وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية (MCB 1021831، JM) وJ. &amp; E. برنامج البحوث الطبية الحيوية (فلوريدا، قسم الصحة، JM).

1. عينة الاستعدادات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ إعداد العينات وجميع التلاعب العينة في غرفة مظلمة لمنع حدوث uncaging غير المرغوب فيها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان DM-nitrophen ((1 - (2-4-نيترو ،5-ديميثوكسي فنيل) - N، N، N &#39;، N&#39; tetrakis [(أوكسي كربونيل) الميثيل] -1،2-ethanediamine) في 50 ملي HEPES العازلة، 100 ملي بوكل، ودرجة الحموضة 7.0 إلى تركيز النهائي من 400 ميكرومتر (ε = 350nm 4330 M -1 سم -1 9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة و CaCl 2 من محلول المخزون 0.1 M إلى تحقيق نسبة مرغوب فيه من [كا 2 +]: [DM-nitrophen]. لبروتينات مع د K لكا 2 + جمعية أكبر من 10 ميكرومتر، نسبة [كا 2 +]: [DM-nitrophen] 1:1 هو الأفضل لمنع ملزم من الكالسيوم اطلاق سراحهم الصورة 2 + لuncaged DM-nitrophen . في الواقع، بالنظر إلى قيمة K د للDM-nitrophen أن يكون 10 نانومتر والتركيز الكلي للDM-nitrophen وكا 2 + لتكون 400 ملم، ~ 90٪ من الكالسيوم بروتين ملزمةمع د K = 10 ميكرومتر سوف تكون في apoform. من ناحية أخرى، لدراسة كا 2 + ملزمة للبروتينات مع K د &lt;10 ميكرومتر، فمن الأفضل أن تقلل من [كا 2 +]: [DM-nitrophen] النسبة إلى 0.95 لمنع كا 2 + complexation مع الاشتقاق البروتين قبل القفص الصور التفكك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان مجمع المرجعية، K 3 [الحديد (III) (CN) 6] أو نا 2 CRO 4، في نفس المخزن المؤقت بالنسبة للعينة. </li></ol> 2. إعداد التجربة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويظهر التكوين التجريبية الأساسية في الشكل 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ثقب دبوس (P 2) لضبط قطر شعاع التحقيق (632 نانومتر خرج من قال ني الليزر، ~ 5 ميغاواط قوة الليزر) إلى 1 مم ونشر شعاع التحقيق من خلال مركز خلية وضعها في درجة حرارة تسيطر حامل الخلية باستخدام M 1 المرآة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المرآة (م 2) وراء العينة إلى مركز شعاع التحقيقعلى مركزا للكشف عن موقف حساس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيز شعاع التحقيق على مركز للكشف في مثل هذه الطريقة أن الفرق في الجهد بين أعلى اثنين من الثنائيات وأسفل اثنين من الثنائيات وكذلك الفرق في الجهد بين الثنائيات اثنين على الجانب الأيسر والأيمن من كاشف هو صفر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في وقت لاحق، تشكيل قطر شعاع مضخة، وإخراج 355 نانومتر من Q-تحول الثانية: YAG الليزر، FWHM 5 NSEC) باستخدام 3 مم الثقب (P 1) وضعت بين اثنين من المرايا ليزر 355 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Copropagate شعاع مضخة من خلال مركز كفيت كما هو موضح في الشكل 2. من المهم أن يتم نشر كل من أشعة الليزر من خلال مركز الخلية الضوئية بطريقة colinear تقريبا للحصول على زاوية انحراف قابلة للقياس، وبالتالي السعة العالية للإشارة PBD. تحت ظروف تجريبية، زاوية تقاطع التحقيق ومضخة الحزم هو أقل من 15 درجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مركب إشارة إلى محاذاة التحقيق ومضخةشعاع لتحقيق إشارة PBD مرضية، أي نسبة S / N جيدة ومستقرة PBD السعة على نطاقات زمنية أطول (~ 100 مللي ثانية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الموقف من شعاع مضخة فيما يتعلق شعاع التحقيق قبل التعديل الإضافية من 355 نانومتر ليزر المرايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس السعة للإشارة المرجعية PBD باعتبارها الفرق بين اثنين من أعلى وأسفل فوتوديوديس على كاشف الحساسة الموقف. إشارة PBD ينبغي أن يحمل على الزيادة السريعة في السعة على النطاق وقت سريع (&lt;10 μsec) وتظل مستقرة على 100 ​​ميللي ثانية الزمني كما هو موضح في الشكل 3. لقطة لتقلب النار من السعة PDB هو في حدود 5٪ من السعة إشارة ويتأثر أساسا استنساخ إشارة من الاهتزازات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق الخطي في إشارة السعة PBD فيما يتعلق الطاقة الحرارية الصادرة عن قياس الاعتماد الخطي للإشارة PBD على قوة الإثارة ليزر وعلى عدد من آينشتاين استيعابها، E و= (1-10-A)، حيث A يتوافق مع الامتصاصية المرجعية في الطول الموجي الإثارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على قوة الليزر أدناه حوالي 1،000 μJ والامتصاصية للمجمع عينة / المرجع في الطول الموجي الإثارة أقل من 0.5 لمنع امتصاص multiphoton وانخفاض القوة مضخة شعاع، على التوالي، وضمان الخطي للإشارة PBD. </li></ol> 3. PBD القياسات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبدأ مع قياس آثار PBD للمرجعية. وضع حل للمجمع الإشارة في 1.0 سم × 1.0 سم أو 1.0 سم خلية الكوارتز × 0.5 سم ووضع الخلايا في درجة حرارة