ونود أن نشكر اندريا بورتبري لقراءة نقدية للمخطوطة، ومختبر خدمة مجهر UNC للحصول على المساعدة مع الوقت الفاصل بين التصوير، والمعاهد الوطنية للصحة (منحة # R01HL061656) لدعم التمويل.

1. إعداد الخرز الضد مترافق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم واحد قبل تشريح، والجمع بين الأضداد من خيار مع Dynabeads المناسبة (مثل الفئران Dynabeads مفتش للجسم التي أثيرت في الفئران، 4 × 10 8 حبات / مل) في تعليمات الشركة الصانعة. لBD الفئران مكافحة CD31 الأجسام المضادة (0.5 ميكروغرام / ميكرولتر، وتستخدم لعزل الخلايا البطانية)، يتم إضافة 3 ميكرولتر الضد لكل ميكرولتر 25 حبات، لتركيز النهائي من 1.5 ميكروغرام الأجسام المضادة لمكافحة CD31 و 1 × 10 7 حبات / 25 ميكرولتر العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان حبات والأضداد بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li></ol> 2. إعداد لوحة الكولاجين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا معزولة تشكيل الأنابيب بسرعة أكبر عندما نمت على هلام الكولاجين بدلا من مجرد لوحة الكولاجين المغلفة. لذلك، مصنوعة المواد الهلامية الكولاجين في الليلة التي سبقت تشريح، كما هو موضح في 6. على الجليد في نسيج الثقافة هود، والجمع بين الكواشف التالية (ما يكفي لمدة 19 بئرا): 206.4 ميكرولتر H العقيمة &lt;الفرعية&gt; 2 O، 140.4 ميكرولتر نوع الكولاجين الأول (4.08 ملغ / مل)، 38.4 ميكرولتر 10X M199، و 1.15 ميكرولتر 5 M هيدروكسيد الصوديوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 20 ميكرولتر من هذا الجل الكولاجين في الآبار من 384 جيدا نسيج لوحة الثقافة. وضع لوحة في 37 درجة مئوية نسيج الثقافة الحاضنة لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 80 ميكرولتر DMEM إلى كل بئر واحتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. إزالة مستنبت وكرر مرتين أكثر من ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد شطف النهائي، إضافة 80 ميكرولتر 10٪ FBS / DMEM إلى كل بئر واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. إزالة مستنبت قبل إضافة الخلايا المعزولة. </li></ol> 3. المكوس وهضم القلب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الماوس توقيت الحوامل في اليوم الجنينية المطلوب باستخدام تقنية القتل الرحيم المعتمدة. تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل لجنة استخدام المؤسسات ورعاية الحيوان في جامعة ولاية كارولينا الشمالية في تشابل هيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع الماوس في موقف ضعيف، رش تحرري الجانب البطني من الأنثى مع الايثانول 70٪ قبلتشريح. باستخدام ملقط لرفع الجلد أسفل البطن والعضلات بعيدا عن الأعضاء الداخلية، وقطع فتح تجويف الأنثى في أسفل البطن لتصور أعضائه الداخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد عنق الرحم مع ملقط، وقطع بعناية الذيلية إلى ملقط والبدء في رفع قرن الرحم من تجويف البطن. في حين رفع قرن الرحم، وقطع بعيدا أي النسيج الضام الذي يحمل قرن في المكان. لإنهاء استئصال قرن الرحم، وقطع تقاطع قرن الرحم مع قناة البيض لتحرير قرن الرحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع قرن الرحم في طبق بتري تحتوي الباردة 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وشطف حسب الحاجة. خفض فتح قرن الرحم عن طريق خط الوسط لفضح الحويصلات الجنينية المرفقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض فتح الكيس الجنيني عند تقاطع المشيمة والجنين لتجنب قصد قطع الجنين واسترجاع الجنين. وضع الجنين في طبق بيتري الثانية مع برنامج تلفزيوني الباردة. العودة طبق بيتري مع قرن الرحم إلى جليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Decapitate الجنين لتحسين الوصول إلى جدار الصدر. إذا التنميط الجيني هو ضروري، وقطع الذيل لإزالته وحفظ في أنبوب إيبندورف وضعت على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع الجنين على ظهرها، وقطع فتح جدار الصدر لتصور القلب والرئتين. لتجنب قطع القلب، وجعل قطع عمودي على طول الجانب من القفص الصدري، بالقرب من forelimb، تليها قطع أفقي عبر الجزء السفلي من الأضلاع، ثم، وسحب بلطف جدار الصدر صعودا وللخروج من الطريق. من خلال ما يقرب من 13.5 يوم الجنينية، جدار الصدر