这项工作是由美国国家科学基金会（MCB 1021831，JM）和J.＆E.生物医学研究发展计划（健康的佛罗里达部门，JM）的支持。

1。样品准备<ol><li>进行样品制备和在一个黑暗的房间里所有取样操作，以防止不必要的解笼锁。 </li><li>溶解DM-nitrophen（（1 - （2 -硝基-4,5 -二甲氧基苯基） - N，N，N&#39;，N&#39; -四[（氧羰基）甲基] -1,2 -乙二胺），在50mM HEPES缓冲液，100mM的氯化钾，pH 7.0至400μM的终浓度（ε350nm处 = 4330 M -1 -1 9）。 </li><li>添加氯化钙的0.1M的储液来实现的[Ca 2 +]的所希望的比例：[DM-nitrophen]。与K d的蛋白质的Ca 2 +协会大于10μm，内[Ca 2 +]的比值：[DM-nitrophen]为1:1，优选为防止光释放的Ca 2 +到出笼DM-nitrophen绑定。的确，考虑到对于DM-nitrophen对K d值为为10 nM和DM-nitrophen与Ca 2 +的总浓度为400 mM的，〜90％的钙结合蛋白具有K D = 10μM将在apoform。另一方面，对于Ca 2 +的研究为K D &lt;10μM的蛋白质结合，这是优选的，以减少内[Ca 2 +]：[DM-nitrophen]比为0.95，以防止Ca 2 +的络合与脱辅基事先笼光离解蛋白质。 </li><li>溶解参考化合物，K 3的[Fe（III）（CN）6]或Na 2的CrO 4，在相同的缓冲液作为样品。 </li></ol> 2。设置实验<ol><li>基本的实验配置示于图2。 </li><li>使用一个销孔（P 2）的探测光束的（He-Ne激光器的632 nm的输出，〜5毫瓦的激光功率）的直径调节到1毫米，并通过单元的中心放置在温度传播的探测光束用M 1镜控制单元支架。 </li><li>用一个反射镜（M 2）的样本后面居中探测光束对位置敏感检测器的中心。 </li><li>着眼于这样的方式，顶部的两个二极管和底部的两个二极管以及两个二极管的检测器的左侧和右侧之间的电压差之间的电压差检测器的中心的探测光束为零。 </li><li>随后，塑造一个直径泵浦光束，Q开关Nd的355纳米输出：采用3毫米的针孔（P 1）放置在两个355 nm的激光反射镜之间的YAG激光器，半高宽5纳秒）。 </li><li>通过比色皿的中心Copropagate泵浦光束表现在图2。重要的是，这两个激光束通过光学单元中几乎共线的方式的中心传播到获得可测量的偏转角，从而高PBD信号的振幅。在实验条件下，探针和泵光束的交叉点的角度小于15°。 </li><li>使用参考化合物对齐探针和泵束达到令人满意的PBD信号， 即在更长的时间尺度（〜100毫秒）的良好S / N比和稳定的PBD振幅。 </li><li>通过355纳米的激光反射镜的增量调节调节泵的光束的位置相对于所述探测光束。 </li><li>测量PBD参考信号的幅度作为位置敏感探测器上的两个顶部和底部的光电二极管之间的一个差异。该PBD信号应该具有在快速时间量程（&lt;10微秒）的振幅的快速增加，并保持稳定的100毫秒时间尺度表现在图3。拍摄到的PDB振幅的拍摄变异性是内信号幅度的5％，且信号的再现性主要受振动。 </li><li>检查在PBD信号振幅的线性相对于所述释放热能，通过测量PBD信号对激励激光功率和关于爱因斯坦的数量线性相关吸收，E 一=（1-10-A），其中A对应的激发波长参考吸光度。 </li><li>遵守以下的激光功率约为1,000μJ，并在激发波长小于0.5，以防止多光子吸收和减少泵束的功率，分别为样品/参照化合物的吸收，并确保PBD信号的线性度。 </li></ol> 3。 PBD测量<ol><li>开始的PBD痕迹的参考测量值。将参照化合物的溶液在1.0厘米×1.0厘米或1.0厘米×0.5厘米石英池，并在该温度控制架的细胞定位。这两种路径长度提供类似的PBD幅度。 </li><li>从16-35℃的温度增量为3°C检测的基准PBD信号作为温度的温度范围内的一个函数</li><li>在每次温度变化，检查位置灵敏探测器的探测光束的位置，并重新如果需要调整位置到检测器的中心。 </li><li>根据等式2检查PBD信号的线性度作为的函数[（的dn / dt）的/ C Pρ]术语。 </li><li>将样品溶液相同的光学元件作为在用于保持光学元件的同一方向作为基准测量的参比化合物。 </li><li>检测样品的PBD的痕迹在相同的温度范围作为参考，并检查样品的PBD振幅的线性相对于[（DN / DT）/ C Pρ]术语。 </li></ol> 4。数据分析偏转的幅度成正比的量的变化，由于根据式（1）的样品加热（ΔVth）和非热容量变化（ΔVnonth）： <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq1.jpg" alt="式（1）" /> 样品（A S的幅度）和参考（A R）PBD信号可以用方程2和3，分别进行说明。 <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq2.jpg" alt="公式2" /> <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq3.jpg" alt="式（3）" /> PBD信号是正比于仪器的响应参数（K）和爱因斯坦的数量被吸收（E a）所示 。在等式2中的第一项，（的dn / dt）的（1/ρCP）Q，对应于信号的变化，由于释放到溶剂中的热量。将dn / dt项表示温度依赖性变化的折射率，ρ是该溶剂的密度，C p是比热容。所有参数是已知的蒸馏水和缓冲溶液通过在蒸馏水中并在合适的缓冲液的参照化合物比较一PBD信号可以被确定。 Q为热报酬e的量d，将该溶剂。在ρ（DN / Dρ）项是一个无单位的常数，它是与温度无关的温度范围从10-40℃下10。的Δn 绝对术语对应于折射率的变化，由于吸光物质的溶液中的存在和它的可忽略不计，如果探测光束的波长位移相对于任何种类的溶液的吸收光谱。从参考化合物（A R）而产生的信号由公式3，其中E Hν是光子能量的激发波长，表示E Hν= 80.5千卡/摩尔为355 nm激发。 <ol><li>就拿参考PBD信号的幅度表现在图3的预触发和后触发的PBD信号之间的差值。以类似的方式，决定了快（ 一个 S 快 ）的幅度和慢相（A 公司 慢样品PBD信号）。 </li><li>消除仪器响应参数，K，由PBD信号为基准的幅度缩放样本PBD信号的振幅。样品信号与参考信号的比值给出方程4和可写为： <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq4.jpg" alt="公式4" /> </li><li>利用这个公式，确定释放到溶液（Q）和非热容量变化（ΔVnonth）自的[一个曲线的斜率和截距，分别有一个光引发反应相关的（A S / A R）E中的热ħν]长期与温度相关项[（DN / DT）（1/ρCp）]。 </li><li>为了确定反应体积和焓变的快速和缓慢的过程，根据公式5-7缩放观察量和焓变到相应的量子产率。 <img sRC =“/ files/ftp_upload/50969/50969eq5.jpg”ALT =“公式5”/&gt; <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq6.jpg" alt="公式6" /> <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq7.jpg" alt="公式7" /> 对于一个多步过程与动力学发生在10微秒〜200毫秒之间的时间尺度，体积和与该反应的各个步骤相关的焓的变化可以被确定。的振幅和寿命的各个步骤由数据拟合的函数F（t）描述该卷和焓变化的时间曲线进行分析。 <img alt="公式8" src="/files/ftp_upload/50969/50969eq8.jpg" /> 其中，α0对应于A 的快速和αi对应至一个S 慢为每个单独的过程和τi分别是单个反应步骤的寿命。从速率常数FO的温度依赖性Ř单个进程（K I = 1 /τi）该活化焓和熵的参数可以容易地使用的Eyring曲线来确定。 </li></ol>

