עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (MCB 1,021,831, JM) וי &amp; E. ביו רפואית תכנית המחקר (פלורידה מחלקת בריאות, JM).

1. הכנות לדוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את הכנת מדגם וכל מניפולציות המדגם בחדר חשוך כדי למנוע משחררות רפרוף לא רצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Solubilize DM-nitrophen ((1 - (2-ניטרו-4 ,5-dimethoxyphenyl) - N, N, N &#39;, N&#39;-tetrakis [מתיל (Oxy-קרבוניל)] -1,2-ethanediamine) ב50 HEPES מ&quot;מ חיץ, 100 מ&quot;מ KCl, pH 7.0 לריכוז סופי של 400 מיקרומטר (ε 350nm = 4330 M -1 cm -1 9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף CaCl 2 מפתרון מניות 0.1 M כדי להשיג יחס רצוי של [Ca 2 +]: [DM-nitrophen]. לחלבונים עם ד K עבור Ca 2 + עמותה גדולה מ10 מיקרומטר, היחס של [Ca 2 +]: [DM-nitrophen] של 1:1 עדיף למנוע מחייב של 2 + Ca-שוחרר תמונה לDM-nitrophen שברחה מכלוב . ואכן, שוקל את ערך ד K עבור DM-nitrophen להיות 10 ננומטר והריכוז הכולל של DM-nitrophen וCa 2 + להיות 400 מ&quot;מ, ~ 90% סידן חלבון מחייביםעם ד K = 10 מיקרומטר יהיה בapoform. מצד השני, למחקר של Ca 2 + מחייב את חלבונים עם ד K &lt;10 מיקרומטר, עדיף להקטין את [Ca 2 +]: היחס [DM-nitrophen] ל0.95 למנוע Ca 2 + complexation עם APO- חלבון לפני צילום דיסוציאציה הכלוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Solubilize מתחם ההתייחסות, K 3 [Fe (III) (CN) 6] או Na 2 4 CRO, באותו חיץ כלמדגם. </li></ol> 2. הגדרת הניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התצורה הניסיונית הבסיסית מוצגת באיור 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש חור סיכה (P 2) כדי להתאים את הקוטר של קרן הבדיקה (פלט 632 ננומטר של לייזר הוא Ne-, כוח לייזר 5 mW ~) 1 מ&quot;מ ולהפיץ את קרן הבדיקה דרך מרכז תא יוצב בטמפרטורה בשליטת בעל תא באמצעות מראה M 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש במראה (ז 2) מאחורי המדגם כדי למרכז את קרן הבדיקהבמרכזו של גלאי רגיש עמדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תתמקד קרן הבדיקה במרכז של הגלאי בצורה כזאת, כי ההבדל במתח בין שתי דיודות העליונה ושתי דיודות תחתונה, כמו גם ההבדל במתח בין שתי דיודות בצד השמאל וימין של הגלאי הוא אפס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהמשך לכך, לעצב את קוטר של קרן המשאבה, פלט 355 ננומטר של ממותג Q Nd: YAG לייזר, FWHM 5 NSEC) באמצעות חריר 3 מ&quot;מ (P 1) ממוקם בין שתי מראות לייזר 355 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Copropagate קרן המשאבה דרך מרכז קובט כפי שמודגם באיור 2. חשוב ששני קרני הלייזר מופצות דרך מרכז התא האופטי באופן כמעט colinear להשיג זווית סטיה מדידה ובכך גבוהה המשרעת של אות PBD. תחת תנאי ניסוי, את הזווית של צומת האלומות ובדיקת המשאבה היא פחות מ 15 °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במתחם התייחסות ליישר את החללית ומשאבהקרן להשגת אות PBD משביעה רצון, כלומר יחס טוב S / N ומשרעת PBD יציב על סקלות זמן ארוכים יותר (~ 100 אלפיות שנייה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את המיקום של קרן המשאבה ביחס לקרן הבדיקה על ידי התאמה הדרגתית של 355 מראות לייזר ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את המשרעת של אות ייחוס PBD כהבדל בין שתי דיודות העליונה והתחתונה על הגלאי רגיש העמדה. אות PBD צריכה להפגין גידול מהיר במשרעת בזמן בקנה מידה מהירה (&lt;10 μsec) ולהישאר יציבה ב100 זמנים אלפיות שניים כפי שמודגמת באיור 3. הזריקה לשונות נורו של משרעת PDB היא בתוך 5% של משרעת האות ושחזור האות מושפע בעיקר מתנודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הליניאריות במשרעת אות PBD ביחס לאנרגיית החום המשתחררת על ידי מדידת התלות ליניארית של אות PBD על כוח לייזר עירור ועל מספר אינשטיין נספגה, E= (1-10-), שבו תואם את ספיגת ההתייחסות בגל העירור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את כוח הלייזר מתחת כ -1,000 μJ וספיגה של מתחם מדגם / התייחסות בגל העירור פחות מ 0.5 כדי למנוע ספיגת multiphoton וירידה של כוח קרן משאבה, בהתאמה, ולהבטיח ליניאריות של אות PBD. </li></ol> 3. מדידות PBD <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל עם המדידה של עקבות PBD להתייחסות. מניחים את הפתרון של מתחם ההתייחסות בתא קוורץ x 0.5 סנטימטר 1.0 סנטימטר x 1.0 סנטימטר או 1.0 סנטימטר ולמקם את התא