حامل للرقابة. تقديم كل من أطوال مسار مشابه PBD السعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكشف عن إشارة PBD المرجعية بوصفها وظيفة من درجة الحرارة في نطاق درجة حرارة 16-35 درجة مئوية مع الزيادة في درجة الحرارة 3 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند كل تغير في درجة الحرارة، والتحقق من موقف شعاع التحقيق على كشف الحساسة الموقف وإعادةضبط الموقف إلى مركز للكشف إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق الخطي للإشارة PBD بوصفها وظيفة من [(DN / دينارا) / C ع ρ] المدى وفقا للمعادلة 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع محلول العينة في الخلية الضوئية نفسها بالنسبة للمجمع المرجعية الحفاظ على نفس التوجه للخلية الضوئية حيث لقياس مرجعية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكشف عن آثار PBD العينة في نطاق درجات الحرارة لنفس المرجع والتحقق من الخطي من السعة عينة PBD فيما يتعلق [(DN / دينارا) / C ع ρ] المدى. </li></ol> 4. تحليل البيانات حجم الانحراف يتناسب طرديا مع حجم التغيير بسبب التدفئة العينة (ΔV عشر) وتغير حجم nonthermal (ΔV nonth) وفقا للمعادلة 1: <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq1.jpg" alt="المعادلة 1" /> اتساع العينة (A Sيمكن وصفها) والمرجع (A ص) إشارة PBD باستخدام معادلات 2 و 3، على التوالي. <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq2.jpg" alt="المعادلة 2" /> <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq3.jpg" alt="المعادلة 3" /> إشارة PBD يتناسب طرديا مع المعلمة استجابة الصك (K) وعدد آينشتاين استيعابها (E أ). الفصل الدراسي الأول في المعادلة 2، (DN / ت) (1/ρC ع) س، يتوافق مع تغير إشارة بسبب الحرارة المنبعثة إلى المذيبات. يمثل DN / دينارا المدى التغيير التي تعتمد على درجة الحرارة في معامل الانكسار، ρ هي كثافة المذيب، C p هو قدرة الحرارة. ومن المعروف أن جميع المعلمات من أجل الماء المقطر ويمكن تحديد لحل العازلة بمقارنة إشارة PBD لمجمع الإشارة في الماء المقطر وجود مخزن مؤقت المناسبة. س هو مقدار رجع الحرارةد للمذيب. وρ (DN / د ρ) المدى هو ثابت وحدة أقل وهذا هو درجات الحرارة مستقلة في نطاق درجة حرارة 10-40 درجة مئوية 10. يقابل مصطلح القيمة المطلقة Δn إلى تغيير في معامل الانكسار بسبب وجود امتصاص الأنواع في الحل وانها لا تذكر إذا ما تحولت الطول الموجي للشعاع التحقيق بالنسبة إلى أطياف امتصاص أي نوع من الأنواع في الحل. وأعرب عن إشارة الناشئة عن مجمع المرجعية (ص) من خلال المعادلة 3 حيث E ح ν هو طاقة الفوتون على طول موجة الإثارة، E ح ν = 80.5 كيلو كالوري / مول ل355 نانومتر الإثارة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ اتساع إشارة مرجعية PBD بالفرق بين pretrigger وآخر إشارة الزناد PBD كما هو موضح في الشكل 3. بطريقة مماثلة، وتحديد السعة من الصيام (A و سريع) ومرحلة بطيئة (A ق بطيئة) للإشارة عينة PBD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للقضاء على المعلمة استجابة الصك، K، قياس السعة للإشارة عينة PBD من السعة للإشارة PBD للمرجعية. نسبة الإشارة إلى عينة إشارة مرجعية يعطي المعادلة 4 ويمكن كتابة على النحو التالي: <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq4.jpg" alt="المعادلة 4" /> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام هذه المعادلة، وتحديد حرارة الافراج الحل (س) وnonthermal تغيير حجم (ΔV nonth) المرتبطة رد فعل بمبادرة صورة من المنحدر واعتراض، على التوالي، من مؤامرة من [(A ق / م ص) E ح ν] المدى مقابل درجة الحرارة على المدى تعتمد [(DN / ت) (1/ρCp)]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحديد حجم رد الفعل والتغيير في المحتوى الحراري لعملية سريعة وبطيئة، وقياس حجم وحظ وتغير المحتوى الحراري للعائد الكم المناسب وفقا لمعادلات 5-7. <img sالصليب الأحمر = &quot;/ files/ftp_upload/50969/50969eq5.jpg&quot; بديل = &quot;5 المعادلة&quot; /&gt; <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq6.jpg" alt="المعادلة 6" /> <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq7.jpg" alt="المعادلة 7" /> لعملية متعددة الخطوات مع حركية تحدث على مقياس الوقت بين 10 ~ 200 ميللي ثانية μsec، يمكن تحديد حجم والتغيرات في المحتوى الحراري المرتبطة الخطوات الفردية للتفاعل. يتم تحليل سعة وأعمار للخطوات الفردية عن طريق تركيب البيانات إلى الدالة F (ر) الذي يصف الشخصى الوقت من حجم والتغيرات في المحتوى الحراري. <img alt="المعادلة 8" src="/files/ftp_upload/50969/50969eq8.jpg" /> حيث α 0 يناظر A سريع وα ط يناظر A و بطيئة لكل عملية فردية وτ ط هي عمر خطوات التفاعل الفردية. من درجة الحرارة اعتماد معدل ثابت للص العمليات الفردية (ك ط = 1 / τ ط) المحتوى الحراري تفعيل والمعلمات الكون يمكن تحديده بسهولة باستخدام المؤامرات Eyring. </li></ol>