هو شفاف، والمساعدة في التصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع بعناية القلب باستخدام ملقط وقطع الأوعية أدناه. ثم، وقطع فوق سفن كبيرة للافراج عن القلب. إذا لم يتم قطع الأوعية الرئوية، قد تتم إزالة الرئتين مع القلب. وهكذا، وإزالة أنسجة غريبة، مثل الرئتين، إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل وتجاهل السفن الأذينين والبطينين كبيرة من. باستخدام مقص، اللحم المفروم البطينين إلى قطع صغيرة (حوالي 1 ملم 3 &lt;/ سوب&gt;) ووضعت في ما يقرب من 500 ميكرولتر كولاجيناز (1 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني العقيمة). الاحتفاظ بعينات على الجليد حتى تم مفروم جميع البطينين ووضعها في كولاجيناز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات السابقة حتى يتم رفعه البطينين من جميع الأجنة، وجمع كل قلب في أنبوب إيبندورف منفصلة. إذا كان كل الأجنة لديها نفس التركيب الوراثي، قد يتم تجميع قلوب في أنبوب إيبندورف واحد. عدد العينات معالجتها في وقت واحد قد تكون محدودة استنادا إلى مغناطيس تستخدم لعزل، وDynaMag (123-21D) تستخدم هنا يحمل بحد أقصى 16 أنابيب إيبندورف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع البطينين المفروم عند 37 درجة مئوية مع هزاز لمدة 45 دقيقة. كل 15 دقيقة، وإزالة بلطف العينات وماصة صعودا وهبوطا لفصل ميكانيكيا الخلايا. </li></ol> 4. عزل الخلايا البطانية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمرير حل البطين للكولاجيناز خلال 70 ميكرون فلتر لإزالة كتل المتبقية من الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا في 400 x ج لمدة 10 دقيقة. نبذطاف، مع استبدال ما يقرب من 200 ميكرولتر FBS 10٪ في DMEM، وماصة صعودا وهبوطا لفصل الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة السابقة مرة واحدة. الطرد المركزي الخلايا في 400 x ج لمدة 10 دقيقة بعد الثانية 10٪ FBS / DMEM غسل. resuspend الخلايا في 50 ميكرولتر 10٪ FBS / DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء خطوة الطرد المركزي النهائية، وإعداد الخرز. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب إيبندورف التي تحتوي على الأجسام المضادة والخرز على مغناطيس لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع الأنبوب في مكان على المغناطيس، وإزالة طاف. إزالة أنبوب من المغناطيس وإضافة ما يقرب من 100 ميكرولتر 10٪ FBS / DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب على مغناطيس لمدة 1 دقيقة. إزالة طاف، ويغسل مرة أخرى مع 10٪ FBS / DMEM. تكرار لما مجموعه 3 يغسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل النهائي، resuspend والخرز الأجسام المضادة، مترافق في 10٪ FBS / DMEM (5 ميكرولتر لكل عينة). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى كل عينة الخلية، إضافة 5 ميكرولتر من الخرز الأجسام المضادة، مترافق. ضع تعليق حبة خلية في 4 درجات مئوية مع هزاز FOR 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في تدفق الصفحي هود، ووضع أنابيب إيبندورف تحتوي على خلايا والخرز الأجسام المضادة، مترافق على مغناطيس لمدة 1 دقيقة. إزالة طاف، وإزالة أنابيب من المغناطيس، ويغسل مع ما يقرب من 100 ميكرولتر 10٪ FBS / DMEM. كرر لمدة 5 يغسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل الماضي، وضع أنابيب على مغناطيس لمدة 1 دقيقة، وإزالة طاف، وإزالة أنابيب من المغناطيس. إضافة ما يقرب من 100 DMEM ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنابيب على مغناطيس لمدة 1 دقيقة، وإزالة طاف، وإزالة أنابيب من المغناطيس. prewarmed إضافة 100-200 ميكرولتر 0.25٪ التربسين EDTA-. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنابيب على مغناطيس لمدة 2 دقيقة. نقل بعناية طاف تحتوي الخلية الى أنابيب إيبندورف الطازجة. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 400 ز س. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف. resuspend الخلايا في 80-100 ميكرولتر متوسطة النمو وطبق في 96 - 384 أو جيدا طبق ثقافة المعالجة، اعتمادا على العائد المتوقع(حوالي 450-600 الخلايا من البطينين من E14.5-E16.5 الأجنة). لخلايا بطانة الأوعية الدموية، واستخدام البطانية نمو الثقافة المتوسطة (المعرف أدناه). </li></ol>

