وأيد هذا العمل من قبل مركز متعدد التخصصات للبحوث السريرية (IZKF) مونستر (SEED 03/12، SB)، من قبل جمعية الألمانية للبحوث (DFG)، خلايا الحركة في والعنقودية التميز (EXC 1003 - CIM)، جامعة مونستر (SB لوSGM) وقبل عدا كرونة-فريزنيوس شتيفتونغ (2012_A88 لSB وSGM). نشكر هايكه بلوم للرسوم توضيحية ممتازة.

وتمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل السلطات المحلية (&quot;LandesamtfürNatur، UMWELT اوند Verbraucherschutz NRW، Fachbereich 87، Tiergesundheit، Tierschutz، ركلينغاوسين، ألمانيا&quot;) والتي أجريت وفقا للقانون الألماني لحماية الحيوان. 1. تعليقات عامة عن تجارب ماوس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء جميع التجارب باستخدام الفئران وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام كل منها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الفئران تحت ظروف خالية من مسببات الأمراض وتمكينهم من الحصول على الغذاء والماء بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الفئران السن والجنس المطابقة في المجموعات التجريبية وذلك لأن الخصائص البيولوجية يمكن أن تختلف مع تقدم العمر والجنس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كلما أمكن ذلك في محاولة للحد من، أو استبدال صقل التجارب على الحيوانات. </li></ol> 2. إعداد التدرج Percoll <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج 19 مل من 1X PBS مع 1 مل 10X PBS، 1 مل و 10 مل FCS Percoll. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء الظريفتثير غضب الترشيح في أنبوب زجاجي (قطر المسام مرشح: 0.2 ميكرون). بعد ذلك تخزين الحل في 4 درجات مئوية. </li></ol> 3. إعداد متوسطة البطانة Endothelium خلية وطلاء الثقافة الخلية لوحات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البطانية المتوسطة الخلية: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 500 مل المتوسطة: (حوالي 20٪) مزيج 400 مل DMEM المتوسطة (حوالي 80٪) مع 100 مل PDS، 0.25 مل bFgF (20 ميكروغرام / مل، حوالي 0.05٪)، و 0.5 مل الهيبارين (100 ميكرولتر / مل؛ حوالي 0.1٪) و 0.5 مل pyrumycin (4 ملغ / مل؛ حوالي 0.1٪). إضافة pyrumycin فقط لمستنبت الخلايا المستخدمة في الأيام الأولى 2 من الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء الترشيح العقيمة في أنبوب زجاجي (قطر المسام مرشح: 0.2 ميكرون). بعد ذلك تخزين الحل في 4 درجات مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طلاء من لوحات زراعة الخلايا: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ل1 مل من محلول طلاء، وإعداد محلول من 500 ميكرولتر DDH 2 O، 400 ميكرولتر الكولاجين الرابع (0.4 ملغ / مل) و 100 ميكرولتر فبرونيكتين (0.1 ملغ / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطي السطح كله من EACح بئر من لوحة زراعة الخلايا مع الحل الطلاء. تخزين لوحة عند 4 درجات مئوية خلال الليل. </li></ol></li></ol> 4. عزل الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ الفئران (MBMEC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 تضحية الفئران البالغة 8 (- 12 أسبوعا من العمر، C57BL / 6) من قبل خلع عنق الرحم. بعد ذلك عزل الماوس العقول وتخزينها في 5 مل من برنامج تلفزيوني (التحذير: العمل العقيم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة ينبع الدماغ، مخيخات والمهاد مع ملقط. فصل السحايا قبل المتداول بعناية العقول على ورقة النشاف العقيمة. جمع المجانية السحايا الناتجة forebrains. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل أدمغة إلى أنبوب 50 مل الصقر مليئة 13.5 مل من DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخطر على الأنسجة، أولا مع ماصة 25 مل، ثم مع ماصة 10 مل حتى يصبح حليبي وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم هضم الأنسجة مع مزيج من 0.6 مل كولاجيناز CLS2 (10 ملغ / مل في DMEM) و 0.2 مل الدناز (1 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني) في Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية على المدار هزةفي ص 180 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل من DMEM أضافت إلى تعليق الأنسجة والخلايا الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طاف نبذ (التحذير: بيليه من السهل أن تفقد) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإزالة النخاعين، resuspend الكرية مع ماصة 25 مل في 25 مل من BSA-DMEM (20٪ ث / ت) (حوالي 25 مرة)، وأجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طبقة المايلين العليا (حليبي) مع كسر الزجاج ماصة باستور مع قطر أكبر، ومن ثم التخلص من طبقة BSA مع ماصة باستير العادية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية في 9 مل DMEM وإضافة 1 مل كولاجيناز / dispase (تركيز النهائي هو 1 ملغ / مل) و 0.1 مل الدناز. هضم الحل لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية على شاكر المداري في 180 دورة في الدقيقة (تحذير: لا تستخدم ماصة ل resuspend - خلايا يمكن أن تضيع). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال عملية الهضم، جهاز طرد مركزي الحل Percoll لإعداد التدرج الكثافة باستخدام نابذة فائقة السرعة في 3000 x ج لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية، مع التسارع، وايتوت الفرامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل من DMEM إلى تعليق خلية هضمها. الطرد المركزي في 1000 x ج لتعليق لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. ثم تجاهل طاف و resuspend بيليه في 2 مل من DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الخلايا معلق بعناية على قمة التدرج Percoll والطرد المركزي في 700 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية دون التسارع والفرامل. ملاحظة: الخلايا مرئية مثل سحابة في الطور البيني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ تقريبا. 12 مل من الطور البيني مع الخلايا بإبرة معقمة طويلة ووضعها في جديد 50 مل الصقر مع 5 مل من DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى في 1000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. بعد ذلك resuspend الكرية في البطانية المتوسطة الخلية (استخدام حوالي 0.2 مل من المتوسط ​​في 1 سم 2 من سطح لوحة زراعة الخلايا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الطلاء من حل المغلفة لوحات زراعة الخلايا (انظر الخطوة 3.2)، وشطف جيدا مع كل برنامج تلفزيوني العقيمة في خطوتين غسل متتالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على مزارع الخلايا البطانية فيمتوسطة خلية عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 في حاضنة معقمة. تغيير المتوسطة كل يومين أو ثلاثة أيام. انقسام الخلايا في 90٪ التقاء. </li></ol>