בבעל הטמפרטורה מבוקרת. שני אורכי הנתיב לספק משרעת PBD דומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות את אות PBD ההתייחסות כפונקציה של טמפרטורה בטווח הטמפרטורות 16-35 ° C עם תוספת הטמפרטורה של 3 מעלות צלזיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על כל שינוי בטמפרטורה, לבדוק את המיקום של קרן הבדיקה בגלאי רגיש העמדה מחדשלהתאים את המיקום למרכז של הגלאי במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הליניאריות של אות PBD כפונקציה של טווח [(dn / dt) ρ P / C] לפי משוואה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את פתרון המדגם באותו התא אופטי כמו למתחם התייחסות שמירה על אותו הכיוון של התא האופטי כמו למדידת ההתייחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי מדגם עקבות PBD באותו טווח הטמפרטורות כמו להתייחסות ולבדוק את הליניאריות של משרעת PBD המדגם ביחס ל[ (dn / dt) ρ P / C] הטווח. </li></ol> 4. ניתוח נתונים סדר הגודל של הסטייה הוא ביחס ישר לשינוי הנפח עקב חימום המדגם (ΔV ה) ושינוי nonthermal נפח (nonth ΔV) לפי משוואת 1: <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq1.jpg" alt="משוואת 1" /> המשרעת של המדגם (S) והתייחסות (r) אות PBD ניתן לתאר באמצעות משוואות 2 ו -3, בהתאמה. <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq2.jpg" alt="משוואה 2" /> <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq3.jpg" alt="משוואה 3" /> אות PBD עומד ביחס ישר לפרמטר תגובת מכשיר (K) ומספר אינשטיין נספג (E). הקדנציה הראשונה במשוואה 2, (dn / dt) (עמ &#39;1/ρC) Q, תואמת את שינוי האות עקב החום המשתחרר לממס. Dn / dt הטווח מייצג את שינוי הטמפרטורה תלויה באינדקס שבירה, ρ הוא הצפיפות של הממס, עמ &#39;C הוא קיבול החום. כל הפרמטרים ידועים למים מזוקקים וניתן לקבוע לפתרון חיץ על ידי השוואת אותות PBD למתחם ההתייחסות במים מזוקקים ובמאגר מתאים. Q הוא כמות returne החוםד לממס. טווח ρ (DN / ד ρ) הוא יחידה קבועה פחות שהוא טמפרטורה עצמאית בטווח טמפרטורות 10-40 ° C 10. טווח רירי בטן Δn מתאים לשינוי באינדקס השבירה בשל נוכחותם של מיני קליטה בפתרון וזה זניח אם אורך הגל של קרן הבדיקה מוסט ביחס לספקטרום הספיגה של מינים כלשהו בפתרון. האות הנובעת ממתחם ההתייחסות (r) באה לידי ביטוי על ידי משוואה 3 בי ν h E הוא אנרגיית הפוטון באורך גל העירור, ν h E = 80.5 קלוריות / mol ל355 עירור ננומטר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את המשרעת של אות PBD ההתייחסות כהפרש בין pretrigger ואות PBD הודעה הדק כפי שמודגם באיור 3. באופן דומה, לקבוע את המשרעת של הצום (s מהירה) ושלב איטי (s איטית) של אות PBD המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסל את פרמטר תגובת המכשיר, K, בהיקף של המשרעת של אות PBD המדגם על ידי משרעת של אות PBD להתייחסות. היחס של אות הדגימה לאות ההתייחסות נותן משוואה 4 ויכול להיות כפי שנכתב: <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq4.jpg" alt="משוואה 4" /> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במשוואה זו, לקבוע את החום המשתחרר לפתרון (Q) והשינוי בנפח nonthermal (nonth ΔV) הקשורים לתגובה ביוזמת תמונה מהמדרון וליירט, בהתאמה, של חלקה [(s / R) E ν h] טווח לעומת [טווח תלוי טמפרטורה (dn / dt) (1/ρCp)]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע את עוצמת תגובה ושינוי באנתלפיה למהירה ותהליך האיטי, קנה מידה של הנפח שנצפה ושינוי באנתלפיה לתשואת הקוונטים המתאים בהתאם למשוואות 5-7. <img src = &quot;/ files/ftp_upload/50969/50969eq5.jpg&quot; alt = /&gt; &quot;משוואה 5&quot; <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq6.jpg" alt="משוואה 6" /> <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq7.jpg" alt="משוואה 7" /> לתהליך רב שלבי עם קינטיקה המתרחשת בזמן בקנה המידה בין 10 μsec ~ 200 אלפיות שני, ניתן לקבוע את עוצמת הקול ושינויי אנתלפיה הקשורים לשלביה השונים של התגובה. אמפליטודות והגלגולים לצעדים הבודדים מנותחים על ידי התאמת הנתונים לפונקצית F (t) שמתאר את הפרופיל של הנפח ושינויי אנתלפיה הזמן. <img alt="משוואה 8" src="/files/ftp_upload/50969/50969eq8.jpg" /> שבו α 0 מתאים לים מהיר וα i מתאימה לים איטי לכל תהליך אישי וτ אני נמצא בחיים של צעדי תגובה הבודדים. מטמפרטורת התלות של קבוע קצב עבורr תהליכים בודדים (k i = 1 / τ) i הפרמטרים אנתלפיה ההפעלה ואנטרופיה ניתן בקלות לקבוע באמצעות עלילות איירינג. </li></ol>