<ol>
	<li>Landecker, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing Life: How Cells Became Technologies. , (2007).</li><li>Kan, C. Y., Wen, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+dysfunction+and+cytoskeletal+changes+associated+with+repression+of+p16(INK4a)+during+immortalization.">Endothelial cell dysfunction and cytoskeletal changes associated with repression of p16(INK4a) during immortalization.</a> Oncogene. , (2012).</li><li>Dyer, L. A., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+endothelium:+an+emphasis+on+heterogeneity.">Development of the endothelium: an emphasis on heterogeneity.</a> Semin. Thromb. Hemost. 36, 227-235 (2010).</li><li>Dong, Q. G., Bernasconi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+strategy+for+isolation+of+endothelial+cells+from+murine+tissues.+Characterization+of+two+endothelial+cell+lines+from+the+murine+lung+and+subcutaneous+sponge+implants.">A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17, 1599-1604 (1997).</li><li>van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+endothelial+cells+from+fresh+tissues.">Isolation of endothelial cells from fresh tissues.</a> Nat. Protoc. 3, 1085-1091 (2008).</li><li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels:+a+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue.">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).</li><li>Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+angiogenesis:+endothelial+cell+tube+formation+on+gelled+basement+membrane+extract.">In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.</a> Nat. Protoc. 5, 628-635 (2010).</li><li>Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+in+kidney+fibrosis+emerge+via+endothelial-to-mesenchymal+transition.">Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition.</a> Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 19, 2282-2287 (2008).</li><li>Chang, L., Noseda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+vascular+smooth+muscle+cells+from+local+precursors+during+embryonic+and+adult+arteriogenesis+requires+Notch+signaling.">Differentiation of vascular smooth muscle cells from local precursors during embryonic and adult arteriogenesis requires Notch signaling.</a> PNAS. 109, 5993-6998 (2012).</li><li>Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., DeLisser, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+murine+lung+endothelial+cells.">Isolation of murine lung endothelial cells.</a> American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, L1095-L1103 (2009).</li><li>Frauli, M., Ludwig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+fibroblast+proliferation+in+a+culture+of+human+endometrial+stromal+cells+using+a+medium+containing+D-valine.">Inhibition of fibroblast proliferation in a culture of human endometrial stromal cells using a medium containing D-valine.</a> Archives of Gynecology and Obstetrics. , 241-96 (1987).</li><li>Lazzaro, V. A., Walker, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+fibroblast+proliferation+in+L-valine+reduced+selective+media.">Inhibition of fibroblast proliferation in L-valine reduced selective media.</a> Research communications in chemical pathology and pharmacology. 75, 39-48 (1992).</li><li>Arima, S., Nishiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+morphogenesis+driven+by+dynamic+and+heterogeneous+collective+endothelial+cell+movement.">Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement.</a> Development. 138, 4763-4776 (2011).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

العمل مع الخلايا الجنينية الأولية يسمح التجارب رواية لمعالجة في المختبر الخطوات الحاسمة للتنمية. ومع ذلك، فإن إجراء العزل ليست تافهة. وتشمل الخطوات الحاسمة لعزل أي نوع من الخلايا ضمان أن يتم فصل الخلايا بشكل جيد على الهضم كولاجيناز ثم أنهم علقت جيدا خلال خطوات ?...

