فإن الكتاب أود أن أشكر مايكل اندرسون لإقامة في المختبر لي هذه الطرق المقبولة لدراسة الحيوانات المنوية مع مشورة الخبراء من كارين هيلز. H. أودا وY. أكياما-أودا قدمت بسخاء γ-تويولين-GFP تطير الأوراق المالية. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01 منحة لLAL (GM074044).

1. تشريح الخصيتين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الذباب في زجاجة أو قارورة باستخدام تيار من ثاني أكسيد الكربون 2 ونقل إلى لوحة الطاير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نوع الذباب تحت المجهر تشريح باستخدام الفرشاة الصغيرة، وجمع عدد مناسب (اعتمادا على التجربة) من الذكور ذبابة الفاكهة من المورثات المطلوب. الشباب الذكور (0-2 أيام من العمر) تعتبر مثالية لفحص الخلايا في جميع أنحاء المراحل السابقة من الحيوانات المنوية (مثل أمهات المني، الخلايا المنوية، وأوائل طلائع منوية بعد الانتصافي)، في حين أن الذكور الأكبر سنا قليلا (2-5 يوما) هي مثالية لدراسة الخلايا في المراحل النهائية من الحيوانات المنوية (على وجه الخصوص، تنضج الحيوانات المنوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط لإزالة الأجنحة من كل يطير (لمنع الذباب من عائمة في السائل خلال تشريح). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ~ 500 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (130 ملي مول كلوريد الصوديوم، 7 ملم نا 2 هبو 4، 3 ملم ناه 2 ص 4؛ PBS) في قطرة إلى طبق تشريح المغلفة سيليكون علىخلفية سوداء. وقد استخدمت المحاليل المائية الأخرى بنجاح لتشريح الخصيتين 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقطة ملقط نحو الأمامي للذبابة، فهم من قبل الصدر، وتزج به في الانخفاض برنامج تلفزيوني. أثناء عرض من خلال مجهر تشريح، واستخدام زوج آخر من ملقط لفهم وسحب الأعضاء التناسلية الخارجية (هيكل البني الداكن تقع في نهاية الخلفي من البطن بطني) الخلف حتى يفصل من البطن. في معظم الحالات، سيتم إزالة الخصيتين والحويصلات المنوية، والغدة التبعي من البطن جنبا إلى جنب مع الأعضاء التناسلية الخارجية، وإذا لم يكن كذلك، اضافة الى وجود زوج واحد من ملقط في البطن وندف من الخصيتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخصيتين منفصلة من الغدة الإكسسوارات والأعضاء التناسلية الخارجية باستخدام اثنين من أزواج من ملقط في انخفاض PBS (الشكل 2). وتتميز البرية من نوع الخصيتين بسهولة من الأنسجة البيضاء المجاورة عن طريق لونها أصفر. الشروع فورا في الخطوة 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لعزل الخصيتين من الذكور pharate (ط<html> . البريد المغلقة داخل حالة العذراء)، يجب أولا أن يتم تنفيذ خطوة إضافية التي تنطوي على إزالة ذبابة من حالة العذراء، وقد تم هذه الخطوة هو موضح سابقا في مكان آخر 31. المضي قدما في تشريح أما الخصيتين الكبار تبدأ في الخطوة 1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لعزل الخصيتين من الذكور اليرقات، إجراء تعديل على بروتوكول للعزل المبايض اليرقات ذبابة الفاكهة 32. لفترة وجيزة، يرقات الذكور يمكن تمييزها عن يرقات الإناث من خلال وجود زوج من، واضحة، والهياكل بيضاوية كبيرة (الخصيتين اليرقات) جزءا لا يتجزأ في الثلث الخلفي من الدهون في الجسم. لعزل اليرقات الخصيتين، سلخ جزئيا فتح يرقة الذكور إلى عزل الخصيتين والدهون في الجسم المحيطة من البطن كما هو موضح لعزل اليرقات المبايض. الشروع فورا في الخطوة 2 من بروتوكول الموصوفة هنا، ويمكن في وقت لاحق يتم إزالة الخصيتين من الجسم الدهون فقط قبل تركيب (2.3 أو 3.14 خطوات) كما هو موضح في المبايض 32. </li></ol>ق ق = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. تحضير العينة وتصوير لايف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام زوج من ملقط لوضع بلطف 2-3 أزواج من الخصيتين في قطرة من 4-5 مل من برنامج تلفزيوني على غطاء زجاجي مربع الانزلاق. نلاحظ أن نسبة عدد الخصيتين للحجم PBS قد تحتاج إلى تعديل: سوف الكثير من السائل منع الخلايا من الانتشار بشكل صحيح عندما سحق، في حين أن السائل القليل جدا سوف يسبب الخلايا لتنفجر عندما ممرود. اختياري: استخدام الغطاء siliconized زلات لتقليل الالتزام من الأنسجة لتغطية الانزلاق في الخطوة 3.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام زوج من ملقط لتمزيق مفتوحة لكل الخصية في الموقف المناسب وذلك لتحقيق أقصى قدر من وجود أنواع الخلايا سلالة الجرثومية المطلوب في إعداد (لاحظ أن محتويات الخصية سوف معظمهم من الخروج من المنطقة التي مزقتها على الشريحة أثناء السحق الخطوة.) لإثراء لأمهات المني والخلايا المنوية، المسيل للدموع فتح الخصية المجاورة للطرف القمي في (مستوى 1، الشكل 2B). لإثراء لالمنوية وطلائع منوية، المسيل للدموع فتح الخصية في نقاط البيعition القاعدية قليلا إلى المستوى 1 (مستوى 2، الشكل 2B). لإثراء للخلايا سلالة الجرثومية أكثر نضجا، المسيل للدموع مفتوحة الخصية أقرب إلى حيث يبدأ انحناء (المستوى 3، الشكل 2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع بلطف شريحة المجهر والزجاج على زلة غطاء لسحق الخصيتين، لا الضغط يدويا كما وزن الغطاء زلة وحده يكفي للحصول على عينة ممرود بشكل صحيح. في محاولة لتجنب احتباس فقاعات الهواء. اختياري: استخدام بولي-L-يسين المغلفة شرائح المجهر لتشجيع الانضمام من الأنسجة إلى الشريحة في الخطوة 3.