<ol>
	<li>Gensch, T., Viappiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+photothermal+methods:+accessing+time-resolved+thermodynamics+of+photoinduced+processes+in+chemistry+and+biology.">Time-resolved photothermal methods: accessing time-resolved thermodynamics of photoinduced processes in chemistry and biology.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 2, 699-721 (2003).</li><li>Larsen, R. W., Mik&#353;ovsk&#225;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+resolved+thermodynamics+of+ligand+binding+to+heme+proteins.">Time resolved thermodynamics of ligand binding to heme proteins.</a> Coord. Chem. Rev. 251 (9-10), 1101-1127 (2007).</li><li>Westrick, J. A., Peters, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoacoustic+calorimetric+study+of+horse+myoglobin.">A photoacoustic calorimetric study of horse myoglobin.</a> Bioph. Chem. 37 (1-3), 73-79 (1990).</li><li>Belogortseva, N., Rubio, M., Terrell, W., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+heme+propionate+groups+to+the+conformational+dynamics+associated+with+CO+photodissociation+from+horse+heart+myoglobin.">The contribution of heme propionate groups to the conformational dynamics associated with CO photodissociation from horse heart myoglobin.</a> J. Inorg. Biochem. 101 (7), 977-986 (2007).</li><li>Mik&#353;ovsk&#225;, J., Suquet, C., Satterlee, J. D., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Conformational+Changes+Coupled+to+Ligand+Photodissociation+from+the+Heme+Binding+Domain+of+FixL.">Characterization of Conformational Changes Coupled to Ligand Photodissociation from the Heme Binding Domain of FixL.</a> Biochemistry. 44 (30), 10028-10036 (2005).</li><li>Miksovska, J., Gennis, R. B., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photothermal+studies+of+CO+photodissociation+from+mixed+valence+Escherichia+coli+cytochrome+bo3.">Photothermal studies of CO photodissociation from mixed valence Escherichia coli cytochrome bo3.</a> FEBS Lett. 579 (14), 3014-3018 (2005).</li><li>Losi, A., Michler, I., G&#228;rtner, W., Braslavsky, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+Thermodynamic+Changes+Photoinduced+in+5,12-trans-locked+Bacteriorhodopsin.+Evidence+that+Retinal+Isomerization+is+Required+for+Protein+Activation.">Time-resolved Thermodynamic Changes Photoinduced in 5,12-trans-locked Bacteriorhodopsin. Evidence that Retinal Isomerization is Required for Protein Activation.</a> Photochem. Photobiol. 72, 590-597 (2000).</li><li>Kondoh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Induced+Conformational+Changes+in+Full-Length+Arabidopsis+thaliana+Cryptochrome.">Light-Induced Conformational Changes in Full-Length Arabidopsis thaliana Cryptochrome.</a> J. Mol. Biol. 413 (1), 128-137 (2011).</li><li>Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolabile+chelators+for+the+rapid+photorelease+of+divalent+cations.">Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (17), 6571-6575 (1988).</li><li>Eisenberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equation+for+the+Refractive+Index+of+Water.">Equation for the Refractive Index of Water.</a> J. Chem. Phys. 43 (11), 3887-3892 (1965).</li><li>Ellis-Davies, G. C., Kaplan, J. H., Barsotti, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+calcium:+rates+of+calcium+release+by+nitrophenyl-EGTA+and+DM-nitrophen.">Laser photolysis of caged calcium: rates of calcium release by nitrophenyl-EGTA and DM-nitrophen.</a> Biophys. J. 70, 1006-1016 (1996).</li><li>Miksovska, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+in+metalloproteins.">Structure-function relationships in metalloproteins.</a> Methods Enzymol. 360, 302-329 (2003).</li><li>Miksovska, J., Norstrom, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+profiles+for+CO+photodissociation+from+heme+model+compounds:+effect+of+proximal+ligands.">Thermodynamic profiles for CO photodissociation from heme model compounds: effect of proximal ligands.</a> Inorg. Chem. 44 (4), 1006-1014 (2005).</li><li>Dhulipala, G., Rubio, M., Michael, K., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+profile+for+urea+photo-release+from+a+N-(2-nitrobenzyl)+caged+urea+compound.">Thermodynamic profile for urea photo-release from a N-(2-nitrobenzyl) caged urea compound.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1157-1163 (2009).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

