وأيد هذا البحث من قبل جمعية الألمانية للبحوث DFG تحت رقم FO منحة 315/4-1 وDFG SFB 688.

1. عزل Microvessels الدماغ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل إعداد 09:55 استخدام الفئران حديثي الولادة من كلا الجنسين (3-5 يوما). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء ماوس وفقا لتوصيات IACUC / طبيب بيطري محلي، وإزالة الدماغ على الفور، ونقل إلى طبق بتري تحتوي على الحل التالي: ملي Hepes 15 (درجة الحموضة 7.4)، 153 ملي مول كلوريد الصوديوم، 5.6 ملي بوكل، 2.3 ملي CaCl 2 × 2H 2 O، 2.6 ملم MgCl 2 × 6H 2 O، 1٪ (وزن / حجم) BSA (يشار إليها فيما يلي العازلة الجديدة بوصفها). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ما لم يذكر خلاف ذلك، ينبغي أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات العزلة في درجة حرارة الغرفة (RT) (22-24 ° C) تحت غطاء محرك السيارة الصفحي تدفق. قطع العقول (المخ المخيخ ودون جذع الدماغ)، بعد إزالة السحايا والأجزاء الشعرية، في المخزن المؤقت A باستخدام مشرط معقم. ماصة الأنسجة شظايا صعودا وهبوطا باستخدام ماصة 10 مل حتى لا تظهر كتل. نقل التعليق في أنبوب 50 مل الصقر وأجهزة الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 5 دقائق في RT. </li></ol> ملاحظة: يمكن تحديد السحايا والأغشية، رقيقة شفافة على سطح أنسجة المخ. يمكن إزالتها بعناية مع ملقط معقم. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل بيليه في المخزن المؤقت مل 4.5 (أ) مع 1.5 مل من 0.75٪ (W / V) كولاجيناز / dispase (روش) واحتضان لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي (الهز أحيانا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفي الوقت نفسه، وإعداد لوحات 12-طلاء جيدا من قبل أربعة آبار مع الكولاجين IV (0.1 ملغ / مل يتم إذابتها في حامض الخليك 50 ملم). السماح للانضمام لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف عملية الهضم من خلال إضافة 15 مل من الجليد الباردة العازلة إعادة تعليق بيليه A. بدقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 250 تعليق XG لمدة 10 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإزالة المايلين، إضافة 10 مل 25٪ (W / V) BSA (سيغما، الطهارة&gt; 98٪) وأجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 20 دقيقة في C. ° 4 يجب ان يحل 25٪ BSA في برنامج تلفزيوني 1X (PAA المختبرات) وتمت تصفيتها من خلال ميكرون و 0،2إلتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية تجاهل طاف، حل بيليه في المخزن المؤقت مل 10 A ونقل إلى أنبوب فالكون الجديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 250 تعليق XG لمدة 5 دقائق في RT. بيليه الناتج على الخلايا البطانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل ضعف الكولاجين IV-12-المغلفة جيدا مع لوحة PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بيليه في 4 مل من المتوسط ​​النمو (DMEM تحتوي على 10٪ FCS والبنسلين 50U/ml / الستربتوميسين، 1٪ الجلوتامين L-) وتعليق لوحة الخلية في بئرين، 2 مل إلى كل بئر. إضافة إلى بوروميسين تركيز النهائي من 4 ميكروغرام / مل واحتضان لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية في خلية حاضنة الثقافة. تسمح هذه الخطوة إزالة الخلايا بسرعة الانضمام ملاحظة: يتم إضافة بوروميسين لمدة 24 ساعة. يمكن فقط ECS الدماغ استقلاب ذلك، لأنواع الخلايا الأخرى بوروميسين سامة 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل متوسطة 2 مل تحتوي على خلايا غير الالتزام من الخطوة 1،14 في بئرين الطازجة (هذه الآبار تحتوي على جزء EC). تملأ الآبار مع الخلايا الالتزام من الظريفف مع 1،14 المتوسطة 2 مل الطازجة (هذه الآبار تحتوي على أنواع أخرى من الخلايا، الخلايا الليفية على سبيل المثال، الخلايا النجمية ويمكن زراعتها في نفس الوقت وتستخدم لمقارنات بين التشكل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير المتوسطة في اليوم التالي. </li></ol> 2. تخليد الدماغ الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زراعة GP + E-86 الجدد (GPENeo) 15 الليفية، إفراز فيروس النسخ المتماثل التي تعاني من نقص الجين الورمي مع تورام T الأوسط في المتوسط ​​تحتوي على 10٪ DMEM للحرارة المعطل FCS، 50U/ml البنسلين / الستربتوميسين، و 2 ملغ / مل G418 ( . PAA المختبرات) في قوارير المغلفة الجيلاتين ملاحظة: تورام الجين الورمي يسبب T الأوسط ترنسفكأيشن ميزة نمو ECS أكثر من ECS غير أحادي الطبقة مما يؤدي إلى متجانسة من الخلايا البطانية مع مورفولوجيا 4 إلى 6 أسابيع من الثقافة. GPENeo غير متوفرة تجاريا ويمكن الحصول على كمادة عامة مشتركة (يرجى الرجوع إلى منشورات الأصلي 4،16). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاستخدام وسيلة الفيروسات المحتوية على<html> تخليد، زراعة الخلايا GPENeo في G418 خالية المتوسطة لمدة 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 10 مل من طاف وإضافة GPEneo Polybrene (hexadimethrine بروميد) (سيغما) إلى تركيز النهائي من 8 ميكروغرام / لتر، 0،45 ميكرون من خلال تعقيم فلتر لإزالة شظايا الخلوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة النمو من الثقافات EC أعد الجزء 1 وإضافة 2 مل من خليط طاف / Polybrene GPEneo في الآبار. تكراره في اليوم التالي باستخدام الطازجة GPEneo طاف / Polybrene خليط ملاحظة: يستخدم لجعل المسام Polybrene في جدار الخلية لتسهيل العدوى مع الجسيمات الفيروسية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف / Polybrene GPEneo خليط في اليوم التالي، وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني والحفاظ على الخلايا في النمو المتوسطة تغييرها كل 3 أيام. على التقاء، وتقسيم الخلايا على لوحات 01:02 IV-المغلفة الكولاجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عادة، ينبغي الحصول الدماغي البطانية مستقرة خطوط الخلايا (cEND) 4-5 أسابيع في وقت لاحق. </li></ol>ه &quot;&gt; 3. زراعة خلايا الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ غشائي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد في الخلايا من cryoaliquot في حمام مائي ونقل في 15 ML-فالكون المتوسطة مع 10 مل قبل تحسنت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 250 تعليق XG لمدة 5 دقائق في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة، نقل بيليه في الرابع الكولاجين مطلية T 25 سم 2 قارورة الثقافة الخلية مع متوسط ​​النمو قبل تحسنت (كثافة الخلية لطلاء يجب ان تكون على الاقل 1X 10 4 خلايا / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير المتوسطة في اليوم التالي وصلت بعد التقاء خلايا (عادة بعد 5 أيام) تقسيم الخلايا. </li></ol> 4. تقسيم خلايا cEND (ملاحظة: يجب أن يتم تقسيم مرة واحدة في الأسبوع، تجنب تقسيم العالي من 1:4). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أضف 3 مل من محلول التربسين EDTA-الدافئة (PAA المختبرات) (T 75 سم 2 قارورة)، احتضان عند 37 درجة مئوية والانتظار حتى يتم تفريق الخلايا طبقة (عادة في غضون 5 إلى 15 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل سو المتوسطة النمو، ماصة صعودا وهبوطا، ونقل إلى الكولاجين الجديد IV-المغلفة القارورة. </li></ol> 5. تجميد خلايا cEND <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على تعليق خلية كما هو موضح في الخطوة 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 250 تعليق XG لمدة 5 دقائق في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بيليه الخلية (التي تم الحصول عليها من 1 T 75 قارورة 2 سم) في 6 مل المتوسطة تجميد (95 متوسطة النمو٪، 5٪ DMSO). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم الخلية إلى أربعة التعليق ملاحظة 1.5 مل البرد مأخوذة: يمكن المصنف واحد البرد قسامة في 25 قارورة T 2 سم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين بالتبريد تحت مأخوذة-النتروجين السائل بخار في درجة الحرارة. </li></ol> cEND المتوسطة النمو: 450 مل DMEM، FCS 10٪، 10 مل الجلوتامين L-، 2٪ MEM-كيت، 2٪ NEAA، صوديوم 10 مل البيروفات، 50 U / مل البنسلين / الستربتوميسين 6. ممثل النتائج وتميزت الخلايا cEND وcerebEND من immunostainings من البطانية علىالثانية BBB وضع العلامات وكذلك قياسات المقاومة الكهربائية transendothelial (طير) والنفاذية. وكان cEND cerebEND على التشكل مماثلة