وأيد هذا العمل من خلال منحة (R01GM098394) من المعاهد الوطنية للصحة والمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة وكذلك منحة 1121176 من المؤسسة الوطنية للعلوم.

1. المسار A. إعداد الخصية لايف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد برنامج تلفزيوني عن طريق إذابة 8.0 جم كلوريد الصوديوم، 0.2 غرام بوكل، 1.44 ز نا 2 هبو 4، 0.24 غ KH 2 PO 4 في 800 مل من الماء المقطر وضبط درجة الحموضة إلى 7.4. تبرزي حجم إلى 1 L وتعقيم بواسطة التعقيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل الخصيتين كما هو موضح سابقا 27. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العازلة تلطيخ دابي عن طريق تمييع 1 ملغ / مل الأسهم إلى 1 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني. استخدام رقائق الألومنيوم لحماية أنبوب من الضوء وتخزينها في -20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد عزل الخصيتين، تزج العينة في 6 ميكرولتر من العازلة تلطيخ دابي على رأس شريحة المجهر والزجاج موجبة الشحنة لمدة 10 دقيقة. الخصيتين تلتزم بشكل جيد لمتاحة تجاريا الشرائح موجبة الشحنة، مما يسمح للتلاعب السهل للعينة. يتم تعديل الشرائح موجبة الشحنة تساهميا لنقل شحنة موجبة ثابتة على سطح الزجاج. مماثلة لطلاء متعدد الليزين، وهذا يشجع على التفاعل بين واي الخصيتينال سطح الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل دابي الزائدة عن طريق استبدال العازلة تلطيخ مرتين مع 6 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. استخدام قطعة من ورق الترشيح لالفتيل بعيدا المخزن المؤقت بعد كل خطوة الغسيل. توخي الحذر حتى لا قصد إزالة الخصيتين جنبا إلى جنب مع المخزن المؤقت أثناء كل غسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 6 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لعينة. ينبغي تعديل كمية من العازلة المستخدمة لحجم ساترة. وحدات التخزين المنصوص عليها في هذا البروتوكول هي ل18 × 18 مم ساترة. اختياري: ومن المستحسن أن يخترق الخصيتين بالقرب من الموقع النسبي لنوع من الخلايا في المصالح. وهذا يضمن أن هناك ضغوطا على الحد الأدنى من هذه الخلايا خلال الخطوة سحق، وبالتالي الحفاظ على سلامة الهيكلية. ثقب الخصيتين يمكن القيام بها باستخدام حاد، مشرط نظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع بعناية ساترة على أعلى من العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم حواف ساترة باستخدام طلاء الأظافر واضحة لضمان أن المخزن المؤقت لا تتبخر من العينة الحية أثناء الدردشةالشيخوخة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام علامة للدلالة على موقف الخصيتين لسهولة في تحديد مكان العينة على الشريحة، والشروع في التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الزائدة دابي العازلة تلطيخ عن طريق استبدال العازلة مرتين مع 6 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. استخدام قطعة من ورق الترشيح لالفتيل بعيدا المخزن المؤقت بعد كل خطوة الغسيل. نكون حذرين حتى لا إزالة بطريق الخطأ عينة جنبا إلى جنب مع المخزن المؤقت أثناء كل غسل. </li></ol> 2. المسار B. إعداد الخصية الثابتة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العازلة فيكس عن طريق تمييع الحل الأسهم 37٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني إلى تركيز النهائي من 3.7٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني 1X </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العازلة تلطيخ دابي عن طريق تمييع الأسهم 1 ملغ / مل دابي إلى 1 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج الخصيتين في قطرة ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 6 على رأس موجبة الشحنة شريحة المجهر والزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توجيه الخصيتين بطريقة خطية أو كما يفضل خلاف ذلك يدويا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام قطعة من ورق الترشيح لالفتيل بعيدا PBS واستبدالها 6 ميكرولتر من فيكسالعازلة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام قطعة من ورق الترشيح لالفتيل بعيدا المخزن المؤقت فيكس وتزج العينة في 6 ميكرولتر من العازلة تلطيخ دابي لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع بعناية على 18 × 18 مم ساترة على أعلى من العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم حواف ساترة باستخدام طلاء الأظافر واضحة لضمان أن المخزن المؤقت لا تتبخر من العينة في حين التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام علامة للدلالة على موقف الخصيتين لسهولة في تحديد مكان العينة على الشريحة، والشروع في التصوير. </li></ol> 3. المسار C. إعداد Immunostained الخصية siliconization ساترة: تزج متعددة 18 × 18 مم coverslips في علبة صغيرة تحتوي على محلول siliconizing واحتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة تحت غطاء الدخان. تأكد من أن لل coverslips يتعرضون بشكل كامل وغير مكدسة فوق بعضها البعض. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العينة في قطرة ميكرولتر من برنامج تلفزيوني على 5 ساترة siliconized. توجيه والخصيتين كما تريد ويخترق الخصيتين باستخدام مشرط حاد. وضع بلطف موجبة الشحنة شريحة المجهر والزجاج على ساترة، والسماح للبرنامج تلفزيوني لتصبح فرقت بالتساوي بين ساترة والشريحة. استخدام قطعة صغيرة من ورق الترشيح لالفتيل بعيدا المخزن المؤقت الزائدة بين ساترة والشريحة. كما تتم إزالة المنطقة العازلة التي كتبها ورقة الترشيح، فإن الزيادة في ضغط الاسكواش الخصيتين. وينبغي إعداد العديد من العينات في وقت واحد، كما أن البعض قد يكون المفقودة أو التالفة على مدار البروتوكول. A حفارة الزجاج يمكن استخدامها لتسمية الشرائح إذا كان سيتم إعداد أنواع مختلفة من العينات في وقت واحد. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل coverslips 3X لمدة 1 دقيقة في كل من المياه، تليها 3X لمدة 1 دقيقة في كل من 70٪ من الإيثانول، وغسل النهائي لمدة 1 دقيقة في الماء. السماح لل coverslips siliconized إلى الهواء الجاف تحت غطاء الدخان. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إسقاط الشرائح في النيتروجين السائل وتسمح العينة لتجميد لمدة 5-10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشرائح من لiquid النيتروجين باستخدام ملقط كبير. استخدام مشرط لإزالة بسرعة ساترة. يجب أن تبقى العينة على الشريحة. يجب الحرص على عدم تشويه العينة أثناء هذه العملية عن طريق تحريك ساترة على طول الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الشرائح في الميثانول prechilled في كوب Coplin جرة تلطيخ في -20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الشرائح إلى الزجاج جرة تحتوي على Coplin تلطيخ الأسيتون prechilled في -20 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل الشرائح لمدة 1 دقيقة في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة باستخدام الزجاج جرة Coplin تلطيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد PBST-B من خلال استكمال برنامج تلفزيوني مع 0.1٪ تريتون-X100 و 1٪ مصل بقري البياض (BSA). 5٪ مصل طبيعي من الأنواع المضيفة نفس الأجسام المضادة الثانوية (من الخطوة 3.14) يمكن أن تستخدم بدلا من BSA للحد من الضوضاء في الخلفية غير محددة تنتج من الأجسام المضادة الثانوية ملزمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الشرائح لمدة 10 دقيقة في PBST-B في تلطيخ عاء زجاجي Coplin للحجب المواقع غير محددة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء آبارغرفة الرطوبة بالماء. سوف الرطوبة داخل غرفة تقليل التبخر من الحلول الضد من العينة خلال الخطوات الحضانة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد PBST-BR من خلال استكمال PBST-B مع 100 ميكروغرام / مل ريبونوكلياز ريبونوكلياز A. A يحط الحمض النووي الريبي في العينة وأيضا بمثابة وكيل حجب إضافية من خلال استيعاب بقوة على سطح الزجاج. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطعة 1X1 سم تقريبا من parafilm على رأس العينة لنشر الحل الضد بالتساوي وحماية حل الضد من التبخر. إغلاق غرفة الرطوبة واحتضان العينة في الأجسام المضادة الأولية لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشرائح من PBST-B. استخدام قطعة من ورق الترشيح لتجفيف المنطقة من الشريحة حول العينة، باستخدام الحذر لا تجف العينة نفسها. أخيرا، ضع الشريحة في غرفة الرطوبة مع العينة مواجهة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف إضافة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية مخففة في PBST-BR على أعلى المواصفاتإيمان (1:200 عموما هو تركيز الأجسام المضادة انطلاق جيدة لuncharacterized). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية العينة مع ما يقرب من 1 × 1 سم قطعة من parafilm وإغلاق غرفة الرطوبة. احتضان العينة في الضد الثانوية لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح غرفة الرطوبة واستخدام الملقط لإزالة بلطف Parafilm من الشريحة. احتضان الشرائح لمدة 5 دقائق في PBST في تلطيخ عاء زجاجي Coplin في درجة حرارة الغرفة لغسل. كرر هذه العملية ما مجموعه ثلاثة يغسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشرائح من PBST-B ووضعها في غرفة الرطوبة مع العينة مواجهة. بلطف إضافة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية مخففة في PBST-BR على أعلى من العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح غرفة الرطوبة واستخدام الملقط لإزالة بلطف Parafilm من الشريحة. مرة أخرى، وغسل 3X العينة لمدة 5 دقائق في كل من PBST في تلطيخ عاء زجاجي Coplin تليها 3X لمدة 5 دقائق كل في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام Kimwipe ورقة الترشيح ل<html> تجف بعناية سطح الشريحة، والحرص على تجنب لمس أو تجفيف العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 6 ميكرولتر من تركيب وسائل الإعلام لعينة، مع تغطية ساترة نظيفة (غير المغلفة مع السيليكون)، وختم حواف مع طلاء الأظافر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام علامة للدلالة على موقف الخصيتين لسهولة في تحديد مكان العينة على الشريحة، والشروع في التصوير. </li></ol> 4. التصوير ملاحظات لا يمكن أن يتحقق التصوير باستخدام مجهر الضوء العادي تستقيم أو مقلوب أو المجهر متحد البؤر. من المهم أن تكون مجهزة المجهر مع مرحلة النقيض من ذلك، خاصة بالنسبة للتصوير الخصيتين الحية العينات (المسار A). أصبحت هذه الميزة متوفرة في الآونة الأخيرة المجاهر متحد البؤر. عندما كسر الخصيتين بشكل عفوي (المسار A)، الطرف (الجذعية المنطقة الخلية) وعادة ما يتم الحفاظ عليه ويسهل التعرف عليها، وتوفير علامة جيدة لتحديد مكان واستخدامها في التوجه في البداية. _content &quot;&gt; Centrioles هي هياكل صغيرة إلى حد ما، وبالتالي ينبغي أن تؤخذ الصور باستخدام 63X أو 100X أهداف، وهو عامل التكبير من 4 6X، والقرار 512 على الأقل 512 بكسل العاشر عندما يكون ذلك ممكنا.

