وأيد هذا العمل من قبل التحالف الوطني لأبحاث الفصام والاكتئاب (NARSAD) جائزة الباحث الشاب والمعاهد الوطنية للصحة منح R01NS073635 لAV.

1. إعداد الكواشف وحلول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم تزويد الكولاجين من النوع 1 الحل بمثابة محلول مائي في 20 ملي حمض الخليك (~ 100 ملغم بروتين / قارورة): طلاء من 35 مم طبق الثقافة. تمييع حجم مناسب من حل الكولاجين لتركيز العمل من 0.01٪ باستخدام زراعة الأنسجة المعقمة للمياه الصف. أطباق معطف مع 1 مل من محلول الكولاجين لمدة 3-4 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT) أو 37 درجة مئوية، أو بين عشية وضحاها في 2-8 درجة مئوية. إزالة الزائدة حل من الطبق المغلفة واتركه حتى يجف بين عشية وضحاها. شطف الطبق مع الماء زراعة الأنسجة الصف أو برنامج تلفزيوني قبل إضافة وسائل الإعلام. ويمكن تخزين الأطباق المغلفة في 4 درجة مئوية لمدة شهر واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد كاملة Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM). تكملة DMEM (500 مل) مع 10٪ FBS وحل المضادات الحيوية مضاد فطري (تركيز 1X؛ ml/100 1 مل). DMEM كاملة يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة شهرين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد قسامة (50 مل) من DMEM مع الدناز الأول (0.001 ملغ / مل)، (ويشار إلى DMEM-الدناز الأول). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد قسامة آخر (10 مل) من DMEM مع كولاجيناز وdispase (1 ملغ / مل) (ويشار إلى DMEM-collagenase/dispase). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الخلايا البطانية الثقافة المتوسطة (ECCM، 500 مل)، على أن تستكمل مع EGF (5 ميكروغرام)، رسم القلب (100 ملغ) و 5 ميكرولتر من محلول مضاد فطري للمضادات الحيوية. ECCM يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة شهرين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prewarm جميع وسائل الإعلام قبل الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تنقية العازلة: برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.2 مع 0.5٪ BSA و 2 ملي EDTA. إبقاء العازلة الباردة (2-8 درجة مئوية). </li></ol> 2. إزالة الأجنة وتشريح الدماغ الانتهائي تمت الموافقة على جميع التجارب باستخدام الحيوانات المختبرية بواسطة رعاية الحيوان واستخدام لجان من مستشفى ماكلين وتتفق مع المبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام توقيت الفئران CD1 الحوامل (اليوم الجنينية 15). ويعتبر اليوم من اكتشاف المكونات المهبلية اليوم الجنينية 0 (E0). السدود CD1 تنتج عادة الفضلات كبيرة، لذلك الجنين 10-12ويتوقع من سد الحوامل ق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لبضع الرحم، تخدير الفئران الحوامل مع حقنة داخل الصفاق من الكيتامين (100 ملغ / كلغ) / زيلازين (5 ملغ / كلغ). بالنسبة للفئران حوالي 20-30 غرام، تقديم 0.3 مل من محلول مخدر 10 مل / كغ الكيتامين / زيلازين والتأكد من أن الألم والضيق هو الحد الأدنى أثناء الحقن داخل الصفاق من تأثير المخدر. استخدام اليد لضبط النفس الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق التخدير العميق عن طريق قرصة أخمص قدميه. ازالة الأجنة من الفئران تخدير عميق. قطع رأس كل جنين فور إزالة من الأم. وضع رؤساء الجنينية في أطباق بتري معقمة في الجليد الباردة PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متابعة استئصال الرحم عن طريق القتل الرحيم مع جرعة زائدة من مخدر فوري (130 ملغ / كغ بنتوباربيتال، والملكية الفكرية)، وهي طريقة للقتل الرحيم، وهو ما يتسق مع المبادئ التوجيهية اخر احصاء للالقتل الرحيم للحيوانات: 2013 الطبعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت المجهر ستيريو، وإزالة المخ من الرأس مع مقص microtip غرامة وملقط غرامة. ملاحظة: A تشريح عالية الجودةأيون هو ضروري لإزالة الغشاء حنوني بنجاح من المخ الجنينية. ويتحقق ذلك عن طريق الممارسة. ملقط غرامة ومقص microtip هي أيضا الأدوات الرئيسية من أجل الحصول على تشريح جيدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط للحصول على احكام قبضتهم على الدماغ ومقص microtip لقشر بعيدا الغشاء حنوني. إزالة الدماغ المتوسط ​​والدماغ التالي وعزل لل telencephalon. نقل مجانية حنوني-الدماغ الانتهائي من جميع الأجنة إلى صحن الثقافة 35 ملم مع 2 مل PBS في الجليد. </li></ol> 3. عزل الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخطر لل telencephalon إلى 1-2 ملم شظايا بشفرة المشرط وجمع الأنسجة في 15 مل فالكون أنبوب يحتوي على 2 مل من DMEM كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الأنسجة بلطف ولكن بدقة مع ماصة 1 مل حتى كتل تختفي ويتم التوصل إلى وقف حليبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا في فصل 800-1،000 x ج لمدة 5 دقائق في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية طاف و resuspend بيليه في DMEM الدناز أولا بلطف يفرق