<ol>
	<li>Gensch, T., Viappiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+photothermal+methods:+accessing+time-resolved+thermodynamics+of+photoinduced+processes+in+chemistry+and+biology.">Time-resolved photothermal methods: accessing time-resolved thermodynamics of photoinduced processes in chemistry and biology.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 2, 699-721 (2003).</li><li>Larsen, R. W., Mik&#353;ovsk&#225;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+resolved+thermodynamics+of+ligand+binding+to+heme+proteins.">Time resolved thermodynamics of ligand binding to heme proteins.</a> Coord. Chem. Rev. 251 (9-10), 1101-1127 (2007).</li><li>Westrick, J. A., Peters, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoacoustic+calorimetric+study+of+horse+myoglobin.">A photoacoustic calorimetric study of horse myoglobin.</a> Bioph. Chem. 37 (1-3), 73-79 (1990).</li><li>Belogortseva, N., Rubio, M., Terrell, W., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+heme+propionate+groups+to+the+conformational+dynamics+associated+with+CO+photodissociation+from+horse+heart+myoglobin.">The contribution of heme propionate groups to the conformational dynamics associated with CO photodissociation from horse heart myoglobin.</a> J. Inorg. Biochem. 101 (7), 977-986 (2007).</li><li>Mik&#353;ovsk&#225;, J., Suquet, C., Satterlee, J. D., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Conformational+Changes+Coupled+to+Ligand+Photodissociation+from+the+Heme+Binding+Domain+of+FixL.">Characterization of Conformational Changes Coupled to Ligand Photodissociation from the Heme Binding Domain of FixL.</a> Biochemistry. 44 (30), 10028-10036 (2005).</li><li>Miksovska, J., Gennis, R. B., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photothermal+studies+of+CO+photodissociation+from+mixed+valence+Escherichia+coli+cytochrome+bo3.">Photothermal studies of CO photodissociation from mixed valence Escherichia coli cytochrome bo3.</a> FEBS Lett. 579 (14), 3014-3018 (2005).</li><li>Losi, A., Michler, I., G&#228;rtner, W., Braslavsky, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+Thermodynamic+Changes+Photoinduced+in+5,12-trans-locked+Bacteriorhodopsin.+Evidence+that+Retinal+Isomerization+is+Required+for+Protein+Activation.">Time-resolved Thermodynamic Changes Photoinduced in 5,12-trans-locked Bacteriorhodopsin. Evidence that Retinal Isomerization is Required for Protein Activation.</a> Photochem. Photobiol. 72, 590-597 (2000).</li><li>Kondoh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Induced+Conformational+Changes+in+Full-Length+Arabidopsis+thaliana+Cryptochrome.">Light-Induced Conformational Changes in Full-Length Arabidopsis thaliana Cryptochrome.</a> J. Mol. Biol. 413 (1), 128-137 (2011).</li><li>Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolabile+chelators+for+the+rapid+photorelease+of+divalent+cations.">Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (17), 6571-6575 (1988).</li><li>Eisenberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equation+for+the+Refractive+Index+of+Water.">Equation for the Refractive Index of Water.</a> J. Chem. Phys. 43 (11), 3887-3892 (1965).</li><li>Ellis-Davies, G. C., Kaplan, J. H., Barsotti, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+calcium:+rates+of+calcium+release+by+nitrophenyl-EGTA+and+DM-nitrophen.">Laser photolysis of caged calcium: rates of calcium release by nitrophenyl-EGTA and DM-nitrophen.</a> Biophys. J. 70, 1006-1016 (1996).</li><li>Miksovska, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+in+metalloproteins.">Structure-function relationships in metalloproteins.</a> Methods Enzymol. 360, 302-329 (2003).</li><li>Miksovska, J., Norstrom, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+profiles+for+CO+photodissociation+from+heme+model+compounds:+effect+of+proximal+ligands.">Thermodynamic profiles for CO photodissociation from heme model compounds: effect of proximal ligands.</a> Inorg. Chem. 44 (4), 1006-1014 (2005).</li><li>Dhulipala, G., Rubio, M., Michael, K., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+profile+for+urea+photo-release+from+a+N-(2-nitrobenzyl)+caged+urea+compound.">Thermodynamic profile for urea photo-release from a N-(2-nitrobenzyl) caged urea compound.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1157-1163 (2009).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