<ol>
	<li>Blachon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+proximal+centriole-like+structure+is+present+in+Drosophila+spermatids+and+can+serve+as+a+model+to+study+centriole+duplication.">A proximal centriole-like structure is present in Drosophila spermatids and can serve as a model to study centriole duplication.</a> Genetics. 182, 133-144 (2009).</li><li>Hennig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis+in+Drosophila.">Spermatogenesis in Drosophila.</a> The International journal of developmental biology. 40, 167-176 (1996).</li><li>Fabian, L., Brill, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+spermiogenesis:+Big+things+come+from+little+packages.">Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages.</a> Spermatogenesis. 2, 197-212 (2012).</li><li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+gene+regulation+during+Drosophila+spermatogenesis.">Molecular mechanisms of gene regulation during Drosophila spermatogenesis.</a> Reproduction. 139, 11-21 (2010).</li><li>Davies, E. L., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+self-renewal+and+differentiation+in+adult+stem+cell+lineages:+lessons+from+the+Drosophila+male+germ+line.">Regulation of self-renewal and differentiation in adult stem cell lineages: lessons from the Drosophila male germ line.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 137-145 (2008).</li><li>Belote, J. M., Zhong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplicated+proteasome+subunit+genes+in+Drosophila+and+their+roles+in+spermatogenesis.">Duplicated proteasome subunit genes in Drosophila and their roles in spermatogenesis.</a> Heredity. 103, 23-31 (2009).</li><li>Xiao, X., Yang, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-based+dynamics+during+spermatogenesis+and+its+significance.">Actin-based dynamics during spermatogenesis and its significance.</a> Journal of Zhejiang University. Science. B. 8, 498-506 (2007).</li><li>Hennig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+proteins+in+the+spermatogenesis+of+Drosophila.">Chromosomal proteins in the spermatogenesis of Drosophila.</a> Chromosoma. 111, 489-494 (2003).</li><li>Wakimoto, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doubling+the+rewards:+testis+ESTs+for+Drosophila+gene+discovery+and+spermatogenesis+expression+profile+analysis.">Doubling the rewards: testis ESTs for Drosophila gene discovery and spermatogenesis expression profile analysis.</a> Genome research. 10, 1841-1842 (2000).</li><li>Avidor-Reiss, T., Gopalakrishnan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+centriole.">Building a centriole.</a> Curr Opin Cell Biol. , (2012).</li><li>Blachon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+asterless+and+vertebrate+Cep152+Are+orthologs+essential+for+centriole+duplication.">Drosophila asterless and vertebrate Cep152 Are orthologs essential for centriole duplication.</a> Genetics. 180, 2081-2094 (2008).</li><li>Basto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flies+without+Centrioles.">Flies without Centrioles.</a> Cell. 125, 1375-1386 (2006).</li><li>Mottier-Pavie, V., Megraw, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+bld10+is+a+centriolar+protein+that+regulates+centriole,+basal+body,+and+motile+cilium+assembly.">Drosophila bld10 is a centriolar protein that regulates centriole, basal body, and motile cilium assembly.</a> Mol Biol Cell. 20, 2605-2614 (2009).</li><li>Rodrigues-Martins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DSAS-6+Organizes+a+Tube-like+Centriole+Precursor,+and+Its+Absence+Suggests+Modularity+in+Centriole+Assembly.">DSAS-6 Organizes a Tube-like Centriole Precursor, and Its Absence Suggests Modularity in Centriole Assembly.</a> Curr Biol. 17, 1465-1472 (2007).</li><li>Stevens, N. R., Dobbelaere, J., Brunk, K., Franz, A., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Ana2+is+a+conserved+centriole+duplication+factor.">Drosophila Ana2 is a conserved centriole duplication factor.</a> J Cell Biol. 188, 313-323 (2010).</li><li>Gopalakrishnan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sas-4+provides+a+scaffold+for+cytoplasmic+complexes+and+tethers+them+in+a+centrosome.">Sas-4 provides a scaffold for cytoplasmic complexes and tethers them in a centrosome.</a> Nat Commun. 2, 359 (2011).</li><li>Gopalakrishnan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+nucleotide+status+controls+Sas-4-dependent+pericentriolar+material+recruitment.">Tubulin nucleotide status controls Sas-4-dependent pericentriolar material recruitment.</a> Nat Cell Biol. 14, 865-873 (2012).</li><li>Riparbelli, M. G., Callaini, G., Megraw, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+persistence+of+primary+cilia+in+dividing+Drosophila+spermatocytes.">Assembly and persistence of primary cilia in dividing Drosophila spermatocytes.</a> Dev Cell. 23, 425-432 (2012).</li><li>Maines, J. Z., Wasserman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+regulation+of+the+meiotic+Cdc25+protein+Twine+by+the+Dazl+orthologue+Boule.">Post-transcriptional regulation of the meiotic Cdc25 protein Twine by the Dazl orthologue Boule.</a> Nat Cell Biol. 1, 171-174 (1999).</li><li>Herrmann, S., Amorim, I., Sunkel, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+POLO+kinase+is+required+at+multiple+stages+during+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">The POLO kinase is required at multiple stages during spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Chromosoma. 107, 440-451 (1998).</li><li>Yamashita, Y. M., Jones, D. L., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+of+asymmetric+stem+cell+division+by+the+APC+tumor+suppressor+and+centrosome.">Orientation of asymmetric stem cell division by the APC tumor suppressor and centrosome.</a> Science. 301, 1547-1550 (2003).</li><li>Dix, C. I., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Spd-2+Recruits+PCM+to+the+Sperm+Centriole,+but+Is+Dispensable+for+Centriole+Duplication.">Drosophila Spd-2 Recruits PCM to the Sperm Centriole, but Is Dispensable for Centriole Duplication.</a> Curr Biol. , (2007).</li><li>Stevens, N. R., Dobbelaere, J., Wainman, A., Gergely, F., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ana3+is+a+conserved+protein+required+for+the+structural+integrity+of+centrioles+and+basal+bodies.">Ana3 is a conserved protein required for the structural integrity of centrioles and basal bodies.</a> J Cell Biol. 187, 355-363 (2009).</li><li>Giansanti, M. G., Bucciarelli, E., Bonaccorsi, S., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+SPD-2+Is+an+Essential+Centriole+Component+Required+for+PCM+Recruitment+and+Astral-Microtubule+Nucleation.">Drosophila SPD-2 Is an Essential Centriole Component Required for PCM Recruitment and Astral-Microtubule Nucleation.</a> Curr Biol. , (2008).</li><li>Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuroblasts+retain+the+daughter+centrosome.">Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome.</a> Nat Commun. 2, 243 (2011).</li><li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+misorientation+reduces+stem+cell+division+during+ageing.">Centrosome misorientation reduces stem cell division during ageing.</a> Nature. 456, 599-604 (2008).</li><li>Zamore, P. D., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Drosophila+melanogaster+testes.">Isolation of Drosophila melanogaster testes.</a> J. Vis. Exp. , e2641 (2011).</li><li>Fuller, M. T., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 71-174 (1993).</li><li>Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+and+microtubule+organization+during+premeiotic,+meiotic+and+early+postmeiotic+stages+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis.">Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis.</a> J Cell Sci. . 107 (Pt. 12), 3521-3534 (1994).</li><li>White-Cooper, H., Schafer, M. A., Alphey, L. S., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+post-transcriptional+control+mechanisms+coordinate+the+onset+of+spermatid+differentiation+with+meiosis+I+in+Drosophila.">Transcriptional and post-transcriptional control mechanisms coordinate the onset of spermatid differentiation with meiosis I in Drosophila.</a> Development. 125, 125-134 (1998).</li><li>Yamashita, Y. M., Mahowald, A. P., Perlin, J. R., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+inheritance+of+mother+versus+daughter+centrosome+in+stem+cell+division.">Asymmetric inheritance of mother versus daughter centrosome in stem cell division.</a> Science. 315, 518-521 (2007).</li><li>Tates, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cytodifferentiation during Spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An Electron Microscope Study. , (1971).</li><li>Baker, J. D., Adhikarakunnathu, S., Kernan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensory-defective,+male-sterile+unc+mutants+identify+a+novel+basal+body+protein+required+for+ciliogenesis+in+Drosophila.">Mechanosensory-defective, male-sterile unc mutants identify a novel basal body protein required for ciliogenesis in Drosophila.</a> Development. 131, 3411-3422 (2004).</li><li>Avidor-Reiss, T., Gopalakrishnan, J., Blachon, S., Polyanovsky, A., Schatten, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Centrosome: Cell and Molecular Mechanisms of Functions and Dysfunctions in Disease. , (2012).</li><li>Gopalakrishnan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+SAS-6+multimer+is+a+core+centriole+building+block.">Self-assembling SAS-6 multimer is a core centriole building block.</a> J Biol Chem. 285, 8759-8770 (2010).</li><li>Hassell, J., Hand, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+fixation+with+diimidoesters+as+an+alternative+to+aldehydes.+I.+Comparison+of+cross-linking+and+ultrastructure+obtained+with+dimethylsuberimidate+and+glutaraldehyde.">Tissue fixation with diimidoesters as an alternative to aldehydes. I. Comparison of cross-linking and ultrastructure obtained with dimethylsuberimidate and glutaraldehyde.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 223-229 (1974).</li><li>Pisano, C., Bonaccorsi, S., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kl-3+loop+of+the+Y+chromosome+of+Drosophila+melanogaster+binds+a+tektin-like+protein.">The kl-3 loop of the Y chromosome of Drosophila melanogaster binds a tektin-like protein.</a> Genetics. 133, 569-579 (1993).</li></ol>