بين مLLS مرة أخرى باستخدام ماصة 1 مل وأجهزة الطرد المركزي في 800-1،000 x ج لمدة 5 دقائق على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية في DMEM كاملة الدافئة. تصفية الخلايا من خلال العقيمة 70 ميكرومتر شبكة النايلون. جمع الخلايا التي تمت تصفيتها والاحتفاظ بها في الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع أجزاء الخلية، احتفظت على شبكة وهضم المزيد مع DMEM-collagenase/dispase (2 مل) لمدة 1-2 دقيقة في RT. غسل الخلايا 3X في DMEM الدناز أنا من خلال الطرد المركزي في 800-1،000 x ج لمدة 5 دقائق على RT. تجمع هذه الخلايا مع الخلايا التي تمت تصفيتها جمعها في الخطوة 3.5. غسل خلايا مرة واحدة مع مجموعه كاملة DMEM. المضي قدما لتحديد عدد الخلايا وخطوات وضع العلامات المغناطيسي. ملاحظة: من المهم الحصول على تعليق خلية واحدة قبل وضع العلامات المغناطيسي. </li></ol> 4. وصفها المغناطيسي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يظهر هذا البروتوكول وصفها المغناطيسي من 10 7 الخلايا. لأرقام الخلية أقل من 10 7، استخدام نفس حجم الكاشف وللأرقام الخلية أكبر من 10 7، زيادة كافة وحدات التخزين وكاشف إجمالي حجموفقا لذلك (على سبيل المثال ل2 × 10 7 مجموع الخلايا، استخدم مرتين حجم كل الكواشف المشار إليها). إبقاء كل الكواشف والخلايا في الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد عدد الخلايا مع عدادة الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق خلية الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. نضح طاف تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 90 μl/10 7 خلايا العازلة تنقية لبيليه الخلية تليها 10 ميكرولتر من بلي CD31. ومترافق وبلي المقدمة من قبل الشركة المصنعة لوحيدة النسيلة المضادة للماوس CD31 الأجسام المضادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخلط جيدا واحتضان لمدة 15 دقيقة في الثلاجة. ملاحظة: ارتفاع درجات الحرارة و / أو أطول فترة حضانة خلال وضع العلامات المغناطيسي قد يؤدي إلى الربط غير محددة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا بإضافة 1-2 ml/10 7 خلايا العازلة تنقية وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة. إزالة الخلايا وطاف resuspend في 500 ميكرولتر من العازلة تنقية. انتقل إلى الفصل المغناطيسي أو خطوة التنقية. </li></ol> 5. بوrification <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العمود MS في المجال المغناطيسي للفاصل MACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف العمود مع 500 ميكرولتر من العازلة تنقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنطبق على تعليق خلية العمود. تحميل عدد مناسب من الخلايا إلى العمود MS عن ارتفاع عدد الخلايا قد تسد العمود. تحذير: كل عمود MS يمكن أن تستوعب أكبر عدد ممكن من 2 × 10 7 خلايا، وذلك لعدد الخلايا أعلى، واستخدام أكثر من الأعمدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع وتجاهل التدفق من خلال الخلايا التي تحتوي على أونلبلد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل العمود مع 500 ميكرولتر من العازلة تنقية ثلاث مرات. خلال خطوات الغسيل، تأكد من أن خزان العمود فارغة قبل إضافة اللاحقة مأخوذة العازلة تنقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة عمود من فاصل MACS ووضعه على أنبوب فالكون 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم تزويد المكبس مع عمود MS. ماصة 1 مل من العازلة تنقية على عمود MS وعلى الفور طرد الخلايا المسمى مغناطيسيا عن طريق دفع المكبس بقوة في العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة سلليرة سورية على طبق ثقافة 35 مم precoated مع الكولاجين من النوع 1 وتنمو الخلايا في ECCM في حاضنة تعيين إلى 37 درجة مئوية مع 95٪ O 2 و 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير المتوسطة كل أربعة أيام. استخدام PVECs للتجارب أو ثقافة فرعية بعد 10-12 يوما عندما طبق هو متموجة. </li></ol> 6. ثقافة فرعية من PV ECS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة ECCM وشطف أحادي الطبقة من PVECS مع 1-2 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف إضافة 1.5 مل من 0.25٪ التربسين EDTA-حل لتغطية أحادي الطبقة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العودة الطبق إلى الحاضنة. في غضون 5-7 دقائق، وفصل الخلايا من سطح الطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن فصل الخلايا، إضافة على الفور حجم مساو من مثبط التربسين ويسحن عدة مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا إلى أنبوب العقيمة 15 مل فالكون. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب في 500 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف و resuspend بيليه في 1 مل من prewarmed ECCM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بذر خلايا لتوسيع الثقافة، والتراسل الفوريالشيخوخة أو فحوصات أخرى. </li></ol>