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام إعداد فورا (مثالي في غضون 15 دقيقة من إعداد) لمراقبة الخلايا الحية من قبل على النقيض من المرحلة المجهري، على الذباب المعدلة وراثيا مع التعبير عن البروتينات الموسومة fluorescently في الخصيتين، والخلايا الحية يمكن دراستها بواسطة المجهر مضان في هذه الخطوة. بدلا من ذلك، المضي قدما في تثبيت وتلوين الأجسام المضادة (بروتوكول 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفتيل بلطف أي السائل الزائد من تحت ساترة باستخدام تنظيف ثبورصة البترول الدولية للسماح تسطيح من التحضير، حتى الخلايا الجرثومية بشكل واضح في التركيز. </li></ol> 3. الفورمالديهايد تثبيت وتلوين الأجسام المضادة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المفاجئة تجميد كل شريحة تحتوي على الخصيتين ممرود (من البروتوكول 2) باستخدام زوج من ملقط معدني لتزج به لفترة وجيزة في النيتروجين السائل (حتى يتوقف النيتروجين السائل محتدما). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الغطاء زلة فورا باستخدام شفرة حلاقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط معدني لنقل الشرائح إلى رف شريحة زجاجية prechilled مليئة الجليد الباردة الايثانول 95٪ (الصف الطيفي، خالية من الميثانول). تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط معدني لنقل الشرائح إلى رف شريحة زجاجية مملوءة 4٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى 0.1٪ تريتون X-100 (PBS-T). تخزين في درجة حرارة الغرفة لمدة 7 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط معدني لنقل الشرائح إلى رف شريحة زجاجية مليئة برنامج تلفزيوني. تغسل الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر 1X. تنفيذ كافة يغسل عن طريق تجاهل الحل في رف شريحة زجاجية ( <em&gt; مثال. بصب بها) واستبدالها مع حل جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل برنامج تلفزيوني وتزج الشرائح في برنامج تلفزيوني-T لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لpermeabilize أغشية الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تكرار 2X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عرقلة الخطوة (اختياري): تزج الشرائح في برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى 1٪ BSA لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام القلم حاجز مسعور لرسم دائرة على الشريحة في جميع أنحاء الأنسجة ممرود (مرئية بسهولة بالعين) من أجل حصر الحلول الضد (المضافة في الخطوات 3.9 و 3.11). يجب أن تبقى الأنسجة رطبة في جميع الأوقات أثناء أداء المناعية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 30-40 مل من الأجسام المضادة الأولية (المخفف في PBS-T، 1:400 إلى 1:50، اعتمادا على الضد) إلى الأنسجة داخل الدائرة. إذا تم تنفيذ حظر، تمييع الأجسام المضادة الأولية في برنامج تلفزيوني-T زائد 1٪ BSA. تم تخفيفه المضادة للأشعة غاما تويولين الضد (لتلطيخ centrosomes في الشكل 4) 1:100. احتضان في رطبة، غرفة مظلمة (على سبيل المثال. علبة بلاستيكية مغلقةمع المناشف مبللة ورقة) لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة 3X. إذا تم تنفيذ حظر، يغسل مرتين في برنامج تلفزيوني-T ومرة ​​واحدة في برنامج تلفزيوني (5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لكل منهما). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 30-40 مل من fluorophore مترافق الضد الثانوية (1:400 المخفف في برنامج تلفزيوني) إلى الأنسجة واحتضان في الظلام لمدة 1-2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تكرار 2X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 30-40 مل من دابي الحل (0.2 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني) إلى الأنسجة داخل الدائرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع بلطف زلة غطاء زجاجي على الأنسجة، مع الحرص على تجنب احتباس فقاعات الهواء. إذا يجب أن تظهر فقاعات الهواء، تحرك بحذر حول انزلاق الغطاء دون تدمير الاسكواش حتى الفقاعات الهروب من جانبي انزلاق الغطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام تنظيف مسح لطخة الزائدة دابي من حواف الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم زلة تغطية إلى الشريحة باستخدام طلاء الأظافر واضحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام هذا المستحضرداخل ساعة القادمة 3-4 لعرض الخلايا immunostained بواسطة المجهر الفلورسنت. للتخزين على المدى الطويل من الشرائح (تصل إلى عدة أسابيع على الأقل)، واستخدام وسائل الاعلام من الصعب القائم على جبل الجلسرين مع دابي، وتخزين الشرائح في -20 ˚ C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدلا من ذلك، وتحديد العينات في الميثانول بدلا من الفورمالديهايد (اعتمادا على مستضد). بعد الانتهاء من البروتوكول بأكمله من خلال الخطوة 3.2، تزج الشرائح من الخصيتين ممرود في الميثانول لمدة 10 دقيقة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية، والمضي قدما في الخطوة 3.5 فصاعدا. </li></ol>

