مئوية ثم المصابين 10 7 WT وفيات رصدها على مدار 24 ساعة بي اليرقات سابقة التجهيز أظهرت معنويا (P = 0.0066، المفردة T-اختبار) انخفاض وفيات. تمثل نتائج شركة طيران الشرق الأوسطن من أربعة في تجارب مستقلة ± الانحراف المعياري مع 10 يرقات لكل حالة. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig3.jpg" /> الرقم 3. التصوير المناعي البروتينات المستجيب في hemocytes المستخرج. انتزعت Hemocytes من اليرقات المصابة مع L. كانت ملطخة المستروحة 130B WT أو Δ DOTA معربا عن 4HA-صدق 41-918 في 5 ساعة خلايا بي استخدام الألغام المضادة للHA (الحمراء)، ومكافحة البكتيريا (الأخضر) الأجسام المضادة والحمض النووي وصمة عار دابي (الأزرق) لتصور النوى. ولوحظ 4HA-صدق 41-918 WT المحيطة بها، ولكن ليس Δ DOTA، والبكتيريا. شريط النطاق 5 ميكرون. <img alt="الرقم 4" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig4.jpg" /> الشكل 4. L. المستروحة يعيد داخل G. ميلوNELLA بطريقة دوت / آي سي إم تعتمد. أصيب اليرقات مع المستروحة WT أو Δ DOTA L. وعلى 0، 5، 18، و 24 ساعة بي الدملمف من ثلاثة الحشرات المصابة المجمعة، مطلي على لوحات CYE وتحديد كفو و تطبيع لقيحة ووزن الدملمف المستخرج. WT L. المستروحة تكرارها على مدى التجربة في حين تمت تبرئة سلالة Δ DOTA في غضون 18 ساعة بي النتائج هي متوسط ​​ثلاثة تجارب منفصلة ± الانحراف المعياري. <img alt="الرقم 5" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/50964/50964fig5.jpg" /> الرقم 5. عدوى مع WT L. النتائج المستروحة في تدمير كرية دموية كبيرة. انتزعت Hemocytes في 5، 18، و 24 ساعة من بي اليرقات المصابة مع المستروحة WT أو Δ DOTA L. خلايا قابلة للحياة وعدها باستخدام عدادة الكريات. لا فرق فيواعتبر عدد من الخلايا في 5 ساعة بي بين سلالات ولكن في 18 ساعة بي يبقى سوى 15٪ تقريبا من hemocytes في اليرقات المصابة بسلالة WT مقارنة مع سلالة Δ DOTA. النتائج هي متوسط ​​ثلاثة تجارب منفصلة، ​​± الانحراف المعياري.

Watch this Scientific Journal Video about Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection at JoVE.com

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

تأسست مؤخرا يرقة عثة الشمع من غاليريا mellonella باعتبارها في الجسم الحي نموذج لدراسة العدوى المستروحة البكتيريا. هنا، علينا أن نظهر التقنيات الأساسية لتوصيف المرضية من البكتيريا في اليرقات، بما في ذلك التلقيح، وقياس الفوعة البكتيرية والتكرار وكذلك استخراج وتحليل hemocytes المصابة.

استخدام<em&gt; غاليريا mellonella</em&gt; كما كائن نموذج لدراسة<em&gt; البكتيريا المستروحة</em&gt; عدوى

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

use-galleria-mellonella-as-model-organism-to-study-legionella

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

40.0K Views.  Imperial College London.  تأسست مؤخرا يرقة عثة الشمع من غاليريا mellonella باعتبارها في الجسم الحي نموذج لدراسة العدوى المستروحة البكتيريا. هنا، علينا أن نظهر التقنيات الأساسية لتوصيف المرضية من البكتيريا في اليرقات، بما في ذلك التلقيح، وقياس الفوع...

Video: Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

إدخال إجهاد القص في دراسة الالتصاق الجرثومي

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

استخدام متوسط ​​البلغم الاصطناعي لاختبار فعالية المضادات الحيوية لمكافحة<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; في شروط أكثر ملاءمة لالرئة التليف الكيسي

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of insects as infection models provides a valuable alternative. Compared to other non-vertebrate model hosts such as nematodes, insects have a relatively advanced system of antimicrobial defenses and are thus more likely to produce information relevant to the mammalian infection process. Like mammals, insects possess a complex innate immune system1. Cells in the hemolymph are capable of phagocytosing or encapsulating microbial invaders, and humoral responses include the inducible production of lysozyme and small antibacterial peptides2,3. In addition, analogies are found between the epithelial cells of insect larval midguts and intestinal cells of mammalian digestive systems. Finally, several basic components essential for the bacterial infection process such as cell adhesion, resistance to antimicrobial peptides, tissue degradation and adaptation to oxidative stress are likely to be important in both insects and mammals1. Thus, insects are polyvalent tools for the identification and characterization of microbial virulence factors involved in mammalian infections.
Larvae of the greater wax moth Galleria mellonella have been shown to provide a useful insight into the pathogenesis of a wide range of microbial infections including mammalian fungal (Fusarium oxysporum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans) and bacterial pathogens, such as Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes or Enterococcus faecalis4-7. Regardless of the bacterial species, results obtained with Galleria larvae infected by direct injection through the cuticle consistently correlate with those of similar mammalian studies: bacterial strains that are attenuated in mammalian models demonstrate lower virulence in Galleria, and strains causing severe human infections are also highly virulent in the Galleria model8-11. Oral infection of Galleria is much less used and additional compounds, like specific toxins, are needed to reach mortality.
G. mellonella larvae present several technical advantages: they are relatively large (last instar larvae before pupation are about 2 cm long and weight 250 mg), thus enabling the injection of defined doses of bacteria; they can be reared at various temperatures (20 &deg;C to 30 &deg;C) and infection studies can be conducted between 15 &deg;C to above 37 &deg;C12,13, allowing experiments that mimic a mammalian environment. In addition, insect rearing is easy and relatively cheap. Infection of the larvae allows monitoring bacterial virulence by several means, including calculation of LD5014, measurement of bacterial survival15,16 and examination of the infection process17. Here, we describe the rearing of the insects, covering all life stages of G. mellonella. We provide a detailed protocol of infection by two routes of inoculation: oral and intra haemocoelic. The bacterial model used in this protocol is Bacillus cereus, a Gram positive pathogen implicated in gastrointestinal as well as in other severe local or systemic opportunistic infections18,19.