<ol>
	<li>Shen, Q., S, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+stimulate+self-renewal+and+expand+neurogenesis+of+neural+stem+cells.">Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells.</a> Science. 304, 1338-1340 (2004).</li><li>Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+three-dimensional+system+to+study+interactions+between+endothelial+cells+and+neural+cells+of+the+developing+central+nervous+system.">A novel three-dimensional system to study interactions between endothelial cells and neural cells of the developing central nervous system.</a> BMC Neurosci. 8, 3 (2007).</li><li>Rauch, M. F., Michaud, M., Xu, H., Madri, J. A., Lavik, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-culture+of+primary+neural+progenitor+and+endothelial+cells+in+a+macroporous+gel+promotes+stable+vascular+networks+in+vivo.">Co-culture of primary neural progenitor and endothelial cells in a macroporous gel promotes stable vascular networks in vivo.</a> 19, 1469-1485 (2008).</li><li>Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartment-specific+transcription+factors+orchestrate+angiogenesis+gradients+in+the+embryonic+brain.">Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain.</a> Nat. Neurosci. 11, 429-439 (2008).</li><li>Vasudevan, A., Bhide, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+the+embryonic+CNS:+a+new+twist+on+an+old+tale.">Angiogenesis in the embryonic CNS: a new twist on an old tale.</a> Cell Adh. Migr. 2, 167-169 (2008).</li><li>Won, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+vascular+networks+synchronize+GABA+neuron+migration+in+the+embryonic+forebrain.">Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain.</a> Nat. Commun. 4, 2149-2162 (2013).</li><li>Dong, Q. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+strategy+for+isolation+of+endothelial+cells+from+murine+tissues.+Characterization+of+two+endothelial+cell+lines+from+the+murine+lung+and+subcutaneous+sponge+implants.">A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17, 1599-1604 (1997).</li><li>Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+colony+stimulation+factor-1+receptor+results+in+loss+of+microglia,+disrupted+brain+development+and+olfactory+deficits.">Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Young+neurons+from+medial+ganglionic+eminence+disperse+in+adult+and+embryonic+brain.">Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain.</a> 2, 461-466 (1999).</li><li>Snapyan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculature+guides+migrating+neuronal+precursors+in+the+adult+mammalian+forebrain+via+brain-derived+neurotrophic+factor+signaling.">Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).</li><li>Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessels+form+a+migratory+scaffold+in+the+rostral+migratory+stream.">Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream.</a> J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).</li></ol>

أعلن عن أي تضارب في المصالح.