<ol>
	<li>Neuwelt, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engaging+neuroscience+to+advance+translational+research+in+brain+barrier+biology.">Engaging neuroscience to advance translational research in brain barrier biology.</a> Nature reviews. Neuroscience. 12, 169-182 (2011).</li><li>Ohtsuki, S., Terasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+carrier-mediated+transport+systems+to+the+blood-brain+barrier+as+a+supporting+and+protecting+interface+for+the+brain;+importance+for+CNS+drug+discovery+and+development.">Contribution of carrier-mediated transport systems to the blood-brain barrier as a supporting and protecting interface for the brain; importance for CNS drug discovery and development.</a> Pharmaceutical Research. 24, 1745-1758 (2007).</li><li>Bittner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+TWIK-related+potassium+channel-1+(TREK1)+regulates+immune-cell+trafficking+into+the+CNS.">Endothelial TWIK-related potassium channel-1 (TREK1) regulates immune-cell trafficking into the CNS.</a> Nature Medicine. 19, 1161-1165 (2013).</li><li>Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier+in+health+and+chronic+neurodegenerative+disorders.Neuron.">The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders.Neuron.</a> 57, 178-201 (2008).</li><li>Stoll, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+widespread+blood-brain+barrier+alterations+after+cerebral+photothrombosis+as+revealed+by+gadofluorine+M-enhanced+magnetic+resonance+imaging.">Transient widespread blood-brain barrier alterations after cerebral photothrombosis as revealed by gadofluorine M-enhanced magnetic resonance imaging.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 29, 331-341 (2009).</li><li>Kleinschnitz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucocorticoid+insensitivity+at+the+hypoxic+blood-brain+barrier+can+be+reversed+by+inhibition+of+the+proteasome.">Glucocorticoid insensitivity at the hypoxic blood-brain barrier can be reversed by inhibition of the proteasome.</a> Stroke. 42, 1081-1089 (2011).</li><li>Hawkins, B. T., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier/neurovascular+unit+in+health+and+disease.">The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease.</a> Pharmacological reviews. 57, 173-185 (2005).</li><li>Bazzoni, G., Dejana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-to-cell+junctions:+molecular+organization+and+role+in+vascular+homeostasis.">Endothelial cell-to-cell junctions: molecular organization and role in vascular homeostasis.</a> Physiological reviews. 84, 869-901 (2004).</li><li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+delivery.">Blood-brain barrier delivery.</a> Drug Discovery Today. 12, 54-61 (2007).</li><li>Persidsky, Y., Ramirez, S. H., Haorah, J., Kanmogne, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier:+structural+components+and+function+under+physiologic+and+pathologic+conditions.">Blood-brain barrier: structural components and function under physiologic and pathologic conditions.</a> Journal of neuroimmunepharmacology : the official journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 1, 223-236 (2006).</li><li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+the+blood-brain+barrier.">Molecular biology of the blood-brain barrier.</a> Molecular Biotechnology. 30, 57-70 (2005).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews Immunology. 7, 678-689 (2007).</li><li>Wilson, E. H., Weninger, W., Hunter, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+immune+cells+in+the+central+nervous+system.">Trafficking of immune cells in the central nervous system.</a> Journal of Clinical Investigation. 120, 1368-1379 (2010).</li><li>Engelhardt, B., Capture Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=crawl,+cross:+the+T+cell+code+to+breach+the+blood-brain+barriers.">crawl, cross: the T cell code to breach the blood-brain barriers.</a> Trends in Immunology. 33, 579-589 (2012).</li><li>Zonta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-to-astrocyte+signaling+is+central+to+the+dynamic+control+of+brain+microcirculation.">Neuron-to-astrocyte signaling is central to the dynamic control of brain microcirculation.</a> Nature Neuroscience. 6, 43-50 (20003).</li><li>Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+are+required+for+blood-brain+barrier+integrity+during+embryogenesis.">Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis.</a> Nature. 468, 562-566 (2010).</li><li>Gerhardt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+guides+angiogenic+sprouting+utilizing+endothelial+tip+cell+filopodia.">VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia.</a> Journal of Cell Biology. 161, 1163-1177 (2003).</li><li>Engelhardt, B., Sorokin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barriers:+function+and+dysfunction.">The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.</a> Seminars in immunopathology. 31, 497-511 (2009).</li><li>Perriere, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Puromycin-based+purification+of+rat+brain+capillary+endothelial+cell+cultures.+Effect+on+the+expression+of+blood-brain+barrier-specific+properties.">Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties.</a> J. Neurochem. 93, 279-289 (2005).</li><li>Ruck, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+NKG2D++T+cells+exhibit+enhanced+migratory+and+encephalitogenic+properties+in+neuroinflammation.">CD4+NKG2D+ T cells exhibit enhanced migratory and encephalitogenic properties in neuroinflammation.</a> PLoS One. 8, 81455 (2013).</li><li>Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+brain+capillary+endothelial+cells+exhibit+improved+barrier+properties+under+the+influence+of+hydrocortisone.">Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone.</a> Brain Res. 1053, 162-174 (2005).</li><li>Gumbleton, M., Audus, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+limitations+in+the+use+of+in+vitro+cell+cultures+to+serve+as+a+permeability+screen+for+the+blood-brain+barrier.">Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as a permeability screen for the blood-brain barrier.</a> J. Pharmaceutal Sci. 90, 1681-1698 (2001).</li><li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracellular+barrier+and+tight+junction+protein+expression+in+the+immortalized+brain+endothelial+cell+lines+bEND.3,+bEND.5+and+mouse+brain+endothelial+cell+4.">Paracellular barrier and tight junction protein expression in the immortalized brain endothelial cell lines bEND.3, bEND.5 and mouse brain endothelial cell 4.</a> Biological &amp; Pharmaceutical Bulletin. 36, 492-495 (2013).</li><li>Omidi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+immortalised+mouse+brain+capillary+endothelial+cell+line,+b.End3,+as+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+uptake+and+transport+studies.">Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies.</a> Brain Research. 990, 95-112 (2003).</li><li>Sacharidou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+lumen+signaling+complexes+control+3D+matrix-specific+tubulogenesis+through+interdependent+Cdc42-+and+MT1-MMP-mediated+events.">Endothelial lumen signaling complexes control 3D matrix-specific tubulogenesis through interdependent Cdc42- and MT1-MMP-mediated events.</a> Blood. 115, 5259-5269 (2010).</li><li>Urich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+self-assembled+spheroidal+model+of+the+blood+brain+barrier.">Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier.</a> Scientific reports. 3, (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