مبدأ المادية وراء أساليب حراري ضوئي؛ هو أن جزيء الصورة متحمس تبدد الطاقة الزائدة عن طريق الاسترخاء الذبذبات الى ارض الدولة، مما أدى إلى التسخين الحراري من 1،12 المذيب المحيطة بها. للمذيبات مثل الماء، وهذا ينتج توسع حجم السريع (ΔV عشر). جزيئات الحالة المثارة...

أساليب الصورة الحرارية مثل الكالوري الضوئي، شعاع حراري ضوئي؛ انحراف (PDB)، وصريف عابرة إلى جانب الإثارة الليزر النانوسيكند تمثل بديلا قويا لعابرة spectroscopies البصرية للدراسات وقت حل وسيطة قصيرة الأجل 1،2. وعلى النقيض من التقنيات البصرية، مثل امتصاص الأشعة تحت الحمراء الطيفي وعابرة، التي ترصد الشخصى الوقت من التغييرات في امتصاص حامل اللون المحيطة بها؛ تقنيات حراري ضوئي؛ كشف عن الاعتماد وقت التغييرات الحرارة / حجم، وبالتالي هي أدوات قيمة للتحقيق في وقت لمحات بصريا عمليات &quot;الصامتة&quot;. حتى الآن، وقد تم تطبيق الكالوري الضوئي وصريف عابرة بنجاح لدراسة ديناميكية بتكوين جزئي للعمليات التي يسببها الصورة بما في ذلك الهجرة ثنائي الذرة يجند في globins 3،4، تفاعلات البروتين يجند مع مستشعر الاوكسجين FixL 5، والإلكترون والبروتون النقل في الهيم والنحاس oxidases 6 والثانية الضوئي الثاني وكذلك الصور المماكبة في رودوبسين 7 وديناميكية بتكوين جزئي في cryptochrome 8. إلى التوسع في تطبيق التقنيات حراري ضوئي؛ لالنظم البيولوجية التي تفتقر لحامل اللون الداخلي و / أو fluorophore، تم الجمع بين تقنية PBD مع استخدام مركب قفص على الصورة الزناد زيادة في تركيز يجند / الركيزة في غضون بضع ميكروثانية أو أسرع، وهذا يتوقف على مجمع في قفص. يسمح هذا النهج رصد ديناميات وعلم الطاقة من التغييرات الهيكلية المرتبطة يجند / الركيزة ملزمة للبروتينات التي تفتقر إلى fluorophore الداخلية أو حامل اللون وعلى الوقت النطاق التي لا يمكن الوصول إليها عن طريق الأدوات توقف تدفق التجارية. هنا طلب من PBD لرصد الديناميكا الحرارية للمجمع القفص، كا 2 + DM-nitrophen، الصور الانقسام وكذلك حركية لكا 2 + الجمعيات إلى المجال C-محطة للاستشعار الكالسيوم العصبية داونوتقدم تيار التنظيمية العنصر خصم المغير (DREAM). كا 2 + هو من كا اطلاق سراحهم الصورة 2 + DM-nitrophen في غضون 10 μsec وrebinds إلى قفص unphotolysed مع ثابت وقت ~ 300 μsec. من ناحية أخرى، في حضور apoDREAM لوحظ حدوث الحركية الإضافية التي تحدث على نطاق وميلي ثانية واحدة وقت ويعكس يجند ملزمة للبروتين. وقد تم تطبيق PBD للتحقيق التحولات متعلق بتكوين جزئي في النظم البيولوجية محدودة نوعا ما بسبب الصعوبات فعال؛ المحاذاة مثل شاقة لجنة التحقيق ومضخة شعاع لتحقيق PBD إشارة قوية وقابلة للتكرار. ومع ذلك، فإن تصميم دقيق من الأجهزة انشاء، ومراقبة دقيقة لدرجة الحرارة، والمحاذاة حذرا من لجنة التحقيق ومضخة شعاع توفير إشارة متسقة وقوية PBD التي تسمح رصد حجم الوقت حل والتغيرات في المحتوى الحراري على نطاق واسع المقياس الزمني من 10 μsec إلى ما يقرب من 200 ميللي ثانية. بالإضافة إلى ذلك، modifications من إجراء التجارب لضمان الكشف عن العينة ومرجعية آثار تحت درجة حرارة متطابقة، وتكوين العازلة، والتوجه الخلايا البصرية، وقوة الليزر، الخ يخفف كثيرا من الخطأ التجريبي في حجم رد الفعل قياس والمحتوى الحراري.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="639">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col /> 
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N&#39;,N&#39;-Tetraacetic Acid</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D-6814</td>
			<td style="width:220px;">DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation,</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid)</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Adrich</td>
			<td>0909C</td>
			<td>HEPES buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Potassium ferricyanide(III)</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">702587</td>
			<td style="width:220px;">reference compound for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"> </td>
			<td style="width:84px;"> </td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td style="width:220px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium chromate</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">307831</td>
			<td style="width:220px;">reference compound for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">He-Ne Laser Diode 5mW 635nm </td>
			<td style="width:84px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">54-179</td>
			<td style="width:220px;">use as a probe beam for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Oscilloscope, </td>
			<td style="width:84px;">LeCroy</td>
			<td style="width:119px;">Wave Surfer 42Xs</td>
			<td style="width:220px;">400 MHz bandwith</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nd:YAG laser</td>
			<td style="width:84px;">Continuum</td>
			<td style="width:119px;">ML II</td>
			<td>pump beam for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:216px;">M355; Nd:YAG laser mirror</td>
			<td style="width:84px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">47-324</td>
			<td>laser mirror for 355 nm laser line</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:216px;">M1 and M2; Laser diode mirror</td>
			<td style="width:84px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">43-532</td>
			<td>visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">P1 and P2; Iris Diaphragm</td>
			<td style="width:84px;">Edmind Optics</td>
			<td style="width:119px;">62-649</td>
			<td style="width:220px;">pin hole to shape the probe and pum beams</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">L1; bi-convex lens</td>
			<td style="width:84px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">LB1844</td>
			<td style="width:220px;">a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350 - 2000 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DM, dichroic mirror</td>
			<td style="width:84px;">Thorlab </td>
			<td style="width:119px;">DMLP505</td>
			<td style="width:220px;">a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">F1; Edge filter</td>
			<td style="width:84px;">Andower </td>
			<td style="width:119px;">500FH90-25</td>
			<td>a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Temperature-controlled cuvette holder</td>
			<td style="width:84px;">Quantum Northwest</td>
			<td style="width:119px;">FLASH 300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