وأيد حرية الوصول إلى هذا المنشور من قبل لايكا مايكروسيستمز.

دراسة البيولوجيا الجسيم المركزي في الخصيتين الطاير باستخدام علامات centrosomal الموسومة راثيا هو طريقة مفيدة لتقييم وظيفة الجسيم المركزي والنشاط في كل من النوع البري ومتحولة السياق. على وجه الخصوص، والمسار هو مناسبة لفحص السريع للشذوذ centrosomal مثل تشوه، misegregation، وعدم الاستقرار، أو طول غير طبيعي في محاولة لتحديد طفرات جديدة. علاوة على ذلك، أهداب أرومة النطفة في الأعمال التحضيرية الحية تبقى متحركة لحوالي 15 دقيقة بعد تشريح واستخدام الخصيتين يعيش في المسار A كما يسمح للالحيوانات المنوية على الحركة أن تعالج بسهولة. منذ نشاط الحيوانات المنوية أهداب متحركة يرتبط مباشرة إلى وظيفة الجسيم المركزي، لا يمكن أن يؤديها المقايسات لتحديد آثار الطفرات المختلفة centrosomal على وظيفة الهدبية. المسار B يمكن استخدامها لملاحظات أكثر تحديدا وخاصة عندما يكون مطلوبا البيانات الإحصائية مثل لإحصاء عدد centrioles لكل خلية وأو عدد الخلايا في الكيس. المسار C هو الأكثر usefuلتر بالنسبة للملاحظات التفصيلية التي تتطلب تلطيخ مع الأجسام المضادة. وتشمل الأمثلة وضع العلامات من نوع خلية معينة مثل الخلايا الجذعية، وتلطيخ من البروتين الذي ليس لديه علامة المتاحة مثل تويولين الأسيتيل، أو للتحقق من عدم وجود أو mislocalization من البروتين في متحولة. عند التصوير centrosomes والهياكل ذات الصلة الجسيم المركزي، وذلك باستخدام علامات وراثيا الموسومة بدلا من الأجسام المضادة ليست فقط أسهل تجريبيا، ولكن أيضا يوفر نتائج أكثر قوة واستنساخه. ولذا، فإن استخدام البروتينات centrosomal الموسومة راثيا هو نهج يمكن الاعتماد عليها لتحليل الآلية والكمية التي تتطلب مجموعة البيانات الكبيرة. على سبيل المثال، فقد تم استخدام علامات centrosomal الموسومة راثيا ذات قيمة خاصة لتقدير حجم طول مريكز. وقد كشف هذا التحليل أن مختلف الطفرات يمكن تصنيفها إلى فئتين استنادا إلى التباين في طول مريكز. وتشمل فئة واحدة الطفرات التي تشانجنرال الكتريك طول مريكز ولكن لا تؤثر على الانحراف المعياري 1 والفئة الأخرى تشمل الطفرات التي تؤثر على كل من طول مريكز والانحراف المعياري في الطول 11. يمكن لمثل هذه البيانات الكمية توفر نظرة متعمقة مفيدة في وظيفة معينة الجينات centrosomal. قد يكون راجعا إلى زعزعة استقرار هيكل مريكزي المسوخ Centrosomal الذي يحمل عيب طول مريكز مع زيادة في الانحراف المعياري. ومع ذلك، معيبة طول مريكز مع الخطأ المعياري العادي قد يشير إلى أن الطفرات لا هيكليا في زعزعة استقرار مريكز وعلى الأرجح أن ذلك يعود إلى تغير في آلية تنظيمية السيطرة على طول مريكز. بسبب التضارب في المناعية، التحليلات الكمية هي صعبة مع استخدام علامات الأجسام المضادة وحدها. والجسيم المركزي هو كبير وبناء البروتينية المعقدة والكثير من البروتينات التي لا توجد إلا في باطنها. باستخدام centrosomal راثيا الموسومةعلامات بدلا من الأجسام المضادة يسمح احد لتسمية باستمرار المكونات الداخلية للالجسيم المركزي الذي لا يمكن الوصول إليها إلا قد يكون لعلامات الضد الحواتم. على سبيل المثال، ودراسات توطين BLD10 باستخدام الأجسام المضادة يجد البروتين لتخصيبه في نهايات القاصي والداني من مريكز 13، في حين يظهر BLD10-GFP توزيع أكثر اتساقا 1. ومع ذلك، فمن المهم أيضا النظر في مستوى التعبير عن بروتين معين وراثيا الموسومة، وهذا يمكن أن يؤثر على توزيع البروتين. أعرب توطين ساس-4-GFP وSAS-6-GFP تحت الوطنية لديها يقتصر على الغايات القريبة من مريكز 1،16،35 ومن ناحية أخرى، أعرب ساس-4-GFP وSAS-6-GFP تحت يتم ترجمة المروج اليوبيكويتين قوية على طول من مريكز 12،14. هناك اعتبار آخر مهم هو تأثير العلامة الجينية على وظيفة البروتين. يمكن تحليل البروتينات الموسومة إذا وراثيا وظيفية تكون الاحصائيينتيد عن طريق إدخال البروتين المعدلة وراثيا الى خلفية متحولة ودراسة ما إذا كان البروتين المعدلة وراثيا النمط الظاهري ينقذ متحولة. تثبيت الخصيتين من ذبابة الفاكهة يمكن القيام بها باستخدام مجموعة متنوعة من مثبتات كيميائية. هنا، نحن تصف التثبيت مع كل من الفورمالديهايد (المسار B) والميثانول، الأسيتون (المسار C). ومع ذلك، إما تثبيتي يمكن استخدامها بالتبادل، ومنذ عدة مثبتات قد يعطل كيميائيا الحواتم الأجسام المضادة الأم، يجب تحديد اختيار المناسب لتثبيتي المناعية تجريبيا. ومثبتات التالية وشروط الحضانة وتستخدم عادة: 3.7٪ الفورمالديهايد، 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة؛ الميثانول، 15 دقيقة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية، الأسيتون، 10 دقيقة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية، والميثانول، و15 دقيقة في -20 درجة مئوية. تليها الأسيتون، 30 ثانية عند درجة حرارة -20 درجة مئوية؛ الإيثانول، 20 دقيقة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. على الرغم من أن التثبيت مع الأسيتون، والميثانول، والإيثانول لا تتطلب خطوة permeabilization الموسعة لالمناعية، واي التثبيتوينبغي اتباع ال الفورمالديهايد قبل 1 ساعة حضانة في PBST-B في درجة حرارة الغرفة لpermeabilize أغشية الخلايا وتسمح بالوصول إلى الضد الحواتم داخل الخلايا. وعلاوة على ذلك، فإن بعض مثبتات هي أكثر ملاءمة لمستضدات معينة. على سبيل المثال، وظائف الفورمالديهايد جيدا لتثبيت البروتينات الصغيرة، في حين الميثانول والأسيتون هي مناسبة تماما للتثبيت من المجمعات الجزيئية كبيرة 36. وقد المناعية من ذبابة الفاكهة الخصيتين سابقا صفها لمراقبة الهياكل ونين وأنيبيب الهيكل الخلوي 29،37. هنا (المسار C)، وقد تم تحسين الإجراء لتحليل الهياكل التي تحتوي على البروتينات الموسومة centrosomal وراثيا. نحن نقدم وصفا مفصلا لهذا الإجراء لتوجيه الأفراد الذين يفتقرون إلى الخبرة في العمل في الخصيتين ذبابة الفاكهة. ويشمل هذا الإجراء أيضا تعديلات لتحسين الحفظ والتشكل من الخصيتين، مثل باستخدام قiliconized coverslips وموجبة الشحنة شرائح المجهر الزجاجية.