העיקרון הפיזי מאחורי שיטות photothermal הוא שמולקולת צילום מתרגש מתפוגגת אנרגיה עודפת באמצעות הרפיה רטט למצב הקרקע, וכתוצאה מחימום תרמית של 1,12 ממס שמסביב. לממסים, כגון מים, זה מייצר התרחבות מהירה נפח (ΔV ה). מולקולות נרגשת מדינה עשויות גם לעבור תהליכי פוטו כי תוצ...

שיטות צילום תרמי כגון calorimetry photoacoustic, סטיה קרן photothermal (PDB), וצורם חולפים בשילוב עם עירור לייזר שבריר שנייה מייצגות חלופה רבת עוצמה ל חולפת spectroscopies האופטי ללימודים של ביניים קצרים 1,2 זמן נפתר. בניגוד לשיטות אופטיות, כגון קליטה חולפת וספקטרוסקופיה IR, העוקב אחר הפרופיל של שינויי קליטה בכרומופור שמסביב הזמן; טכניקות photothermal לזהות בזמן התלות של שינויי חום / נפח ולכן הם כלים רבי ערך לחקר פרופילים של אופטי זמן תהליכים &quot;שקטים&quot;. עד כה, calorimetry photoacoustic והצורם חולפים כבר מיושמים בהצלחה ללמוד דינמיקה קונפורמציה של תהליכים הנגרם תמונה כוללים הגירת יגנד דו אטומית בglobins 3,4, אינטראקציות יגנד עם חלבון חיישן חמצן FixL 5, אלקטרון ופרוטון בתחבורת heme-נחושת oxidases 6nd photosystem השני, כמו גם צילום isomerization ברודופסין 7 ודינמיקת קונפורמציה בCryptochrome 8. כדי להרחיב את היישום של טכניקות photothermal למערכות ביולוגיות שחסרות chromophore ו / או fluorophore פנימי, טכניקת PBD הייתה בשילוב עם השימוש במתחם בכלוב לצילום הדק עלייה בריכוז ליגנד / מצע בתוך כמה מיקרו או מהיר יותר, בהתאם במתחם בכלוב. גישה זו מאפשרת ניטור של דינמיקה ואנרגטיקה של שינויים מבניים הקשורים ליגנד / המצע מחייב את חלבונים שחסרים fluorophore או כרומופור פנימי ובזמן בקנה מידה שאינם נגישים על ידי עצירת זרימת מכשירים מסחריים. הנה יישום של PBD כדי לפקח על התרמודינאמיקה של מתחם הכלוב, Ca 2 + DM-nitrophen, צילום מחשוף כמו גם קינטיקה לCa 2 + עמותה לתחום בטרמינל C-של חיישן סידן העצבי דאוןזרם התקינה האלמנט אנטגוניסט מודולטור (חלום) מוצג. Ca 2 + הוא מCa-שוחררה תמונה 2 + DM-nitrophen בתוך 10 μsec וrebinds לכלוב unphotolysed עם קבוע של ~ 300 μsec זמן. מצד השני, בנוכחות apoDREAM הקינטית נוספת המתרחש בזמן בקנה המידה אלפית השנייה הוא ציין ומשקף את יגנד מחייב את החלבון. היישום של PBD לחקור מעברי קונפורמציה במערכות ביולוגיות היה מוגבל בדרך כלשהי בשל קשיי אינסטרומנטלי; יישור למשל מפרך של החללית וקרן משאבה כדי להשיג אות PBD חזקה ושחזור. עם זאת, עיצוב מוקפד של הגדרת מכשור, שליטה מדויקת של הטמפרטורה, ויישור זהיר של קרן הבדיקה ומשאבה מספקים אות PBD עקבית ויציבה, המאפשרת ניטור של זמן נפתר שינויי אנתלפיה ועוצמת קול ברחב זמן בקנה מידה מ10 μsec כ 200 לאלפיות שניים. בנוסף, modifications של ההליך ניסיוני כדי להבטיח זיהוי של עקבות מדגם והתייחסות בטמפרטורה זהה, הרכב חיץ, אורינטצית תא אופטי, כוח הלייזר, וכו &#39;מפחית באופן משמעותי את השגיאה הניסיונית בכמויות תגובה נמדדו וenthalpies.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="639">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col /> 
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N&#39;,N&#39;-Tetraacetic Acid</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D-6814</td>
			<td style="width:220px;">DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation,</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&#8242;-(2-ethanesulfonic acid)</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Adrich</td>
			<td>0909C</td>
			<td>HEPES buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Potassium ferricyanide(III)</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">702587</td>
			<td style="width:220px;">reference compound for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"> </td>
			<td style="width:84px;"> </td>
			<td style="width:119px;"> </td>
			<td style="width:220px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium chromate</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">307831</td>
			<td style="width:220px;">reference compound for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">He-Ne Laser Diode 5mW 635nm </td>
			<td style="width:84px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">54-179</td>
			<td style="width:220px;">use as a probe beam for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Oscilloscope, </td>
			<td style="width:84px;">LeCroy</td>
			<td style="width:119px;">Wave Surfer 42Xs</td>
			<td style="width:220px;">400 MHz bandwith</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nd:YAG laser</td>
			<td style="width:84px;">Continuum</td>
			<td style="width:119px;">ML II</td>
			<td>pump beam for PBD measurments</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:216px;">M355; Nd:YAG laser mirror</td>
			<td style="width:84px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">47-324</td>
			<td>laser mirror for 355 nm laser line</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:216px;">M1 and M2; Laser diode mirror</td>
			<td style="width:84px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:119px;">43-532</td>
			<td>visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">P1 and P2; Iris Diaphragm</td>
			<td style="width:84px;">Edmind Optics</td>
			<td style="width:119px;">62-649</td>
			<td style="width:220px;">pin hole to shape the probe and pum beams</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">L1; bi-convex lens</td>
			<td style="width:84px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">LB1844</td>
			<td style="width:220px;">a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350 - 2000 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DM, dichroic mirror</td>
			<td style="width:84px;">Thorlab </td>
			<td style="width:119px;">DMLP505</td>
			<td style="width:220px;">a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">F1; Edge filter</td>
			<td style="width:84px;">Andower </td>
			<td style="width:119px;">500FH90-25</td>
			<td>a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Temperature-controlled cuvette holder</td>
			<td style="width:84px;">Quantum Northwest</td>
			<td style="width:119px;">FLASH 300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