<ol>
	<li>McKim, K. S., Joyce, E. F., Jang, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+analysis+of+meiosis+in+fixed+Drosophila+ovaries.">Cytological analysis of meiosis in fixed Drosophila ovaries.</a> Methods Mol. Biol. 558, 197-216 (2009).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging.">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M., Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila Protocols. , 87-109 (2000).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunostaining+of+Drosophila+testes.">Immunostaining of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1273-1275 (2011).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methanol-acetone+fixation+of+Drosophila+testes.">Methanol-acetone fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1270-1272 (2011).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+live+testis+squashes+in+Drosophila.">Preparation of live testis squashes in Drosophila.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, (2011).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+fixation+of+Drosophila+testes.">Formaldehyde fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, (2012).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraformaldehyde+fixation+of+Drosophila+testes.">Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 102-104 (2012).</li><li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F-actin+staining+of+Drosophila+testes.">F-actin staining of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 105-106 (2012).</li><li>Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescence+imaging+of+whole-mount+Drosophila+testes+for+studying+spermatogenesis.">Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis.</a> Anal. Biochem. 436, 55-64 (2013).</li><li>Singh, S. R., Hou, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistological+techniques+for+studying+the+Drosophila+male+germline+stem+cell.">Immunohistological techniques for studying the Drosophila male germline stem cell.</a> Methods Mol. Biol. 450, 45-59 (2008).</li><li>Zamore, P. D., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Drosophila+melanogaster+Testes.">Isolation of Drosophila melanogaster Testes.</a> J. Vis. Exp. (2641), (2011).</li><li>de Cuevas, M., Matunis, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stem+cell+niche:+lessons+from+the+Drosophila+testis.">The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis.</a> Development. 138, 2861-2869 (2011).</li><li>Fabian, L., Brill, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+spermiogenesis:+Big+things+come+from+little+packages.">Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages.</a> Spermatogenesis. 2, 197-212 (2012).</li><li>Giansanti, M. G., Sechi, S., Frappaolo, A., Belloni, G., Piergentili, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis+in+Drosophila+male+meiosis.">Cytokinesis in Drosophila male meiosis.</a> Spermatogenesis. 2, 185-196 (2012).</li><li>Matunis, E. L., Stine, R. R., de Cuevas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+Drosophila+male+germline+stem+cell+biology.">Recent advances in Drosophila male germline stem cell biology.</a> Spermatogenesis. 2, 137-144 (2012).</li><li>McKee, B. D., Yan, R., Tsai, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+in+male+Drosophila.">Meiosis in male Drosophila.</a> Spermatogenesis. 2, 167-184 (2012).</li><li>Zoller, R., Schulz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+cyst+stem+cell+lineage:+Partners+behind+the+scenes.">The Drosophila cyst stem cell lineage: Partners behind the scenes.</a> Spermatogenesis. 2, 145-157 (2012).</li><li>Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+and+microtubule+organization+during+premeiotic,+meiotic+and+early+postmeiotic+stages+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis.">Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis.</a> J. Cell Sci.. 107, 3521-3534 (1994).</li><li>Rebollo, E., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+spindle+checkpoint+in+Drosophila+spermatocytes.">Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes.</a> EMBO Rep. 1, 65-70 (2000).</li><li>Castrillon, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+molecular+genetic+analysis+of+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster:+characterization+of+male-sterile+mutants+generated+by+single+P+element+mutagenesis.">Toward a molecular genetic analysis of spermatogenesis in Drosophila melanogaster: characterization of male-sterile mutants generated by single P element mutagenesis.</a> Genetics. 135, 489-505 (1993).</li><li>Giansanti, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+meiotic+cytokinesis+in+Drosophila+males.">Genetic dissection of meiotic cytokinesis in Drosophila males.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 2509-2522 (2004).</li><li>Wakimoto, B. T., Lindsley, D. L., Herrera, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+comprehensive+genetic+analysis+of+male+fertility+in+Drosophila+melanogaster.">Toward a comprehensive genetic analysis of male fertility in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 167, 207-216 (2004).</li><li>Fuller, M. T., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 71-147 (1993).</li><li>Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tokens+of+love:+functions+and+regulation+of+Drosophila+male+accessory+gland+products.">Tokens of love: functions and regulation of Drosophila male accessory gland products.