في PVEC هي أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية من الخلايا البطانية الكبار الدماغ وECS من مصادر الأنسجة الأخرى للدراسات تركز على التفاعلات الوعائية العصبية وأيضا لديها الإمكانات العلاجية. لإعداد PVEC، فمن بداية حاسمة مع تشريح للعمل بسرعة لتحقيق الجدوى جيدة منذ الخلايا الم?...

الأوعية الدموية، والخلايا العصبية الهجرة العصبية هي الأحداث الحاسمة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) التنمية والإصلاح والتجديد. وقد أظهرت العديد من الدراسات أن الخلايا البطانية أنيقة تحفيز انتشار العصبية والعكس بالعكس من خلال الافراج عن العوامل القابلة للذوبان وعن طريق الاتصال المباشر. وجدنا أنه من الغريب أنه في الغالبية العظمى من هذه الدراسات 1-3، في حين يتم عزل الأسلاف العصبية / الخلايا الجذعية العصبية من المخ الجنينية، وأنها cocultured مع الخلايا البطانية من الدماغ الكبار، الكبار مصادر الأنسجة الأخرى، أو مع خطوط الخلايا البطانية. وهذا قد يكون في جزء منه بسبب الصعوبات التقنية المرتبطة عزل وزراعة السكان نقية من الخلايا البطانية من المخ الجنينية. ومع ذلك، الأوعية الدموية، تكوين الخلايا العصبية، وهجرة الخلايا العصبية هي الأحداث المتزامنة التي تحدث في أوامر من حجم أكثر قوة في الدماغ الجنينية مما كانت عليه في الدماغ الكبار العادي. شبكة الأوعية الدموية المحيطة بالبطين من embryoniج الدماغ الأمامي (الدماغ الانتهائي) تنبع من سفينة تقع ضمن العقد القاعدية منشم ويتطور في شكل التدرج المنظم من بطني لالظهرية لل telencephalon بعد يوم الجنينية 11 (E11) 4،5. هذه الضفيرة من السفن من شبكة الأوعية الدموية المحيطة بالبطين تختلف عن السفن حنوني على أساس أصول والموقع التشريحي، وأنماط النمو، وتنظيم التنموية 4،5. اتجاه الانتشار من الأوعية الدموية المحيطة بالبطين مباريات متدرجة الانحدار العصبية الوراثية عرضية الدماغ الانتهائي. ضمن الدماغ الانتهائي، التدرج الأوعية الدموية المحيطة بالبطين والتدرج من الخلايا العصبية GABA المهاجرة تتداخل بشكل طفيف مكانيا كذلك 6. فيما يتعلق بالتوقيت، التدرج الأوعية الدموية في وقت مبكر من العصبية الوراثية الانحدار والخلايا العصبية GABA التدرج بنحو يوميا. وبالتالي، الخلايا البطانية حول البطينات الدماغية هي مكانيا وزمانيا في وضع جيد لتقديم العظة الحرجة لدعم تكوين الخلايا العصبية والدماغ الانتهائي4،6 هجرة الخلايا العصبية. ولذا، فإن استخدام الخلايا البطانية حول البطينات الدماغية الجنينية في التجارب coculture مع الأسلاف العصبية و / أو الخلايا العصبية تقدم نموذجا أكثر ملاءمة لدراسة التفاعلات الوعائية العصبية وتطوير سبل جديدة لعلاج المرض العصبي أو نقص تروية / إصابات في الدماغ. فإننا نؤكد على أهمية إزالة الغشاء حنوني، وليس فقط للحد من تلوث الخلايا الظهارية ولكن أيضا لفصل الخلايا البطانية حنوني التي هي جزيئيا ومتميزة وظيفيا من الخلايا البطانية في الأوعية الدموية المحيطة بالبطين شبكة 4،6 (PVECs يطلق تمييزها عن حنوني ECS) . هنا، نحن تصف طريقة التي نستخدمها بشكل روتيني في مختبرنا للحصول على العائد غنية ونقية من PVECs. وتعد هذه الخلايا البطانية من forebrains الجنينية معزولة عن ماوس توقيت الحوامل واحد. أنها يمكن توسيعها، subcultured، وتجميد أسفل بنجاح لاستخدامها في المستقبل.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="768">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">DNase I</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">D-4527</td>
			<td style="width:167px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagen, Type 1 solution from rat tail </td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS</td>
			<td>Quality Biologicals</td>
			<td style="width:147px;">114057-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M4055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td>A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MS column</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD31 microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-097-418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACS multi stand</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell strainer 70 &#181;m</td>
			<td style="width:183px;">BD Bioscience</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibiotic and antimycotic solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase/Dispase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10269638001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">DMEM </td>
			<td style="width:183px;">Lonza</td>
			<td>12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35 mm culture dish</td>
			<td style="width:183px;">BD Bioscience</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15 ml falcon tube </td>
			<td style="width:183px;">BD Bioscience</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml falcon tube</td>
			<td style="width:183px;">BD Bioscience</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">ECCM kit</td>
			<td style="width:183px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:147px;">355054</td>
			<td>Kit Includes Endothelial cell growth supplement, EGF and Soybean Trypsin Inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS)</td>
			<td style="width:183px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:147px;">354006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RBECGM</td>
			<td style="width:183px;">Cell applications </td>
			<td style="width:147px;">R819-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM F12 </td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glutamax</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">305050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">tissue culture grade water</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">15230162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">0.25% Trypsin</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">15050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Soyabean trypsin inhibitor</td>
			<td style="width:183px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:147px;">5425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Matrigel</td>
			<td style="width:183px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:147px;">354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qtracker 655 Cell Labeling Kit</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">Q25021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">C10608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Biotinylated Isolectin B4 antibody</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">L2140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Anti-Von Willebrand factor</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F3520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Anti-CD31/PECAM-1</td>
			<td style="width:183px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:147px;">550274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Vectashield Hardset Mounting media with DAPI</td>
			<td style="width:183px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:147px;">H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:271px;">Ketamine</td>
			<td style="width:183px;">Butler Schein Animal Health Supply</td>
			<td style="width:147px;">44028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Xylazine</td>
			<td style="width:183px;">Lloyd Laboratories</td>
			<td style="width:147px;">1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:183px;">Motic</td>
			<td style="width:147px;">SMZ-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">hemocytometer</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">267110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">inverted microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus CK-40</td>
			<td style="width:147px;">CK-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Flouroscent microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus FSX-100</td>
			<td style="width:147px;">FSX-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Fine forceps</td>
			<td style="width:183px;">Roboz surgical instrument</td>
			<td>7 inox</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:271px;">Fine microtip scissors</td>
			<td style="width:183px;">Roboz surgical instrument</td>
			<td>RS5611</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of endothelial cells from the embryonic forebrain