على الثقافات الرئيسي لECS الدماغ، مع monolayers من الخلايا معبأة بإحكام ممدود أن عرضت في تثبيط نمو التقاء. وأعرب الخلايا المستويات التي يمكن اكتشافها جيدا claudin-5 occludin، والبروتينات VE-كادهيرين التي مترجمة في تقاطعات خلية خلية، كما هو موضح من قبل المناعي (الشكل 3) 4،5. الخلايا cEND زراعة في المصل انخفاض المتوسط ​​أدى إلى زيادة في طير (من 150 Ωcm 2 في وجود 10٪ المصل إلى 2 Ωcm 500 في وجود 2٪ مصل)، الذي potentiated بإضافة الهيدروكورتيزون (800 Ωcm 2) أو الأنسولين (1،000 Ωcm 2) 4 كان من Monolayers cEND المستزرعة في المصل انخفاض المتوسطة لمدة 21 يوما طير من 900 Ωcm 2 (الشكل 4). وقد تم قياس طير باستخدام الجمعيةتحتوي على أقطاب كهربائية الجاري فاة والجهد قياس-(أدوات دقيقة العالمي). على سبيل المقارنة، تم الإبلاغ عن الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ الأولية ECS لديها قيم طير من 200-600 Ωcm 2 و خلية الفأر المتاحة تجاريا خط bEnd.3 كان طير قيم 100-140 Ωcm 2 (انظر للمراجعة الأخيرة أبوت 2005 وآخرون توث آل.، 2011 17،18). وبالإضافة إلى ذلك، انخفض مرور الجزيئات، مثل المنظمات غير المشحونة FITC-dextrans من الجماهير الجزيئية 4 و 10 و 70 و كيلو دالتون 500، أو فلوريسئين (300 دا) عبر أحادي الطبقة من cEND في المتوسط ​​2٪ FCS التمايز أكثر من 4 ساعة مقارنة مع الخلايا السيطرة الحفاظ على النمو في وسط يحتوي على 10٪ FCS: تم تخفيض تدفق paracellular إلى 30٪ من الخلايا الرقابة على فلوريسئين، إلى 26٪ للFITC-dextrans 10 و كيلو دالتون 70، وانخفض تدفق إلى 4.5٪ من الخلايا الرقابة على FITC 500 كيلو دالتون، dextrtan. كان نفاذية مماثلة لطير القيم، على أدنى مستوى في الخلايا المستزرعة في وجود الحلاوةocorticoids (GC) 4. في دراسات أخرى، حددنا الجينات المستهدفة جلايكورتيكود، occludin، claudin 5-VE-كادهيرين والبطانة في الدماغ الوعائية 4،7،9. أدى GC العلاج إلى زيادة في التعبير عن هذه البروتينات وإلى إعادة ترتيب كادهيرين-VE إلى الهيكل الخلوي. المباشرة بوساطة GC تنظيم محكم تقاطع البروتينات occludin وclaudin 5-يظهر من خلال عناصر استجابة GC في مناطق المروج لها 4،7،19. بالإضافة إلى ذلك، claudin-5 تم تحديد كهدف رواية الاستروجين في 10 البطانة الوعائية. وراء ضعف البطانية أمراض مختلفة كثيرة. نحن مثقف وcEND تحت الأوكسجين / الجلوكوز الحرمان (OGD) الظروف. أدى OGD إلى تعطيل وظيفة BBB، والتي يمكن اعادة بعد العلاج المشترك مع GC وproteasome بورتيزوميب المانع 12. أدت الظروف OGD إلى زيادة كبيرة في امتصاص الجلوكوز في التعبير ونقل القوارب من الجلوكوزالنسب في cerebEND، التي يمكن أن تكون مخففة من خلال إضافة MK801، مثبط غير التنافسية للمستقبلات NMDA 13. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig1.jpg" /> الشكل 1. واتخذت مورفولوجية خلايا المخ البطانية الاوعية الدموية الدقيقة (cEND) بعد أسبوع واحد العزلة. صور المجهر الضوئي تحت التكبير (B) 6X (A) و15X. المستعمرات الجزيرة تتكون من الخلايا البطانية مرئية. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig2.jpg" /> الشكل 2. واتخذت مورفولوجية خلايا المخ البطانية الاوعية الدموية الدقيقة (cEND) بعد شهر واحد العزلة وتخليد. صور المجهر الضوئي تحت التكبير 15X. ويمكن ملاحظة A، متجانسة متموجة أحادي الطبقة الخلايا البطانية. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig3.jpg" /> الشكل 3. خلد الدماغ microvasculكانت تزرع الخلايا البطانية ع صريحة claudin-5، وoccludin VE-كادهيرين. الخلايا CEND على coverslips المغلفة IV-الكولاجين وملطخة أجسام مضادة ضد claudin-5 (A)، occludin (B) وVE-كادهيرين (C). تم نقل الصور باستخدام المجهر زايس Axioscop2 تحت التكبير 40X. <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/4022/4022fig4.jpg" /> الشكل 4. كانت تزرع قياس المقاومة الكهربائية transendothelial (طير) من cEND CEND. أحادي الطبقة على مرشحات الكولاجين IV-transwell المغلفة (المسام حجم 0.4 ميكرومتر). بعد التوصل التقاء، واستمرت الخلايا في المتوسط ​​تحتوي على FCS 2٪. وقد تم قياس طير بعد أيام 7 و 14 و 21 باستخدام أقطاب كهربائية تحتوي على الجمعية الحالية، ومرور الجهد القياس.

