저자는 이명박 실험실에서 카렌 헤일 즈에서 전문가의 조언과 정자를 연구하는이 허용 방법을 설정하기위한 마이클 앤더슨에게 감사의 말씀을 전합니다. H.오다와 Y 아키야마 -오다 아낌없이 γ-튜 불린-GFP 재고 비행 제공. 이 작품은 LAL (GM074044)에 NIH R01 교부금에 의해 지원되었다.

1. 고환의 해부 <ol><li> CO 2의 스트림을 사용하여 병 또는 유리 병에 파리를 마취 및 비행 패드에 전송합니다. </li><li> 정렬 작은 붓을 사용하여 해부 현미경으로 파리, 원하는 유전자형의 초파리 수컷의 (실험)에 따라 해당 번호를 수집합니다. (2-5 일) 이전 약간 나이가 남성은 세포 검사에 이상적입니다 반면 (0-2일 세) 젊은 남성은 정자의 초기 단계 (예를 들어 정조 세포, 정모 세포, 초기 포스트 감수 정자)를 통해 세포를 검사에 이상적입니다 정자의 마지막 단계에서 (특히, 정자를 성숙). </li><li> (해부하는 동안 액체에 떠에서 파리를 방지하기 위해) 각 비행에서 날개를 제거하는 집게를 사용합니다. </li><li> 에 실리콘 코팅 해부 접시에 드롭, 인산염 완충 생리 식염수 (PBS 130 mM의 NaCl을, 7 개 mm 나 2 HPO 4, 3 밀리미터의 NaH 2 PO 4)의 ~ 500 ML을 추가합니다검은 배경. 다른 수용액을 성공적으로 고환 절제술 3에 사용되었다. </li><li> 포인트는 파리의 전방을 향해 핀셋, 가슴으로 이해하고, PBS의 드롭에 젖어. 해부 현미경을 통해 볼 수 있지만, 복부에서 분리 될 때까지 후방 외부 생식기 (복부 복부의 뒤쪽 끝 부분에 진한 갈색 구조)를 잡아 당겨 포셉의 다른 쌍을 사용합니다. 대부분의 경우, 고환, 정낭, 및 부속 선은 외부 성기와 복부에 따라 제거 할 것,하지 않을 경우, 복부에 포셉 한 쌍을 삽입하고 고환을 애타게. </li><li> PBS의 드롭 집게 이쌍 (그림 2)를 사용하여 부속 선 및 외부 생식기에서 별도의 고환. 야생 형 고환은 쉽게 노란색으로 이웃 흰색 조직과 구별된다. 2 단계로 바로 진행합니다. </li><li> pharate의 남성 (전에서 고환을 분리하려면.. 전자 번데기 케이스 내에 포함), 추가 단계는 먼저 번데기 케이스에서 비행을 제거 포함하는 수행해야합니다,이 단계는 이전에 다른 31에 설명되어 있습니다. 단계 1.2에서 시작하는 성인의 고환을 위해 같은 해부를 진행합니다. </li><li> 애벌레 남성에서 고환을 분리, 초파리 애벌레 난소 32을 분리하는 프로토콜의 변형을 수행합니다. 간략하게, 수컷 유충 지방 본체의 후방 제에 포함 된 대형, 분명, 타원형 구조 (유생 정소) 쌍의 존재에 의해 암컷 유충으로부터 구별 될 수있다. 유생 고환을 분리 부분적 유생 난소의 분리 기술 한 바와 같이 복부에서 고환 및 주변 체지방을 분리 수컷 유충을 열 채찍. 