الخصيتين ذبابة الفاكهة هي نظام الجهاز مناسبة لدراسة مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية والتنموية وتم استعراض نطاق واسع على مدى السنوات 1-9. يركز هذا المخطوط على استخدام الخصيتين ذبابة الفاكهة لدراسة الجسيم المركزي، وهي عضية الخلوية الحفظ. كما هو الحال في الأنظمة الأخرى، والجسيم المركزي وظيفة الخصيتين ذبابة الفاكهة في الانقسام، الانقسام الاختزالي، وتكون الأهداب 10. وتتكون Centrosomes من زوج من الهياكل القائمة على أنيبيب المعروفة باسم centrioles تحيط بها شبكة معقدة من البروتين المواد المشار إليها محيط بالمريكز باسم (PCM). ويتألف الزوج مريكز من مريكز الأم الأكبر سنا والأصغر سنا ابنة مريكز. كما تقدم الخلية نحو الانقسام، سواء centrioles فصل، مكررة، والحصول على كمية كبيرة من PCM لتشكيل نهاية المطاف اثنين centrosomes متميزة. يشار إلى الجسيم المركزي الذي يحتوي على مريكز الأم الأصلي باسم الجسيم المركزي الأم والمركيشار osome تحتوي على ابنة مريكز الأصلي على أنها ابنة الجسيم المركزي. الخصيتين ذبابة الفاكهة مثالية لدراسة الأساس الجزيئي للبيولوجيا الجسيم المركزي بواسطة المجهر الفلورسنت لمجموعة متنوعة من الأسباب. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم حفظها معظم البروتينات ذبابة الفاكهة التي مطلوبة من أجل البيولوجيا الجسيم المركزي في الخصيتين بين حقيقيات النوى، مما يوحي بأن البصيرة ذات الصلة لعلم الأحياء الجسيم المركزي في البشر والأنواع الأخرى يمكن الحصول عليها من خلال دراسة الجسيم المركزي في ذبابة الفاكهة الخصيتين 1،11-14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل أداء متحولة في ذبابة الفاكهة يوفر ميزة كبيرة منذ ذلك الحين، على عكس العديد من النماذج الأخرى، والطفرات centrosomal في ذبابة الفاكهة ليست قاتلة الجنينية، مما يسمح للتحليل الجيني الكلاسيكية وظيفة الجسيم المركزي. هذه الميزة الفريدة لذبابة الفاكهة بسبب وجود مساهمة الأمهات التي استمرت خلال المراحل الحرجة من develo الجنينيةpment. 1،11-14. وبالتالي، يمكن للمرء أ) الطفرات الدراسة أن القضاء نهائيا على تشكيل الجسيم المركزي وب) دراسة مصير الجسيم المركزي العادية التي تشكلت في الجنين في وقت مبكر عن طريق مساهمة الأمهات في سياق متحولة بعد أن تم استنفاد مساهمة الأمهات (مبدأ الأسلوب الموضح في 11). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتوفر الجينات المحورة وظيفية مع العلامات الفلورية المرمزة وراثيا أن تسمية الجسيم المركزي. العديد من هذه الخطوط تستخدم المروج البروتين نفسه لدفع النسخ من التحوير من أجل منع من overexpression قوية. هذا مهم بشكل خاص لأن overexpression من البروتينات غالبا ما يؤدي إلى القطع الأثرية التي تتداخل مع وظيفة تحليل الجسيم المركزي 1،11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومريكز والجسيم المركزي طويلة فريد طوال ذبابة الفاكهة الحيوانات المنوية، وبالتالي السماح للتحليل السريع والسهل من الجسيم المركزي قبل التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خطوات متتالية في الحيوانات المنوية والجسيم المركزي بويتم تنظيم iology زمنيا على طول الخصيتين، بدءا من طرف الخصية مع centrosomes الخلايا الجذعية الحيوانات المنوية وتنتهي في أسفل الخصيتين مع انخفاض حجم الجسيم المركزي والنشاط في خلايا الحيوانات المنوية الناضجة (الشكلان 1 و 2). وهذا يسمح لسهولة تحديد وتحليل وظيفة الجسيم المركزي خلال مراحل مختلفة من التنمية الحيوانات المنوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تشريح الخصيتين بسهولة من يرقات الذكور، الشرانق، والكبار 27. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال الحيوانات المنوية، والجسيم المركزي وcentrioles في المضي قدما من خلال التركيبية متعددة والهيكلية والوظيفية الدول لتعمل في الانقسام، الانقسام الاختزالي، وتشكيل هدب. خلال هذه العمليات، وتجميع الجسيم المركزي، التكرارات، يهاجر، والمراسي لأجزاء معينة من الخلايا، وينضج، والقسمة، ويخلق هدب. وعلاوة على ذلك، فإن مريكز من أرومة النطفة الناضجة يثير تمهيدا مريكزي يدعى PCL 1. أيضا في أرومة النطفة ناضجة، والجسيم المركزي يخضع لعملية جalled الحد الجسيم المركزي حيث أنه يفقد العديد من العناصر من PCM ومريكز (الشكلان 1 و 2). وبالتالي، دراسات في الخصيتين تسمح لأحد لمعالجة جوانب متعددة من الحياة الجسيم المركزي مثل الاحتفاظ الجسيم المركزي في الخلايا الجذعية، والازدواجية مريكز والاستقرار مريكز، واستطالة مريكز، والفصل مريكز والفصل العنصري، PCM التوظيف، وتكون الأهداب، وتشكيل PCL، والحد من الجسيم المركزي، و التنوي أنيبيب نجمي من بين آخرين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخيرا، وبمساعدة دراسات البيولوجيا الجسيم المركزي قبل غيرها من الخصائص المعروفة من ذبابة الفاكهة التي جعلت من كائن النموذج المفضل للدراسات البيولوجية. وتشمل هذه فترة قصيرة جيل، وسهولة علم الوراثة، وكذلك الطفرات العشوائية وتوجه الموقع. </li></ol> معا، وخصائص ذكر أعلاه من ذبابة الفاكهة الخصيتين يقدم نموذجا حيث الجسيم المركزي يمكن دراستها عن طريق سهلة وسريعة ومفصلة التصوير. التقنيات الموضحةفي هذه الورقة تم تطبيقها على تحقيق العديد من جوانب علم الأحياء الجسيم المركزي بما في ذلك تشكيل مريكز 11، الازدواجية مريكز 15، PCM تجنيد 16، وتنظيم الجسيم المركزي 17، وتكون الأهداب 18. كما تم تطبيق هذه التقنيات لدراسة الجسيم المركزي في مناطق أخرى من الأحياء مثل تنظيم الانتصافي 19، والتجمع المغزل 20، والنشاط الجسيم المركزي في انقسام الخلايا الجذعية غير المتكافئة 21 ضمن أشياء أخرى كثيرة. التصوير من الخصيتين في بدايات الجسيم المركزي مع الحصول على الذباب التي تعبر عن البروتينات centrosomal راثيا الموسومة وعزل الخصيتين من يرقات الذكور، الشرانق، أو الذباب الكبار. تتوفر العديد من المجموعات البحثية هذه الذباب 