<ol>
	<li>Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier.">In vitro models of the blood-brain barrier.</a> Acta Neurobiol. Exp (Wars). 71, 113 (2011).</li><li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+hydrocortisone+and+TNFalpha+on+tight+junction+proteins+in+an+in+vitro+model+of+the+human+blood-brain+barrier.">Differential effects of hydrocortisone and TNFalpha on tight junction proteins in an in vitro model of the human blood-brain barrier.</a> J. Physiol. 586, 1937 (2008).</li><li>Weksler, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line.">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> FASEB. J. 19, 1872 (2005).</li><li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occludin+as+direct+target+for+glucocorticoid-induced+improvement+of+blood-brain+barrier+properties+in+a+murine+in+vitro+system.">Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system.</a> J. Physiol. 565 (Pt 2), 475 (2005).</li><li>Silwedel, C., Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+susceptibility+of+cerebral+and+cerebellar+murine+brain+microvascular+endothelial+cells+to+loss+of+barrier+properties+in+response+to+inflammatory+stimuli.">Differential susceptibility of cerebral and cerebellar murine brain microvascular endothelial cells to loss of barrier properties in response to inflammatory stimuli.</a> J. Neuroimmunol. 179, 37 (2006).</li><li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+effects+on+mouse+microvascular+endothelial+barrier+permeability+are+brain+specific.">Glucocorticoid effects on mouse microvascular endothelial barrier permeability are brain specific.</a> J. Physiol. 573 (Pt 2), 413 (2006).</li><li>Burek, M., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+the+murine+claudin-5+promoter.">Cloning and characterization of the murine claudin-5 promoter.</a> Mol. Cell Endocrinol. 298, 19 (2009).</li><li>Forster, C., Kahles, T., Kietz, S., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+induces+the+expression+of+metalloproteinase+inhibitor+TIMP-1+in+the+murine+cerebral+vascular+endothelial+cell+line+cEND.">Dexamethasone induces the expression of metalloproteinase inhibitor TIMP-1 in the murine cerebral vascular endothelial cell line cEND.</a> J. Physiol. 580 (Pt.3), 937 (2007).</li><li>Blecharz, K. G., Drenckhahn, D., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+increase+VE-cadherin+expression+and+cause+cytoskeletal+rearrangements+in+murine+brain+endothelial+cEND+cells.">Glucocorticoids increase VE-cadherin expression and cause cytoskeletal rearrangements in murine brain endothelial cEND cells.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 28, 1139 (2008).</li><li>Burek, M., Arias-Loza, P. A., Roewer, N., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-5+as+a+novel+estrogen+target+in+vascular+endothelium.">Claudin-5 as a novel estrogen target in vascular endothelium.</a> Arterioscler. Thromb Vasc. Biol. 30, 298 (2010).</li><li>Blecharz, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+effects+on+endothelial+barrier+function+in+the+murine+brain+endothelial+cell+line+cEND+incubated+with+sera+from+patients+with+multiple+sclerosis.">Glucocorticoid effects on endothelial barrier function in the murine brain endothelial cell line cEND incubated with sera from patients with multiple sclerosis.</a> Mult. Scler. 16, 293 (2010).</li><li>Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+insensitivity+at+the+hypoxic+blood-brain+barrier+can+be+reversed+by+inhibition+of+the+proteasome.">Glucocorticoid insensitivity at the hypoxic blood-brain barrier can be reversed by inhibition of the proteasome.</a> Stroke. 42, 1081 (2011).</li><li>Neuhaus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+NMDA-receptor+antagonist+MK801+during+oxygen/glucose+deprivation+moderately+attenuates+the+upregulation+of+glucose+uptake+after+subsequent+reoxygenation+in+brain+endothelial+cells.">Addition of NMDA-receptor antagonist MK801 during oxygen/glucose deprivation moderately attenuates the upregulation of glucose uptake after subsequent reoxygenation in brain endothelial cells.</a> Neurosci. Lett. 506, 44 (2012).</li><li>Perriere, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Puromycin-based+purification+of+rat+brain+capillary+endothelial+cell+cultures.+Effect+on+the+expression+of+blood-brain+barrier-specific+properties.">Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties.</a> J. Neurochem. 