يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في حقل المبيضات حول فدة الإجهاد ومساهمات جينات محددة في هذه العمليات. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تتجنب المخاوف المتعلقة باستخدام الحيوانات ، وهي قوية وسريعة ورخيصة ، وتوفر أعدادًا عالية من الحيوانات في التجربة الواحدة. بشكل عام ، فإن الأفراد الذين هم جدد على هذه الطريقة من المرجح أن النضال قليلا لأنهم سوف يكون لديهم بعض الصعوبة في تقييم قابلية البقاء دودة قبل بداية التجربة أو قد يكون لديهم بعض القضايا مع حقن غير متناسقة من الديدان.
طلب اليرقات من تجار الجملة والموردين التي لا تقدم الهرمونات أو المضادات الحيوية أو غيرها من العلاجات إلى اليرقات والتي هي قادرة على شحن وتسليم العينات الحية. عند وصول اليرقات ، تحقق من كل حاوية للتأكد من صحة اليرقات وقابليتها للتطبيق. سوف تكون مغمورة تماما اليرقات صحية تحت الفراش، تتحرك، وتمتلك الأصفر، لون تان الضوء مع عدد قليل من اليرقات التي تحتوي على علامات سوداء أو تلونات على طول الجسم.
يمكن تخزين اليرقات في حاوياتها في مساحة تهوية في درجة الحرارة المحيطة لمدة تصل إلى أسبوعين. لإعداد خلايا الخميرة لعدوى جاليريا ميلونيلا، تنمو سلالات C.albicans ليتم حقنها بين عشية وضحاها في ثلاثة ملليلتر من خميرة الطازجة بيبتون- مرق dextrose لكل سلالة في أنابيب الثقافة القياسية على طبل الدورية في سرعة متوسطة و 30 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي، وغسل الخميرة ثلاث مرات في خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني جديد في الطرد المركزي.
بعد الغسيل الأخير ، تُعيد تثبيت الخلايا في ملليلتر واحد من PBS الطازجة ونقل الخميرة إلى أنبوب microcentrifuge. بشكل متسلسل تمييع الخلايا في برنامج تلفزيوني إضافي في واحد إلى 100، واحد إلى 1، 000، واحد إلى 100، 000 تركيزات، وفرز الخلايا من واحد إلى 100 واحد إلى 1، 000 dilutions. ضبط الخلايا إلى 2.5 مرة 10 إلى الخلايا السابعة لكل ملليلتر من تركيز برنامج تلفزيوني في أنبوب جديد microcentrifuge، وتأكيد دقة الجرعة المعدية عن طريق طلاء الحجم المناسب من واحد إلى 100، 000 تخفيف لتحقيق 100 مستعمرة تشكيل وحدات على واحد الخميرة بيبتون ديكستروز لوحة أغار لكل ثقافة لاستخدامها في العدوى.
لتصيب اليرقات مع خلايا المبيضات، نشرت أولا كمية صغيرة من الفراش الدودة الشمعية في واحد فارغ، 100 في 15 سنتيمترا طبق بيتري معقمة لكل تكرار بيولوجي، وتعقيم حقنة 10 ميكرولتر مجهزة إبرة 26 قياس ثلاث مرات مع 10 ميكرولترات من 70٪ الإيثانول وثلاث مرات مع 10 ميكرومترات من PBS لكل غسل. بعد ذلك ، دوامة تخفيف التطعيم من C.albicans ، وتحميل 10 ميكرولترات من الخلايا في الحقنة. افتح حاوية واحدة من يرقات G.mellonella ، واستخدم إصبعًا لتحويل الفراش بعناية للكشف عن اليرقات ، واختيار يرقات تان صفراء ذات حجم مماثل تتمتع بصحة جيدة مع عدم وجود تصبغ أسود على الأجسام ، باستخدام الأصابع الوسطى والمفهرسة والإبهام لالتقاط يرقة واحدة بطريقة مشابهة لفهم قلم رصاص.
لفة اليرقة على ظهرها بحيث تواجه الساقين حتى، وعقد طول كامل من الجسم بين الأصابع والإبهام بحيث اليرقة غير قادر على حليقة أو سحب بعيدا عن الحقن. مع ناحية أخرى، تدوير الحقنة بحيث شطبة إبرة تواجه لأعلى، وأدخل ببطء كامل طول شطبة في الجسم عند تقاطع مع الساق اليسرى في أقصى الظهر، وضمان أن الإبرة تخترق الجسم ولا تدفع ببساطة جسم اليرقة إلى الداخل. الخطوة الأكثر أهمية في هذا الإجراء هو حقن الدودة الشمعية بطريقة تقلل من الأضرار التي لحقت بالجسم اليرقات ويتم تلقيح البلح الكامل.
ثم حقن كامل 10 ميكرولترات من المبيضات inoculum، واستخراج الإبرة. شارك في إيواء ما يصل إلى 10 يرقات حقنت من نفس ثقافة المبيضات في كل طبق بيتري 100 في 15 ملليمتر بعد التطعيم ، وتحتضن اليرقة عند 37 درجة مئوية لمدة ثمانية أيام. تحقق من الأطباق كل 24 ساعة لمراقبة الموت.
يمكن في البداية تقييم الوفيات عن طريق التصبغ المظلم ، وتشكيل بقع سوداء أو أجسام ، وعدم وجود حركة. لتأكيد الوفيات ، استخدم الملاقط لتلف بلطف اليرقات المحتضرة على ظهورهم وكزة طفيفة على الجانب السفلي لليرقة مع الملاقط. يمكن تضمين اليرقات التي تبدأ في العث في التحليل ولكن يجب إزالتها إذا بدأت في العث.
لا يوجد فرق كبير في حركة موت G.mellonella بين اليرقات المصابة صفر أو 10 أيام بعد الوصول. تنشأ العلامات المميزة للمرض في اليرقات من كلا الأعمار التي تستسلم للعدوى ، بدءًا من تغير اللون الذي يفسح المجال للبقع السوداء قبل فقدان الحركة التامة والموت في نهاية المطاف. عدوى مع C.albicans يسرع هذه العملية من تغير اللون والمراضة ولكن لا يغير بشكل كبير من سلسلة من علامات فينوتيبيك مما يؤدي إلى الموت مقارنة مع اليرقات غير المصابة أو التي حقنها PBS.
وتجدر الإشارة إلى أن عدوى G.mellonella مع التزاوج مثل نوع الهومو أو غير المترادفات من أي من سلالات C.albicans المعزولة سريريا اختبار تنتج معدلات عالية من الوفيات بالمقارنة مع الحيوانات التي حقنها PBS، في حين أن حقن سلالات مشتقة prototrophic يخفف من التأثير القاتل في هذا النموذج. من المهم أن تتذكر أن تختار يرقات صحية وأن تكون لطيفًا في التعامل مع اليرقات. إذا سيتم تلقيح سلالات متعددة، والحرص على عدم السماح لخلايا المبيضات الجلوس في برنامج تلفزيوني لفترة طويلة جدا.
بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل التنميط المناعي وتوطين المبيضات داخل اليرقات للإجابة على أسئلة إضافية حول التفاعلات بين المضيف والمسببات الفطرية أثناء العدوى. بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين لاستكشاف التسبب في المبيضات باستخدام تنسيقات عالية الإنتاجية. لا ننسى أن العمل مع المبيضات albicans يتطلب الرعاية، وأن الاحتياطات القياسية، بما في ذلك ارتداء معدات الحماية الشخصية، ينبغي دائما أن تتخذ أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