본원에 기술 된 프로토콜의 2 단계로 바로 진행; 정소하기 직전 난소 (32)에서 기술 한 바와 같이 (2.3 또는 3.14 단)에 장착 지방 본체로부터 제거 될 수있다. </li></ol><ol><li> 부드럽게 사각 유리 커버 슬립에 PBS의 4-5 ML의 드롭 고환 2 ~ 3 쌍을 배치 포셉 한 쌍을 사용합니다. 너무 작은 액체 때 숙청 세포는 파열의 원인이됩니다 반면, 너무 많은 액체를 숙청 할 때 제대로 확산 세포를 방지 할 수 있습니다 : PBS의 볼륨에 고환의 수의 비율을 조정해야 할 수도 있습니다. 선택 사항 : 사용 실리콘 처리 된 커버 단계 3.2 슬립을 충당하기 위해 조직의 부착을 최소화하기 위해 전표. </li><li> (참고 준비에 필요한 생식 세포 유형의 존재를 극대화 할 수 있도록 적절한 위치에 열려있는 각각의 고환을 찢어 포셉 한 켤레를 사용하는 부수 동안 슬라이드에 고환 찢어진 지역에서 의지 주로 출구의 내용 단계를 포함한다.) 정조 세포와 정모 세포에 풍부하게, 그 정점 팁 (레벨 1, 그림 2B)에 인접한 고환을 열고 눈물. 정모 세포와 정자 세포에 풍부하게, 눈물은 pos의 고환을 열레벨 1 (레벨 2, 그림 2B)에 약간 기초 ition. , 더 성숙한 생식 세포에 풍부 가까이 곡률 (레벨 3, 그림 2B)를 시작하는 위치에 개방 고환을 찢어. </li><li> 부드럽게 고환 스쿼시 커버 슬립 위에 유리 현미경 슬라이드를 배치, 혼자 커버 슬립의 무게가 제대로 숙청 샘플을 얻기에 충분하다로 수동으로 압력을 적용하지 않는다. 공기 방울이 않도록하십시오. 선택 사항 : 사용 폴리-L-라이신 코팅 현미경 단계 3.2에서 슬라이드에 조직의 준수를 촉진하기 위해 슬라이드. </li><li> 위상차 현미경으로 살아있는 세포를 관찰하기 (이상적으로 준비 15 분 이내) 즉시 준비를 사용하여, 고환에서 찬란 태그 단백질의 발현과 유전자 변형 파리에, 살아있는 세포는이 단계에서 형광 현미경으로 검사 할 수 있습니다. 또한, 고정 및 항체 염색 (프로토콜 3)를 진행합니다. </li><li> 부드럽게 청소 W를 사용하여 커버 슬립 아래에서 초과 액체를 심지생식 세포에 초점이 명확하게 될 때까지 IPE는 자료의 평탄화를 허용합니다. </li></ol> 3. 포름 알데히드 고정 및 항체 염색법 <ol><li> 스냅 (액체 질소 버블 링을 멈출 때까지) 액체 질소에 짧게 젖어 금속 집게의 쌍을 사용 (프로토콜 2) 숙청 고환이있는 각 슬라이드를 동결. </li><li> 면도날을 사용하여 즉시 커버 슬립을 제거합니다. </li><li> 얼음처럼 차가운 95 % 에탄올로 가득 prechilled 유리 슬라이드 랙 (분광 등급, 메탄올 - 무료)에 슬라이드를 전송하는 금속 집게를 사용합니다. 10 분 -20 ° C에 보관하십시오. </li><li> 4 % PBS에 포름 알데히드 플러스 0.1 % 트리톤 X-100 (PBS-T)로 채워진 유리 슬라이드 랙에 슬라이드를 전송하는 금속 집게를 사용합니다. 7 분 동안 실온에서 보관하십시오. </li><li> PBS로 가득 유리 슬라이드 랙에 슬라이드를 전송하는 금속 집게를 사용합니다. 