submillisecond conformational changes in proteins resolved by photothermal beam deflection

ضوحراري شعاع انحراف معا مع الصورة الصوتية الكالوري وصريف الحرارية ينتمي إلى عائلة من أساليب حراري ضوئي؛ التي ترصد حجم والمحتوى الحراري تغييرات التوقيت الشخصى الضوء الناجم عن التغيرات متعلق بتكوين جزئي في البروتينات على ميكروثانية إلى ميلي ثانية واحدة وقت القشور التي لا يمكن الوصول إليها باستخدام محطة التقليدية أدوات التدفق. بالإضافة إلى ذلك، منذ يتم بحثها التغييرات الشاملة في حجم و / أو المحتوى الحراري، وهذه التقنيات يمكن تطبيقها على البروتينات والجزيئات الكبيرة الحيوية الأخرى التي تفتقر إلى fluorophore وأو تسمية حامل اللون. لرصد ديناميات وعلم الطاقة من التغييرات الهيكلية المرتبطة كا 2 + ملزمة لمحولات الكالسيوم، مثل أجهزة الاستشعار الكالسيوم العصبية، وهو مركب الكالسيوم في قفص، DM-nitrophen، ويعمل على الصورة الزناد زيادة سريعة (τ &lt;20 μsec) في الكالسيوم الحرة يتم بحثها تركيز وحجم والمحتوى الحراري المرتبطة التغييرات باستخدام شعاع حراري ضوئي؛ تقنية انحراف.

وهناك مثال ممثل PBD يتتبع لكا 2 + الصور الإفراج عن كا 2 + DM-nitrophen هو مبين في الشكل (3). المرحلة سريع يتوافق مع الصور الانقسام من كا 2 + DM-nitrophen وكا 2 + التحرر، في حين أن المرحلة بطيئة يعكس كا 2 + ملزمة إلى القفص nonphotolysed. مؤامرة من PBD السعة العي?...

Watch this Scientific Journal Video about Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection at JoVE.com

التغيرات التشكلية دون المللي ثانية في البروتينات التي تم حلها بواسطة انحراف الشعاع الحراري الضوئي | الكيمياء | فيديو

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

نحن هنا الإبلاغ عن تطبيق تقنية انحراف شعاع حراري ضوئي؛ بالاشتراك مع مركب الكالسيوم في قفص، DM-nitrophen، لرصد ميكروثانية وميلي ثانية واحدة ديناميكية و طاقة من التغييرات الهيكلية المرتبطة ارتباط الكالسيوم إلى الخلايا العصبية جهاز استشعار الكالسيوم، العنصر التنظيمي المصب خصم المغير .