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 179-192 (1997).</li><li>Tram, U., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+seminal+fluid+proteins+are+essential+for+sperm+storage+in+Drosophila+melanogaster.">Male seminal fluid proteins are essential for sperm storage in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 153, 837-844 (1999).</li><li>Kemphues, K. J., Raff, E. C., Raff, R. A., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+in+a+testis-specific+beta-tubulin+in+Drosophila:+analysis+of+its+effects+on+meiosis+and+map+location+of+the+gene.">Mutation in a testis-specific beta-tubulin in Drosophila: analysis of its effects on meiosis and map location of the gene.</a> Cell. 21, 445-451 (1980).</li><li>Gunsalus, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+twinstar,+a+Drosophila+gene+encoding+a+cofilin/ADF+homologue,+result+in+defects+in+centrosome+migration+and+cytokinesis.">Mutations in twinstar, a Drosophila gene encoding a cofilin/ADF homologue, result in defects in centrosome migration and cytokinesis.</a> J. Cell Biol. 131, 1243-1259 (1995).</li><li>Anderson, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asunder+is+a+critical+regulator+of+dynein-dynactin+localization+during+Drosophila+spermatogenesis.">Asunder is a critical regulator of dynein-dynactin localization during Drosophila spermatogenesis.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 2709-2721 (2009).</li><li>Sitaram, P., Anderson, M. A., Jodoin, J. N., Lee, E., Lee, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+dynein+localization+and+centrosome+positioning+by+Lis-1+and+asunder+during+Drosophila+spermatogenesis.">Regulation of dynein localization and centrosome positioning by Lis-1 and asunder during Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 139, 2945-2954 (2012).</li><li>Martins, A. R., Machado, P., Callaini, G., Bettencourt-Dias, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+methods+for+the+study+of+centriole+biogenesis+and+function+in+Drosophila.">Microscopy methods for the study of centriole biogenesis and function in Drosophila.</a> Methods in cell biology. 97, 223-242 (2010).</li><li>Maimon, I., Gilboa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+staining+of+Drosophila+larval+ovaries.">Dissection and staining of Drosophila larval ovaries.</a> J. Vis. Exp. (10), (2011).</li><li>Gonzalez, C., Casal, J., Ripoll, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+chromosome+content+and+nuclear+diameter+in+early+spermatids+of+Drosophila+melanogaster.">Relationship between chromosome content and nuclear diameter in early spermatids of Drosophila melanogaster.</a> Genet. Res. 54, 205-212 (1989).</li><li>Liebrich, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+cytochalasin+B+and+colchicine+on+the+morphogenesis+of+mitochondria+in+Drosophila+hydei+during+meiosis+and+early+spermiogenesis.+An+in+vitro+study.">The effects of cytochalasin B and colchicine on the morphogenesis of mitochondria in Drosophila hydei during meiosis and early spermiogenesis. An in vitro study.</a> Cell Tissue. Res. 224, 161-168 (1982).</li><li>Wong, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIP2+hydrolysis+and+calcium+release+are+required+for+cytokinesis+in+Drosophila+spermatocytes.">PIP2 hydrolysis and calcium release are required for cytokinesis in Drosophila spermatocytes.</a> Curr. Biol. 15, 1401-1406 (2005).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+cell+type+and+stage-specific+ectopic+gene+expression+and+RNAi+induction+in+the+Drosophila+testis.">Tissue cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis.</a> Spermatogenesis. 2, 11-22 (2012).</li><li>Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+noncentrosomal+microtubules+to+spindle+assembly+in+Drosophila+spermatocytes.">Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes.</a> PLoS Biol. 2, (2004).</li><li>Cheng, J., Hunt, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+live+imaging+of+stem+cells+in+Drosophila+testis.">Time-lapse live imaging of stem cells in Drosophila testis.</a> Curr. Protoc. Stem Cell. Biol.. 2, 10-1002 (2009).</li><li>Sheng, X. R., Matunis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+Drosophila+spermatogonial+stem+cell+niche+reveals+novel+mechanisms+regulating+germline+stem+cell+output.">Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output.</a> Development. 138, 3367-3376 (2011).</li><li>Belloni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Cog7+affect+Golgi+structure,+meiotic+cytokinesis+and+sperm+development+during+Drosophila+spermatogenesis.">Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis.</a> J. Cell Sci. 125, 5441-5452 (2012).</li><li>Moon, S., Cho, B., Min, S. H., Lee, D., Chung, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+THO+complex+is+required+for+nucleolar+integrity+in+Drosophila+spermatocytes.">The THO complex is required for nucleolar integrity in Drosophila spermatocytes.</a> Development. 138, 3835-3845 (2011).</li><li>Wang, Z., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+two+nearly+identical+TGIF-related+homeobox+genes+in+Drosophila+spermatogenesis.">Requirement for two nearly identical TGIF-related homeobox genes in Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 130, 2853-2865 (2003).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