ضعف الدم في الدماغ من العوائق هو السمة المميزة لمختلف أمراض الجهاز العصبي المركزي الضارة، مثل انهيار من BBB في التصلب المتعدد يسهل على نطاق واسع للغزو من قبل الجهاز العصبي المركزي الخلايا المناعية autoreactive وتمكن من لقاء وتدمير الخلايا قليلة التغصن. في السكتة الدماغية اختلال BBB وتشكيل لاحق من الوذمة الدماغية من العوامل الهامة التي تؤثر على نمو احتشاء الثانوي وبقاء الكلي للمرضى 6. وعلاوة على ذلك، من خلال التعديلات من BBB في المناطق النائية الآفات الدماغية اتصال قادرة على إحداث تغييرات وظيفية واسعة النطاق من الدماغ. ومع ذلك، فإن الآليات الجزيئية الكامنة غير معروفة إلى حد كبير 5. في المقابل، فإن كثافة عالية وتنوع النقل هروب رأس المال في BMECs ظيفية يقلل من تركيز الأدوية النافعة مثل مبحث المعالجة الكيميائية عن الأورام الخبيثة في المخ أو المضادات الحيوية للأمراض المعدية. لذا، فهم أعمق للدماغ بار الدممطلوب رير وظيفة في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض لتطوير كلاء الدوائية التي تكون قادرة على تنظيم تحديدا وظيفة الحاجز في الاتجاه المفضل 21. يمكن الاعتماد عليها في المختبر نماذج من BBB هي أدوات لا غنى عنها لدراسة الآليات التنظيمية على BBB. وقد تم إنشاء العديد من خطوط الخلايا البطانية خلد الدماغ ويعمل كما هو الحال في المختبر نماذج BBB 22. هذه خطوط الخلايا توفر مزايا معينة على BMECs الابتدائية لأنها تنمو أسرع والحفاظ على الخصائص BBB معينة على مدى عدة فقرات. ومع ذلك، يمكن للخطوط الخلايا البطانية ليس بديلا كاملا للخلايا الأولية يتم تغيير الخصائص الهامة كما أن تختلط مع إمكانية نقل نتائج التجارب إلى الوضع في الجسم الحي. على سبيل المثال، خط الخلية البطانية دماغ الفئران bEnd.5 عن مستويات منخفضة فقط من البروتينات وزعت متقطع مفرق ضيقة مما يؤدي إلى ارتفاع paracنفاذية ellular 23. BEnd.3، الفئران البطانية الدماغ خط خلية أخرى تستخدم في كثير من الأحيان، يدل على التقاطعات كثيفة ومستمرة بتوزيع ضيقة، ومقاومة transendothelial عالية، عدة ناقلات هروب رأس المال وانخفاض نفاذية paracellular. ومع ذلك، طبقات الخلايا bEND.3 مقارنة BMECs الابتدائية تفتقر إلى التمييز الحقيقي فيما يتعلق تخلل العابر للبعض وركائز paracellular 24. في الأعمال التحضيرية للثقافات الخلية الأولية، يمكن خلايا تلويث تتدخل بشكل كبير مع صحة النتائج التجريبية. في البروتوكول وصفها، يستخدم pyrumicin كعامل انتقائي للخلايا البطانية لتحقيق نقاوة عالية. ومع ذلك، هناك حاجة إلى مراقبة الجودة العادية للثقافة الخلية حتما إلى ضمان للتجارب موثوقة. هناك عدة طرق لمراقبة الجودة، إلى جانب الخصائص المورفولوجية نموذجي من الخلايا البطانية (انظر الشكل 1A)، وtransendotheliaيمكن قياس لتر المقاومة أو قد يتم تقييم التعبير عن البطانية علامة الخلية مثل CD31 (انظر الشكل 1B) أو عامل فون ويلبراند (VWF). عدد الخلايا البطانية الدماغ معزولة عن بعضها مخ الفأر منخفض نسبيا