ويدعم VN من قبل الجمعية الملكية. JPR هو المستقبل زميل مجلس البحوث الأسترالي (FT0992129). نشكر الدكتور ميريام جيفورد لقراءة نقدية للمخطوطة.

ملاحظة: تتم جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة، ما لم ينص على خلاف ذلك. 1. إعداد المواد النباتية والمخازن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لN. benthamiana <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الأجرعية المورمة سلالات من الفائدة للتعبير عابر (في هذا المثال الملف Prf-FLAG، الملف Prf-3xHA، قدرة الإنطلاق-FLAG وناقلات الفارغة كعنصر تحكم) عن طريق هز (200 دورة في الدقيقة) في الثقافة السائل (L المتوسطة مع المضادات الحيوية المناسبة) في 28 ° مئوية حتى مرحلة ثابتة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وجمع بيليه agrobacteria بواسطة الطرد المركزي (3،000 x ج لمدة 5 دقائق). تجاهل طاف و resuspend agrobacteria مكعبات العازلة في التسلل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس كمية agrobacteria عن طريق الحصول على الكثافة الضوئية (OD) قيمة بأفضل الامتصاصية من 600 نانومتر (عبس 600 نانومتر). ضبط OD من البكتيريا إلى 0،1-0،8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التسلل N. 4 الاسبوع القديمة النباتات benthamiana (22 درجة مئوية، 16 ساعة ضوء) مع agrobacteria بواسطة هاند (مع حقنة needleless 1 مل) أو فراغ (إضافة 0.02٪ ت / ت السطحي). ملاحظة: استخدم أول ورقة موسعة تقريبا بالكامل، واثنين من الأوراق القديمة على الفور لأنجع تعبير البروتين. للكشف عن البروتينات ubiquitinated أو الأسيتيل التسلل أوراق مع 100 نيوتن متر MG-132 أو 100 نانوغرام / مل Trichostatin A، على التوالي، في 1 و 2 يوما بعد تسلل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الأوراق تسلل 2-5 أيام آخر تسلل والتجميد في النيتروجين السائل. تخزين العينات في الفريزر -80 درجة مئوية. ملاحظة: تحديد أفضل مستوى من التعبير عن بروتين من الفائدة مسبقا من قبل أخذ عينات على مدار الساعة من 5 أيام وكشف عن مستويات البروتين immunoblotting. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لA. thaliana خطوط المعدلة وراثيا مستقرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو A. thaliana البذور في 6 لوحات جيدة تستكمل مع 5 مل من السائل MS المتوسطة (1٪ ث / ت السكروز) لكل بئر. وضع 3-5 بذور (تعقيم والطبقية) من خط المعدلة وراثياالإهتمام أو خط السيطرة هو دون تغيير لكل بئر. يهز في 200 دورة في الدقيقة لمدة يومين قبل نقل لوحة لغرفة النمو ويترك لمدة 2 أسابيع (22 درجة مئوية، 10 ساعة ضوء). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات الحصاد والتجميد في النيتروجين السائل. ملاحظة: يمكنك استخدام كعنصر تحكم خط المعدلة وراثيا التعبير عن بروتين لا علاقة لها مع نفس العلامة باسم البروتين من الفائدة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مخازن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العازلة ألف دي الغاز المخزن المؤقت لمدة 1-2 ساعة (لRLKs، وغيرها من الغشاء ملزمة البروتينات والبروتينات النووية، إضافة 1٪ ت / ت IGEPAL CA-630 53). ملاحظة: يمكنك الاحتفاظ الاحتياطي A في 4 درجات مئوية إلى أجل غير مسمى. يمكنك استخدام 1٪ ت / ت تريتون بدلا من IGEPAL CA-360. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 80 مل من البرد العازلة B 1-2 على الأقل ساعة قبل الاستخراج. ملاحظة: نسبة مثالية من الأنسجة العازلة مقابل استخراج هو 01:04 (ث / ت). </li></ol></li></ol> 2. استخراج البروتين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فقط قبل استخراج تحضير 80 مل من البرد العازلة C. <bص /&gt; ملاحظة: إضافة 10 ميكرومتر MG-132 للكشف عن البروتينات ubiquitinated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طحن 20 غرام من N. benthamiana أنسجة (حوالي 15 ورقة) أو A. thaliana الشتلات (2-4 غ لكل لوحة 6 جيدا) في النيتروجين السائل باستخدام قذائف هاون ومدقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 80 مل من البرد العازلة C إلى 20 غرام من الأنسجة الأرض، وتخلط جيدا، وذوبان الجليد على الجليد. ملاحظة: طحن جميع العينات في نفس الوقت (بروتين من الفائدة والسيطرة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التجانس مع 3 رشقات نارية من 10 ثانية لكل بأقصى سرعة مع الخالط