실온에서 5 분 동안 PBS에서 슬라이드를 씻으십시오. 1X를 반복합니다. (유리 슬라이드 랙에 솔루션을 삭제하여 모든 세척을 수행 <em&gt; 예. 그것을 밖으로 쏟아져)와 신선한 솔루션으로 대체하여. </li><li> PBS를 폐기하고 세포막을 투과하는, 실온에서 30 분 동안 PBS-T에서 슬라이드 젖어. </li><li> 실온에서 5 분 동안 PBS에서 슬라이드를 씻으십시오. 배를 반복합니다. </li><li> 단계 (옵션) 차단 : 실온에서 45 분 동안 PBS에서 슬라이드 플러스 1 % BSA를 담근다. </li><li> (단계 3.9 및 3.11에 추가) 항체 솔루션을 제한하기 위해 (눈으로 쉽게 볼) 숙청 조직 주변의 슬라이드에 원을 그리려면 소수성 장벽 펜을 사용합니다. 면역 염색을 수행하는 동안 조직을 항상 습한 유지되어야한다. </li><li> 원 내에서 조직에 (항체에 따라 1:50 PBS-T, 1:400으로 희석) 일차 항체의 30 ~ 40 ML을 추가합니다. 블로킹이 수행 된 경우, PBS-T 플러스 1 % BSA에 일차 항체를 희석. (그림 4의 중심체의 염색에 대한) 안티-γ-tubulin에 항체는 1:100 희석시켰다. 습기, 어두운 챔버 (예. 폐 플라스틱 상자에 품다젖은 종이 실온에서 2 시간 동안 수건) 또는 4 박 ° C에서와 </li><li> 실내 온도 3 배에서 5 분 동안 PBS에서 슬라이드를 씻으십시오. 차단을 수행 한 경우, PBS-T에 두 번 세척 한 번 PBS에서 (실내 온도 각에서 5 분). </li><li> 조직에 형광 - 복합 이차 항체 (PBS에서 1:400 희석)의 30 ~ 40 mL를 넣고 실온에서 1 ~ 2 시간 동안 어둠 속에서 부화. </li><li> 실온에서 5 분 동안 PBS에서 슬라이드를 씻으십시오. 배를 반복합니다. </li><li> 30 ~ 40 원 내에서 조직에 DAPI 용액 (PBS 0.2 ㎎ / ㎖)의 ML을 추가합니다. </li><li> 부드럽게 공기 방울이 않도록주의하면서, 조직 위에 유리 커버 슬립을 배치합니다. 기포가 발생한 경우, 거품이 커버 슬립의 측면에서 탈출 할 때까지 스쿼시를 파괴하지 않고 커버 슬립 주위를 조심스럽게 이동합니다. </li><li> 청소를 사용하여 슬라이드의 가장자리에서 초과 DAPI를 지워 버리 닦아냅니다. </li><li> 명확한 매니큐어를 사용하여 슬라이드에 커버 슬립을 봉인. </li><li> 이 혼합물을 사용하여형광 현미경으로 세포 면역 염색을 볼 수있는 다음 3 ~ 4 시간 이내. (적어도 몇 주까지) 슬라이드의 장기 저장을 위해, -20 ˚ C에서 글리세롤 기반 하드 마운트 DAPI와 매체 및 저장 슬라이드를 사용 </li><li> 또한, (항원)에 따라 메탄올 대신 포름 알데히드에 샘플을 고정합니다. 단계 3.2을 통해 전체 프로토콜을 완료 한 후, -20 ° C에서 10 분 동안 메탄올 숙청 고환의 슬라이드를 담가 이후 단계 5를 진행합니다. </li></ol>