على الرغم من أن الخصيتين من نوع البرية الذباب يمكن تحديدها بسهولة بسبب اللون الأصفر بهم (على النقيض من الأنسجة البيضاء المجاورة)، الخصيتين متحولة من الذباب الأبيض هم من البيض، وبالتالي يمكن أحيانا أن الخلط بينه وبين القناة الهضمية. سلالات معظم المعدلة وراثيا، ا...

الخصيتين ذبابة الفاكهة هي نظام نموذج مثالي لدراسة العديد من العمليات البيولوجية بما في ذلك تنظيم الخلايا الجذعية، والانقسام الاختزالي، وتطوير الحيوانات المنوية 13-18. والخلايا المنوية ومغزل على الانتصافي كبيرة وبالتالي مريحة للتحليل الخلوي، واسترخاء نقاط التفتيش خلال دورة الخلية الحيوانات المنوية تيسير دراسة الطفرات في الجينات دورة الخلية. أنواع مختلفة من الخلايا يمكن ملاحظة التقدم في أمر على طول الخصيتين، وأي خلل في الحيوانات المنوية يمكن أن يؤدي إلى تغييرات في هذا الترتيب العام. هذه الميزات جنبا إلى جنب مع الأدوات الوراثية ذبابة الفاكهة قد سهلت تحليل طفرية من الحيوانات المنوية 21-23. وقد تم تحديد مراحل تكوين الحيوانات المنوية ذبابة الفاكهة جيدا. خلايا سلالة الجرثومية التي تتطور بشكل متزامن داخل الخراجات بالتتابع تقدم من خلال مراحل تكوين الحيوانات المنوية على طول الخصية. خلال بوعشر والإنقسامية والانقسامات الانتصافي من الخلايا الجرثومية الذكور، يحدث الانقسام السيتوبلازمي مثل هذه غير كامل أن الخلايا الوليدة لا تزال متصلة بواسطة جسور حشوية المعروفة باسم قنوات حلقة (الشكل 1). غيض من قمية الخصية يحتوي على السكان من الخلايا الجذعية سلالة الجرثومية التي تؤدي إلى خلايا النطفة، التي تخضع لأربعة أقسام الإنقسامية مع الانقسام السيتوبلازمي غير مكتملة لتوليد الخراجات 16 خلية من الخلايا المنوية الأولية. بعد المرحلة S السابق للانتصاف، الخلايا المنوية الأولية أدخل G2، وهي فترة طويلة من النمو الذي يزيد من حجم ~ ~ الخلوية 25 أضعاف خلال 90 ساعة. التقدم من خلال الانقسام الاختزالي الأول والانقسام الاختزالي الثاني النتائج في تشكيل الخراجات 32 خلية من الخلايا المنوية الثانوية والخراجات 64 خلية من طلائع منوية فرداني، على التوالي. غير ناضجة، طلائع منوية الجولة الخضوع لإعادة عرض الخلوية واسعة لتشكيل الحيوانات المنوية الناضجة. الخلايا بعد الانتصافي، ولا سيما حزم من التمطيط وطلائع منوية ناضجة، تحتل جزءا كبيرا من حجم الخصية. Tوقال انه نقل ناجحة من الحيوانات المنوية وظيفية لالذباب الإناث يتطلب التنسيق بين أجزاء مختلفة من الجهاز التناسلي الذكري، والتي تتألف من العديد من الهياكل تقرن (الخصيتين والحويصلات المنوية والغدد ملحق) والقناة قذفي واحد (الشكل 2). ويتم إنتاج الحيوانات المنوية داخل الخصيتين وتخزينها داخل الحويصلات المنوية حتى الجماع 24. الغدد التبعي تحتوي على خلايا إفرازية التي تنتج السائل المنوي. الحيوانات المنوية المهاجرة من الحويصلات المنوية تختلط مع السائل المنوي داخل القناة قذفي، التي يتم توصيلها إلى كل من الحويصلات المنوية والغدد التبعي. هذا الخليط من الحيوانات المنوية والسائل المنوي ويتم ضخ في نهاية المطاف للخروج من الذكور في المهبل من الإناث تطير من خلال لمبة قذفي تقع في نهاية الخلفي من البطن الذكور 25. البروتينات داخل السائل المنوي ضرورية لتخزين لفترة طويلة من الحيوانات المنوية داخل الأجهزة المتخصصة المعروفة باسم spermathecae في مندوبالمسالك roductive الإناث ذبابة الفاكهة 26. تتوفر طرق ممتازة لعزل الخصيتين ذبابة الفاكهة والتصور من الخلايا في مراحل مختلفة من الحيوانات المنوية في الكتابات العلمية 3-12. نحن هنا لإضافة هذه الهيئة من المعرفة من خلال تقديم أمثلة من هذه البروتوكولات مع مظاهرة الفيديو المرفقة. ويستند بروتوكول لإعداد الخصيتين الحية عينات للمرحلة التباين المجهري على الطريقة الموصوفة سابقا 27. ويستند بروتوكول لتثبيت الفورمالديهايد والمناعية من الخصيتين أيضا على الطريقة الموصوفة سابقا 28. وقد استخدمت الأساليب الموصوفة هنا في العديد من الدراسات من ذبابة الفاكهة الحيوانات المنوية (على سبيل المثال، لتقييم أدوار داينين، أنيبيب المحركات الموجهة ناقص نهاية، خلال ذبابة الفاكهة الحيوانات المنوية). بالإضافة إلى البروتوكولات الأساسية، وتقدم اقتراحات لvaryinز تشريح وذلك لإثراء للأمهات المني، الخلايا المنوية، أو الحيوانات المنوية الناضجة. طرق مختلفة لمعالجة الخصيتين بحيث الخراجات إما لا تزال سليمة أو تتعطل حسب الحاجة موصوفة. ميزة في استخدام الخصيتين ذبابة الفاكهة كنظام نموذج هو أنه، بالمقارنة مع البويضات والأجنة ذبابة الفاكهة، والأجسام المضادة والأصباغ يمكن بسهولة اختراق الخلايا التالية تشتتهم من الخصيتين، وأقل مطلوبة الخطوات الغسيل، وبالتالي، لا يمكن أن يؤديها البروتوكولات في نسبيا وقت قصير.