Submillisecond بتكوين جزئي التغييرات في البروتينات حلها بواسطة شعاع ضوحراري الإمالة

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

submillisecond-conformational-changes-proteins-resolved-photothermal

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Biology

Physics

Fundamentals

Unit 1

The First Law of Thermodynamics

Macromolecules

SCIENTISTS IN ACTION

8.9K Views.  Florida International University.  نحن هنا الإبلاغ عن تطبيق تقنية انحراف شعاع حراري ضوئي؛ بالاشتراك مع مركب الكالسيوم في قفص، DM-nitrophen، لرصد ميكروثانية وميلي ثانية واحدة ديناميكية و طاقة من التغييرات الهيكلية المرتبطة ارتباط الكالسيوم إلى الخلايا العصبية جهاز استشعار الكا?...

Video: Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice through their ice-binding surfaces. Fluorescence-based ice plane affinity (FIPA) analysis is a modified technique used to determine the ice planes to which the AFPs bind. FIPA is based on the original ice-etching method for determining AFP-bound ice-planes. It produces clearer images in a shortened experimental time. In FIPA analysis, AFPs are fluorescently labeled with a chimeric tag or a covalent dye then slowly incorporated into a macroscopic single ice crystal, which has been preformed into a hemisphere and oriented to determine the a- and c-axes. The AFP-bound ice hemisphere is imaged under UV light to visualize AFP-bound planes using filters to block out nonspecific light. Fluorescent labeling of the AFPs allows real-time monitoring of AFP adsorption into ice. The labels have been found not to influence the planes to which AFPs bind. FIPA analysis also introduces the option to bind more than one differently tagged AFP on the same single ice crystal to help differentiate their binding planes. These applications of FIPA are helping to advance our understanding of how AFPs bind to ice to halt its growth and why many AFP-producing organisms express multiple AFP isoforms.

Antifreeze proteins (AFPs) bind to specific planes of ice to prevent or slow ice growth. Fluorescence-based ice plane affinity (FIPA) analysis is a modification of the original ice-etching method for determination of AFP-bound ice planes. AFPs are fluorescently labeled, incorporated into macroscopic single ice crystals, and visualized under UV light.

تحديد الطائرات الملزمة للجليد من البروتينات المضادة للتجمد من قبل تقارب طائرة الجليد القائم على الفلورسينس

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

The Use of Gas Chromatography to Analyze Compositional Changes of Fatty Acids in Rat Liver Tissue during Pregnancy

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, yielding results with high accuracy and high reproducibility. In metabolic and nutrition studies GC allows assessment of changes in fatty acid concentrations following interventions or during changes in physiological state such as pregnancy. Solid phase extraction (SPE) using aminopropyl silica cartridges allows separation of the major lipid classes including triacylglycerols, different phospholipids, and cholesteryl esters (CE). GC combined with SPE was used to analyze the changes in fatty acid composition of the CE fraction in the livers of virgin and pregnant rats that had been fed various high and low fat diets. There are significant diet/pregnancy interaction effects upon the omega-3 and omega-6 fatty acid content of liver CE, indicating that pregnant females have a different response to dietary manipulation than is seen among virgin females.

Pregnancy leads to significant changes to the fatty acid composition of maternal tissues. Lipid profiles can be obtained via gas chromatography to allow identification and quantification of fatty acids in individual lipid classes among rats fed various high and low fat diets during pregnancy.

استعمال اللوني للغاز لتحليل التغييرات التركيبية من الأحماض الدهنية في الفئران الكبد الأنسجة أثناء الحمل

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

Radiolabeling والكمي لمستويات الخلايا من Phosphoinositides التي كتبها التلألؤ تدفق عالية الأداء اللوني السائل الديناميكي

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). The fibronectin protein film was immobilized on the silicon nitride (SiN) membrane that forms the SALVI detection area. During ToF-SIMS analysis, three modes of analysis were conducted including high spatial resolution mass spectrometry, two-dimensional (2D) imaging, and depth profiling. Mass spectra were acquired in both positive and negative modes. Deionized water was also analyzed as a reference sample. Our results show that the fibronectin film in water has more distinct and stronger water cluster peaks compared to water alone. Characteristic peaks of amino acid fragments are also observable in the hydrated protein ToF-SIMS spectra. These results illustrate that protein molecule adsorption on a surface can be studied dynamically using SALVI and ToF-SIMS in the liquid environment for the first time.

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

This work presents a protocol for liquid handling and sample introduction to a microchannel for in situ time-of-flight secondary ion mass spectrometry analysis of protein biomolecules in an aqueous solution.