1،11،15،22-25. الخصيتين اليرقات تحتوي على جميع مراحل تكوين الحيوانات المنوية قبل الانقسام الاختزالي ومفيدة عند تحليل الطفرات التي هي قاتلة في خادرة أو الكبار. ومع ذلك، في وقت متأخر أو العذراء أدو الشبابالخصيتين لتر هي الأكثر قوة وتحتوي على جميع مراحل ما قبل وما بعد الانتصافي من الحيوانات المنوية، مما يجعلها الأفضل للتحليل. لأن عدد الخلايا المنوية تتناقص مع العصور ذبابة، واستخدام الخصيتين الكبار هو أيضا مناسبة لدراسة الجسيم المركزي في سياق الشيخوخة 26. وهناك طريقة للخصية بمعزل عن الذباب الكبار وقد وصفت سابقا 27. لا يمكن أن يتحقق من التصوير centrosomes وظيفتها في الخصيتين ذبابة الفاكهة عبر ثلاثة مسارات ذات الصلة التي يتم تقديمها هنا (الشكل 3). اختيار المسار الذي هو الأنسب يعتمد على طبيعة المسألة المحقق تعالج. المسار A ينطوي على التصوير من الخصيتين الحية. هو أسرع من المسارات الثلاثة ولكن يمكن تطبيقها فقط عندما لا تحتاج العينات ليتم الحفاظ عليها وعندما المناعية غير مطلوب. في المسار A، هي التي شنت الخصيتين (سليمة، مثقوب أو قطع) على الشرائحوممرود بعناية تحت ساترة لتشكيل طبقة واحدة من الخلايا يسهل التعرف عليها. ثم يتم تصور الخلايا باستخدام المجهر على حد سواء وعلى النقيض من المرحلة المجهر الفلورسنت. استخدام على النقيض من المرحلة أهمية خاصة لتحليل الخصيتين ذبابة الفاكهة لأنه يكشف عن معلومات الخلوية التي هي غير مرئية مع أشكال أخرى من الإضاءة المنقولة وبالتالي يسمح لتحديد سريع لمراحل مختلفة من التطوير الحيوانات المنوية 28،29. ومع ذلك، المسار واثنين من العيوب الرئيسية. الأولى، في كثير من الأحيان للخطر سلامة المورفولوجية للخلايا مرة واحدة وتمزق الخصيتين. الثانية، والخلايا غير المثبتة التحرك في بعض الأحيان داخل العينة، مما يجعل التصوير من طبقات متعددة متحد البؤر داخل المنطقة المحددة صعبة. لتعزيز تحليل أنواع معينة من الخلايا، الخصيتين قد اخترقت أو قطع من أجل توجيه الطريقة التي تمزق الخصية أن مثل سحق تحت الحد الأدنى ساترة يؤثر على التشكل من نوع من الخلايا في المصالح. المسار B ينطوي التثبيت الكيميائية من الخصيتين. هذا المسار يتطلب مبلغ وسيطة من الوقت لإعداد العينات وديه ميزة أن العينات ثابتة يمكن حفظها لتحليلها لاحقا. علاوة على ذلك، تثبيت يعمل على جعل الهياكل الخلوية أكثر جمودا، والتقليل من حركة العينة أثناء التصوير. ومع ذلك، يصبح على النقيض من المرحلة المجهري أقل بكثير بالمعلومات بعد التثبيت الكيميائية، مما يجعل بعض مراحل التنمية الحيوانات المنوية من الصعب التعرف عليها. المسار C هي الأكثر كثافة من الوقت، ولكن له فائدة أضاف أن الهياكل الخلوية والثابتة وimmunostained، والسماح لتصور من البروتينات التي لا تتوفر مع علم الوراثة به المناسبة. هناك العديد من الأجسام المضادة المتاحة سواء تجاريا ومجموعات بحثية من مختلف المناعية للcentrosomes والهياكل ذات الصلة الجسيم المركزي في الخصيتين ذبابة الفاكهة.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/ Equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments/Description</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DAPI</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>D1306</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Positively Charged Slides</td>
 <td>AZER Scientific</td>
 <td>EMS200A+</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Feather Microscalpel</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>72045-30</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>37% Formaldehyde or Paraformaldehyde</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP531-500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
 <td>Boston Bioproducts</td>
 <td>BM-220</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>18x18 mm coverslips number 1.5</td>
 <td>VWR</td>
 <td>48366 205</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nail Polish</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>72180</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sigmacote</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>SL2-100 ml</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Methanol</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>A412-4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetone</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>A949-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Triton-X100</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>T9284-100ML</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BSA</td>
 <td>Jackson ImmunoResearch</td>
 <td>001-000-162</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNAse A</td>
 <td>5 prime</td>
 <td>2900142</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter paper</td>
 <td>Whatman</td>
 <td>1001-055</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass engraver</td>
 <td>Dremel</td>
 <td>290-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TCS SP5 confocal microscope</td>
 <td>Leica </td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mounting Media</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>17985-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Immuno Stain Moisture Chamber, Black</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>62010-37</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass Coplin Staining Jar, Screw Cap</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>70315</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