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish</td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9888126</td><td>Ted Pella #22309</td></tr><tr><td>Clear nail protector</td><td>Wet n Wild</td><td>7780235001</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6557</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC61511-0040</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>16% Formaldehyde</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2</td><td>Use according to manufacturer&#039;s directions to siliconize cover slips</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9542</td><td>0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Research Products International Corp.</td><td>S23020</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes delicate task wipers</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47299</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Research Products International Corp.</td><td>A30075</td><td>Molecular biology grade</td></tr><tr><td>Glass Coplin staining jar, screw cap</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70315</td><td></td></tr><tr><td>Single frosted microscope slides</td><td>Corning</td><td>2948-75X25</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine coated microscope slides</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>22247-1</td><td>Optional (to replace untreated microscope slides )</td></tr><tr><td>Square cover glass</td><td>Corning</td><td>2865-22</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Kimax Petri dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>S31473</td><td>Kimble #23060 10015 EMD</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dumont</td><td>52100-51S</td><td>Pattern 5 INOX</td></tr><tr><td>Stemi 2000-CS stereoscope</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse 80i</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Fluor 40X objective</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiophot</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Neofluar Ph2 40X objective</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cytological analysis of spermatogenesis: live and fixed preparations of drosophila testes

ذبابة الفاكهة السوداء البطن هو نظام نموذجي القوية التي استخدمت على نطاق واسع لتوضيح مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية. على سبيل المثال، ساهمت الدراسات كل من الإناث والذكور خطوط الجرثومية من ذبابة الفاكهة إلى حد كبير في الفهم الحالي للالانقسام الاختزالي وكذلك بيولوجيا الخلايا الجذعية. تتوفر بروتوكولات ممتازة في الأدب لعزل والتصوير من المبيضين والخصيتين ذبابة الفاكهة 3-12. هنا، يتم وصف طرق للتشريح وإعداد الخصيتين ذبابة الفاكهة لتحليل مجهري مع مظاهرة الفيديو المرفقة. يتم عرض بروتوكول للعزل الخصيتين من البطن من الذكور البالغين وإعداد الشرائح من الأنسجة الحية لتحليلها من قبل على النقيض من المرحلة المجهري وكذلك بروتوكول لتحديد والمناعية الخصيتين لتحليلها من قبل مضان المجهري. هذه التقنيات يمكن تطبيقها في توصيف المسوخ ذبابة الفاكهة الذي يحمل دefects في الحيوانات المنوية وكذلك في تصور تعريب التحت خلوية من البروتينات.

ويرد مثال على الزوج تشريح بشكل صحيح من ذبابة الفاكهة الذكور الأجهزة التناسلية في الشكل 2A. وترد الخصيتين إزالتها من البطن من الكبار ذبابة الذكور عادة إلى القناة قذفي (البني والشكل 2A &#39;) وزوج من الغدد التبعي (الأخضر والشكل 2A&#39;) عن طريق ز...

Watch this Scientific Journal Video about Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes at JoVE.com

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

وصفت وسائل لعزل وإعداد ذبابة الفاكهة الخصيتين عينات (العيش وثابتة) للتصوير من قبل على النقيض من المرحلة ومضان المجهري في هذه الوثيقة.

تحليل الخلوي الحيوانات المنوية: الأعمال التحضيرية لايف والثابتة من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الخصية

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

cytological-analysis-spermatogenesis-live-fixed-preparations

Research

JoVE Journal

Biology

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

26.1K Views.  Vanderbilt University Medical Center.  وصفت وسائل لعزل وإعداد ذبابة الفاكهة الخصيتين عينات (العيش وثابتة) للتصوير من قبل على النقيض من المرحلة ومضان المجهري في هذه الوثيقة. 

Video: Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been preserved, freshly removed, or excised but kept viable, as in slice preparations of brain tissue.  Subsequent microscopic studies of this material can be challenging, as the tissue samples may be difficult to handle.  Demonstrated here is a method for obtaining thin cryostat sections of tissue with a thickness that may range from 0.2-5.0 mm.  We routinely cut 400 micron thick Vibratome brain slices serially into 5-10 micron coronal cryostat sections.  The slices are typically first used for electrophysiology experiments and then require microscopic analysis of the cytoarchitecture of the region from which the recordings were observed.  We have constructed a simple device that allows controlled and reproducible preparation and positioning of the tissue slice.  This device consists of a cylinder 5 cm in length with a diameter of 1.2 cm, which serves as a freezing stage for the slice.  A ring snugly slides over the cylinder providing walls around the slice allowing the tissue to be immersed in freezing compound (e.g., OCT).  This is then quickly frozen with crushed dry ice and the resulting  wafer  can be position easily for cryostat sectioning.  Thin sections can be thaw-mounted onto coated slides to allow further studies to be performed, such as various staining methods, in situ hybridization, or immunohistochemistry, as demonstrated here.