الخلايا البطانية المخ الجنينية يمكن أن تكون بمثابة أداة هامة في دراسة الأوعية الدموية والتنمية وعائية عصبية والتفاعلات. شبكات الأوعية الدموية وهما من الدماغ الأمامي الجنينية، حنوني وحول البطينات الدماغية، ومميزة مكانيا ولها أصول مختلفة وأنماط النمو. الخلايا البطانية من شبكات الأوعية الدموية حنوني وحول البطينات الدماغية وفريدة من نوعها ملامح التعبير الجيني ووظائفها. هنا نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لعزل والثقافة، والتحقق من السكان نقية من الخلايا البطانية من شبكة الأوعية الدموية المحيطة بالبطين (PVECs) من الدماغ الأمامي الجنينية (الدماغ الانتهائي). في هذا النهج، ومفروم الدماغ الانتهائي خالية من الغشاء حنوني تم الحصول عليها من يوم الجنينية 15 الفئران، يتفاعل مع كولاجيناز / dispase، وفرقت ميكانيكيا في تعليق خلية واحدة. يتم تنقيته PVECs من الايقاف الخلية باستخدام اختيار إيجابية مع الأجسام المضادة anti-CD-31/PECAM-1 مترافق لبلي باستخدام مغناطيسي قويطريقة الانفصال. الخلايا تنقيته يتم تربيتها على الكولاجين 1 الأطباق الثقافة المغلفة في البطانية مستنبت الخلايا حتى تصبح متكدسة ومزيد من subcultured. الحصول PVECs مع هذا البروتوكول المعرض الحصوه والمغزل على شكل الظواهر، كما تصور من قبل على النقيض من المرحلة المجهر الضوئي ومضان المجهري. تأسست نقاء الثقافات PVEC مع علامات الخلايا البطانية. في أيدينا، وهذه الطريقة بشكل موثوق وثابت تعطي السكان نقية من PVECs. وهذا البروتوكول الاستفادة من الدراسات التي تهدف إلى اكتساب رؤى الآلي في الدماغ الأمامي الأوعية الدموية، وفهم التفاعلات PVEC، ومحادثات عبر أنواع الخلايا العصبية مع ويحمل إمكانات هائلة لتكوين الأوعية الدموية العلاجية.