في الموقع توصيف المطفأ البروتينات في المياه التي SALVI وTOF-سيمز

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring high sensitivity and a wide dynamic range. Mass spectrometry-based quantification assays for proteins typically involve protein digestion followed by the selective reaction monitoring/multiple reaction monitoring (SRM/MRM) quantification of peptides using a low-resolution (Rs ~1,000) tandem quadrupole mass spectrometer. One of the limitations of this approach is the interference phenomenon observed when the peptide of interest has the "same" precursor and fragment mass (in terms of m/z values) as other co-eluting peptides present in the sample (within a 1-Da window). To avoid this phenomenon, we propose an alternative mass spectrometric approach, a high selectivity (HS) MRM assay that combines the ion mobility separation of peptide precursors with the high-resolution (Rs ~30,000) MS detection of peptide fragments. We explored the capabilities of this approach to quantify low-abundance peptide standards spiked in a monoclonal antibody (mAb) digest and demonstrated that it has the sensitivity and dynamic range (at least 3 orders of magnitude) typically achieved in HCP analysis. All six peptide standards were detected at concentrations as low as 0.1 nM (1 femtomole loaded on a 2.1-mm ID chromatographic column) in the presence of a high-abundance peptide background (2 &#181;g of a mAb digest loaded on-column). When considering the MW of rabbit phosphorylase (97.2 kDa), from which the spiked peptides were derived, the LOQ of this assay is lower than 50 ppm. Relative standard deviations (RSD) of peak areas (n = 4 replicates) were less than 15% across the entire concentration range investigated (0.1-100 nM or 1-1,000 ppm) in this study.

Here, we describe a chromatographic assay coupled with the ion mobility separation of peptide precursors followed by the high-resolution (~30,000) MS-detection of peptide fragments for the quantification of spiked peptide standards in a monoclonal antibody digest.

مقايسة HS-الآلية للتحديد الكمي لبروتينات الخلية المضيفة في صيدلية البروتين اللوني السائل أيون التنقل قطوف الطيف الكتلي

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Time-resolved Photophysical Characterization of Triplet-harvesting Organic Compounds at an Oxygen-free Environment Using an iCCD Camera

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables the acquisition of photoluminescence spectra covering the time regime from nanoseconds up to 0.1 s. This enables us to follow the changes in the intensity (decay) and emission of the spectra over time. Using this method, it is possible to study diverse photophysical phenomena, such as the emission of phosphorescence, and the contributions of prompt and delayed fluorescence in molecules showing thermally activated delayed fluorescence (TADF). Remarkably, all spectra and decays are obtained in a single experiment. This can be done for solids (thin film, powder, crystal) and liquid samples, where the only limitations are the spectral sensitivity of the camera and the excitation wavelength (532 nm, 355 nm, 337 nm, and 266 nm). This technique is, thus, very important when investigating the excited state dynamics in organic emitters for their application in organic light-emitting diodes and other areas where triplet harvesting is of paramount importance. Since triplet states are strongly quenched by oxygen, emitters with efficient TADF luminescence, or those showing room temperature phosphorescence (RTP), must be correctly prepared in order to remove any dissolved oxygen from solutions and films. Otherwise, no long-lived emission will be observed. The method of degassing solid samples as presented in this work is basic and simple, but the degassing of liquid samples creates additional difficulties and is particularly interesting. A method of minimizing solvent loss and changing the sample concentration, while still enabling to remove oxygen in a very efficient and a repeatable manner, is presented in this work.

Here, we present a method of the spectroscopic characterization of organic molecules by means of time-resolved photoluminescence spectroscopy on the nanosecond-to-millisecond timescale in oxygen-free conditions. Methods to efficiently remove oxygen from the samples and, thus, limit luminescence quenching are also described.

حل وقت الحصاد "التوصيف الثلاثي فوتوفيسيكال المركبات العضوية" في خالية من الأكسجين "البيئة باستخدام" الوثيقة iCCD الكاميرا

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables ...

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the evaluation of DNA-magnetic particles binding via dynamic light scattering (DLS) and electrophoretic light scattering (ELS). Analysis by DLS provides valuable information on the physicochemical properties of particles including particle size, polydispersity, and zeta potential. The latter describes the surface charge of the particle which plays major role in electrostatic binding of materials such as DNA. Here, a comparative analysis exploits three chemical modifications of nanoparticles and microparticles and their effects on DNA binding and elution. Chemical modifications by branched polyethylenimine, tetraethyl orthosilicate and (3-aminopropyl)triethoxysilane are investigated. Since DNA exhibits a negative charge, it is expected that zeta potential of particle surface will decrease upon binding of DNA. Forming of clusters should also affect particle size. In order to investigate the efficiency of these particles in isolation and elution of DNA, the particles are mixed with DNA in low pH (~6), high ionic strength and dehydration environment. Particles are washed on magnet and then DNA is eluted by Tris-HCl buffer (pH = 8). DNA copy number is estimated using quantitative polymerase chain reaction (PCR). Zeta potential, particle size, polydispersity and quantitative PCR data are evaluated and compared. DLS is an insightful and supporting method of analysis that adds a new perspective to the process of screening of particles for DNA isolation.

This protocol describes the synthesis of magnetic particles and evaluation of their DNA-binding properties via dynamic and electrophoretic light scattering. This method focuses on monitoring changes in particle size, their polydispersity and zeta potential of particle surface which play major role in binding of materials such as DNA.