The present method allows reproducible cryostat sectioning of small, difficult-to-manage, tissue pieces, such as biopsies and brain slices. We utilize a simple aluminum freezing stage to facilitate handling of tissue and a standard cryostat to routinely produce 5-10 micron serial sections from 400 micron thick brain slices.

Sectioning رقيقة من الاستعدادات لشريحة المناعية

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during meiosis can lead to infertility, pregnancy loss or genetic defects. Commencing at the onset of puberty and continuing throughout adulthood, continuous semi-synchronous waves of spermatocytes undergo spermatogenesis and ultimately form haploid sperm. The first wave of mouse spermatocytes undergoing meiotic initiation appear at day 10 post-partum (10 dpp) and are released into the lumen of seminiferous tubules as mature sperm at 35 dpp. Therefore, it is advantageous to utilize mice within this developmental time-window in order to obtain highly enriched populations of interest. Analysis of rare cell stages is more difficult in older mice due to the contribution of successive spermatogenic waves, which increase the diversity of the cellular populations within the tubules. The method described here is an easily implemented technique for the cytological evaluation of the cells found within the seminiferous tubules of mice, including spermatogonia, spermatocytes, and spermatids. The tubule squash technique maintains the integrity of isolated male germ cells and allows examination of cellular structures that are not easily visualized with other techniques. To demonstrate the possible applications of this tubule squash technique, spindle assembly was monitored in spermatocytes progressing through the prophase to metaphase I transition (G2/MI transition). In addition, centrosome duplication, meiotic sex chromosome inactivation (MSCI), and chromosome bouquet formation were assessed as examples of the cytological structures that can be observed using this tubule squash method. This technique can be used to pinpoint specific defects during spermatogenesis that are caused by mutation or exogenous perturbation, and thus, contributes to our molecular understanding of spermatogenesis.

The goal of this tubule squash technique is to rapidly assess cytological features of developing mouse spermatocytes while preserving cellular integrity. This method allows for the study of all stages of spermatogenesis, and can be easily implemented alongside other biochemical and molecular biological approaches for the study of mouse meiosis.

تقنية إسكواش أنبوب سيمينيفيروس لتحليل الحيوانات المنوية باستخدام نموذج الماوس الخلوية

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Developmental Biology

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

يعيش تصوير ذبابة الفاكهة السوداء البطن هجرات كرية دموية الجنينية

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

إعداد دروسوفيلا رفال واختبارات Pupal لتحليل انقسام الخلايا في الأنسجة الحية والسليمة

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established cell isolation protocols using Hoechst 33342 staining in combination with fluorescence-activated cell sorting, it requires cell sorters equipped with an ultraviolet laser. Here we describe a cell isolation protocol using the DyeCycle Violet (DCV) stain, a low cytotoxicity DNA binding dye structurally similar to Hoechst 33342. DCV can be excited by both ultraviolet and violet lasers, which improves the flexibility of equipment choice, including a cell sorter not equipped with an ultraviolet laser. Using this protocol, one can isolate three live-cell subpopulations in meiotic prophase I, including leptotene/zygotene, pachytene, and diplotene spermatocytes, as well as post-meiotic round spermatids. We also describe a protocol to prepare single-cell suspension from mouse testes. Overall, the procedure requires a short time to complete (4-5 hours depending on the number of needed cells), which facilitates many downstream applications.

Here we present a simple and efficient method to isolate live meiotic and post-meiotic germ cells from adult mouse testes. Using a low-cytotoxicity, violet-excited DNA binding dye and fluorescence-activated cell sorting, one can isolate highly enriched spermatogenic cell populations for many downstream applications.

عزل الخلايا المنوية مورين باستخدام البنفسجي-متحمس خلية نفاذة صبغة ملزمة

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Imaging Centrosomes in Fly Testes

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell differentiation. Centrosomes are essential to determine the cell division axis during mitosis and to nucleate cilia during interphase. The identity of the proteins that mediate these dynamic changes remains only partially known, and the function of many of the proteins that have been implicated in these processes is still rudimentary. Recent work has shown that Drosophila spermatogenesis provides a powerful system to identify new proteins critical for centrosome function and formation as well as to gain insight into the particular function of known players in centrosome-related processes. Drosophila is an established genetic model organism where mutants in centrosomal genes can be readily obtained and easily analyzed. Furthermore, recent advances in the sensitivity and resolution of light microscopy and the development of robust genetically tagged centrosomal markers have transformed the ability to use Drosophila testes as a simple and accessible model system to study centrosomes. This paper describes the use of genetically-tagged centrosomal markers to perform genetic screens for new centrosomal mutants and to gain insight into the specific function of newly identified genes.