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

Oral and intra haemocolic infection of larvae of the greater wax moth Galleria mellonella is described. This insect can be used to study virulence factors of entomopathogenic as well as mammalian opportunistic bacteria. Rearing of the insects, methods of infection and examples of in vivo analysis are described.

والحشرات<em&gt; جاليريا mellonella</em&gt; نموذجا عدوى قوية المعنية بالتحقيق في إمراض البكتيرية

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

على<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج لدراسة عدم تجانس التمايز بلعم الإنسان والاستقطاب

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is provided to induce sepsis of varying severity in mice using the CLP technique. Autophagy is a fundamental tissue response to stress and pathogen invasion. Two current protocols to assess autophagy in vivo in the context of experimental sepsis are also presented here. (I) Transgenic mice expressing green fluorescence protein (GFP)-LC3 fusion protein are subjected to CLP. Localized enhancement of GFP signal (puncta), as assayed either by immunohistochemical or confocal assays, can be used to detect enhanced autophagosome formation and, thus, altered activation of the autophagy pathway. (II) Enhanced autophagic vacuole (autophagosome) formation per unit tissue area (as a marker of autophagy stimulation) can be quantified using electron microscopy. The study of autophagic responses to sepsis is a critical component of understanding the mechanisms by which tissues respond to infection. Research findings in this area may ultimately contribute towards understanding the pathogenesis of sepsis, which represents a major problem in critical care medicine.

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method. Current protocols to assess autophagy in vivo in the context of CLP-induced sepsis are presented here: A protocol for measuring autophagy using (GFP)-LC3 mice, and a protocol for measuring autophagosome formation by electron microscopy.

الأعور ربط والبزل التي يسببها تعفن الدم نموذجا لدراسة الالتهام الذاتي في الفئران

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

استخدام<em&gt; الشيجلا الفلكسنرية</em&gt; لدراسة التفاعلات الالتهام الذاتي الهيكل الخلوي

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

إنشاء والأمثل لإعداد إنتاجية عالية لدراسة<em&gt; المكورات العنقودية البشروية</em&gt; و<em&gt; المتفطرة البحرية</em&gt; عدوى نموذجا لاكتشاف المخدرات

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

اللثوية Porphyromonas كما كائن نموذج لتقييم تفاعل البكتيريا اللاهوائية مع خلايا المضيف

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Zebrafish as a Model to Assess the Teratogenic Potential of Nitrite

High nitrate levels in the environment may&#160;result in congenital defects or miscarriages in humans. Presumably, this is due to the conversion of nitrate to nitrite by gut and salivary bacteria. However, in other mammalian studies, high nitrite levels do not cause birth defects, although they can lead to poor reproductive outcomes. Thus, the teratogenic potential of nitrite is not clear. It would be useful to have a vertebrate model system to easily assess teratogenic effects of nitrite or any other chemical of interest. Here, we demonstrate the utility of zebrafish (Danio rerio) to screen compounds for toxicity and embryonic defects. Zebrafish embryos are fertilized externally and have rapid development, making them a good model for teratogenic studies. We show that increasing the time of exposure to nitrite negatively affects survival. Increasing the concentration of nitrite also adversely affects survival, whereas nitrate does not. For embryos that survive nitrite exposure, various defects can occur, including pericardial and yolk sac&#160;edema, swim bladder noninflation, and craniofacial malformation. Our results indicate that the zebrafish is a convenient system for studying the teratogenic potential of nitrite. This approach can easily be adapted to test other chemicals for their effects on early vertebrate development.

Exposure to teratogens may cause birth defects. Zebrafish are useful for determining the teratogenic potential of chemicals. We demonstrate the utility of zebrafish by exposing embryos to various levels of nitrite and also at different times of exposure. We show that nitrite can be toxic and cause severe developmental defects.

الزرد نموذجا لتقييم إمكانات المسخية من النطرون

High nitrate levels in the environment may&#160;result in congenital defects or miscarriages in humans. Presumably, this is due to the conversion of ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

البكتيريا المستروحة الخارجي غشاء الحويصلات: عزل وتحليل إمكاناتهم الموالية للالتهابات في الضامة

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...