93, 279 (2005).</li><li>Golenhofen, N., Ness, W., Wawrousek, E. F., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+induction+of+the+stress+protein+alpha-B-crystallin+in+vascular+endothelial+cells.">Expression and induction of the stress protein alpha-B-crystallin in vascular endothelial cells.</a> Histochem Cell Biol. 117, 203 (2002).</li><li>Risau, W., Engelhardt, B., Wekerle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+function+of+the+blood-brain+barrier:+incomplete+presentation+of+protein+(auto-)antigens+by+rat+brain+microvascular+endothelium+in+vitro.">Immune function of the blood-brain barrier: incomplete presentation of protein (auto-)antigens by rat brain microvascular endothelium in vitro.</a> J. Cell Biol. 110, 1757 (1990).</li><li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+CNS+barriers:+evolution,+differentiation,+and+modulation.">Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation.</a> Cell Mol. Neurobiol. 25, 5 (2005).</li><li>Toth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patented+in+vitro+blood-brain+barrier+models+in+CNS+drug+discovery.">Patented in vitro blood-brain barrier models in CNS drug discovery.</a> Recent Pat. CNS Drug Discov. 6, 107 (2011).</li><li>Harke, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoids+regulate+the+human+occludin+gene+through+a+single+imperfect+palindromic+glucocorticoid+response+element.">Glucocorticoids regulate the human occludin gene through a single imperfect palindromic glucocorticoid response element.</a> Mol. Cell Endocrinol. 295, 39 (2008).</li><li>Kiefer, F., Courtneidge, S. A., Wagner, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+properties+of+the+middle+T+antigens+of+polyomaviruses.">Oncogenic properties of the middle T antigens of polyomaviruses.</a> Adv. Cancer Res. 64, 125 (1994).</li><li>Kiefer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+transformation+by+polyomavirus+middle+T+antigen+in+mice+lacking+Src-related+kinases.">Endothelial cell transformation by polyomavirus middle T antigen in mice lacking Src-related kinases.</a> Curr. Biol. 4, 100 (1994).</li><li>Ong, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ShcA+and+Grb2+mediate+polyoma+middle+T+antigen-induced+endothelial+transformation+and+Gab1+tyrosine+phosphorylation.">ShcA and Grb2 mediate polyoma middle T antigen-induced endothelial transformation and Gab1 tyrosine phosphorylation.</a> EMBO J. 20, 6327 (2001).</li><li>O'Connell, K. A., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+lymphoid+endothelial+cell+line+immortalized+by+simian+virus+40+binds+lymphocytes+and+retains+functional+characteristics+of+normal+endothelial+cells.">A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells.</a> J. Immunol. 144, 521 (1990).</li><li>Roux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+gamma-glutamyl+transpeptidase+and+alkaline+phosphatase+activities+in+immortalized+rat+brain+microvessel+endothelial+cells.">Regulation of gamma-glutamyl transpeptidase and alkaline phosphatase activities in immortalized rat brain microvessel endothelial cells.</a> J. Cell Physiol. 159, 101 (1994).</li><li>Montesano, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+proteolytic+activity+is+responsible+for+the+aberrant+morphogenetic+behavior+of+endothelial+cells+expressing+the+middle+T+oncogene.">Increased proteolytic activity is responsible for the aberrant morphogenetic behavior of endothelial cells expressing the middle T oncogene.</a> Cell. 62, 435 (1990).</li><li>Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immortalized+bEnd5+and+primary+mouse+brain+microvascular+endothelial+cells+as+in+vitro+blood-brain+barrier+models+for+the+study+of+T+cell+extravasation.">Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315 (2010).</li><li>Skaper, S. D., Conn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Neurosciences. 2, 1303 (1990).</li><li>Ishii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombomodulin,+an+endothelial+anticoagulant+protein,+is+absent+from+the+human+brain.">Thrombomodulin, an endothelial anticoagulant protein, is absent from the human brain.</a> Blood. 67, 362 (1986).</li><li>Minagar, A., Alexander, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+disruption+in+multiple+sclerosis.">Blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis.</a> Mult. Scler. 9, 540 (2003).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