الأنسجة (prechilled في 4 درجات مئوية). تصفية من خلال الأنسجة 22-25 ميكرومتر وأجهزة الطرد المركزي في 30،000 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 ° C. ملاحظة: بدلا من ذلك، التجانس مع هاون ومدقة prechilled الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحجب وغسل الخطوات من المصفوفة تقارب، وإعداد 20 مل من العازلة D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كتلة 100 مل من مناسبة مصفوفة تقارب باستخدام 500 مل من البرد العازلة التي تحتوي على 1٪ D BSA لمدة 5 دقائق عند 4 ° C. ملاحظة: المفضل بالعربيةوتشمل مصفوفات finity مكافحة FLAG M2 الاغاروز، Streptavidin الاغاروز، GFP-Trap_A ومكافحة HA الاغاروز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 3X مع 1 مل الباردة العازلة D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف من استخراج أوراق والتصفية من خلال مرشح 0.45 ميكرون حقنة في أنبوب جديد على الجليد. ملاحظة: يجب أن يكون اللون الأخضر أو ​​الأصفر استخراج، وإذا تحولت العينة البني، وتجاهل والبدء من جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ قسامة من استخراج النفط الخام لطخة مناعية، إضافة 5X العازلة SDS-PAGE التحميل ودوامة وتفسد بواسطة عينات المغلي لمدة 10 دقيقة في 80-100 ° مئوية في كتلة الحرارة. </li></ol> 3. مناعي البروتين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم استخراج البروتين إلى قسمين 50 مل أنابيب وإضافة 50 ميكرولتر من المصفوفة تقارب معلقة في الواق D لكل أنبوب. احتضان مع التناوب لطيف لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية. ملاحظة: لم يتم العثور حضانات أطول لزيادة الغلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 600 ميكرولتر (6X حجم حبة من مصفوفة تقارب) من شطف العازلة بإضافة لالعازلة D (تركيزات النهائي): 0.5٪ BSA، الببتيد 0.25 ملغ / مل FLAG (لمكافحة FLAG M2 الاغاروز) أو 10 ملي مد البيوتين (لStreptavidin الاغاروز). ملاحظة: لا ينصح شطف في حالة GFP-Trap_A ومكافحة HA المصفوفات، لذلك الانتقال مباشرة لدرجة الغليان في 1X العازلة SDS-PAGE التحميل، خطوة 3.11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترسيب مصفوفة تقارب بواسطة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية (5 دقائق في 1000 x ج). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ قسامة من مستخلص غير منضم لطخة مناعية، وتجاهل بقية طاف، وترك حوالي 500 ميكرولتر في الجزء السفلي من الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend والحل الطين مع طرف واسعة الجوف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الحل الطين مختلطة من كل من أنابيب واحد إلى 1.5 مل أنبوب. ملاحظة: من الآن فصاعدا، استخدم 1.5 مل المنخفضة البروتين ملزمة أنابيب microfuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3X النبض لمدة 5 ثانية باستخدام جهاز للطرد المركزي الفوق لترسيب مصفوفة تقارب وإزالة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل 3-5X مع 1 مل العازلة الباردة D. بين يغسل ترسيب ماتري تقاربس كما هو موضح سابقا وتجاهل طاف. في غسل مشاركة إزالة الزائدة العازلة D مع إبرة حقنة. ملاحظة: A غسل النهائي باستخدام العازلة D مع 0.1٪ IGEPAL يمكن استخدامها لزيادة خفض ملزم غير محددة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أزل مع 200 ميكرولتر من شطف العازلة المناسبة (لمكافحة FLAG M2 أو Streptavidin الاغاروز خطوة انظر 3.2) 3X، 5 دقائق في كل مرة مع الهز المستمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع eluates 3 في أنبوب واحد. تركيز البروتينات باستخدام 30 ميكرولتر من الراتنج الاستيعاب. دوامة، واسمحوا الوقوف لمدة 5 دقائق ويعجل الراتنج (2 دقيقة عند 10،000 x ج). تجاهل طاف. ملاحظة: للحصول على GFP-Trap_A ومكافحة HA الاغاروز، تخطى الخطوات 3.9 و 3.10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من 1X العازلة SDS-PAGE التحميل إلى مصفوفة تقارب عجلت أو الراتنج الاستيعاب. دوامة ويغلي لمدة 10 دقيقة في 80-100 ° مئوية في كتلة الحرارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمصفوفة تقارب المغلي أو الراتنج لمدة 2 دقيقة في 10،000 ز س. قسامة 5 ميكرولتر من supernatanر لطخة مناعية، وتشغيل مع الكسور الأخرى في الصعود إلى ~ 10 سم طويلة هلام SDS-PAGE (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفصل وتحديد البروتينات فسفرته بواسطة مطياف الكتلة، تحميل 45 ميكرولتر المتبقية في الصعود إلى ~ طويل 19 سم، وهلام SDS-PAGE إذا كان المطلوب فصل إضافي (الشكل 2). ملاحظة: يمكن تضمين حارة فارغ بين كل العينات للحد من تلوث العينات. </li></ol> 4. هضم البروتين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار على هلام SDS-PAGE مع الغروية Coomassie بريليانت الأزرق (cCBB) وصمة عار. ملاحظة: تصغير التعامل مع هلام للحد من التلوث مع keratins. تأكد من أن أيا من المعدات أو الأدوات التي استخدمت لimmunoblotting أو غيرها من الأنشطة التي قد لم يقم تلوث البروتين المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يزيل اللون هلام مع الغسيل وفيرة في الماء، ويفضل O / N. خفض الفرقة من الاهتمام من هلام بشفرة حلاقة نظيفة. ملاحظة: محاذاة هلام مع طخة مناعية إذا necessaراي لتحديد المنطقة الصحيحة. كما الفسفرة يمكن تأخير الهجرة من البروتينات على SDS-PAGE قطع المنطقة على الفور فوق وتحت عصابة من الفائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الزهر شريحة هلام إلى مكعبات من 2-4 ملم (وهذا يضمن أن الجل ستتم تغطيته من الحلول في أنبوب دون عرقلة نصائح ماصة). وضع في أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقدير الحجم المطلوب للحفاظ على هلام المغمورة أيضا. استخدام هذا المبلغ لاشتقاق، الحضانة مع البروتيني واستخراج الببتيد، ومن ثم استخدام مزدوج إلى وحدات تخزين الثلاثي للغسيل. ملاحظة: في هضم نموذجية مع ما يقرب من 100 ميكرولتر من القطع قطع هلام، واستخدام 500 ميكرولتر حل للغسيل، 2 × 180 ميكرولتر من الجفاف، و 150 ميكرولتر للحد، و 120 ميكرولتر لالألكلة، و 120 ميكرولتر للهضم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل قطعة هلام 2 × 20 دقيقة (أو حتى destained) وذلك بإضافة 50٪ أسيتونتريل (في بيكربونات الأمونيوم 50 ملم، ABC). ماصة قبالة الحل مع الحرص على عدم إزالة قطعة هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوى مع 100٪ أسيتوالنتريل لمدة 5 دقائق وإزالة السائل الحرة. ملاحظة: يجب أن تظهر هلام منكمشة والأبيض. إذا استمرت اللون الأزرق، واحتضان أطول في أسيتونتريل / ABC و / أو في درجة حرارة مرتفعة (45-55 درجة مئوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض السندات ثاني كبريتيد البروتين بإضافة 10 ملي DTT في الماء واحتضان لمدة 30-45 دقيقة في 56 درجة مئوية مع الهز. إزالة السائل الحرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بقايا السيستين يؤلكل بإضافة 55 ملي الكلوراسيتاميد (في 50 ملي ABC) لمدة 20-30 دقيقة (درجة حرارة الغرفة، والظلام). إزالة السائل الحرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل قطعة هلام 2 × 10 دقيقة مع 50٪ أسيتونتريل (في 50 ملي ABC). إزالة السائل الحرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوى القطع هلام مع 100٪ أسيتونتريل لمدة 5 دقائق وإزالة السائل الحرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لهضم زيتية، إضافة 40 ميكرولتر من محلول التربسين العمل (100 نانوغرام من التربسين في المخزن الهضم: 50 ملي ABC، 5٪ أسيتونتريل لمدة متوسطها الفرقة Coomassie الملون). السماح قطعة هلام لترطيب لمدة 10 دقيقة. إضافة ما يكفي من العازلة الهضم لتغطية قطعة هلام إذا لزم الأمر. احتضان عند 37 º CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوقف عملية الهضم واستخراج الببتيدات من القطع هلام، إضافة حمض الفورميك 5٪ (50٪ في أسيتونتريل) (إضافة نفس الحجم، حيث بلغ حجم الهضم). يصوتن لمدة 5-10 دقيقة. نقل طاف لأنبوب جديد. كرر استخراج 3X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجفيف الببتيدات بواسطة تجفيد (المفضل) أو المكثف فراغ (مثل السرعة بطالة أو سافانت). تخزينها في -20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يقدم عينتك لقياس الطيف الكتلي. ملاحظة: نحن لدينا عينة المقدمة إلى مرفق مطياف الكتلة في مختبر سينسبري (نورويتش، المملكة المتحدة). البروتوكولات في مرافق مطياف الكتلة تختلف اختلافا كبيرا، ولكن سيتم حله عادة الببتيدات في حمض trifluoroacetic 0.2٪ مع 2٪ أسيتونتريل قبل تحميل على نظام اللوني السائل إلى جانب الالكتروميكانيكية ورذاذ جنبا إلى جنب مطياف الكتلة. </li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة (مالية أو غيرها).