submillisecond conformational changes in proteins resolved by photothermal beam deflection

סטיה קרן photothermal יחד עם calorimetry תמונה אקוסטי ותרמי צורמת שייכת למשפחה של שיטות photothermal שלפקח בזמן פרופיל הנפח ואנתלפיה שינויי אור הנגרמים שינויי קונפורמציה בחלבונים במייקרו לאלפית שני בזמן קשקשים שאינם נגישים באמצעות מסורתית תחנה תזרים מכשירים. בנוסף, מאז שינויים הכוללים בנפח ו / או אנתלפיה הם חקרו, ניתן ליישם את הטכניקות הללו לחלבונים וBiomacromolecules האחרים שחסרים fluorophore ואו תווית chromophore. כדי לעקוב אחר דינמיקה ואנרגטיקה של שינויים מבניים הקשורים Ca 2 + מחייב מתמרים סידן, סידן חיישנים עצביים כגון, תרכובת סידן בכלוב, DM-nitrophen, הוא מועסק צילום הדק עלייה מהיר (τ &lt;20 μsec) בסידן חופשי שינויי ריכוז והנפח הקשורים ואנתלפיה הם חקרו באמצעות טכניקת סטיה קרן photothermal.

דוגמא מייצגת של PBD עקבות לCa 2 + תמונה שחרור מCa 2 + DM-nitrophen מוצגת באיור 3. השלב המהיר מתאים לצילום המחשוף של Ca 2 + DM-nitrophen וCa 2 + שחרור, ואילו השלב האיטי משקף Ca 2 + מחייבים לכלוב nonphotolysed. העלילה של המדגם משרעת PBD לשלב המהיר ואיטי בקנה מידה למש?...

Watch this Scientific Journal Video about Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection at JoVE.com

שינויים קונפורמציוניים של תת-מילישניות בחלבונים שנפתרו על ידי הסטת קרן פוטרמית | כימיה | וִידֵאוֹ

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

כאן אנו מדווחים יישום של טכניקת הסטת קרן photothermal בשילוב עם תרכובת בכלוב סידן, DM-nitrophen, לעקוב אחר דינמיקת המיקרו והאלפית שנייה והאנרגטיקה של שינויים מבניים הקשורים לעמותת סידן לחיישן סידן עצבי, אלמנט רגולטורים במורד אנטגוניסט מודולטור .

שינויי קונפורמציה Submillisecond בחלבונים נפתר על ידי photothermal Beam הסטה

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

submillisecond-conformational-changes-proteins-resolved-photothermal

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Biology

Physics

Fundamentals

Unit 1

The First Law of Thermodynamics

Macromolecules

SCIENTISTS IN ACTION

8.9K Views.  Florida International University.  כאן אנו מדווחים יישום של טכניקת הסטת קרן photothermal בשילוב עם תרכובת בכלוב סידן, DM-nitrophen, לעקוב אחר דינמיקת המיקרו והאלפית שנייה והאנרגטיקה של שינויים מבניים הקשורים לעמותת סידן לחיישן סידן עצבי, אלמנט רגולטורים במורד אנטגוניסט מודולטור . 