<ol>
	<li>Gensch, T., Viappiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+photothermal+methods:+accessing+time-resolved+thermodynamics+of+photoinduced+processes+in+chemistry+and+biology.">Time-resolved photothermal methods: accessing time-resolved thermodynamics of photoinduced processes in chemistry and biology.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 2, 699-721 (2003).</li><li>Larsen, R. W., Mik&#353;ovsk&#225;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+resolved+thermodynamics+of+ligand+binding+to+heme+proteins.">Time resolved thermodynamics of ligand binding to heme proteins.</a> Coord. Chem. Rev. 251 (9-10), 1101-1127 (2007).</li><li>Westrick, J. A., Peters, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoacoustic+calorimetric+study+of+horse+myoglobin.">A photoacoustic calorimetric study of horse myoglobin.</a> Bioph. Chem. 37 (1-3), 73-79 (1990).</li><li>Belogortseva, N., Rubio, M., Terrell, W., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+heme+propionate+groups+to+the+conformational+dynamics+associated+with+CO+photodissociation+from+horse+heart+myoglobin.">The contribution of heme propionate groups to the conformational dynamics associated with CO photodissociation from horse heart myoglobin.</a> J. Inorg. Biochem. 101 (7), 977-986 (2007).</li><li>Mik&#353;ovsk&#225;, J., Suquet, C., Satterlee, J. D., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Conformational+Changes+Coupled+to+Ligand+Photodissociation+from+the+Heme+Binding+Domain+of+FixL.">Characterization of Conformational Changes Coupled to Ligand Photodissociation from the Heme Binding Domain of FixL.</a> Biochemistry. 44 (30), 10028-10036 (2005).</li><li>Miksovska, J., Gennis, R. B., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photothermal+studies+of+CO+photodissociation+from+mixed+valence+Escherichia+coli+cytochrome+bo3.">Photothermal studies of CO photodissociation from mixed valence Escherichia coli cytochrome bo3.</a> FEBS Lett. 579 (14), 3014-3018 (2005).</li><li>Losi, A., Michler, I., G&#228;rtner, W., Braslavsky, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+Thermodynamic+Changes+Photoinduced+in+5,12-trans-locked+Bacteriorhodopsin.+Evidence+that+Retinal+Isomerization+is+Required+for+Protein+Activation.">Time-resolved Thermodynamic Changes Photoinduced in 5,12-trans-locked Bacteriorhodopsin. Evidence that Retinal Isomerization is Required for Protein Activation.</a> Photochem. Photobiol. 72, 590-597 (2000).</li><li>Kondoh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Induced+Conformational+Changes+in+Full-Length+Arabidopsis+thaliana+Cryptochrome.">Light-Induced Conformational Changes in Full-Length Arabidopsis thaliana Cryptochrome.</a> J. Mol. Biol. 413 (1), 128-137 (2011).</li><li>Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolabile+chelators+for+the+rapid+photorelease+of+divalent+cations.">Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (17), 6571-6575 (1988).</li><li>Eisenberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equation+for+the+Refractive+Index+of+Water.">Equation for the Refractive Index of Water.</a> J. Chem. Phys. 43 (11), 3887-3892 (1965).</li><li>Ellis-Davies, G. C., Kaplan, J. H., Barsotti, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+calcium:+rates+of+calcium+release+by+nitrophenyl-EGTA+and+DM-nitrophen.">Laser photolysis of caged calcium: rates of calcium release by nitrophenyl-EGTA and DM-nitrophen.</a> Biophys. J. 70, 1006-1016 (1996).</li><li>Miksovska, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+in+metalloproteins.">Structure-function relationships in metalloproteins.</a> Methods Enzymol. 360, 302-329 (2003).</li><li>Miksovska, J., Norstrom, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+profiles+for+CO+photodissociation+from+heme+model+compounds:+effect+of+proximal+ligands.">Thermodynamic profiles for CO photodissociation from heme model compounds: effect of proximal ligands.</a> Inorg. Chem. 44 (4), 1006-1014 (2005).</li><li>Dhulipala, G., Rubio, M., Michael, K., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+profile+for+urea+photo-release+from+a+N-(2-nitrobenzyl)+caged+urea+compound.">Thermodynamic profile for urea photo-release from a N-(2-nitrobenzyl) caged urea compound.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1157-1163 (2009).</li></ol>