ظهور خطوط الخلايا خلد قد أحدثت ثورة بيولوجيا الخلية الأساسية 1. وتستمد خطوط الخلايا المتوفرة حاليا من مجموعة واسعة من الأجهزة وتشمل جميع أنواع الخلايا الرئيسية. ومع ذلك، خطوط الخلايا التي أنشئت لديها بعض القيود. من الواضح أن عملية تخليد تغيير سلوك الخلايا، وتحديدا فيما يتعلق مدى الحياة والانتشار، ولكن يمكن أن تؤثر أيضا على التعبير عن البروتينات غير متوقعة، مثل البروتينات هيكل الخلية 2. وبالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن العديد من خطوط الخلايا المختلفة المتاحة، وهناك تنوع كبير بين حتى نوع خلية واحدة داخل الكائن الحي بأكمله. الخلايا البطانية على وجه الخصوص تظهر السلوكيات المتنوعة سواء كانت تقوم على خط الشرايين أو الأوردة وأي نوع من تدفق موجود في السفينة 3. حتى أكثر إلحاحا من منظور إنمائي، ومع ذلك، هو أن الغالبية العظمى من خطوط الخلايا المتاحة مستمدة من أنسجة البالغين (انظر، على سبيل المثال خميسوقال انه جمع متاحة عبر آي تي ​​سي سي). هذه خطوط الخلايا الكبار الأرجح لا ألخص الطبيعة الديناميكية لسلائفها الجنينية. ويتغير بسرعة الزمانية المكانية أنماط التعبير الجيني لوحظت خلال تطوير تشير أيضا إلى أن خلية البطانية من جهاز واحد في كل مرحلة تنموية معينة قد لا تتصرف بنفس الطريقة باعتبارها الخلية البطانية من نفس الجهاز في مرحلة تنموية مختلفة. كبديل لاستخدام المتاحة تجاريا خطوط الخلايا خلده، الخلايا الأولية يمكن أن تكون معزولة عن الأنسجة محددة من الفائدة. من بين مزايا هذه التقنية، وهذه الخلايا الأولية يمكن أن تكون معزولة عن جهاز معين أو حتى جزء من الجهاز في أي مرحلة تنموية محددة. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الخلايا الأولية يمكن أن تكون معزولة عن مجموعة واسعة من الحيوانات المعدلة وراثيا المتوفرة، مما يتيح دراسة في المختبر من خروج المغلوب الجينات والضربة القاضية في حين تجنب مشاكل أخرى مثل كفاءة ترنسفكأيشن للفي. ليس من المستغرب، وكثيروقد نشرت تقنيات بالتفصيل كيفية عزل أنواع معينة من الخلايا 4،5. بشكل عام، هذه التقنيات تشمل جمع المنطقة من الفائدة، وعدم الربط بين الخلايا، ووضع علامات على نوع من الخلايا محددة من الفائدة، وعزل تلك الخلايا لمزيد من التحليل. لدراسة السكان الجنينية المبكرة من الخلايا البطانية التاجي، ان قلصنا تقنية 4 التي تم نشرها مسبقا للاستخدام مع جهاز أصغر. مع هذا الإجراء تحجيم، يمكننا عزل الخلايا البطانية التاجية من القلب الجنينية في مراحل جنينية محددة. ويمكن بعد هذه الخلايا يمكن استخدامها في المقايسات البطانية التقليدية، مثل تحليلات الهجرة. حتى أوائل خطوط الخلايا الجنينية تصبح أكثر انتشارا، والعمل مع الخلايا الأولية هي تقنية لا تقدر بثمن.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Timed-pregnant mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To be dissected at the embryonic stage of interest</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-mouse CD31</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553370</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Rat IgG Dynabeads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>110-35</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Collagen</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Collagenase, type I</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Cellgro </td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich </td>
			<td>F2442 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Endothelial cell growth medium</td>
			<td>(made in lab as described in notes)</td>
			<td></td>
			<td>DMEM containing 20% FBS, 5 &mu;M &beta;-mercaptoethanol, 50 &mu;g/ml ECG, and 1x penicillin/streptomycin</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>&beta;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ECGS</td>
			<td>Biomedical Technologies, Inc.</td>
			<td>BT-203</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>384-well culture plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>T-3037-6</td>
			<td>Plate was prepared with a thin collagen gel, as described in 6; working surface area 10 mm2</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Collagen type I</td>
			<td>BD</td>
			<td>354236</td>
			<td>Use at a final concentration of 1.5 mg/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>M199, 10x</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11825-015</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Syto-16</td>
			<td>Invitrogen </td>
			<td>S7578 </td>
			<td>Used as directed in 13 </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stereoscopic microscope</td>
			<td>Nikon </td>
			<td>SMZ645</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo </td>
			<td>3110 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DynaMag</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>123-21D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Table-top centrifuge</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>75002430</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