وإنشاء ثقافة الخلية المناسبة لتجارب متعددة، العقل المدبر للعديد من الفئران يجب أن تكون مجمعة. في تجربتنا، وتحتاج على الأقل 10 الفئران لاستخدامها في تجربة واحدة التي قد تكون عاملا مقيدا اعتمادا على موارد مرفق الحيوانية منها. من أجل تجنب التحيز أو عوامل خارجية، ينبغي تجميع الفئران فقط مع خلفية وراثية وبيئية مماثلة. في المقابل، البقر والخنزير التحضيرات الخلايا البطانية الدماغ توفير عدد كبير من الخلايا البطانية الدماغ المتاحة في الدماغ واحد. ولكن، إلى جانب تربية غير معقدة، والإسكان، وذخيرة واسعة ومتزايدة من الفئران المعدلة وراثيا المتوفرة يجعل الفئران الأساسي BMECs باعتباره المثل الأعلىنموذج لدراسة وظيفة الدم في الدماغ من العوائق. وتأتي العديد من النتائج الرئيسية التي تتعلق بوظائف BBB والآليات الجزيئية الكامنة من الدراسات في أنظمة زراعة الأنسجة 2D. مؤخرا، تم تطوير نظم الاستزراع 3D 25، حيث توضع الخلايا البطانية داخل مصفوفة الكولاجين وتمكينهم من تشكيل التجويف والشبكات الأنبوبية. هذه الأنظمة الثقافة خلية جديدة تسمح لاستنساخ أكثر دقة من العمليات الدموية في الكائن الحي سليمة في الجسم الحي. إشراك المزيد من خلايا NVU في 3D أنظمة زراعة الخلايا، مثل الخلايا النجمية وpericytes قد تحدث ثورة في المختبر دراسة وظيفة الدم في الدماغ من العوائق. وقد تم مؤخرا تطوير النماذج الأولى 26. هناك بعض التوصيات لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. أولا وقبل كل عمل عقيم أمر ضروري لنوعية زراعة الخلايا البطانية. ثانيا، ينبغي أن يضاف pyrumycin فقط للخليةمستنبت المستخدمة في الأيام الأولى 2 للثقافة، قد يؤدي إلى زيادة الطلب أطول MBMEC موت الخلايا وانخفاض وظيفة الحاجز الجودة. ثالثا، الانزيمات المطبقة في هذا البروتوكول يجب أن تستخدم وتخزن وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. خلاف ذلك قد يثير الشبهة وظيفتها المناسبة. وعلاوة على ذلك، يمكن تعديل طلاء لوحات ثقافة الخلية إذا الخلايا البطانية لا نعلق. قد تتغير تركيزات فبرونيكتين والكولاجين أو قد تضاف البروتينات مصفوفة أخرى إلى حل الطلاء. أخيرا، العمر، الجنس، الموسم الشروط العام والبيئية داخل المنشأة الحيوانية من العوامل الهامة التي قد تؤثر على نوعية MBMEC العزلة والمقارنة بين التجارب. يجب التأكد من أن الظروف قابلة للمقارنة بين تجارب مستقلة. ينبغي النظر في بروتوكول صفها بأنها طريقة neuroimmunological الأساسي لعزل BMECs الفئران. الخلايا المعزولة قد يكون شالحوار الاقتصادي الاستراتيجي لمجموعة واسعة من التطبيقات للحصول على مزيد من التبصر في وظيفة BBB، مثل فحوصات الهجرة والجينات ودراسات التعبير البروتين، والتقييمات الكهربية أو تجارب النفاذية. كما ذكر أعلاه، نظم زراعة الخلايا 3D من BMECs قد توفر فرصا جديدة لدراسة الآليات المعقدة التي تنطوي عليها تنظيم BBB في سياق NVU. وبالتالي، فإن عزل الخلايا البطانية الأولية تبقى تقنية لا تقدر بثمن في مجال البحث BBB في المستقبل.