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+live+imaging+of+stem+cells+in+Drosophila+testis.">Time-lapse live imaging of stem cells in Drosophila testis.</a> Curr. Protoc. Stem Cell. Biol.. 2, 10-1002 (2009).</li><li>Sheng, X. R., Matunis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+Drosophila+spermatogonial+stem+cell+niche+reveals+novel+mechanisms+regulating+germline+stem+cell+output.">Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output.</a> Development. 138, 3367-3376 (2011).</li><li>Belloni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Cog7+affect+Golgi+structure,+meiotic+cytokinesis+and+sperm+development+during+Drosophila+spermatogenesis.">Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis.</a> J. Cell Sci. 125, 5441-5452 (2012).</li><li>Moon, S., Cho, B., Min, S. H., Lee, D., Chung, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+THO+complex+is+required+for+nucleolar+integrity+in+Drosophila+spermatocytes.">The THO complex is required for nucleolar integrity in Drosophila spermatocytes.</a> Development. 138, 3835-3845 (2011).</li><li>Wang, Z., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+two+nearly+identical+TGIF-related+homeobox+genes+in+Drosophila+spermatogenesis.">Requirement for two nearly identical TGIF-related homeobox genes in Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 130, 2853-2865 (2003).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

야생형 파리의 고환은 쉽게 인해 노란색 (대조적으로 이웃 흰색 조직)을 식별 할 수 있지만, 흰색 돌연변이 체의 고환은 흰색이며, 따라서 가끔 용기와 혼동 할 수 있습니다. P 요소에있는 미니 흰색 유전자가 고환에있는 색소의 축적을 촉진하지 않기 때문에 흰색 배경에 전형적으로 대부분의 형질 전환 균주는 또한 흰색 고환이 있습니다. 초파리의 고환은 색깔로...

초파리의 고환은 줄기 세포의 조절, 세포의 감수 분열, 그리고 정자 개발 13-18 등 많은 생물 학적 과정의 연구를위한 이상적인 모델 시스템이다. 정모 세포와 그들의 감수 스핀들 대형 및 세포 학적 분석에 따라서 편리하고 편안한 정자 동안에 세포주기 체크 포인트는 세포주기 유전자 변이의 연구를 용이하게한다. 상이한 세포 유형은 고환의 길이를 따라 정렬 된 진행성에서 관찰 될 수 있고, 정자 형성에 어떠한 중단이 전반적인 배열의 변화로 이어질 수있다. 초파리의 유전 도구와 결합 된 이러한 기능은 정자 21-23의 돌연변이 분석을 용이하게했다. 초파리의 정자의 단계가 잘 정의되어 있습니다. 낭종 내에 동기 개발 생식선 세포는 고환의 길이를 따라 정자의 단계를 통해 순차적으로 진행. 보 중유사 분열과 남성 생식 세포의 감수 분열 번째, 세포질 분열은 딸 세포 (그림 1) 링 운하로 알려진 세포질 다리로 연결되어있는 것을 불완전 같은 발생합니다. 고환의 꼭대기 끝은 차 정모 세포의 16 셀 낭종을 생성하는 불완전한 세포질 분열 네 개의 유사 분열 분열을 거쳐 정원 세포에 상승을 제공 생식 줄기 세포의 인구가 포함되어 있습니다. premeiotic S 단계 후, 차 정모 세포는 G2 ~ 90 시간하는 세포 부피가 증가 ~ 25 배 동안의 장기 성장 기간을 입력합니다. 감수 분열의 I 각각 차 정모 세포와 반수체 정자의 64 세포 낭종, 32 셀 낭종의 형성 세포의 감수 분열 II 결과를 통해 진행 상황. 미숙 한, 둥근 정자 성숙 정자를 형성하기 위해 광범위한 세포 리모델링을 받고있다. 사후 감수 세포는 연신의 번들 및 성숙 정자 특히, 고환의 볼륨을 중시 점유한다. 티여성 파리에 기능 정자의 그는 성공적으로 전송 여러 쌍 구조 (고환, 정낭 및 액세서리 땀샘)과 하나의 사정관으로 구성되어 남성의 생식 시스템 (그림 2)의 다른 부분 간의 조정이 필요합니다. 정자는 고환에서 생산 교미 24까지 정낭에 저장됩니다. 액세서리 샘은 정액을 생산하는 분비 세포가 포함되어 있습니다. 정낭에서 이주 정자가 정낭 및 액세서리 분비 모두 연결된 사정관, 내 정액과 혼합된다. 정자와 정액의이 혼합물은 궁극적으로 여성의 남성의 복부 (25)의 후방 단부에 위치 사정 전구를 통해 비행의 질에 남성의 펌핑된다. 정액 내 단백질은 담당자에 spermathecae로 알려진 전문 기관 내에서 정자의 장기간 보관에 필수적인초파리 암컷 26 roductive 기관. 초파리 고환의 분리 및 정자의 여러 단계에서 세포의 시각화를위한 훌륭한 방법은 과학 문헌 3-12에서 사용할 수 있습니다. 우리는 여기에 첨부 된 비디오 데모와 함께 이러한 프로토콜의 예를 제시하여 지식이 몸에 추가합니다. 위상차 현미경 라이브 고환 샘플의 준비를위한 프로토콜은 앞에서 설명한 방법 (27)에 기초한다. 포름 알데히드 고정 및 고환의 면역 염색을위한 프로토콜은 이전에 설명한 방법 28을 기반으로합니다. 본원에 기재된 방법 (예를 들어, 초파리 정자 동안, 마이너스 엔드 - 지향의 미세 소관 모터 dynein의 역할을 평가하기 위해) 초파리 정자의 많은 연구에 사용되었다. 기본 프로토콜 이외에, 제안은 varyin 제공된다G 해부 정조 세포, 정모 세포, 또는 성숙한 정자 풍부하게하기 위해. 이러한 낭종이 고환을 처리하기위한 다른 방법은 그대로 유지 또는 설명되어 필요에 따라 중단됩니다 하나. 모델 시스템으로 초파리 고환 사용에 장점은 초파리 난자 및 배아에 비해 항체 및 염료 쉽게 고환에서 그들의 분산 다음 세포에 침투 할 수 있으며, 적은 세척 단계가 요구되는 점이다, 따라서, 프로토콜은 상대적으로 수행 될 수있다 짧은 시간.