imaging centrosomes in fly testes

يتم حفظها Centrosomes العضيات القائم على أنيبيب هيكلها وتغير بشكل كبير في جميع أنحاء دورة الخلية وتمايز الخلايا وظيفة. Centrosomes ضرورية لتحديد محور انقسام الخلايا أثناء الانقسام ول nucleate أهداب أثناء الطور البيني. تبقى هوية من البروتينات التي تتوسط هذه التغيرات الدينامية الوحيدة المعروفة جزئيا، وظيفة العديد من البروتينات التي قد تورطت في هذه العمليات لا تزال بدائية. وقد أظهرت الأعمال الأخيرة التي ذبابة الفاكهة الحيوانات المنوية يوفر نظام قوي لتحديد بروتينات جديدة حاسمة من أجل وظيفة الجسيم المركزي وتشكيل وكذلك لاكتساب نظرة ثاقبة على وظيفة معينة من اللاعبين المعروفين في العمليات المتعلقة الجسيم المركزي. ذبابة الفاكهة هو إنشاء نموذج الوراثية الحي حيث المسوخ في الجينات centrosomal يمكن الحصول بسهولة وتحليلها بسهولة. علاوة على ذلك، التطورات الحديثة في الحساسية والقرار من المجهر الضوئي وتطوير علامات centrosomal الموسومة راثيا قوية حولت القدرة على استخدام الخصيتين ذبابة الفاكهة كنظام نموذج بسيط ويمكن الوصول إليها لدراسة centrosomes. توضح هذه الورقة استخدام علامات centrosomal الموسومة راثيا لأداء شاشات الوراثية للطفرات centrosomal جديدة واكتساب نظرة ثاقبة وظيفة محددة من الجينات التي تم تشخيصها حديثا.