isolation of embryonic ventricular endothelial cells

ثقافة الخلية عززت بشكل كبير من قدرتنا على تقييم السكان من الخلايا الفردية في ظل ظروف ثقافة لا تعد ولا تحصى. بينما خطوط الخلايا خلد توفر مزايا كبيرة لسهولة استخدامها، وهذه خطوط الخلايا غير متوفرة لجميع أنواع الخلايا المحتملة. من خلال عزل الخلايا الأولية من منطقة محددة من الفائدة، ولا سيما من الماوس المعدلة وراثيا، ودراسات أكثر دقة لا يمكن أن يؤديها. الأسلوب الذي ينطوي على تشريح الأساسية للجهاز أو الجهاز الجزئي للاهتمام (مثل القلب أو منطقة محددة من القلب) والفصل بين الجهاز إلى الخلايا واحد. ثم يتم تحضين هذه الخلايا مع حبات مغناطيسية مترافق إلى الأجسام المضادة التي تعترف نوع من الخلايا في المصالح. الخلايا من الفائدة يمكن أن ثم تكون معزولة مع استخدام المغناطيس، مع التربسين الحضانة قصيرة الانفصال الخلايا من الخرز. ويمكن بعد هذه الخلايا المعزولة يكون مثقف وتحليلها كما تريد. وقد تم تصميم هذه التقنية في الأصل لجهاز الماوس الكبارو لكن يمكن زيادتها بسهولة إلى أسفل للاستخدام مع أجهزة الجنينية، كما هو موضح هنا. لأن مصلحتنا هي في الأوعية الدموية التاجية النامية، أردنا أن دراسة هذه الفئة من السكان من الخلايا الجنينية خلال مراحل محددة. وهكذا، فإن البروتوكول الأصلي إلى تعديل لتكون متوافقة مع صغر حجم البطينين الجنينية والعائد قدرة منخفضة من الخلايا البطانية في هذه المراحل التنموية. الاستفادة من هذا النهج تحجيم، قمنا بتقييم التاجي الضفيرة إعادة عرض في المعدلة وراثيا الجنينية الخلايا البطانية البطين.

استخدام أجسام مضادة محددة البطانية التي تعترف CD31، تم عزل الخلايا البطانية من البطينين من الجنينية (E) 13.5 (الشكل 1A) و 18.5 (أرقام 1B-1D) الأجنة. عندما نمت على طبق ثقافة غير المعالجة، تبقى هذه الخلايا تقريب وسوف تشكل نمطا حصوه إذا قرب متموجة (الشكل 1A).</stron...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells at JoVE.com

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

ثقافة الخلية الأولية هي تقنية مفيدة لتحليل فئات معينة من السكان من الخلايا، لا سيما من أجنة الفئران المعدلة وراثيا في مراحل نمو محددة. هنا، يتم تشريح البطينين الجنينية وفصلها، والخرز الأجسام المضادة، مترافق الاعتراف وفصل الخلايا البطانية لمزيد من التحليل.