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish</td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9888126</td><td>Ted Pella #22309</td></tr><tr><td>Clear nail protector</td><td>Wet n Wild</td><td>7780235001</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6557</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC61511-0040</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>16% Formaldehyde</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2</td><td>Use according to manufacturer&#039;s directions to siliconize cover slips</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9542</td><td>0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Research Products International Corp.</td><td>S23020</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes delicate task wipers</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47299</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Research Products International Corp.</td><td>A30075</td><td>Molecular biology grade</td></tr><tr><td>Glass Coplin staining jar, screw cap</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70315</td><td></td></tr><tr><td>Single frosted microscope slides</td><td>Corning</td><td>2948-75X25</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine coated microscope slides</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>22247-1</td><td>Optional (to replace untreated microscope slides )</td></tr><tr><td>Square cover glass</td><td>Corning</td><td>2865-22</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Kimax Petri dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>S31473</td><td>Kimble #23060 10015 EMD</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dumont</td><td>52100-51S</td><td>Pattern 5 INOX</td></tr><tr><td>Stemi 2000-CS stereoscope</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse 80i</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Fluor 40X objective</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiophot</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Neofluar Ph2 40X objective</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cytological analysis of spermatogenesis: live and fixed preparations of drosophila testes

초파리 melanogaster의 널리 생물학적 과정의 다양성을 설명하기 위해 사용 된 강력한 모델 시스템이다. 예를 들어, 여성과 초파리의 수컷 생식 라인 모두의 연구는 현재의 감수 분열에 대한 이해뿐만 아니라 줄기 세포 생물학에 크게 기여했다. 우수한 프로토콜은 초파리의 난소와 고환 3-12의 분리 및 이미징에 대한 문헌에서 사용할 수 있습니다. 여기서, 현미경 분석에 대한 해부와 초파리 고환의 제조 방법은 첨부 된 비디오 데모와 ​​함께 설명되어 있습니다. 성인 남성의 복부에서 고환을 분리하고 위상차 현미경에 의한 분석뿐만 아니라 형광 현미경에 의한 분석을 위해 고환을 고정하고 면역 염색을위한 프로토콜에 대한 살아있는 조직 슬라이드를 제조하는 프로토콜이 제공됩니다. 이러한 기술 개발을 나타내는 초파리 돌연변이의 특성에 적용 할 수있다정자뿐만 아니라 단백질의 세포 내 현지화의 시각화 EFECTS.