Imaging of centrosomal proteins during Drosophila spermatogenesis is a powerful method to identify new proteins critical for centrosome biology as well as to elucidate the particular function of known players in this process.

Centrosomes التصوير في يطير الخصية

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell ...

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and organogenesis. Immunostaining allows for the visualization of developing tissues and organs. However, a protective cuticle that forms at the end of embryogenesis prevents permeation of antibodies into late-stage embryos and larvae. While dissection prior to immunostaining is regularly used to analyze Drosophila larval tissues, it proves inefficient for some analyses because small tissues may be difficult to locate and isolate. Sonication provides an alternative to dissection in larval Drosophila immunostaining protocols. It allows for quick, simultaneous processing of large numbers of late-stage embryos and larvae and maintains in situ morphology. After fixation in formaldehyde, a sample is sonicated. Sample is then subjected to immunostaining with antigen-specific primary antibodies and fluorescently labeled secondary antibodies to visualize target cell types and specific proteins via fluorescence microscopy. During the process of sonication, proper placement of a sonicating probe above the sample, as well as the duration and intensity of sonication, is critical. Additonal minor modifications to standard immunostaining protocols may be required for high quality stains. For antibodies with low signal to noise ratio, longer incubation times are typically necessary. As a proof of concept for this sonication-facilitated protocol, we show immunostains of three tissue types (testes, ovaries, and neural tissues) at a range of developmental stages.

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

-سهلت صوتنة المناعي تلطيخ المرحلة الجنينية في وقت متأخر من اليرقات و<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأنسجة<em&gt; في الموقع</em

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and ...

التهجين الفلوري في الموقع لدراسة تكوين المنوية للبعوض

Whole-Mount Fluorescence In Situ Hybridization to Study Spermatogenesis in the Anopheles Mosquito

Spermatogenesis is a complex biological process during which diploid cells undergo successive mitotic and meiotic division followed by large structural changes to form haploid spermatozoa. Besides the biological aspect, studying spermatogenesis is of paramount importance for understanding and developing genetic technologies such as gene drive and synthetic sex ratio distorters, which, by altering Mendelian inheritance and the sperm sex ratio, respectively, could be used to control pest insect populations. These technologies have proven to be very promising in lab settings and could potentially be used to control wild populations of Anopheles mosquitoes, which are vectors of malaria. Due to the simplicity of the testis anatomy and their medical importance, Anopheles gambiae, a major malaria vector in sub-Saharan Africa, represents a good cytological model for studying spermatogenesis. This protocol describes how whole-mount fluorescence in situ hybridization (WFISH) can be used to study the dramatic changes in cell nuclear structure through spermatogenesis using fluorescent probes that specifically stain the X and Y chromosomes. FISH usually requires the disruption of the reproductive organs to expose mitotic or meiotic chromosomes and allow the staining of specific genomic regions with fluorescent probes. WFISH enables the preservation of the native cytological structure of the testis, coupled with a good level of signal detection from fluorescent probes targeting repetitive DNA sequences. This allows researchers to follow changes in the chromosomal behavior of cells undergoing meiosis along the structure of the organ, where each phase of the process can clearly be distinguished. This technique could be particularly useful for studying chromosome meiotic pairing and investigating the cytological phenotypes associated with, for example, synthetic sex ratio distorters, hybrid male sterility, and the knock-out of genes involved in spermatogenesis.

تسليط الضوء على المؤلف: التهجين الفلوري الكامل في الموقع لدراسة تكوين المنوية في بعوضة الأنوفيليس  

Given their simple anatomy, Anopheles testes offer a good cytological model for studying spermatogenesis. This protocol describes whole-mount fluorescence in situ hybridization, a technique used to investigate this biological process, as well as the phenotype of transgenic strains harboring mutations in the genes involved in sperm production.

التهجين الفلوري الكامل في الموقع لدراسة تكوين الحيوانات المنوية في بعوضة الأنوفيليس

Spermatogenesis is a complex biological process during which diploid cells undergo successive mitotic and meiotic division followed by large structural ...

تحليل الخلوي الحيوانات المنوية: الأعمال التحضيرية لايف والثابتة من

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Sectioning رقيقة من الاستعدادات لشريحة المناعية

تقنية إسكواش أنبوب سيمينيفيروس لتحليل الحيوانات المنوية باستخدام نموذج الماوس الخلوية

يعيش تصوير ذبابة الفاكهة السوداء البطن هجرات كرية دموية الجنينية

إعداد دروسوفيلا رفال واختبارات Pupal لتحليل انقسام الخلايا في الأنسجة الحية والسليمة

عزل الخلايا المنوية مورين باستخدام البنفسجي-متحمس خلية نفاذة صبغة ملزمة

Centrosomes التصوير في يطير الخصية

-سهلت صوتنة المناعي تلطيخ المرحلة الجنينية في وقت متأخر من اليرقات و

التهجين الفلوري الكامل في الموقع لدراسة تكوين الحيوانات المنوية في بعوضة الأنوفيليس

التهجين الفلوري الكامل في الموقع لدراسة تكوين الحيوانات المنوية في بعوضة الأنوفيليس

التهجين الفلوري الكامل في الموقع لدراسة تكوين الحيوانات المنوية في بعوضة الأنوفيليس