يمكن توضيح آلية تنشيط مستقبلات بواسطة PAMPs والمستجيبات تسهم إلى حد كبير في فهمنا للمناعة النبات. في السنوات ال 20 الماضية، كانت الشاشتين الهجين الوراثية والخميرة مفيدة لاكتشاف خنازير والبروتينات NB-LRR. في الآونة الأخيرة، وقد وضعت البروتوكولات المستندة إلى مطياف الكتلة لتحديد البروتينات تنظم بشكل مختلف خلال المناعي إشارة 55-58، PTMs بهم 11،33،59،60، وتكوين المركبات المناعية 61 والمستجيب يستهدف 62. نحن هنا وصف بروتوكول واضحة لتحديد PTMs تنظيم تفعيل المجمعات المناعي. بالمقارنة مع البروتوكولات التي سبق وصفها، وهذا البروتوكول يسمح تحديد مفصل للتغيرات الديناميكية للPTMs. يمكن بروتوكولات النهج البروتينات واسعة النطاق تحديد PTMs من البروتينات ولكن ليست قادرة على الكشف عن اللدونة موقع PTMs بسبب الحدتبلغ إد من البروتين. في حالة البروتين الفسفرة، والنهج البروتينات على نطاق واسع عادة فقط تحديد المواقع الفسفرة السائد 11،33،59. توصيف مفصل للوضع البروتين الفسفرة يتطلب كمية كبيرة من البروتين التي يمكن الحصول عليها إلا من خلال تنقية جزئية من البروتين المستهدف 47. وصف بروتوكول هنا الأزواج نهج تنقية البروتين الذي ينتج كمية كبيرة من البروتين الهدف، مع تحليل الطيف الكتلي من البروتين النقي. بعد هذا البروتوكول، ويعزى هذا الحدث الفسفرة واحد من قدرة الإنطلاق في الغالب إلى سر-198 كما هو موضح سابقا 52 ولكن أيضا أيد بعض أطياف الطيف الشامل حدثا الفسفرة واحد على الثريونين-195-199 أو الثريونين. عندما لوحظت الأحداث الفسفرة ضعف قدرة الإنطلاق، كان الجمع الغالبة من الأحماض الأمينية فسفرته سر-198-199 والثريونين على الرغم من أن مجموعات على مواقع أخرى لوحظت أيضا (الجدول 1). هذه النتائج تظهر بوضوح اللدونة موقع الفسفرة من تحركات البروتينات والقدرة على البروتوكول وصف لوصف التفاصيل في جميع المواقع الفسفرة ممكن. الخطوات الأكثر أهمية من هذا البروتوكول هي: 1) استخراج كافية من البروتينات؛ 2) حماية PTMs، و 3) كمية كافية من البروتين الهدف. أولا، لاستخراج ما يكفي من البروتينات، فمن المهم لطحن الأنسجة في النيتروجين السائل وبعد ذلك إلى استخدام الخالط الأنسجة كما هو موضح في البروتوكول. إذا الخالط الأنسجة غير متوفرة، ويمكن استخدام قذيفة هاون ومدقة. من المهم أيضا لاستخدام نسبة 1-3 (أو أربعة) من غرام من الأنسجة لحجم استخراج العازلة. وهذا النسيج لتخفيف نسبة وقوة عازلة العالية التي نقترح ضمان أن الرقم الهيدروجيني ستبقى محايدة أثناء عملية الاستخراج. وجدنا أن هذا له أهمية خاصة لA. thaliana والطماطم اضافيةctions 52. حماية PTMs يمكن تحقيقه عن طريق بما في ذلك في جميع مخازن مثبطات الانزيمات المناسبة التي يمكن إزالة PTMs. ومن الأهمية بمكان أيضا لأداء جميع الخطوات في 4 درجات مئوية وprechill مخازن والصكوك. ويمكن تحقيق عائدات أعلى من البروتين المستهدفة باستخدام النباتات معربا عن البروتين بكميات كافية وباستخدام كميات عالية من الأنسجة (حوالي 20 غراما). الخطوة الأكثر أهمية للحصول على كميات كافية من البروتين الهدف هو تركيز البروتين الهدف