초파리의 남성 생식 기관의 제대로 해부 쌍의 예를 그림 2A에 표시됩니다. 성인 남성 파리의 복부에서 제거 고환은 일반적으로 정낭의 쌍 (파란색, 그림 2A &#39;)를 통해 절규하는듯한 덕트 (브라운, 그림 2A&#39;) 및 액세서리 땀샘의 한 쌍 (녹색, 그림 2A &#39;)에 연결되어 . 첨부 된 체세포 조직, 절규하는듯한 덕트 및 부속 샘의 대부분에서 고?...

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Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

분리 및 위상 콘트라스트와 형광 현미경으로 이미징 초파리 고환 샘플 (생활하고 고정)을 제조하는 방법이 설명된다.

정자의 세포 학적 분석 : 라이브와 고정 준비<em&gt; 초파리</em&gt; 고환

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

cytological-analysis-spermatogenesis-live-fixed-preparations

Research

JoVE Journal

Biology

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

26.1K 조회수.  Vanderbilt University Medical Center.  분리 및 위상 콘트라스트와 형광 현미경으로 이미징 초파리 고환 샘플 (생활하고 고정)을 제조하는 방법이 설명된다. 

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Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been preserved, freshly removed, or excised but kept viable, as in slice preparations of brain tissue.  Subsequent microscopic studies of this material can be challenging, as the tissue samples may be difficult to handle.  Demonstrated here is a method for obtaining thin cryostat sections of tissue with a thickness that may range from 0.2-5.0 mm.  We routinely cut 400 micron thick Vibratome brain slices serially into 5-10 micron coronal cryostat sections.  The slices are typically first used for electrophysiology experiments and then require microscopic analysis of the cytoarchitecture of the region from which the recordings were observed.  We have constructed a simple device that allows controlled and reproducible preparation and positioning of the tissue slice.  This device consists of a cylinder 5 cm in length with a diameter of 1.2 cm, which serves as a freezing stage for the slice.  A ring snugly slides over the cylinder providing walls around the slice allowing the tissue to be immersed in freezing compound (e.g., OCT).  This is then quickly frozen with crushed dry ice and the resulting  wafer  can be position easily for cryostat sectioning.  Thin sections can be thaw-mounted onto coated slides to allow further studies to be performed, such as various staining methods, in situ hybridization, or immunohistochemistry, as demonstrated here.

The present method allows reproducible cryostat sectioning of small, difficult-to-manage, tissue pieces, such as biopsies and brain slices. We utilize a simple aluminum freezing stage to facilitate handling of tissue and a standard cryostat to routinely produce 5-10 micron serial sections from 400 micron thick brain slices.