يظهر توصيف المظهري من PVECs من يوم 1-12 خلال المرحلة على النقيض المجهر الضوئي (الشكل 2). الخلايا تعلق على طبق في يوم 1 عرض التشكل سمة من انقسام الخلايا (الشكل 2A). بين 5-8 أيام، PVECs الانتقال من المرصوفة بالحجارة لالمغزل التشكل على شكل نموذجي للخلايا البطانية و...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain at JoVE.com

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

يوضح هذا الفيديو استراتيجية سهلة وموثوقة لإعداد الثقافات نقية من الخلايا البطانية من الدماغ الأمامي الجنينية داخل 10-12 يوما، وسوف يكون من المفيد للبحوث تركز على جوانب كثيرة من الأوعية الدموية الدماغية.

العزلة والثقافة من الخلايا البطانية من الجنينية الدماغ المقدم

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

isolation-culture-endothelial-cells-from-embryonic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.3K Views.  Harvard Medical School.  يوضح هذا الفيديو استراتيجية سهلة وموثوقة لإعداد الثقافات نقية من الخلايا البطانية من الدماغ الأمامي الجنينية داخل 10-12 يوما، وسوف يكون من المفيد للبحوث تركز على جوانب كثيرة من الأوعية الدموية الدماغية. 

Video: Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

تشريح والثقافة من الخلايا العصبية من النخاع الشوكي صواري الجنينية

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Isolation and Culture of Neural Crest Stem Cells from Human Hair Follicles

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a well-characterized niche for adult stem cells1. This segment of the outer root sheath contains a number of different types of stem cells, including epithelial stem cells2, melanocyte stem cells3 and neural crest like stem cells4-7. Hair follicles represent an accessible and rich source for different types of human stem cells. We and others have isolated neural crest stem cells (NCSCs) from human fetal and adult hair follicles4,5. These human stem cells are label-retaining cells and are capable of self-renewal through asymmetric cell division in vitro. They express immature neural crest cell markers but not differentiation markers. Our expression profiling study showed that they share a similar gene expression pattern with murine skin immature neural crest cells. They exhibit clonal multipotency that can give rise to myogenic, melanocytic, and neuronal cell lineages after in vitro clonal single cell culture. Differentiated cells not only acquire lineage-specific markers but also demonstrate appropriate functions in ex vivo conditions. In addition, these NCSCs show differentiation potential toward mesenchymal lineages. Differentiated neuronal cells can persist in mouse brain and retain neuronal differentiation markers. It has been shown that hair follicle derived NCSCs can help nerve regrowth, and they improve motor function in mice transplanted with these stem cells following transecting spinal cord injury8. Furthermore, peripheral nerves have been repaired with stem cell grafts9, and implantation of skin-derived precursor cells adjacent to crushed sciatic nerves has resulted in remyelination10. Therefore, the hair follicle/skin derived NCSCs have already shown promising results for regenerative therapy in preclinical models.
Somatic cell reprogramming to induced pluripotent stem (iPS) cells has shown enormous potential for regenerative medicine. However, there are still many issues with iPS cells, particularly the long term effect of oncogene/virus integration and potential tumorigenicity of pluripotent stem cells have not been adequately addressed. There are still many hurdles to be overcome before iPS cells can be used for regenerative medicine. Whereas the adult stem cells are known to be safe and they have been used clinically for many years, such as bone marrow transplant. Many patients have already benefited from the treatment. Autologous adult stem cells are still preferred cells for transplantation. Therefore, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin/hair follicles are a valuable source for regenerative medicine.