Video: Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice through their ice-binding surfaces. Fluorescence-based ice plane affinity (FIPA) analysis is a modified technique used to determine the ice planes to which the AFPs bind. FIPA is based on the original ice-etching method for determining AFP-bound ice-planes. It produces clearer images in a shortened experimental time. In FIPA analysis, AFPs are fluorescently labeled with a chimeric tag or a covalent dye then slowly incorporated into a macroscopic single ice crystal, which has been preformed into a hemisphere and oriented to determine the a- and c-axes. The AFP-bound ice hemisphere is imaged under UV light to visualize AFP-bound planes using filters to block out nonspecific light. Fluorescent labeling of the AFPs allows real-time monitoring of AFP adsorption into ice. The labels have been found not to influence the planes to which AFPs bind. FIPA analysis also introduces the option to bind more than one differently tagged AFP on the same single ice crystal to help differentiate their binding planes. These applications of FIPA are helping to advance our understanding of how AFPs bind to ice to halt its growth and why many AFP-producing organisms express multiple AFP isoforms.

Antifreeze proteins (AFPs) bind to specific planes of ice to prevent or slow ice growth. Fluorescence-based ice plane affinity (FIPA) analysis is a modification of the original ice-etching method for determination of AFP-bound ice planes. AFPs are fluorescently labeled, incorporated into macroscopic single ice crystals, and visualized under UV light.

קביעת המישורים המחייבים קרח של חלבונים נגד קיפאון על ידי זיקה למטוס קרח מבוסס פלואורסצנטיות

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

The Use of Gas Chromatography to Analyze Compositional Changes of Fatty Acids in Rat Liver Tissue during Pregnancy

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, yielding results with high accuracy and high reproducibility. In metabolic and nutrition studies GC allows assessment of changes in fatty acid concentrations following interventions or during changes in physiological state such as pregnancy. Solid phase extraction (SPE) using aminopropyl silica cartridges allows separation of the major lipid classes including triacylglycerols, different phospholipids, and cholesteryl esters (CE). GC combined with SPE was used to analyze the changes in fatty acid composition of the CE fraction in the livers of virgin and pregnant rats that had been fed various high and low fat diets. There are significant diet/pregnancy interaction effects upon the omega-3 and omega-6 fatty acid content of liver CE, indicating that pregnant females have a different response to dietary manipulation than is seen among virgin females.

Pregnancy leads to significant changes to the fatty acid composition of maternal tissues. Lipid profiles can be obtained via gas chromatography to allow identification and quantification of fatty acids in individual lipid classes among rats fed various high and low fat diets during pregnancy.

השימוש בגז כרומטוגרפיה לנתח הלחנה שינויים של חומצות שומן ברקמות חולדה כבד במהלך הריון

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

Radiolabeling וכימות של רמות סלולריות של Phosphoinositides ידי נצנץ זרימה מצמיד כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). The fibronectin protein film was immobilized on the silicon nitride (SiN) membrane that forms the SALVI detection area. During ToF-SIMS analysis, three modes of analysis were conducted including high spatial resolution mass spectrometry, two-dimensional (2D) imaging, and depth profiling. Mass spectra were acquired in both positive and negative modes. Deionized water was also analyzed as a reference sample. Our results show that the fibronectin film in water has more distinct and stronger water cluster peaks compared to water alone. Characteristic peaks of amino acid fragments are also observable in the hydrated protein ToF-SIMS spectra. These results illustrate that protein molecule adsorption on a surface can be studied dynamically using SALVI and ToF-SIMS in the liquid environment for the first time.

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

This work presents a protocol for liquid handling and sample introduction to a microchannel for in situ time-of-flight secondary ion mass spectrometry analysis of protein biomolecules in an aqueous solution.

באפיון באתרו של חלבונים מימה במים על ידי Salvi ו TOF-SIMS

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring high sensitivity and a wide dynamic range. Mass spectrometry-based quantification assays for proteins typically involve protein digestion followed by the selective reaction monitoring/multiple reaction monitoring (SRM/MRM) quantification of peptides using a low-resolution (Rs ~1,000) tandem quadrupole mass spectrometer. One of the limitations of this approach is the interference phenomenon observed when the peptide of interest has the "same" precursor and fragment mass (in terms of m/z values) as other co-eluting peptides present in the sample (within a 1-Da window). To avoid this phenomenon, we propose an alternative mass spectrometric approach, a high selectivity (HS) MRM assay that combines the ion mobility separation of peptide precursors with the high-resolution (Rs ~30,000) MS detection of peptide fragments. We explored the capabilities of this approach to quantify low-abundance peptide standards spiked in a monoclonal antibody (mAb) digest and demonstrated that it has the sensitivity and dynamic range (at least 3 orders of magnitude) typically achieved in HCP analysis. All six peptide standards were detected at concentrations as low as 0.1 nM (1 femtomole loaded on a 2.1-mm ID chromatographic column) in the presence of a high-abundance peptide background (2 &#181;g of a mAb digest loaded on-column). When considering the MW of rabbit phosphorylase (97.2 kDa), from which the spiked peptides were derived, the LOQ of this assay is lower than 50 ppm. Relative standard deviations (RSD) of peak areas (n = 4 replicates) were less than 15% across the entire concentration range investigated (0.1-100 nM or 1-1,000 ppm) in this study.