عن طريق مناعي مباشرة. وسلط الضوء على أهمية هذه الخطوة التي كان فشلنا في تحديد PTMs من قدرة الإنطلاق بعد مناعي الملف Prf نظرا لكمية محدودة من coimmunoprecipitated التسليح (الشكل 2B). في المقابل، مناعي مباشرة لجهاز السياحة أسفرت عن الببتيدات إلى حد كبير أكثر قابلية للقياس (الشكل 2C) مما أدى إلى تغطية حوالي 80٪ من بروتين تسلسل وتحديد PTMs (الجدول 1). نحن أيضا شارعيوصي rongly استخدام حاتمة به للبروتين مناعي. بالمقارنة مع الأجسام المضادة التي أثيرت ضد الأم مصفوفة البروتينات حاتمة به تقارب يمكن أن تسفر عن كميات أكبر من البروتين النقي جزئيا. باستخدام الأجسام المضادة التي أثيرت ضد البروتين قدرة الانطلاق الأصلي 51 (الشكل 2A) للمناعي، وكنا قادرين على تحديد واحد فقط من الفسفرة الموقعين الفسفرة الغالبة من قدرة الإنطلاق. وقد وضعت في المقام الأول هذا البروتوكول لتنقية جزئية من N. benthamiana حشوية البروتين وتحديد اللاحقة من المواقع الفسفرة بهم. ومع ذلك، باستخدام التعديلات الموصوفة هنا، وهذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة لA. البروتينات thaliana وغشاء ملزمة البروتينات. الهدف الرئيسي من هذا البروتوكول هو لانتاج كميات كافية من البروتين المستهدف لتحديد PTMs وليس لتحقيق أعلى نقاء المجمع. إذا نقاء أعلىمطلوب من المجمع خطوة الثانية من تنقية يمكن أن تضاف إلى هذا البروتوكول 52. في هذه الحالة، فإن الخطوة الأولى تسمح شطف من البروتين الهدف من مصفوفة تقارب دون استخدام أملاح عالية أو حمض والخطوة اللاحقة قد يترتب عليها مصفوفة، الأمر الذي يتطلب ظروف قاسية شطف. من المهم التأكيد على أن اختبرناها فقط هذا البروتوكول لتحديد المواقع الفسفرة وأننا حاليا اختبار قدرتها لتحديد مفصل لPTMs إضافية. نتائجنا تظهر بوضوح ممثل اللدونة موقع الفسفرة من تحركات البروتينات والقدرة على البروتوكول وصف لتوصيف المواقع الفسفرة. الأهم من ذلك، أنها تسلط الضوء على أن تحديد مواقع الفسفرة تعتمد في كمية قليلة من البروتينات عن طريق قياس الطيف الكتلي والطفرات نقطة واحدة من المواقع لصناعة السيارات في الفسفرة يمكن أن تعطي نتائج مربكة. نعرض هنا وسابقا 47 </sup&gt; يترافق أن الفسفرة ضعف قدرة الإنطلاق على سر-198-199 والثريونين مع تفعيل المجمع الملف Prf / جهاز السياحة. في المقابل، أظهرت النتائج التي نشرت في وقت سابق أن الطفرات 47،63 نقطة واحدة من السير-198-199 والثريونين إلى ألانين، التي تمنع الفسفرة على هذه المواقع، هي قادرة على إشارات تشير إلى أن الفسفرة من هذه المواقع ليست شرطا أساسيا لتفعيل معقدة . ويمكن الآن هذه النتائج يمكن تفسيرها من خلال الفسفرة من الموقع الثانوي الثريونين-195. نظرة مماثلة في اللدونة موقع الفسفرة الأخرى بروتين كيناز يمكن الحصول على هذا البروتوكول التالية. علاوة على ذلك، نهج الجمع باستخدام مواقع الفسفرة نقطة الطفرات، والبروتينات التي يمكن أن تمنع تحركات محددة (المستجيبات) إلى جانب مناعي البروتين وتحليل الطيف الكتلي سوف يؤدي إلى فهم أفضل لأهمية التطورية للاللدونة موقع الفسفرة من تحركات البروتينات.