Centrosomes الخضوع متعددة التحولات المورفولوجية والوظيفية على مدار الحيوانات المنوية. هذه الخاصية يجعل الحيوانات المنوية الخصيتين نظام مفيد لدراسة مختلف جوانب علم الأحياء الجسيم المركزي. واحدة من هذه العملية بسهولة لاحظ هو استطالة الجسيم المركزي. في أمهات المني، علامة مريكزي Ana1-GFP يصادف (4A الشكل) 0.6 ميكرون مريكز طويلة. هذا مريكز يستطيل خلال الحيوانات المنوية ويبلغ طولها 2.5 ميكرومتر في طلائع منوية ناضجة تقريبا. منذ centrioles في ذبابة الفاكهة الحيوانات المنوية هي طويلة بشكل فريد، والتصوير يمكن أن تستخدم لجعل البيانات الكمية المتعلقة استطالة الجسيم المركزي (الشكل 4B). ويمكن أيضا تحليل طول مريكز أن يؤديها في خلفية متحولة وتم تحديدها مختلف المسوخ التي تغير النمو مريكز (الشكل 5). الأمثلة هي دائما في وقت مبكر (ALY) وتسديدة صاروخية (يمكن)، والطفرات التي عراسر الحيوانات المنوية قبل بدء الانقسام الاختزالي 30 ولكن لا تحجب مريكز استطالة. في هذه المسوخ، centrioles منوية ناضجة من النمو إلى حوالي 2.4 ميكرومتر ~ مقارنة centrioles من الخلايا السيطرة التي تصل بحد أقصى 1.8 ميكرون. <img src="/files/ftp_upload/50938/50938fig1.jpg" alt="الشكل 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50938/50938fig1highres.jpg"/> الشكل 1. الحيوانات المنوية والبيولوجيا الجسيم المركزي. أ) تطوير الخلايا الجذعية وأمهات المني. جميع الخلايا المنوية تنشأ من الخلايا الجذعية الموجودة في الطرف القمي من الخصيتين. يقسم كل الخلايا الجذعية غير متماثلة لتشكيل الخلايا الجذعية أن يرث الجسيم المركزي أم وspermatogonium السلف يرث ابنة الجسيم المركزي 31. كما شكل أمهات المني، فإنها تصبح محاطة 2 خلايا الكيس، التي لا تزال تحيط الخلايا المنوية والحيوانات المنوية في جميع أنحاء طلائع منوية. أمهات المني الفجوة 4 مرات لإنتاج 16 أمهات المني، كل منها يحتوي على اثنين centrioles. ب) تطوير الخلايا المنوية والانقسام الاختزالي. أثناء تطوير منوية، centrioles تكرار مرة أخرى لتوليد أربعة centrioles تنظيمها في اثنين من أزواج لكل خلية و 64 centrioles في الكيس. في وقت مبكر خلال تطوير منوية، كل مريكز ينتقل إلى غشاء البلازما، والاحواض لذلك، ويستطيل لتشكيل هيكل يشبه هدب الأولية 18،32-34. في الخلايا المنوية الناضجة، وطول يصل مريكز ~ 1.8 ميكرون. وcentrosomes تلعب دورا أساسيا في الانقسام الاختزالي. أثناء الانقسام الاختزالي الأول، أزواج مريكز التي لا تزال تعلق على غشاء البلازما الخطوة نحو مركز الخلية، وخلق خلية غشاء invaginations في تلميح بهم القاصي. وPCM حول centrioles ينمو، nucleates الأنابيب الدقيقة نجمي، وcolocalizes مع قطب المغزل. أثناء الانتقال إلى الانقسام الاختزالي الثاني، الزوج مريكز يفصل بحيث يتم حاضرا سوى مريكز واحدر في كل قطب المغزل. C) تكون النطاف. في نهاية الانقسام الاختزالي الثاني، وأرومة النطفة جولة في وقت مبكر لديها مريكز واحدة تعلق على غشاء البلازما invaginated. تم العثور على المشتقة الميتوكوندريا جولة كبيرة بالقرب من النواة ويبدأ في وقت لاحق إلى استطال على طول الخيط المحوري المتزايد في وقت لاحق طلائع منوية جولة. خلال الحيوانات المنوية، وأشكال الخيط المحوري ويستطيل داخل السيتوبلازم. بالإضافة يظهر هيكل مريكزي الجديدة المعروفة باسم PCL (الدانية مريكز مثل) بالقرب من مريكز قبل الإيجاد 1. في نهاية الحيوانات المنوية، والخلايا تقاسم كيس مشتركة منفصلة عن بعضها البعض لتصبح الحيوانات المنوية متحركة ناضجة تماما. المخططات التنمية منوية (B) وتكون النطاف (C) تصور خلية واحدة فقط من أصل 16 المنوية وطلائع منوية 64، على التوالي في الكيس، وليس لتصوير الخلايا الكيس. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50938/50938fig1large.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة كبيرة</a><html> الرقم ص. <img src="/files/ftp_upload/50938/50938fig2.jpg" alt="الرقم 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50938/50938fig2highres.jpg"/> الشكل 2. ذبابة الفاكهة الخصية. تراكب من مرحلة التباين وGFP مضان صورة مجهرية من الخصية كله جبل معربا عن علامة عموم مريكزي آنا-1-GFP. يتم فصل منطقة متميزة المقابلة لوحات 1-3 من الشكل 1 بواسطة خط أحمر متقطع A) الخلايا الجذعية وأمهات المني، B) والخلايا المنوية الانقسام الاختزالي، C) تكون النطاف. <img src="/files/ftp_upload/50938/50938fig3.jpg" alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50938/50938fig3highres.jpg"/> الرقم 3. يتابع نحو التصوير Centrosomes في ذبابة الفاكهة الخصية. : together.within المحافظة على صفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50938/50938fig4.jpg" alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50938/50938fig4highres.jpg"/> الشكل 4. الجسيم المركزي الاستطالة خلال الحيوانات المنوية. A) يظهر كل مرحلة صورة على النقيض من المرحلة (يسار)، وصورة مضان (وسط)، وصورة مكبرة من الجسيم المركزي (يمين). يوضح الصورة على النقيض من المرحلة مرحلة خلية معينة استنادا إلى موقف ومورفولوجية الخلية، النواة، نوية، والميتوكوندريا. يظهر صورة مضان الحمض النووي ملطخة دابي (الأزرق). يظهر الصورة الجسيم المركزي centrosomes صفت من قبل Asterless-GFP (الاصل، وأعلى صور) وAna1-GFP (Ana1، الصورة أسفل). دائرة بيضاء يسلط الضوء على غشاء الخلية في كل مرحلة التباين ومضان الصور. الدوائر البيضاء متقطع والدائرة الرمادية في الصورة مضان تسليط الضوء على موقف نواة ونوية، على التوالي. يشير السهم الأصفر إلى الصبغي Y-بعض الحلقات. أحمر متقطع الدوائر بمناسبة الميتوكوندريا. المراحل 1-6 يشير إلى 29 ومراحل 13-17 يشير إلى وصف مراحل خلية في 32. المرحلة 1: منوية الابتدائية. التعرف على خلية صغيرة غيض من الخصية. المرحلة 2A: القطبية منوية. التي حددتها وجود غطاء الميتوكوندريا على جانب واحد من النواة. المرحلة 3: عديم الأقطاب منوية. النسبية التي حددها لها حجم أكبر من منوية الأولية وعدم وجود غطاء الميتوكوندريا. المرحلة 4: منوية الابتدائية. التي حددها ظهور جميع: كل 3 حلقات Y كروموسوم. المرحلة 5: منوية ناضجة الابتدائية. أكبر منوية أنتجت في الحيوانات المنوية التي تحمل لزيادة أخرى في حجم النووية. المرحلة 6: منوية السابق للانتصاف الابتدائية. الحلقات Y كروموسوم تتفكك وتختفي النواة. المرحلة 13: البصل المرحلة أرومة النطفة. خلية تحتوي على نواة مستديرة متساوية الحجم والميتوكوندريا. المرحلة 17: أرومة النطفة في وقت متأخر. حددت باعتبارها أرومة النطفة ممدود التي لا تزال جزءا من bundl(ه) من 64 طلائع منوية مع نوى وجدت بالقرب من قاعدة الخصيتين.، نواة أوسع قليلا من طلائع منوية ناضجة وجدت في الحويصلة المنوية. أشرطة النطاق، 10 ميكرومتر و 1 ميكرومتر. B) رسم بياني يصور المتوسط ​​والانحراف المعياري لكل مرحلة مقاسا Asterless-GFP (الازرق) وAna1-GFP (الخضراء). في المرحلة 6، Asterless-GFP (الازرق) وAna1-GFP (الخضراء) المتوسطات والانحرافات المعيارية وتتداخل فقط Asterless-GFP (الأزرق) هو واضح. ابتداء من الساعة 13 مرحلة، Asterless-GFP لا تزيين مريكز كله ولم يحدد القياسات (ND). <img src="/files/ftp_upload/50938/50938fig5.jpg" alt="الرقم 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50938/50938fig5highres.jpg"/> الرقم 5. Centrioles طويلة بشكل غير طبيعي في المرحلة 6 من الخلايا المنوية على وسعها المسوخ. AC) صورة مجهرية ضوء الخصيتين كله ولوحة الفلورسنت من ممثل الجسيم المركزي لاbeled بواسطة Ana1-GFP. لاحظ شكل غير طبيعي في الخصيتين في وسعها على المسوخ، والذي ينتج من نقص طلائع منوية نتيجة لاعتقال الانتصافي. D) رسم بياني يصور المتوسط، الانحراف المعياري، وتوزيع البيانات من طول مريكز في البرية من نوع، ويمكن على . عدد العينة لكل نقطة بيانات في أقواس. شريط النطاق، 1 ميكرون.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Centrosomes in Fly Testes at JoVE.com