ويمكن استخدام الإجراء الموضح لعزل سلالات من الاوعية الدموية الدقيقة ECS الماوس المختلفة وكذلك من مختلف سلالات الفئران ضرب المغادرة لدراسة التغيرات في وظيفة محددة البطانة الوعائية. كوسيلة من وسائل تخليد استخدمنا التحول مع oncoprotein من الفيروسة التورامية الفئران، تورام المستضد T الأوسط. فإنها تحول بسرعة الخلايا البطانية غير ناضجة في الجسم الحي في المختبر و20،21،22. وسائل أخرى للتخليد ECS هو موضح في الأدب تشمل على سبيل المثال تخليد مع المستضد T SV40 كبيرة من الفيروس قردي 40 23 المفجي، منتج الجين اتش E1A 24 أو overexpression من الوحيدات الحفاز تيلوميراز الإنسان 3. تخليد مع PymT هو محددة لاظهار الدعم للالفئران غير ناضجة، والذي يسمح الحصول على ثقافة متجانسة من الفئران EC حديثي الولادة في وقت قصير. تخليد تغيير خصائص الخلايا واليجب مقارنة نتائج ه تم الحصول عليها مع خطوط الخلايا خلد سواء مع الخلايا الأولية أو مع التجارب المجراة على الفئران. وقد وصفت PymT EC خلدت للتعبير عن مستويات عالية من النشاط fibrinolytic والناتجة عن زيادة إنتاج المنشط البلازمينوجين يوروكيناز من نوع وانخفض إنتاج مثبطات منشط البلازمينوجين 25. المقارنة المباشرة لPymT خلد bEND5 خط الخلية الأولية مع ECS كشفت أن كلا من النماذج في المختبر BBB هي مناسبة تماما للدراسات التصاق الخلايا T 26. يمكن استخدام خطوط الخلايا التي أنشئت وفقا للإجراء المبين في رقم مرور منخفضة للحفاظ على خصائص الحاجز بواسطة التعبير عالية من البروتينات وBBB EC موصلي، كما تفقد الخلايا هذه الخصائص خلال الشيخوخة. هكذا بعد فقدان خصائص الحاجز، ينبغي النظر في إعداد خط خلية جديدة. يجب أن تكون الخلية كثافة الطلاء عالية لاظهار الدعم، وهذا أمر بالغ الأهمية لانتشار الخلايا. يجب النظر في هذا الإجراء خلال العزلة وكذلك الحفاظ على ECS خلد. وينبغي اختبار كل سطر الخلية الجديدة لخصائص الجدار وللملوثات محتملة مع أنواع الخلايا الأخرى. يمكن ملطخة monolayers EC مع مستضد العضلات المضادة للغالاكتوسيريبروزيد والبروتين لييفي الحمضية المضادة للالدبقية ومكافحة سلس والأجسام المضادة الأولية لاستبعاد التلوث مع الخلايا النجمية، وoligodendrocytes قد pericytes 4،27. استبعاد التلوث الأوعية الدموية meningal، يمكن اختبار التعبير عن thrombomodulin، وهو ما يعبر عنه في كل أسرة الأوعية الدموية باستثناء الدماغ 28. ومن المثير للاهتمام، وخلد خطوط الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة المعزولة من مناطق الدماغ المختلفة تختلف في خصائص الجدار والتعرض للمؤثرات الموالية للالتهابات. وكمثال على ذلك، يمكن ذكر الدماغي خلية cerebEND cEND والمخيخ خطوط 4،5. وأظهرت CerebEND، مقارنةلcEND، وانخفاض مستويات التعبير عن مكونات رئيسية تقاطع ضيق claudin-1 وoccludin. ومع ذلك، كانت مستويات claudin-3 -12 وأعلى في cerebEND. عانى وظيفة الحاجز من الخلايا cerebEND أكثر من ذلك بكثير تحت العلاج مع الوسيط التهابات، TNFα من خصائص الجدار من الخلايا cEND فعلت 5. ويمكن ملاحظة ضعف أعلى المخيخ للمؤثرات التهابات، في الجسم الحي في مرضى التصلب المتعدد ولها في حيوانات التجارب الذاتية التهاب الدماغ و النخاع نموذج 29. هذه النتائج مثيرة للاهتمام تظهر ضرورة توليد وتميز الفرد نماذج في المختبر لمناطق الدماغ المختلفة، من أجل تحسين استهداف المستقبل المخدرات في الدماغ.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> ألبومين المصل البقري (BSA) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> A7906 </td><td> الطهارة&gt; 98٪ </td></tr><tr><td> الكولاجين IV </td><td> سيغما الدريخ </td><td> C5533 </td><td> 50 ميكروغرام / مل في حمض الخليك 50 ملم </td></tr><tr><td> كولاجيناز / Dispase </td><td> روش </td><td> 10269638001 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> D5796 </td><td></td></tr><tr><td> ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> الجنين مصل العجل (FCS) </td><td> PAA المختبرات </td><td> A15110-1333 </td><td> تركيز النهائي 10٪، للحرارة المعطل (30 دقيقة عند 56 ° C) </td></tص&gt; <tr><td> الجلوتامين L- </td><td> Biochrom AG </td><td> K0282 </td><td> التخزين: -15 ° C ≤ </td></tr><tr><td> MEM فيتامين </td><td> Biochrom AG </td><td> K0373 </td><td> التخزين: -15 ° C ≤ </td></tr><tr><td> NA-البيروفات </td><td> Biochrom AG </td><td> L0473 </td><td></td></tr><tr><td> النيوميسين (G418) </td><td> PAA المختبرات </td><td> P11-012 </td><td></td></tr><tr><td> غير الأحماض الأمينية الأساسية (NEA) </td><td> Biochrom AG </td><td> K0293 </td><td> تخزين عند 4 ° C </td></tr><tr><td> Penicilin / الستربتوميسين </td><td> Biochrom AG </td><td> A2212 </td><td> التخزين: -15 ° C ≤ </td></tr><tr><td> الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrene (hexadimethrine الميثيل) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 107689 </td><td> 0.8 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني، والتخزين في -20 ° C </td></tr><tr><td> بوروميسين </td><td> سيغما الدريخ </td><td> P8833 </td><td></td></tr><tr><td> التربسين / EDTA </td><td> Biochrom AG </td><td> L1825 </td><td> 0.05٪، 0.02٪ EDTA في برنامج تلفزيوني </td></tr></tbody></table>

generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model

الخلايا الظهارية والبطانية (EC) وبناء الحواجز التي تحمي paracellular الأنسجة من البيئة الخارجية والداخلية. حاجز الدم في الدماغ (BBB)، ويتألف من EC، نجمية نهاية أقدام pericytes، والغشاء القاعدي هو المسؤول عن الحماية والتوازن للحمة الدماغ. في المختبر هي نماذج BBB الأدوات المشتركة لدراسة بنية ووظيفة BBB على المستوى الخلوي. وقد تم إنشاء عدد كبير من مختلف النماذج في المختبر BBB للبحوث في مختبرات مختلفة حتى الآن. عادة، يتم الحصول على الخلايا من الأبقار، الخنازير، الفئران أو الماوس أنسجة المخ (نوقشت بالتفصيل في الاستعراض الذي فيلهلم وآخرون. 1). عينات الأنسجة البشرية لا تتوفر إلا في عدد محدود من المختبرات أو الشركات 2،3. بينما الخلية الأولية هي الاستعدادات تستغرق وقتا طويلا ويمكن أن تختلف الثقافات EC من دفعة لدفعة، وإنشاء خلد EC لينES هو محور الاهتمام العلمي. هنا، نقدم طريقة لإنشاء خط خلد الدماغ EC الاوعية الدموية الدقيقة من مخ الفأر حديثي الولادة. وصفنا الإجراء خطوة بخطوة قائمة الكواشف والحلول المستخدمة. وبالطريقة المحددة من قبل المختبر يسمح للعزلة ومتجانسة خلد خط الخلية البطانية في غضون أربعة إلى خمسة أسابيع. الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ خطوط الخلايا البطانية ووصف cEND 4 (من القشرة المخية) وcerebEND 5 (القشرة المخيخية من)، تم عزل وفقا لهذا الإجراء في المختبر فورستر واستخدمت على نحو فعال لشرح مختلف العمليات الفسيولوجية والمرضية في BBB. وباستخدام cEND cerebEND لقد أثبتنا أن هذه الخلايا تستجيب ل4،6-9-جلايكورتيكود والاستروجين علاج 10 كما كذلك لصالح infammatory سطاء، مثل TNFalpha 5،8. وعلاوة على ذلك، درسنا في علم الأمراض من SC متعددةlerosis 11 و 12،13 نقص الأكسجة على مستوى EC-. يمكن اعتبار cEND وخطوط cerebEND كأداة جيدة لدراسة بنية ووظيفة الردود وBBB الخلوية من ECS للمؤثرات مختلفة أو تفاعل مع الخلايا اللمفية أو EC الخلايا السرطانية.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model at JoVE.com

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

هذه الطريقة يصف كيفية عزل خلايا بطانية وخلد الاوعية الدموية الدقيقة من مخ الفأر. وصفنا بروتوكول خطوة بخطوة بدءا من تجانس أنسجة المخ، والخطوات الهضم، والبذر وتخليد للخلايا. عادة، يستغرق حوالي خمسة أسابيع للحصول على متجانسة، خلدت الاوعية الدموية الدقيقة خط الخلية البطانية.

جيل من الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ الفئران مخلد الخط الخلية البطانية باعتبارها<em&gt; في المختبر</em&gt; حاجز الدم في الدماغ الموديل

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

generation-an-immortalized-murine-brain-microvascular-endothelial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

18.8K Views.  University of Wurzburg. هذه الطريقة يصف كيفية عزل خلايا بطانية وخلد الاوعية الدموية الدقيقة من مخ الفأر. وصفنا بروتوكول خطوة بخطوة بدءا من تجانس أنسجة المخ، والخطوات الهضم، والبذر وتخليد للخلايا. عادة، يستغرق حوالي خمسة أسابيع للحصول على متجانسة، خلدت الاوعية الدموية الدقيقة خط الخل?...

