وظل توصيل الأدوية إلى الدماغ يشكل تحديا. إن تطوير لوحات كبيرة من المواد النانوية الجديدة لتحسين التوصيل إلى الدماغ يسلط الضوء على الحاجة إلى نظام مجهري حقيقي في المختبر للتنبؤ باختراق الدماغ في إطار الفحوصات قبل السريرية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي تجميد القيم الخلوية الخلوية الخالية من الألم لحاجز الدم في الدماغ داخل نفس النظام مما يسمح باتصالات الخلايا الخلوية اللازمة لتحريض النمط الظاهري لحاجز الدم في الدماغ.
علاوة على ذلك ، يمكن عزل كل نوع من أنواع الخلايا بشكل منفصل لمزيد من التحليل الجزيئي. ويمكن استخدام هذا النموذج في مجموعة واسعة من التجارب في الحالات الصحية والمرضية، ويمثل أداة قيمة للتقييمات قبل السريرية لنقل الجزيئات والجسيمات، فضلا عن الاتجار بين الخلايا وداخلها. سيوضح الإجراء الدكتور كليمينس ديليني والدكتورة إليونورا ريزي.
ابدأ بترميز الآبار ب 500 ميكرولتر من ميكروغرام لكل سنتيمتر مربع من محلول Poly-L-Lysine. احتضان بين عشية وضحاها أو لمدة ساعة واحدة على الأقل عند 37 درجة مئوية وإزالة محلول Poly-L-Lysine بعناية باستخدام ماصة زجاجية متصلة بنظام شفط. ثم شطف مرتين بالماء المعقم.
لجمع الخلايا النجمية ، اغسل الخلايا النجمية أولا مرة واحدة باستخدام 10 ملليلتر من 1X PBS CMF الدافئ. احتضنها لمدة ثلاث دقائق مع 10 ملليلتر من محلول Trypsin EDTA الدافئ بنسبة 20٪ عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 21٪ من الأكسجين. افصل الخلايا ميكانيكيا عن القارورة وانقل التعليق إلى أنبوب مخروطي يحتوي على خمسة ملليلترات من FCS الدافئ غير المخفف.
جهاز الطرد المركزي للتعليق عند 190 مرة G لمدة خمس دقائق عند 20 درجة مئوية. أعد تعليق حبيبات الخلية في خمسة ملليلتر من وسط الخلايا النجمية الدافئ ، ثم قم بتخفيف 20 ميكرولتر من تعليق الخلية باستخدام 80 ميكرولتر من 1X PBS CMF. عد الخلايا باستخدام غرفة عد يدوية تحت المجهر.
لوحة حوالي 40،000 خلية لكل سنتيمتر مربع في كل بولي L-ليسين مشفرة مسبقا جيدا في حجم 1.5 ملليلتر من وسط الخلايا النجمية الدافئة. ضع مرشحات الإدراج المعادة في محيط طبق مغطى بارتفاع 25 ملم وأضف 250 ميكرولتر من محلول الكولاجين من النوع الأول إلى مرشحات الإدراج. حضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
ثم قم بإزالة محلول الكولاجين من النوع الأول بعناية باستخدام ماصة زجاجية متصلة بنظام شفط. اغسل مرتين ب 250 ميكرولتر من الجلوكوز العالي DMEM في درجة حرارة الغرفة وقم بإزالة جميع المحلول بعناية من مرشحات الإدراج. اغسل الخلايا المحيطة مرتين مع 10 ملليلتر من 1X PBS CMF الدافئ واحتضن الخلايا بملليلترين من التربسين الدافئ.
مراقبة الخلايا تحت المجهر لمراقبة عمل التربسين. عندما تبدأ الخلايا في الانفصال ، قم بإزالة التربسين ، ثم أضف خمسة ملليلترات من الوسط القاعدي الدافئ للخلية البطانية أو ECM إلى الخلايا ، وابدأ التفكك الميكانيكي. قم بتخفيف 20 ميكرولتر من تعليق الخلية باستخدام 80 ميكرولتر من 1X PBS CMF ، وعد الخلايا باستخدام غرفة عد يدوية تحت المجهر كما هو موضح سابقا.
البذور 44 ، 500 خلية لكل سنتيمتر مربع على مرشحات الإدراج المعاد ترميزها مسبقا في حجم 250 ميكرولتر. احتفظ بمرشحات الإدراج في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 21٪ من الأكسجين. استخدم ملاقط معقمة لإعادة مرشحات الإدراج بعناية إلى صفيحة 12 بئر تحتوي على 1.5 ملليلتر من ECM الدافئ لكل بئر.