الحمض النووي-المغناطيسي الجسيمات ربط التحليل بتشتت الضوء الديناميكي والغرواني الكهربي

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent proteins and generation of fluorescent fusion proteins have been wildly used as an effective tool to directly visualize the protein localization and dynamics in cells. It is especially useful to compare them with well-known organelle markers after co-expression with the protein of interest. Nevertheless, classical approaches for protein co-expression in plants usually involve multiple independent expression plasmids, and therefore have drawbacks that include low co-expression efficiency, expression-level variation, and high time expenditure in genetic crossing and screening. In this study, we describe a robust and novel method for co-expression of multiple chimeric fluorescent proteins in plants. It overcomes the limitations of the conventional methods by using a single expression vector that is composed of multiple semi-independent expressing cassettes. Each protein expression cassette contains its own functional protein expression elements, and therefore it can be flexibly adjusted to meet diverse expression demand. Also, it is easy and convenient to perform the assembly and manipulation of DNA fragments in the expression plasmid by using an optimized one-step reaction without additional digestion and ligation steps. Furthermore, it is fully compatible with current fluorescent protein derived bio-imaging technologies and applications, such as FRET and BiFC. As a validation of the method, we employed this new system to co-express fluorescently fused vacuolar sorting receptor and secretory carrier membrane proteins. The results show that their perspective subcellular localizations are the same as in previous studies by both transient expression and genetic transformation in plants.

We have developed a novel method for co-expressing multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants to overcome the difficulties of conventional methods. It takes advantage of using a single expression plasmid that contains multiple functionally independent protein expressing cassettes to achieve protein co-expression.

التعبير المشارك من البروتينات الانصهار الفلورسنت تشيميريك متعددة بطريقة فعالة في النباتات

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of F&#8722;

Anion photoelectron imaging is a very efficient method for the study of energy states of bound negative ions, neutral species and interactions of unbound electrons with neutral molecules/atoms. State-of-the-art in vacuo anion generation techniques allow application to a broad range of atomic, molecular, and cluster anion systems. These are separated and selected using time-of-flight mass spectrometry. Electrons are removed by linearly polarized photons (photo detachment) using table-top laser sources which provide ready access to excitation energies from the infra-red to the near ultraviolet. Detecting the photoelectrons with a velocity mapped imaging lens and position sensitive detector means that, in principle, every photoelectron reaches the detector and the detection efficiency is uniform for all kinetic energies. Photoelectron spectra extracted from the images via mathematical reconstruction using an inverse Abel transformation reveal details of the anion internal energy state distribution and the resultant neutral energy states. At low electron kinetic energy, typical resolution is sufficient to reveal energy level differences on the order of a few millielectron-volts, i.e., different vibrational levels for molecular species or spin-orbit splitting in atoms. Photoelectron angular distributions extracted from the inverse Abel transformation represent the signatures of the bound electron orbital, allowing more detailed probing of electronic structure. The spectra and angular distributions also encode details of the interactions between the outgoing electron and the residual neutral species subsequent to excitation. The technique is illustrated by the application to an atomic anion (F&#8722;), but it can also be applied to the measurement of molecular anion spectroscopy, the study of low lying anion resonances (as an alternative to scattering experiments) and femtosecond (fs) time resolved studies of the dynamic evolution of anions.

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of F&lt;sup&gt;&amp;#8722;&lt;/sup&gt;

Here, we present a protocol for photoelectron imaging of anionic species. Anions generated in vacuo and separated by mass spectrometry are probed using velocity mapped photoelectron imaging, providing details of anion and neutral energy levels, anion and neutral structure and the nature of the anion electronic state.

تصوير النانومترية من الأنيونات يتضح من 310 نانومتر مفرزة و−

Anion photoelectron imaging is a very efficient method for the study of energy states of bound negative ions, neutral species and interactions of unbound ...

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray free electron lasers (XFELs). A series of experiments using the light-driven proton pump bacteriorhodopsin have further established these injectors as a preferred option to deliver crystals for time-resolved serial femtosecond crystallography (TR-SFX) to resolve structural changes of proteins after photoactivation. To obtain multiple structural snapshots of high quality, it is essential to collect large amounts of data and ensure clearance of crystals between every pump laser pulse. Here, we describe in detail how we optimized the extrusion of bacteriorhodopsin microcrystals for our recent TR-SFX experiments at the Linac Coherent Light Source (LCLS). The goal of the method is to optimize extrusion for a stable and continuous flow while maintaining a high density of crystals to increase the rate at which data can be collected in a TR-SFX experiment. We achieve this goal by preparing lipidic cubic phase with a homogenous distribution of crystals using a novel three-way syringe coupling device followed by adjusting the sample composition based on measurements of the extrusion stability taken with a high-speed camera setup. The methodology can be adapted to optimize the flow of other microcrystals. The setup will be available for users of the new Swiss Free Electron Laser facility.

The success of a time-resolved serial femtosecond crystallography experiment is dependent on efficient sample delivery. Here, we describe protocols to optimize the extrusion of bacteriorhodopsin microcrystals from a high viscosity micro-extrusion injector. The methodology relies on sample homogenization with a novel three-way coupler and visualization with a high-speed camera.

تحسين قذف لزوجة عالية من ميكروكريستالس لحل وقت المسلسل Femtosecond البلورات في أشعة الليزر

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...