Video: Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

تصوير الأعصاب وظيفية عن طريق الموجات فوق الصوتية تعطيل حاجز الدم في الدماغ والتصوير بالرنين المغناطيسي المنغنيز معززة لل

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

عزل خلايا الدماغ الأولية الفئران الاوعية الدموية الدقيقة غشائي

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 &#181;m in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

تفاعل الثقافات 3D المهندسة العصبية لمايكرو الكهربائي صالحة: مبتكر<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج تجريبي

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

إعداد شرائح الدماغ الحادة باستخدام محسن N-الميثيل-د-أسلوب استرداد واقية جلوكاميني

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

في فيفو حاجز الدم في الدماغ نفاذية مقايسة في الفئران باستخدام المسمى فلوريسسينتلي تتبع

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

تقييم في فيفو لتعطيل حاجز الدم في الدماغ في نموذج الفئران من السكتة الدماغية

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) model in male Sprague-Dawley rats was chosen. By changing the rat&#39;s weight (260&#8722;330 g), the thread bolt type (2636/2838/3040/3043) and the brain infarct time (2-3 h), a higher Longa&#39;s score, a larger infarct volume and a greater model success ratio were screened using the Longa&#39;s score and TTC staining. The optimum model condition (300 g, 3040 thread bolt, 3 h brain infarct time) was acquired and used in a 1-90 day observation period after reperfusion via assessment of sensorimotor functions and infarct volume. At these conditions, the bilateral asymmetry test had a significant difference from 1 to 90 days, and the grid-walking test had a significant difference from 1 to 60 days; both differences could be a suitable sensorimotor functional test. Thus, the most appropriate condition of a novel rat model in the recovery and sequela stages of brain ischemia was found: 300 g rats that underwent MCAO with a 3040 thread bolt for a 3 h brain infarct and then reperfused. The appropriate sensorimotor functional tests were a bilateral asymmetry test and a grid-walking test.

The&#160;purpose of this study is to establish and validate an animal model for research in the recovery and sequela stages of brain ischemia by testing brain infarction and sensorimotor function after middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) after 1-90 days in rats.

نموذج قبل السريرية لتقييم تعافي الدماغ بعد السكتة الدماغية الحاده في الفئران

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is characterized by the cumulative and irreversible loss of sensory hair cells and auditory nerves in the cochlea. Entire and vital cochlear explants are one of the fundamental tools in hearing research to detect hair cell loss and to characterize the molecular mechanisms of the inner ear cells. Many years ago, a protocol for neonatal cochlear isolation was developed, and although it has been modified over time, it still holds potential for improvement. 
This paper presents an optimized protocol for isolating and culturing whole neonatal cochlear explants in multi-well culture chambers that enables the study of hair cells and spiral ganglion neuron cells along the entire length of the cochlea. The protocol was tested using cochlear explants from mice and rats. Healthy cochlear explants were obtained to study the interaction between hair cells, spiral ganglion neuron cells, and the surrounding supporting cells. 
One of the main advantages of this method is that it simplifies the organ culture steps without compromising the quality of the explants. All three turns of the organ of Corti are attached to the bottom of the chamber, which facilitates in vitro experiments and the comprehensive analysis of the explants. We provide some examples of cochlear images from different experiments with live and fixed explants, demonstrating that the explants retain their structure despite exposure to ototoxic drugs. This optimized protocol can be widely used for the integrative analysis of the mammalian cochlea.

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

The current protocol updates previous protocols and incorporates relatively straightforward approaches for culturing high-quality cochlear explants. This provides reliable data acquisition and high-resolution imaging in live and fixed cells. This protocol supports the ongoing trend of studying inner ear cells.

نباتات القوقعة الكاملة لحديثي الولادة كنموذج في المختبر

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is ...

قياس المقاومة عبر بطانة الرحم لتقييم سلامة حاجز الخلية

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating the interaction between restricted transit of harmful substances, nutrient absorption, and metabolite clearance in the brain, the BBB is essential in preserving central nervous system homeostasis. Building in vitro models of the BBB is a valuable tool for exploring the pathophysiology of neurological disorders and creating pharmacological treatments. This study describes a procedure for creating an in vitro monolayer BBB cell model by seeding bEnd.3 cells into the upper chamber of a 24-well plate. To assess the integrity of cell barrier function, the conventional epithelial cell voltmeter was used to record the transmembrane electrical resistance of normal cells and CoCl2-induced hypoxic cells in real-time. We anticipate that the above experiments will provide effective ideas for the creation of in vitro models of BBB and drugs to treat disorders of central nervous system diseases.

تسليط الضوء على المؤلف: تطبيقات اكتشاف TEER لتقييم سلامة حاجز الخلية 

This protocol describes a dependable and efficient in vitro model of the brain blood barrier. The method uses mouse cerebral vascular endothelial cells bEnd.3 and measures transmembrane electrical resistance.

تسجيل السلامة الوظيفية للحاجز على bEnd.3 الخلايا البطانية الوعائية عبر اكتشاف المقاومة الكهربائية عبر بطانة الرحم

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...