عزلة الجنينية البطيني الخلايا البطانية

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

isolation-of-embryonic-ventricular-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

9.3K Views.  University of North Carolina at Chapel Hill. ثقافة الخلية الأولية هي تقنية مفيدة لتحليل فئات معينة من السكان من الخلايا، لا سيما من أجنة الفئران المعدلة وراثيا في مراحل نمو محددة. هنا، يتم تشريح البطينين الجنينية وفصلها، والخرز الأجسام المضادة، مترافق الاعتراف وفصل الخلايا البطانية لمزيد من التحليل.

Video: Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

عزل خلايا الإنسان الوريد السري غشائي (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This pathology causes symptoms such as intermittent claudication (pain with walking), painful ischemic ulcerations, or even limb-threatening gangrene. It is generally believed that the vascular endothelium, a monolayer of endothelial cells that invests the luminal surface of all blood and lymphatic vessels, plays a dominant role in vascular homeostasis and vascular regeneration. As a result, stem cell-based regeneration of the endothelium may be a promising approach for treating PAD.In this video, we demonstrate the transplantation of embryonic stem cell (ESC)-derived endothelial cells for treatment of unilateral hindimb ischemia as a model of PAD, followed by non-invasive tracking of cell homing and survival by bioluminescence imaging. The specific materials and procedures for cell delivery and imaging will be described. This protocol follows another publication in describing the induction of hindlimb ischemia by Niiyama et al.1

The surgical procedure for delivery of embryonic stem cell-derived endothelial cells to the ischemic hindlimb is demonstrated, with non-invasive tracking by bioluminescence imaging.

الخلايا الجذعية الجنينية المستمدة من الخلايا البطانية لعلاج نقص التروية Hindlimb

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

العزلة واشتقاق خلايا الفأر الجنينية بيرشوت

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

عزل الخلايا البطانية صمامي

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of endocardium surrounded by myocardium. The myocardium secretes cardiac jelly, a hyaluronan-rich gelatinous matrix, into the atrioventricular (AV) junction and outflow tract (OFT) lumen. At stage HH14 valvulogenesis begins when a subset of endocardial cells receive signals from the myocardium, undergo endocardial to mesenchymal transformation (EMT), and invade the cardiac jelly. At stage HH25 the valvular cushions are fully mesenchymalized, and it is this mesenchyme that eventually forms the valvular and septal apparatus of the heart. Understanding the mechanisms that initiate and modulate the process of EMT and cell differentiation are important because of their connection to serious congenital heart defects. In this study we present methods to isolate pre-EMT endocardial and post-EMT mesenchymal cells, which are the two different cell phenotypes of the prevalvular cushion. Pre-EMT endocardial cells can be cultured with or without the myocardium. Post-EMT AV cushion mesenchymal cells can be cultured inside mechanically constrained or stress-free collagen gels. These 3D in vitro models mimic key valvular morphogenic events and are useful for deconstructing the mechanisms of early and late stage valvulogenesis.

This article will provide a method for isolating and culturing quail or chicken HH14- valve endocardial cells and HH25 valve cushion mesenchymal cells.

العزلة وثقافة الطيور الجنينية الخلايا الاصلية صمامي

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

العزلة والثقافة في الخلايا البطانية الرئوي من الفئران حديثي الولادة

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

عزل خلايا الفئران صمام غشائي

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

العزلة والثقافة الابتدائية من خلايا الفأر الأورطي غشائي

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

عزل خلايا الفأر التاجي غشائي

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

عزل الخلايا العضلية الأذينية والبطينية عالية الجودة للقياسات المتزامنة لتيار الكالسيوم2+ العابر وتيار الكالسيوم من النوع L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...