مسارات المناعي تعتمد على مختلف التعديلات بعد متعدية (PTMs) من البروتينات لتنبيغ بسرعة الإشارات وتنشيط الاستجابات المناعية 1. PTMs هي التعديلات الكيميائية السريعة، وعكسها، ومحددة للغاية من بنية البروتين التي يمكن أن تؤثر على التشكل البروتين، والنشاط، والاستقرار، والترجمة، والبروتين البروتين التفاعلات 2-4. في النباتات، وقد تم تحديد أكثر من 300 أنواع من PTMs بما في ذلك ubiquitination، sumoylation، الكبرتة، ارتباط بالغليكوزيل، والفسفرة 2،5. وهناك مجموعة متزايدة من الأدلة يسلط الضوء على أهمية PTMs في جوانب مختلفة من الحصانة محطة 1،5،6. الفسفرة البروتين، المرفق عكسها من مجموعة الفوسفات إلى سيرين، وبقايا ثريونين أو التيروزين هو منظم من العديد من الوظائف الخلوية وليس من المستغرب أن معظم درس غاية PTM دفاعا النبات يشير شلالات 5-11. التي تعتمد على الفسفرة الإشارات هي جزء لا يتجزأ من defe النباتبدأ تفعيل NSE بعد الإدراك خارج الخلية من الميكروبات عن طريق مستقبلات عبر الغشاء، أو الاعتراف الخلايا من البروتينات المقاومة متعددة المجالات 5،8. عند غزو النباتات، يتم الكشف عن الميكروبات عن طريق مستقبلات غشاء البلازما تسمى المستقبلات التعرف على الأنماط (خنازير) 12. خنازير المعروفة هي إما مثل مستقبلات البروتينات (RLPs) أو تحركات مثل مستقبلات (RLKs)، وكلاهما يحمل ectodomain ملزم يجند وعلى مسار واحد عبر الغشاء المجال. وعلى النقيض من RLPs، RLKs ديك مجال الخلايا كيناز 13-15. وectodomain من خنازير بربط الحفظ جزيئات ميكروب يسمى elicitor أنماط المرتبطة الممرض الجزيئية (PAMPs) الرائدة، في حالة RLKs، لautophosphorylation ونقل الفسفوريل ضمن المجال داخل الخلايا 6، 16. المصب التي يسببها تصور الفسفرة من خنازير، الفسفرة اللاحقة للبروتينات حشوية بما في ذلك تحركات 17، </suع&gt; 18، E3 ligases 19،-mitogen تنشيط تحركات البروتينات (MAPKs) 20، 21، تعتمد على الكالسيوم تحركات البروتينات (CDPK) 22، 23، وعوامل النسخ 24 و 25 يؤدي إلى الحصانة أثار PAMP (PTI). بالإضافة إلى تصور خارج الخلية من قبل خنازير، ويتحقق الاعتراف الخلايا من مسببات الأمراض من خلال مستقبلات حشوية. هذه المقاومة متعددة المجالات (R) البروتينات تحتوي على متغير نطاق N-محطة، مركزية ملزمة النوكليوتيدات (NB) عزر، ويكرر-يسين الغنية C-محطة (LRR)، وبالتالي تسمى البروتينات NB-LRR 26، 27. البروتينات R تعترف مباشر أو غير مباشر جزيئات الفوعة المستمدة من الممرض دعا المستجيبات، والمعروف أيضا لاستهداف خنازير والعقد الأخرى في الجهاز المناعي. الاعتراف يدفع دفاعات قوية مما يؤدي إلى الحصانة أثار المستجيب (ETI) 28-31. البروتينات NB-LRR ديك requisiعزر الشركة المصرية للاتصالات ATP ملزم ضمن المجال NB 30، 32، لكنهم يفتقرون مجال كيناز. وقد تم الإبلاغ عن الفسفرة من المجالات الحفظ من NB-LRRS في مسح البروتين على نطاق واسع 33، ولكن أهميتها لETI غير واضح. على نحو مماثل لPTI، وتفعيل البروتينات NB-LRR يؤدي إلى الفسفرة من البروتينات السيتوبلازمية بما في ذلك MAPKs 34-37 وCDPKs 38-40. الأهم من ذلك، يمكن أن يؤدي إلى الاعتراف المستجيب الفسفرة من البروتينات الإكسسوارات التي تتفاعل مباشرة مع البروتينات NB-LRR 41. وتشمل بعض الأمثلة RIN4 (نبات الأرابيدوبسيس thaliana) وحديد التسليح (الطماطم، مغد قوطة) البروتينات التي تتفاعل مع البروتينات NB-LRR، RPM1 42 و 43 و 44 الملف Prf، على التوالي. خلال العدوى عن طريق البكتيريا الزائفة syringae، البروتين المستجيب AvrB يدفع RIN4 الفسفرة، وعلى الأرجح من قبل مثل مستقبلات كيناز RIPK 45، <sup&gt; 46. وبالمثل، في الطماطم وP. syringae المستجيبات AvrPto وAvrPtoB لحث الفسفرة من قدرة الإنطلاق 47. وعلى النقيض من RIN4 التي تفتقر مجال كيناز ويجب أن يكون عبر فسفرته، قدرة الإنطلاق هو كيناز نشطة قادرة على صناعة السيارات في الفسفرة 48 وعبر الفسفرة من ركائز 49، 50. في حين يتطلب قدرة الإنطلاق النشاط كيناز من أجل تعتمد على المستجيب بدء الإشارات، المسوخ قدرة الإنطلاق-كيناز القتلى لا تزال قادرة على إشارة على نحو المستجيب مستقلة 51. شرحنا في الآونة الأخيرة هذه الملاحظات من خلال إظهار أن المجمع الملف Prf / جهاز السياحة هو من oligomeric، التي تحتوي على العديد من الجزيئات الملف Prf وقدرة الانطلاق 52 وأن جزيئات جهاز السياحة داخل المجمع نفسه يمكن عبر الفوسفات بعضها البعض 47. اقترحنا نموذج التي جزيء واحد من حديد التسليح (استشعار) تتفاعل مع بروتين المستجيب، مما تسبب في تغير التشكل إلى البروتين NB-LRR (الملف Prf) وهذا بدوره ينشط جزيء قدرة الإنطلاق الثاني (المساعد) الطرافةهين المجمع. في وقت لاحق، والمساعد قدرة الإنطلاق جزيء عبر phosphorylates استشعار قدرة الانطلاق مما يؤدي إلى تنشيط كامل للمقاومة معقدة 47. وتبين هذه الأمثلة أن تحديد مكونات مجمع المناعي وPTMs إمكاناتهم على الاعتراف المستجيب يمكن أن يؤدي إلى فهم أفضل للكيفية التي يتم transduced إشارات من المستجيب تصور لأهداف المصب. نحن هنا تصف طريقة تنقية البروتين لNB-LRR-التفاعل البروتينات وتحديد اللاحقة من PTMs بهم. نستخدم نيكوتيانا benthamiana ومجمع الطماطم الملف Prf / جهاز السياحة كنموذج، ولكن يمكن بسهولة أن تطبق نفس البروتوكول لRLKs من N. benthamiana وA. thaliana 53 مع تعديلات صغيرة كما وصفنا في البروتوكول.