<html> الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ الخلايا البطانية (BMEC) شكل الطبقات الوحيدة التي تشكل جزءا لا يتجزأ من درجة عالية من التخصص الدم في الدماغ من العوائق (BBB). مترابطة BMECs من البروتينات صلي تعلق على الغشاء القاعدي. جنبا إلى جنب مع pericytes، وخلايا العضلات الملساء، قدم نهاية نجمي وخلايا الدم يبنون ما يسمى وحدة وعائية عصبية (NVU) 1. ضد فكرة سابقة من حاجز كتيم بين الدم و-عصبي-النظام المركزي (CNS)، وNVU هو واجهة ديناميكية ومحددة للغاية والتنظيم الذي يسيطر على الانتقال من السوائل، والجزيئات والخلايا بين الأوعية الدموية الدماغية والجهاز العصبي المركزي 2 . خلل وظيفي أو التقلبات في NVU قد بدء و / أو المساهمة في مجموعة متنوعة من الوعائية العصبية، والأمراض المعدية، والتهابات أو التنكسية في الجهاز العصبي المركزي، مثل السكتة الدماغية، ومرض الاعتلال الدماغي، والتصلب المتعدد، الزهايمر أو مرض باركنسون 3-6. _content &quot;&gt; وختم أحادي الطبقة BMEC بإحكام من قبل مجمع صلي تتألف من ضيق (TJ) والملتصقة تقاطعات (AJ) 7. والمقاومة الكهربائية عالية ونفاذية منخفضة paracellular من BBB تقوم أساسا على البروتينات TJ (8). وTJS و المجمعات التي شكلتها البروتينات عبر الغشاء من عائلة claudin وoccludin، التي ترتبط الهيكل الخلوي للخلايا البطانية من قبل جزيئات محول، مثل zonulaoccludens (ZO) البروتينات ZO1-3 4، ويتم تجميعها بشكل رئيسي تقاطعات الملتصقة بها بروتين الغشاء لا يتجزأ الوعائية البطانية (VE) -cadherin، الذي يرتبط الهيكل الخلوي عبر catenins 8. وختم ضيق من BBB يمنع التبادل الحر للركائز والخلايا بين الدم والسائل النخاعي. استثناءات لهذه القاعدة هي محبة للدهون، جزيئات صغيرة ذات وزن جزيئي &lt;400 دا، والتي هي قادرة على عبور BBB من قبل بوساطة الدهون نشر 9. مرور أكبر و / أوجزيئات ماء، مثل الجلوكوز والأحماض الأمينية، والببتيدات والبروتينات والعديد من الأدوية يقتصر على أنظمة رقابة شديدة النقل العابر لل10، والتي يمكن تصنيفها إلى خمس فئات رئيسية هي: النقل بوساطة الناقل، نقل أيون، والنقل هروب رأس المال النشط، بوساطة مستقبلات النقل، وcaveolae بوساطة النقل 4. هذه الأنظمة تساعد على نقل الحفاظ على التوازن للجهاز العصبي المركزي، وهو مطلوب لجيل إشارة دقيقة، التنبيغ والتكامل. وعلاوة على ذلك، BMECs هي قادرة على السيطرة بفاعلية على انتقال الجزيئات متميزة من خلال التعبير عن مجموعة متنوعة من ectoenzymes. يتم ترجمة هذه الإنزيمات على سطح الخلية وتعديل ركائز الداخلية والخارجية التي تعيق أو محددة تسمح بالانتقال من BBB 11. في حين اعتبر الجهاز العصبي المركزي كجهاز المناعة حظا لفترة طويلة، وتشير النتائج الأخيرة لنظام ديناميكي ومنظم بإحكام بدلا من surv المناعةeillance من الجهاز العصبي المركزي. وBMECs تشارك بشكل حاسم في تنظيم هجرة الخلايا المناعية. من خلال التعبير عن selectins على الخلايا الليمفاوية سطحها والناجم بشكل انتقائي إرفاق فضفاضة إلى البطانة. إفراز كيموكينات التي تواجهها مع مستقبلات معينة على الكريات البيض يؤدي إلى التعبير أو تغيير متعلق بتكوين integrins من الكريات البيض، مثل LFA-1 (وظيفة الخلايا اللمفاوية المرتبطة مستضد 1) وVLA-4 (أواخر جدا مستضد 4). وintegrins توسط في التصاق متين من قبل ملزم counterreceptors البطانية، وعلى سبيل المثال VCAM-I (الأوعية الدموية جزيء التصاق الخلية)، ICAM-I (بين الخلايا جزيء التصاق) تمكين التهجير في لحمة بين الدماغ أو من خلال BMECs من BBB 12-14. هذه النتائج وغيرها تؤكد على الدور النشط للالبطانة نفسها في تنظيم هجرة الخلايا المناعية. وعلاوة على ذلك، BMECs كما يشارك جزءا من NVU في تنظيم تدفق الدم الدماغي لىnked لمطالب الأيضية العصبية المحلية. على التحفيز نجمي الخلايا تنتج الخلايا البطانية المواد فعال في الأوعية مثل أكسيد النيتريك مما يؤدي إلى التخفيف من خلايا العضلات الملساء الوعائية 15. الأوعية الدموية والخلايا العصبية في البلدان النامية وكذلك في المعرض الدماغ الكبار الزخرفة موازية والتنمية وتبادل العديد من خصائص التنظيم 1، 4. الخلايا البطانية وتشارك بشكل حاسم في هذه العمليات 16، 17. باختصار، BMECs توفر ميزات أساسية لتبرير التنمية السليمة وأداء الجهاز العصبي المركزي. يرتبط ضعف BBB إلى العديد من الاضطرابات العصبية الحادة. ومع ذلك، فقد تم التعرف سوى عدد قليل جدا من الأهداف في واجهة الدماغ الأوعية الدموية لعلاج محدد وفعال 18. نماذج مبسطة في المختبر استخدمت لفهم الآليات التي تشارك في تنظيم وظيفة من الأنظمة الفسيولوجية المعقدة للوالوقت نانوغرام. العزلة كما وصفها هذا المخطوط والدراسة في المختبر من الفئران BMECs، نظرا لمجموعة واسعة من الماوس خروج المغلوب-سلالات محددة، قد يوفر المزيد من التفهم لوظيفة BBB والتنظيم في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض فتح آفاقا علاجية جديدة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="808">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">bFGF</td>
			<td style="width:133px;">Peprotech</td>
			<td style="width:123px;">100-18B</td>
			<td style="width:331px;">Basic fibroblast growth factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">BSA</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">A9418</td>
			<td>Bovine serum albumine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Collagenase CLS2</td>
			<td style="width:133px;">Worthington</td>
			<td style="width:123px;">LS004176</td>
			<td>High relative level of protease activity</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Collagenase-dispase</td>
			<td style="width:133px;">Roche</td>
			<td align="right" style="width:123px;">10269638001</td>
			<td style="width:331px;">Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Collagen IV</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C0543</td>
			<td style="width:331px;">From Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">DMEM</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D5030</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">DNAse</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D4513</td>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">FCS</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">F6178</td>
			<td>Fetal calf serum (also named fetal bovine serum)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Heparin</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H3393</td>
			<td>Anticoagulant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">PDS</td>
			<td style="width:133px;">First Link UK Ltd.</td>
			<td style="width:123px;">60-00-850</td>
			<td>Plasma-derived serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Percoll</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P1644</td>
			<td>Warm to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Pyrumycin</td>
			<td style="width:133px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">P8833</td>
			<td>Should only be used in first 2 d of culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