Immunohistochemistry에 대한 슬라이스 준비 씬 Sectioning

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

연구

생물학

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during meiosis can lead to infertility, pregnancy loss or genetic defects. Commencing at the onset of puberty and continuing throughout adulthood, continuous semi-synchronous waves of spermatocytes undergo spermatogenesis and ultimately form haploid sperm. The first wave of mouse spermatocytes undergoing meiotic initiation appear at day 10 post-partum (10 dpp) and are released into the lumen of seminiferous tubules as mature sperm at 35 dpp. Therefore, it is advantageous to utilize mice within this developmental time-window in order to obtain highly enriched populations of interest. Analysis of rare cell stages is more difficult in older mice due to the contribution of successive spermatogenic waves, which increase the diversity of the cellular populations within the tubules. The method described here is an easily implemented technique for the cytological evaluation of the cells found within the seminiferous tubules of mice, including spermatogonia, spermatocytes, and spermatids. The tubule squash technique maintains the integrity of isolated male germ cells and allows examination of cellular structures that are not easily visualized with other techniques. To demonstrate the possible applications of this tubule squash technique, spindle assembly was monitored in spermatocytes progressing through the prophase to metaphase I transition (G2/MI transition). In addition, centrosome duplication, meiotic sex chromosome inactivation (MSCI), and chromosome bouquet formation were assessed as examples of the cytological structures that can be observed using this tubule squash method. This technique can be used to pinpoint specific defects during spermatogenesis that are caused by mutation or exogenous perturbation, and thus, contributes to our molecular understanding of spermatogenesis.

The goal of this tubule squash technique is to rapidly assess cytological features of developing mouse spermatocytes while preserving cellular integrity. This method allows for the study of all stages of spermatogenesis, and can be easily implemented alongside other biochemical and molecular biological approaches for the study of mouse meiosis.

Spermatogenesis 마우스 모델을 사용 하 여의 Cytological 분석을 위한 Seminiferous 관 스쿼시 기술

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

발생학

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

살아있는, 그대로 조직에서 세포 분열의 분석을 위한 초파리 애벌레와 Pupal 고환의 준비

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established cell isolation protocols using Hoechst 33342 staining in combination with fluorescence-activated cell sorting, it requires cell sorters equipped with an ultraviolet laser. Here we describe a cell isolation protocol using the DyeCycle Violet (DCV) stain, a low cytotoxicity DNA binding dye structurally similar to Hoechst 33342. DCV can be excited by both ultraviolet and violet lasers, which improves the flexibility of equipment choice, including a cell sorter not equipped with an ultraviolet laser. Using this protocol, one can isolate three live-cell subpopulations in meiotic prophase I, including leptotene/zygotene, pachytene, and diplotene spermatocytes, as well as post-meiotic round spermatids. We also describe a protocol to prepare single-cell suspension from mouse testes. Overall, the procedure requires a short time to complete (4-5 hours depending on the number of needed cells), which facilitates many downstream applications.

Here we present a simple and efficient method to isolate live meiotic and post-meiotic germ cells from adult mouse testes. Using a low-cytotoxicity, violet-excited DNA binding dye and fluorescence-activated cell sorting, one can isolate highly enriched spermatogenic cell populations for many downstream applications.

보라색 흥분 세포 투과성 DNA 결합 염료를 사용하여 뮤린 정자 세포의 격리

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Imaging Centrosomes in Fly Testes

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell differentiation. Centrosomes are essential to determine the cell division axis during mitosis and to nucleate cilia during interphase. The identity of the proteins that mediate these dynamic changes remains only partially known, and the function of many of the proteins that have been implicated in these processes is still rudimentary. Recent work has shown that Drosophila spermatogenesis provides a powerful system to identify new proteins critical for centrosome function and formation as well as to gain insight into the particular function of known players in centrosome-related processes. Drosophila is an established genetic model organism where mutants in centrosomal genes can be readily obtained and easily analyzed. Furthermore, recent advances in the sensitivity and resolution of light microscopy and the development of robust genetically tagged centrosomal markers have transformed the ability to use Drosophila testes as a simple and accessible model system to study centrosomes. This paper describes the use of genetically-tagged centrosomal markers to perform genetic screens for new centrosomal mutants and to gain insight into the specific function of newly identified genes.

Imaging of centrosomal proteins during Drosophila spermatogenesis is a powerful method to identify new proteins critical for centrosome biology as well as to elucidate the particular function of known players in this process.

비행 고환에있는 영상 중심체

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell ...