مرشحات الإدراج جاهزة الآن للطلاء على الجانب الآخر. قم بتغطية الجانب العلوي ومرشحات الإدراج ب 500 ميكرولتر من الهيدروجيل القائم على المصفوفة خارج الخلية. ضع مرشحات الإدراج في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 21٪ من الأكسجين لمدة ساعة.
اغسلها مرة واحدة مع 500 ميكرولتر من الجلوكوز العالي DMEM في درجة حرارة الغرفة. اغسل مزرعة الخلايا البطانية مرة واحدة مع 10 ملليلتر من 1X PBS CMF الدافئ واحتضن الخلايا بملليلترين من التربسين الدافئ. قم بإزالة التربسين عندما تبدأ الخلايا في الانفصال ، ثم أضف خمسة ملليلترات من ECM الدافئ وابدأ التفكك الميكانيكي.
قم بتخفيف 20 ميكرولتر من تعليق الخلية باستخدام 80 ميكرولتر من 1X PBS CMF وعد الخلايا باستخدام غرفة عد يدوية. زرع الخلايا البطانية بكثافة 71،500 خلية لكل سنتيمتر مربع على مرشحات الإدراج المشفرة مسبقا في حجم 500 ميكرولتر من ECM الدافئ. استبدل وسط الخلايا النجمية ب 1.5 ملليلتر من ECM الدافئ لكل بئر.
ثم انقل مرشحات الإدراج البذرية إلى الآبار التي تحتوي على الخلايا النجمية. ضع أنظمة الخلايا ثلاثية الزراعة في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 21٪ من الأكسجين. اخلع الوسط بعناية من المقصورة العلوية والسفلية باستخدام ماصة زجاجية متصلة بنظام الشفط.
استبدل الوسط ب ECM دافئ بحجم 500 ميكرولتر في المقصورة العلوية و 1.5 ملليلتر في المقصورة السفلية. قم بتجديد الوسيط كل يومين حتى اليوم السادس عن طريق تكرار نفس الإجراء. وأخيرا ، أعد الخلايا إلى حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 21٪ من الأكسجين.
أكدت بيانات الكيمياء المناعية التعبير عن العلامات التقليدية مثل مستقبلات عامل النمو المشتقة من الصفائح الدموية بيتا و Desmine للخلايا المحيطة ، والبروتين الحمضي الليفي الدبقي للخلايا النجمية. وبالتالي ، بعد ستة أيام من الثقافة مع الخلايا المحيطة والخلايا النجمية ، فإن الطبقة الأحادية من الخلايا البطانية الشبيهة بالدماغ أو BLECs التي تم تصورها مع تلطيخ التقاطع الملتصق ب Ve-Cadherin تعرض توطينا مستمرا لبروتينات TJ CLD5 و Z-01 على حدود الخلية. تظهر النفاذية شبه الخلوية ل BLECS إلى علامات سلامة BBB الفلورية ، فلوريسين الصوديوم و FITC dextran هنا.
أظهر التراكم داخل الخلايا R123 في BLECs زيادة كبيرة في وجود مثبط مضخة التدفق السائلة Elacridar مقارنة بحالة التحكم مع غيابه. هذا يشير إلى وجود جزيئات مضخة التدفق السائلة النشطة وهي البروتين السكري P والبروتين المقاوم لسرطان الثدي أو BCRP في BLEC. يظهر هنا التعبير الجيني لبروتينات الوصلة الضيقة والناقلات ومستقبلات الجزيئات الكبيرة التي تم تطبيعها من خلال التعبير عن RPLP0.
هنا ، تتوافق القيم الأكبر من واحد مع التعبير الجيني الأعلى في نموذج الثقافة الثلاثية. الخط الأحمر يتوافق مع قيمة واحد حيث يكون مستوى التعبير للنموذجين متساويا. تظهر الصورة التمثيلية مستوى البروتين لبروتينات الوصلة الضيقة ، الناقلين ، في مستقبلات الجزيئات الكبيرة التي يتم تطبيعها من خلال التعبير عن بيتا أكتين.
تم تقييم نقل المواد الهلامية النانوية البوليمرية المحايدة الموسومة بالفلورسنت NIPAM الموسومة بالفلورسنت. في الوقت صفر ، تم وضع المواد الهلامية النانوية البوليمرية في المقصورة المضيئة بتركيز 0.1 ملليغرام لكل ملليلتر. بعد 24 ساعة من الحضانة ، تم العثور على 5.82٪ من المواد الهلامية النانوية البوليمرية في المقصورة المضيئة مما يثبت قدرتها على عبور BLECs.
الطلاء الصحيح والبذر للخلايا المحيطة على المرشح المعاد أمر محوري. المهم هو الحفاظ على عقم الهياكل وسلامتها لتجنب تلوث نظام زراعة الخلايا.