作者什么都没有透露。

背后的光热方法的物理原理是光激发态分子通过振动弛豫消耗多余的能量回到基态，从而导致周围1,12溶剂热供暖。为溶剂，例如水，这将产生一个快速的体积膨胀度（ΔVTH）。激发态分子也可能发生，由于键断裂/形成和/或改变分子结构，可以改变分子（S）（ 即改变范德分子的大小导致非热容积的变化（ΔVnonth）光化学过程范德华体积），以及改变分子（次）从而?...

光热方法，如光声量热法，光热光束偏转（PDB）和瞬态光栅加上纳秒激光激发代表一个强大的替代瞬态光谱学为短命的中间体1,2时间分辨的研究。相反，光学技术，如瞬态吸收和IR光谱，该监测在周围发色团的吸收变化的时间曲线;光热检测方法的热/体积变化的时间相关性，因此是有价值的工具，用于研究的光时访问“沉默”的进程。到目前为止，光声量热法和瞬态光栅已经成功地用于研究光诱导过程的构象动力学包括球蛋白3,4，用氧气传感器蛋白配体相互作用的双原子的配体迁移FIXL 5，电子和血红素-铜质子转运氧化酶6一ND光系统II和光异构化的视紫红质7和8隐构象动力学。 扩大的光热技术所缺乏的内部生色团和/或荧光团的生物系统的应用，PBD技术被结合使用笼形化合物的光致触发几微秒内增加了配位体/底物浓度或更快，这取决于上笼化合物。这种方法允许监控与配体/底物结合到缺乏内部荧光团或生色蛋白，并且在时间尺度不属于商业停流仪器可访问相关的结构性变化动力学和热力学的。这里的PBD的应用监控笼状化合物，钙的热力学2 + DM-nitrophen，光裂解以及动力学的Ca 2 +协会向神经元钙传感器的C端结构域向下流调节元件拮抗剂调制器（DREAM）提出。的Ca 2 +的是光释放的Ca 2 +内10微秒DM-nitrophen和重新绑定到一个unphotolysed笼的〜300微秒的时间常数。另一方面，在apoDREAM的存在下在毫秒级的时间尺度发生的额外动能观察和反映了配体结合的蛋白质。 PBD的应用，探讨在生物系统中的构象转变已经以某种方式限制由于器乐困难;探头和泵浦光束，实现了强大的和可重复的PBD信号，例如艰巨对齐。然而，一个精心设计的仪器设定，温度的精确控制，并在探针和泵浦光束的仔细对准提供一个一致的和健壮的PBD信号，使监控的时间分辨体积和热焓的变化在广泛时间尺度从10微秒至约200毫秒。此外，modific的实验步骤，以保证相同的温度，缓冲液组成，光学元件取向，激光功率等下的样品和参考轨迹的检测的ations显著降低测得的反应体积和焓的实验误差。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="639">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col /> 
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N&#39;,N&#39;-Tetraacetic Acid</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D-6814</td>
			<td style="width:220px;">DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation,</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid)</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Adrich</td>
			<td>0909C</td>
			<td>HEPES buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Potassium ferricyanide(III)</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">702587</td>
			<td style="width:220px;">reference compound for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"> </td>
			<td style="width:84px;"> </td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td style="width:220px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium chromate</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">307831</td>
			<td style="width:220px;">reference compound for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">He-Ne Laser Diode 5mW 635nm </td>
			<td style="width:84px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">54-179</td>
			<td style="width:220px;">use as a probe beam for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Oscilloscope, </td>
			<td style="width:84px;">LeCroy</td>
			<td style="width:119px;">Wave Surfer 42Xs</td>
			<td style="width:220px;">400 MHz bandwith</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nd:YAG laser</td>
			<td style="width:84px;">Continuum</td>
			<td style="width:119px;">ML II</td>
			<td>pump beam for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:216px;">M355; Nd:YAG laser mirror</td>
			<td style="width:84px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">47-324</td>
			<td>laser mirror for 355 nm laser line</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:216px;">M1 and M2; Laser diode mirror</td>
			<td style="width:84px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">43-532</td>
			<td>visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">P1 and P2; Iris Diaphragm</td>
			<td style="width:84px;">Edmind Optics</td>
			<td style="width:119px;">62-649</td>
			<td style="width:220px;">pin hole to shape the probe and pum beams</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">L1; bi-convex lens</td>
			<td style="width:84px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">LB1844</td>
			<td style="width:220px;">a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350 - 2000 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DM, dichroic mirror</td>
			<td style="width:84px;">Thorlab </td>
			<td style="width:119px;">DMLP505</td>
			<td style="width:220px;">a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">F1; Edge filter</td>
			<td style="width:84px;">Andower </td>
			<td style="width:119px;">500FH90-25</td>
			<td>a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Temperature-controlled cuvette holder</td>
			<td style="width:84px;">Quantum Northwest</td>
			<td style="width:119px;">FLASH 300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

submillisecond conformational changes in proteins resolved by photothermal beam deflection

光热光束偏转与光声量热法和热光栅一起属于监视光诱导微秒的蛋白质构象变化用传统的站到毫秒时间尺度是不能访问的时间分布体积和焓变光热方法的家庭流量仪表。另外，由于在体积和/或焓的整体变化进行了探讨，这些技术可以应用到那些缺乏荧光团和或发色团标记的蛋白质和其他生物大分子。为了监测与钙有关的结构变化动力学和热力学+结合钙的传感器，例如神经元钙传感器，笼中的钙化合物，DM-nitrophen，是用来光电触发快速（τ&lt;20微秒）增加游离钙浓度和相关的量和焓变是使用光热光束偏转技术探讨。

PBD的一个代表性的例子痕迹的Ca 2 +的光释放的Ca 2 + DM-nitrophen示于图3。快速相位对应于光裂解的Ca 2 + DM-nitrophen与Ca 2 +释放的，而慢相体现的Ca 2 +结合到nonphotolysed笼。样品PBD振幅缩放到参考化合物的振幅随着温度依赖系数[C Pρ/（的dn / dt）的]的函数的快和慢相的积因子，根据公式4和缩放所观察到的量释放到溶液中，非热容...

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Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

在这里，我们报告的光热光束偏转技术在同一个笼中钙化合物，DM-nitrophen，监控微秒和毫秒动态及与钙的关联关联到一个神经元的钙传感器，下游调控元件拮抗剂调制器结构变化热力学相结合的应用。

亚毫秒构象变化蛋白的光热光束偏转已解决

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

submillisecond-conformational-changes-proteins-resolved-photothermal

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