Imaging Centrosomes in Fly Testes

التصوير من البروتينات centrosomal خلال ذبابة الفاكهة الحيوانات المنوية هو وسيلة قوية لتحديد بروتينات جديدة الحرجة للبيولوجيا الجسيم المركزي وكذلك لتوضيح وظيفة معينة من اللاعبين المعروفين في هذه العملية.

Centrosomes التصوير في يطير الخصية

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Cell Division

SCIENTISTS IN ACTION

15.8K Views.  University of Toledo.  التصوير من البروتينات centrosomal خلال ذبابة الفاكهة الحيوانات المنوية هو وسيلة قوية لتحديد بروتينات جديدة الحرجة للبيولوجيا الجسيم المركزي وكذلك لتوضيح وظيفة معينة من اللاعبين المعروفين في هذه العملية. 

Video: Imaging Centrosomes in Fly Testes

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

التصوير تغيير الشكل في الخلية الحية ذبابة الفاكهة الأجنة

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

عزلة ذبابة الفاكهة السوداء البطن الخصيات

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich vascularization and high density of mitochondria. BAT plays a major role in energy expenditure and non-shivering thermogenesis in newborn mammals as well as the adults 1. BAT-mediated thermogenesis is highly regulated by the sympathetic nervous system, predominantly via &beta; adrenergic receptor 2, 3. Recent studies have shown that BAT activities in human adults are negatively correlated with body mass index (BMI) and other diabetic parameters 4-6. BAT has thus been proposed as a potential target for anti-obesity/anti-diabetes therapy focusing on modulation of energy balance 6-8. While several cold challenge-based positron emission tomography (PET) methods are established for detecting human BAT 9-13, there is essentially no standardized protocol for imaging and quantification of BAT in small animal models such as mice. Here we describe a robust PET/CT imaging method for functional assessment of BAT in mice. Briefly, adult C57BL/6J mice were cold treated under fasting conditions for a duration of 4 hours before they received one dose of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG). The mice were remained in the cold for one additional hour post FDG injection, and then scanned with a small animal-dedicated micro-PET/CT system. The acquired PET images were co-registered with the CT images for anatomical references and analyzed for FDG uptake in the interscapular BAT area to present BAT activity. This standardized cold-treatment and imaging protocol has been validated through testing BAT activities during pharmacological interventions, for example, the suppressed BAT activation by the treatment of &beta;-adrenoceptor antagonist propranolol 14, 15, or the enhanced BAT activation by &beta;3 agonist BRL37344 16. The method described here can be applied to screen for drugs/compounds that modulate BAT activity, or to identify genes/pathways that are involved in BAT development and regulation in various preclinical and basic studies.

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

A method of functional imaging of mouse brown adipose tissue (BAT) is described in which cold-stimulated uptake of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) in BAT is non-invasively assessed with a standardized micro-PET/CT protocol. This method is robust and sensitive to detect differences in BAT activities in mouse models.

وظيفية التصوير الشحوم البنية في الفئران مع micro-PET/CT FDG

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose  tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich  vascularization and high ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

يعيش التصوير من تخليص الخلية أفكارك أثناء<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

تحليل الخلوي الحيوانات المنوية: الأعمال التحضيرية لايف والثابتة من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الخصية

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

الكمية المناعي الفحص لقياس التفاوت في مستويات البروتين في Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

عالية الدقة التصوير الوقت الفاصل بين وتحليل الآلي للأنيبيب حيوية في المعيشة السري الإنسان خلايا الوريد غشائي

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods for safe storage of genetic resources beyond the common practices of keeping breeding colonies. The main purpose of this study was to adapt the needle immersed vitrification (NIV) procedure to cryopreserve whole zebrafish testes. Cryopreservation of early-stage germ cells by whole testes NIV offers possibilities for the storage of zebrafish genetic resources, especially since after transplantation they can mature into both male and female gametes. Testes were excised, pinned on an acupuncture needle, equilibrated in two cryoprotective media (equilibration solution containing 1.5 M methanol and 1.5 M propylene glycol; and vitrification solution containing 3 M dimethyl sulfoxide and 3 M propylene glycol) and plunged into liquid nitrogen. Samples were warmed in a series of three consequent warming solutions. The main advantages of this technique are (1) the lack of spermatozoa after digestion of warmed testes thus facilitating downstream manipulations; (2) ultra-rapid cooling enabling the optimal exposure of tissues to liquid nitrogen therefore maximizing the cooling and reducing the required concentration of cryoprotectants, thereby reducing their toxicity; (3) synchronous exposure of several testes to cryoprotectants and liquid nitrogen; and (4) repeatability demonstrated by obtaining viability of above 50% in five different zebrafish strains.

The main purpose of this study was to adapt the needle immersed vitrification (NIV) procedure to cryopreserve whole zebrafish testes. Additionally, the repeatability of the method in five different zebrafish strains was tested.

للواسمات Spermatogonia الزرد بأكملها الخصيتين إبرة مغمورة تبريد فائقة السرعة

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water deficit or pathogens plays a crucial role. Identifying small molecules that regulate stomatal movement can therefore contribute to understanding the physiological basis by which plants adapt to their environment. Large-scale screening approaches that have been used to identify regulators of stomatal movement have potential limitations: some rely heavily on the abscisic acid (ABA) hormone signaling pathway, therefore excluding ABA-independent mechanisms, while others rely on the observation of indirect, long-term physiological effects such as plant growth and development. The screening method presented here allows the large-scale treatment of plants with a library of chemicals coupled with a direct quantification of their transpiration by thermal imaging. Since evaporation of water through transpiration results in leaf surface cooling, thermal imaging provides a non-invasive approach to investigate changes in stomatal conductance over time. In this protocol, Helianthus annuus seedlings are grown hydroponically and then treated by root feeding, in which the primary root is cut and dipped into the chemical being tested. Thermal imaging followed by statistical analysis of cotyledonary temperature changes over time allows for the identification of bioactive molecules modulating stomatal aperture. Our proof-of-concept experiments demonstrate that a chemical can be carried from the cut root to the cotyledon of the sunflower seedling within 10 minutes. In addition, when plants are treated with ABA as a positive control, an increase in leaf surface temperature can be detected within minutes. Our method thus allows the efficient and rapid identification of novel molecules regulating stomatal aperture.

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

We provide a method for identifying modulators of foliar transpiration by large-scale screening of a compound library.

تحديد المنظمين رواية نتح النبات من خلال فحص التصوير الحراري على نطاق واسع في Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...