Here, we describe a chromatographic assay coupled with the ion mobility separation of peptide precursors followed by the high-resolution (~30,000) MS-detection of peptide fragments for the quantification of spiked peptide standards in a monoclonal antibody digest.

וזמינותו HS-MRM עבור כימות של התא המארח חלבונים בחלבון ביופרמצבטיקה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית יון ניידות QTOF ספקטרומטר מסה

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Time-resolved Photophysical Characterization of Triplet-harvesting Organic Compounds at an Oxygen-free Environment Using an iCCD Camera

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables the acquisition of photoluminescence spectra covering the time regime from nanoseconds up to 0.1 s. This enables us to follow the changes in the intensity (decay) and emission of the spectra over time. Using this method, it is possible to study diverse photophysical phenomena, such as the emission of phosphorescence, and the contributions of prompt and delayed fluorescence in molecules showing thermally activated delayed fluorescence (TADF). Remarkably, all spectra and decays are obtained in a single experiment. This can be done for solids (thin film, powder, crystal) and liquid samples, where the only limitations are the spectral sensitivity of the camera and the excitation wavelength (532 nm, 355 nm, 337 nm, and 266 nm). This technique is, thus, very important when investigating the excited state dynamics in organic emitters for their application in organic light-emitting diodes and other areas where triplet harvesting is of paramount importance. Since triplet states are strongly quenched by oxygen, emitters with efficient TADF luminescence, or those showing room temperature phosphorescence (RTP), must be correctly prepared in order to remove any dissolved oxygen from solutions and films. Otherwise, no long-lived emission will be observed. The method of degassing solid samples as presented in this work is basic and simple, but the degassing of liquid samples creates additional difficulties and is particularly interesting. A method of minimizing solvent loss and changing the sample concentration, while still enabling to remove oxygen in a very efficient and a repeatable manner, is presented in this work.

Here, we present a method of the spectroscopic characterization of organic molecules by means of time-resolved photoluminescence spectroscopy on the nanosecond-to-millisecond timescale in oxygen-free conditions. Methods to efficiently remove oxygen from the samples and, thus, limit luminescence quenching are also described.

זמן לפתור Photophysical אפיון של שלישיה-קציר תרכובות אורגניות ללא חמצן-הסביבה שימוש iCCD המצלמה

Here, we present a sensible method of the acquisition and analysis of time-resolved photoluminescence using an ultrafast iCCD camera. This system enables ...

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the evaluation of DNA-magnetic particles binding via dynamic light scattering (DLS) and electrophoretic light scattering (ELS). Analysis by DLS provides valuable information on the physicochemical properties of particles including particle size, polydispersity, and zeta potential. The latter describes the surface charge of the particle which plays major role in electrostatic binding of materials such as DNA. Here, a comparative analysis exploits three chemical modifications of nanoparticles and microparticles and their effects on DNA binding and elution. Chemical modifications by branched polyethylenimine, tetraethyl orthosilicate and (3-aminopropyl)triethoxysilane are investigated. Since DNA exhibits a negative charge, it is expected that zeta potential of particle surface will decrease upon binding of DNA. Forming of clusters should also affect particle size. In order to investigate the efficiency of these particles in isolation and elution of DNA, the particles are mixed with DNA in low pH (~6), high ionic strength and dehydration environment. Particles are washed on magnet and then DNA is eluted by Tris-HCl buffer (pH = 8). DNA copy number is estimated using quantitative polymerase chain reaction (PCR). Zeta potential, particle size, polydispersity and quantitative PCR data are evaluated and compared. DLS is an insightful and supporting method of analysis that adds a new perspective to the process of screening of particles for DNA isolation.

This protocol describes the synthesis of magnetic particles and evaluation of their DNA-binding properties via dynamic and electrophoretic light scattering. This method focuses on monitoring changes in particle size, their polydispersity and zeta potential of particle surface which play major role in binding of materials such as DNA.