This article presents a robust protocol for isolation and culture of neural crest stem cells from human hair follicles.

العزلة وثقافة العصبية الخلايا الجذعية من بصيلات الشعر كريست الإنسان

Hair follicles undergo lifelong growth and hair cycle is a well-controlled process involving stem cell proliferation and quiescence. Hair bulge is a ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. Neuroepithelial cells of the neural tube that express Nkx6.1 are the unique precursor cells for spinal motoneurons1. Though postmitotic motoneurons move towards their final position and organize themselves into columns along the spinal tract2,3. More than 90% of all these differentiated and positioned motoneurons express the transcription factors Islet 1/2. They innervate the muscles of the limbs as well as those of the body and the inner organs. Among others, motoneurons typically express the high affinity receptors for brain derived neurotrophic factor (BDNF) and Neurotrophin-3 (NT-3), the tropomyosin-related kinase B and C (TrkB, TrkC). They do not express the tropomyosin-related kinase A (TrkA)4. Beside the two high affinity receptors, motoneurons do express the low affinity neurotrophin receptor p75NTR. The p75NTR can bind all neurotrophins with similar but lower affinity to all neurotrophins than the high affinity receptors would bind the mature neurotrophins. Within the embryonic spinal cord, the p75NTR is exclusively expressed by the spinal motoneurons5. This has been used to develop motoneuron isolation techniques to purify the cells from the vast majority of surrounding cells6. Isolating motoneurons with the help of specific antibodies (panning) against the extracellular domains of p75NTR has turned out to be an expensive method as the amount of antibody used for a single experiment is high due to the size of the plate used for panning. A much more economical alternative is the use of lectin. Lectin has been shown to specifically bind to p75NTR as well7. The following method describes an alternative technique using wheat germ agglutinin for a preplating procedure instead of the p75NTR antibody. The lectin is an extremely inexpensive alternative to the p75NTR antibody and the purification grades using lectin are comparable to that of the p75NTR antibody. Motoneurons from the embryonic spinal cord can be isolated by this method, survive and grow out neurites.

An alternative way of isolating mouse embryonic motoneurons from the spinal cord is described. The method takes into account the fact that lectin can bind to the low affinity nerve growth factor receptor p75NTR. This lectin-based preplating allows a purification similar to that with a specific antibody against the p75NTR.

Lectin القائم على عزل وثقافة حركية مماثلة الجنينية الماوس

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

العزلة والثقافة من الخلايا العصبية قرن آمون من الفئران قبل الولادة

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied successfully to the isolation of mouse and human primary neurons and neural progenitors. Dissociated neurons are maintained in serum-free medium up to several weeks. These cultures can be used for nucleofection, immunocytochemistry, nucleic acids preparation, as well as electrophysiology. Older neuronal cultures can also be transfected with a good efficiency rate by lentiviral transduction and, less efficiently, with calcium phosphate or lipid-based methods such as lipofectamine.

We describe a rapid methodology to isolate and culture hippocampal and cortical neurons from rodent embryos. This protocol allows us to perform experiments in which nearly pure neuronal cultures are required.

العزلة والثقافة من خلايا الفئران العصبية الجنينية: بروتوكول سريعة

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

العزلة والثقافة من الخلايا العصبية كريست من الأنبوبة العصبية الجنينية الفئران

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

عزل خلايا الدماغ الأولية الفئران الاوعية الدموية الدقيقة غشائي

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

العزلة والثقافة وطويل الأجل صيانة الابتدائية الدماغ المتوسط ​​الدوبامين العصبية من المخ الجنينية القوارض

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

العزلة والثقافة من الخلايا الجذعية البالغة العصبية من المنطقة تحت الثفني ماوس

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.