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1108">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:296px;">MgCl2</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">M8266</td>
			<td style="width:436px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetosyringone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D134406</td>
			<td>toxic - 1 M stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 1mL sterile</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2525R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Silwet L-77 (surfactant)</td>
			<td>Lehle Seeds</td>
			<td>VIS-01</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MG-132 (Z-Leu-Leu-Leu-al)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2211</td>
			<td>1 M stock in DMSO, store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MS salts</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5524</td>
			<td>oxidizing, toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>adjust pH with 1 N HCl to make 1 M Tris-HCl buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>5 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td>toxic - 0.5 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>EC-606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td>corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PVPP (polyvinylpolypyrrolidone)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5288</td>
			<td>do not confuse with PVP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DTT (DL-dithiothreitol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815</td>
			<td>toxic - 1 M stock, store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plant protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9599</td>
			<td>do not freeze/thaw too many times</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>corrosive, toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calyculin A</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Fluoride (NaF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7920</td>
			<td>toxic - 1 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Molybdate (Na2MoO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6646</td>
			<td>0.5 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="95">
			<td height="95" style="height:95px;">Sodium orthovanadate (Na3VO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>450243</td>
			<td>toxic - Prepare a 200 mM solution of sodium orthovanadate. Adjust the pH to 10.0 using either 1N NaOH or 1N HCl. The starting pH of the sodium orthovanadate solution may vary with lots of the chemical. At pH 10.0 the solution will be yellow. Boil the solution until it turns colorless (approximately 10 minutes). Cool to room temperature.Readjust the pH to 10.0 and repeat steps 3 and 4 until the solution remains colorless and the pH stabilizes at 10.0.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Okadaic acid</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kinematica Polytron tissue homogeniser</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-451-320&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Miracloth</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>475855-1R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-FLAG M2 agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2220</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptavidin-agarose</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>20347</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GFP-Trap_A</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>gta-20</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-HA-Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2095</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.45 &#956;m filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>513-1902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FLAG peptide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">StrataClean resin</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>400714</td>