חלקיקים מגנטיים-DNA מחייב ניתוח לפי פיזור אור דינאמי, Electrophoretic

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent proteins and generation of fluorescent fusion proteins have been wildly used as an effective tool to directly visualize the protein localization and dynamics in cells. It is especially useful to compare them with well-known organelle markers after co-expression with the protein of interest. Nevertheless, classical approaches for protein co-expression in plants usually involve multiple independent expression plasmids, and therefore have drawbacks that include low co-expression efficiency, expression-level variation, and high time expenditure in genetic crossing and screening. In this study, we describe a robust and novel method for co-expression of multiple chimeric fluorescent proteins in plants. It overcomes the limitations of the conventional methods by using a single expression vector that is composed of multiple semi-independent expressing cassettes. Each protein expression cassette contains its own functional protein expression elements, and therefore it can be flexibly adjusted to meet diverse expression demand. Also, it is easy and convenient to perform the assembly and manipulation of DNA fragments in the expression plasmid by using an optimized one-step reaction without additional digestion and ligation steps. Furthermore, it is fully compatible with current fluorescent protein derived bio-imaging technologies and applications, such as FRET and BiFC. As a validation of the method, we employed this new system to co-express fluorescently fused vacuolar sorting receptor and secretory carrier membrane proteins. The results show that their perspective subcellular localizations are the same as in previous studies by both transient expression and genetic transformation in plants.

We have developed a novel method for co-expressing multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants to overcome the difficulties of conventional methods. It takes advantage of using a single expression plasmid that contains multiple functionally independent protein expressing cassettes to achieve protein co-expression.

ביטוי משותף של מספר חלבונים Chimeric פיוז'ן פלורסנט בדרך יעילה בצמחים

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of F&#8722;

Anion photoelectron imaging is a very efficient method for the study of energy states of bound negative ions, neutral species and interactions of unbound electrons with neutral molecules/atoms. State-of-the-art in vacuo anion generation techniques allow application to a broad range of atomic, molecular, and cluster anion systems. These are separated and selected using time-of-flight mass spectrometry. Electrons are removed by linearly polarized photons (photo detachment) using table-top laser sources which provide ready access to excitation energies from the infra-red to the near ultraviolet. Detecting the photoelectrons with a velocity mapped imaging lens and position sensitive detector means that, in principle, every photoelectron reaches the detector and the detection efficiency is uniform for all kinetic energies. Photoelectron spectra extracted from the images via mathematical reconstruction using an inverse Abel transformation reveal details of the anion internal energy state distribution and the resultant neutral energy states. At low electron kinetic energy, typical resolution is sufficient to reveal energy level differences on the order of a few millielectron-volts, i.e., different vibrational levels for molecular species or spin-orbit splitting in atoms. Photoelectron angular distributions extracted from the inverse Abel transformation represent the signatures of the bound electron orbital, allowing more detailed probing of electronic structure. The spectra and angular distributions also encode details of the interactions between the outgoing electron and the residual neutral species subsequent to excitation. The technique is illustrated by the application to an atomic anion (F&#8722;), but it can also be applied to the measurement of molecular anion spectroscopy, the study of low lying anion resonances (as an alternative to scattering experiments) and femtosecond (fs) time resolved studies of the dynamic evolution of anions.

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of F&lt;sup&gt;&amp;#8722;&lt;/sup&gt;

Here, we present a protocol for photoelectron imaging of anionic species. Anions generated in vacuo and separated by mass spectrometry are probed using velocity mapped photoelectron imaging, providing details of anion and neutral energy levels, anion and neutral structure and the nature of the anion electronic state.

Photoelectron הדמיה של אניונים מאויר על ידי ניתוק 310 ננומטר F−

Anion photoelectron imaging is a very efficient method for the study of energy states of bound negative ions, neutral species and interactions of unbound ...

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray free electron lasers (XFELs). A series of experiments using the light-driven proton pump bacteriorhodopsin have further established these injectors as a preferred option to deliver crystals for time-resolved serial femtosecond crystallography (TR-SFX) to resolve structural changes of proteins after photoactivation. To obtain multiple structural snapshots of high quality, it is essential to collect large amounts of data and ensure clearance of crystals between every pump laser pulse. Here, we describe in detail how we optimized the extrusion of bacteriorhodopsin microcrystals for our recent TR-SFX experiments at the Linac Coherent Light Source (LCLS). The goal of the method is to optimize extrusion for a stable and continuous flow while maintaining a high density of crystals to increase the rate at which data can be collected in a TR-SFX experiment. We achieve this goal by preparing lipidic cubic phase with a homogenous distribution of crystals using a novel three-way syringe coupling device followed by adjusting the sample composition based on measurements of the extrusion stability taken with a high-speed camera setup. The methodology can be adapted to optimize the flow of other microcrystals. The setup will be available for users of the new Swiss Free Electron Laser facility.

The success of a time-resolved serial femtosecond crystallography experiment is dependent on efficient sample delivery. Here, we describe protocols to optimize the extrusion of bacteriorhodopsin microcrystals from a high viscosity micro-extrusion injector. The methodology relies on sample homogenization with a novel three-way coupler and visualization with a high-speed camera.

שיפור ההבלטה צמיגות גבוהה של Microcrystals עבור זמן לפתור את טורי קריסטלוגרפיה הפמטו-שנייה-רנטגן לייזרים

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...