مباشرة بعد العزلة، BMECs الفئران وخلايا تلويث تشكيل تكتلات عائمة في مستنبت الخلية (الشكل 1A، يوم 0). العلاج مع pyrumycin يؤدي إلى مجموعة مختارة من BMECs الفئران لأنها تعبير عن مستويات عالية من الناقلين هروب رأس المال مثل P-بروتين سكري مما يؤدي إلى مقاومة نسبية للسموم. خلايا تلويث أكثر عرضة بكثير للpyrumycin السمية الخلوية بوساطة 19. خلال عملية الاختيار pyrumicin، خلايا تلويث تدخل موت الخلايا أفكارك أو الناخر، في حين تبدأ MBMECs لنعلق على الكولاجين IV / فبرونيكتين المغلفة لوحات زراعة الخلايا (الشكل 1A، يوم 1 ويوم 2). حتى يوم 5، وMBMECs تتكاثر لكثافة تقريبا. 80-90٪. فهي تتميز نموذجي ظهور على شكل مغزل. في التقاء، وتشكيل أحادي الطبقة من الخلايا تحول دون الاتصال غير متداخلة معبأة بإحكام، تتماشى طوليا و(الشكل 1A، يوم 5). بواسطةيتم التوصل pyrumicin الاختيار، نقاء عالية تصل إلى 99٪ MBMEC كما يتبين من علامة الخلية البطانية CD31 (PECAM1، الشكل 1B). وMBMECs تشكيل الطبقات الوحيدة مغلقة بإحكام مترابطة من البروتينات مفرق ضيقة. بعد 7 - 8 أيام للثقافة، طبقات الخلايا البطانية تبنى القيم المستقرة للمقاومة الكهربائية (الوصول إلى القيم النموذجية بين 20 - 30 Ω س سم 2). والسعة (الشكل 1C) عند هذه النقطة مرة المقايسات الفنية مثل الخلوي تجارب الهجرة 3، 20،21 ونفاذية الاختبارات، على سبيل المثال مع ايفانز الأزرق أو ديكستران، يجب أن يتم تنفيذ. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/52204/52204fig1highres.jpg" width="500" /> الشكل 1. خصائص المورفولوجية والوظيفية من الفئران BMECs. (A) بالطبع الوقت تمثيلي من BMECs مثقف ينظر إليها من قبل انتقال الضوء الصغيرscopy أكثر من 5 أيام. ينطبق شريط النطاق لجميع الصور. (B) تلطيخ المناعي للخلايا البطانية علامة CD31 CD31 في اليوم 5. (الخضراء) ودابي (الأزرق). وقد precultured (C) خلايا لمدة 5 أيام، ثم نقل إلى نظام آلي ل تحليل الخصائص الفيزيائية الحيوية (المقاومة والسعة). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52204/52204fig1highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