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and organogenesis. Immunostaining allows for the visualization of developing tissues and organs. However, a protective cuticle that forms at the end of embryogenesis prevents permeation of antibodies into late-stage embryos and larvae. While dissection prior to immunostaining is regularly used to analyze Drosophila larval tissues, it proves inefficient for some analyses because small tissues may be difficult to locate and isolate. Sonication provides an alternative to dissection in larval Drosophila immunostaining protocols. It allows for quick, simultaneous processing of large numbers of late-stage embryos and larvae and maintains in situ morphology. After fixation in formaldehyde, a sample is sonicated. Sample is then subjected to immunostaining with antigen-specific primary antibodies and fluorescently labeled secondary antibodies to visualize target cell types and specific proteins via fluorescence microscopy. During the process of sonication, proper placement of a sonicating probe above the sample, as well as the duration and intensity of sonication, is critical. Additonal minor modifications to standard immunostaining protocols may be required for high quality stains. For antibodies with low signal to noise ratio, longer incubation times are typically necessary. As a proof of concept for this sonication-facilitated protocol, we show immunostains of three tissue types (testes, ovaries, and neural tissues) at a range of developmental stages.

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

늦게 단계 배아와 애벌레의 초음파 - 촉진 면역 형광 염색<em&gt; 초파리</em&gt; 조직<em&gt; 제자리에서</em

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and ...

모기 정자 형성을 연구하기 위한 Fluorescence In Situ Hybridization

Whole-Mount Fluorescence In Situ Hybridization to Study Spermatogenesis in the Anopheles Mosquito

Spermatogenesis is a complex biological process during which diploid cells undergo successive mitotic and meiotic division followed by large structural changes to form haploid spermatozoa. Besides the biological aspect, studying spermatogenesis is of paramount importance for understanding and developing genetic technologies such as gene drive and synthetic sex ratio distorters, which, by altering Mendelian inheritance and the sperm sex ratio, respectively, could be used to control pest insect populations. These technologies have proven to be very promising in lab settings and could potentially be used to control wild populations of Anopheles mosquitoes, which are vectors of malaria. Due to the simplicity of the testis anatomy and their medical importance, Anopheles gambiae, a major malaria vector in sub-Saharan Africa, represents a good cytological model for studying spermatogenesis. This protocol describes how whole-mount fluorescence in situ hybridization (WFISH) can be used to study the dramatic changes in cell nuclear structure through spermatogenesis using fluorescent probes that specifically stain the X and Y chromosomes. FISH usually requires the disruption of the reproductive organs to expose mitotic or meiotic chromosomes and allow the staining of specific genomic regions with fluorescent probes. WFISH enables the preservation of the native cytological structure of the testis, coupled with a good level of signal detection from fluorescent probes targeting repetitive DNA sequences. This allows researchers to follow changes in the chromosomal behavior of cells undergoing meiosis along the structure of the organ, where each phase of the process can clearly be distinguished. This technique could be particularly useful for studying chromosome meiotic pairing and investigating the cytological phenotypes associated with, for example, synthetic sex ratio distorters, hybrid male sterility, and the knock-out of genes involved in spermatogenesis.

저자 스포트라이트: Anopheles Mosquito의 정자 형성을 연구하기 위한 Whole-Mount Fluorescence In Situ Hybridization  

Given their simple anatomy, Anopheles testes offer a good cytological model for studying spermatogenesis. This protocol describes whole-mount fluorescence in situ hybridization, a technique used to investigate this biological process, as well as the phenotype of transgenic strains harboring mutations in the genes involved in sperm production.

Anopheles 모기의 정자 형성을 연구하기 위한 전체 장착 형광 In Situ 교잡

Spermatogenesis is a complex biological process during which diploid cells undergo successive mitotic and meiotic division followed by large structural ...

정자의 세포 학적 분석 : 라이브와 고정 준비

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Spermatogenesis 마우스 모델을 사용 하 여의 Cytological 분석을 위한 Seminiferous 관 스쿼시 기술

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Anopheles 모기의 정자 형성을 연구하기 위한 전체 장착 형광 In Situ 교잡