عزل خلايا الدماغ الأولية الفئران الاوعية الدموية الدقيقة غشائي

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

isolation-of-primary-murine-brain-microvascular-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

32.0K Views.  University of Münster. Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB. 

Video: Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The blood-brain barrier (BBB) consisting of EC, astrocyte end-feet, pericytes and the basal membrane is responsible for the protection and homeostasis of the brain parenchyma. In vitro BBB models are common tools to study the structure and function of the BBB at the cellular level. A considerable number of different in vitro BBB models have been established for research in different laboratories to date. Usually, the cells are obtained from bovine, porcine, rat or mouse brain tissue (discussed in detail in the review by Wilhelm et al. 1). Human tissue samples are available only in a restricted number of laboratories or companies 2,3. While primary cell preparations are time consuming and the EC cultures can differ from batch to batch, the establishment of immortalized EC lines is the focus of scientific interest.
Here, we present a method for establishing an immortalized brain microvascular EC line from neonatal mouse brain. We describe the procedure step-by-step listing the reagents and solutions used. The method established by our lab allows the isolation of a homogenous immortalized endothelial cell line within four to five weeks. The brain microvascular endothelial cell lines termed cEND 4 (from cerebral cortex) and cerebEND 5 (from cerebellar cortex), were isolated according to this procedure in the F&ouml;rster laboratory and have been effectively used for explanation of different physiological and pathological processes at the BBB. Using cEND and cerebEND we have demonstrated that these cells respond to glucocorticoid- 4,6-9 and estrogen-treatment 10 as well as to pro-infammatory mediators, such as TNFalpha 5,8. Moreover, we have studied the pathology of multiple sclerosis 11 and hypoxia 12,13 on the EC-level. The cEND and cerebEND lines can be considered as a good tool for studying the structure and function of the BBB, cellular responses of ECs to different stimuli or interaction of the EC with lymphocytes or cancer cells.

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

This method describes how to isolate and immortalize microvascular endothelial cells from mouse brain. We describe a step-by-step protocol starting from the homogenization of brain tissue, digestion steps, seeding and immortalization of the cells. Usually, it takes about five weeks to obtain a homogenous, immortalized microvascular endothelial cell line.

جيل من الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ الفئران مخلد الخط الخلية البطانية باعتبارها<em&gt; في المختبر</em&gt; حاجز الدم في الدماغ الموديل

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

العزلة والثقافة من الخلايا البطانية من الجنينية الدماغ المقدم

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

العزلة والثقافة وطويل الأجل صيانة الابتدائية الدماغ المتوسط ​​الدوبامين العصبية من المخ الجنينية القوارض

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

يعيش تصوير خلايا قشرة الدماغ الأولية باستخدام نظام ثقافة 2D

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

عزل خلايا بطانية Microvascular الابتدائي مورين الهيكل العظمى والعضلات

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

تحديد علامات سطح الخلية من الجذعية العصبية الأولية والخلايا السلف عن طريق وضع العلامات الأيضية من Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

الهجرة، والجذب الكيميائي، ومقالات الثقافة المشتركة للخلايا الأنبوسلية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية والخلايا العصبية GABAergic

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

تشريح وعزل الفئران الدبقية من مناطق الجهاز العصبي المركزي المتعددة

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models for studying blood-brain barrier (BBB) function. This modified protocol provides detailed steps to derive, expand, and cryopreserve BMECs from human iPSCs using a different donor and reagents than those reported in previous protocols. iPSCs are treated with essential 6 medium for 4 days, followed by 2 days of human endothelial serum-free culture medium supplemented with basic fibroblast growth factor, retinoic acid, and B27 supplement. At day 6, cells are sub-cultured onto a collagen/fibronectin matrix for 2 days. Immunocytochemistry is performed at day 8 for BMEC marker analysis using CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1, and SLC2A1. Western blotting is performed to confirm BMEC marker expression, and absence of SOX17, an endodermal marker. Angiogenic potential is demonstrated with a sprouting assay. Trans-endothelial electrical resistance (TEER) is measured using chopstick electrodes and voltohmmeter starting at day 7. Efflux transporter activity for ATP binding cassette subfamily B member 1 and ATP binding cassette subfamily C member 1 is measured using a multi-plate reader at day 8. Successful derivation of BMECs is confirmed by the presence of relevant cell markers, low levels of SOX17, angiogenic potential, transporter activity, and TEER values ~2000 &#937; x cm2. BMECs are expanded until day 10 before passaging onto freshly coated collagen/fibronectin plates or cryopreserved. This protocol demonstrates that iPSC-derived BMECs can be expanded and passaged at least once. However, lower TEER values and poorer localization of BMEC markers was observed after cryopreservation. BMECs can be utilized in co-culture experiments with other cell types (neurons, glia, pericytes), in three-dimensional brain models (organ-chip and hydrogel), for vascularization of brain organoids, and for studying BBB dysfunction in neuropsychiatric disorders.

This protocol details an adapted method to derive, expand, and cryopreserve brain microvascular endothelial cells obtained by differentiating human induced pluripotent stem cells, and to study blood brain barrier properties in an ex vivo model.

اشتقاق، توسعة، المحافظة على التبريد وتوصيف خلايا الدماغ البطانية الدقيقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من الإنسان

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. Microglia can adopt a large spectrum of activation phenotypes. Moreover, microglia that endorse pro-inflammatory phenotype is associated with both neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. In vitro studies are widely used in research to evaluate potential therapeutic strategies in specific cell types. In this context studying microglial activation and neuroinflammation in vitro using primary microglial cultures is more relevant than microglial cell lines or stem-cell-derived microglia. However, the use of some primary cultures might suffer from a lack of reproducibility. This protocol proposes a reproducible and relevant method of magnetically isolating microglia from neonate pups. Microglial activation using several stimuli after 4 h and 24 h by mRNA expression quantification and a Cy3-bead phagocytic assay is demonstrated here. The current work is expected to provide an easily reproducible technique for isolating physiologically relevant microglia from juvenile developmental stages.

Primary microglia cultures are commonly used to evaluate new anti-inflammatory molecules. The present protocol describes a reproducible and relevant method to magnetically isolate microglia from neonate pups.