			<td>this absorption resin is recommended for protein precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PROTEAN II XL Cell</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>this stain is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protein low-binding tubes (LoBind)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 108.116</td>
			<td>these tubes are recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium bicarbonate (ABC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83639</td>
			<td>toxic, flammable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2-chloroacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>22790</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
			<td>irritant, sensitizing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14265</td>
			<td>toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water-bath sonicator</td>
			<td>Ultravawe</td>
			<td>Ultra BT Ultrasonic Bath</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LTQ-Orbitrap XL</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trichostatin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8552</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of post-translational modifications of plant protein complexes

النباتات التكيف بسرعة مع تغير البيئات نظرا لوضع تصور وأنظمة إنذار. خلال الهجوم الممرض والنباتات الاستجابة السريعة للعدوى عن طريق تجنيد وتنشيط مجمعات المناعي. ويرتبط التنشيط في مأمن من المجمعات مع بعض التعديلات بعد متعدية (PTMs) من البروتينات، مثل الفسفرة، ارتباط بالغليكوزيل، أو ubiquitination. وفهم كيفية فشلت هذه PTMs يؤدي إلى فهم أفضل للكيفية التي يتم تحقيق المقاومة. نحن هنا تصف طريقة تنقية البروتين لليسين الغنية تكرار ملزمة النوكليوتيدات (NB-LRR) تتفاعل البروتينات وتحديد اللاحقة من التعديلات بعد متعدية الخاصة بهم (PTMs). مع تعديلات صغيرة، وبروتوكول يمكن تطبيقها لتنقية البروتينات النباتية الأخرى المجمعات. ويستند هذا الأسلوب على التعبير عن إصدار الموسومة حاتمة من البروتين من الفائدة، والذي فيما بعد تنقيته جزئيا بذ مناعي وتعرض لمطياف الكتلة لتحديد التفاعل البروتينات وPTMs. هذا البروتوكول يوضح أن: ط). ويمكن الكشف عن التغيرات الدينامية في PTMs مثل الفسفرة بواسطة مطياف الكتلة؛ الثاني). فمن المهم أن يكون بكميات كافية من البروتين من الفائدة، وهذا يمكن أن تعوض عن عدم وجود نقاء immunoprecipitate؛ الثالث). من أجل الكشف عن PTMs من البروتين من الفائدة، وهذا البروتين لابد من immunoprecipitated للحصول على كمية كافية من البروتين.

نحن هنا وصف بروتوكول لتنقية البروتينات الموسومة المعدلة وراثيا من مستقرة A. thaliana خطوط أو بعد التعبير عابرة للبروتينات في N. benthamiana. كما هو موضح في الشكل رقم 1 يقترن تنقية البروتين المستهدف مع مطياف الكتلة للسماح تحديد التفاعل البروتينات وPTMs من البروتين المستهدفة. وقد تم تصميم بروتوكول لتنقية البروتينات المشاركة في الحصانة النبات وتحديد PTMs ولكن يمكن تطبيقها على تنقية أي البروتينات النباتية الموسومة. كمثال نستخدم تنقية معقدة الملف Prf / قدرة الإنطلاق من N. benthamiana. وN. المعدلة وراثيا خط benthamiana 38-12 54، معربا عن 35S: PTO، تحولت عابر مع 35S: تم immunoprecipitated الملف Prf-FLAG ومعقدة مع المضادة للFLAG M2 الاغاروز (الشكل 2A). وimmunoblots (IB) في الشكل 2Aتوضيح أنه تم immunoprecipitated معظم البروتين المستهدفة (الملف Prf). تم copurified قدرة الإنطلاق والبروتين المستجيب التفاعل مع AvrPtoB الملف Prf والكشف باستخدام الأجسام المضادة وتحليل الطيف الكتلي (أرقام 2A و 2B). وجدنا أن جهاز السياحة أن copurified مع الملف Prf هاجر أبطأ على هلام SDS-PAGE عندما coexpressed مع المستجيب يبني 35S: AvrPto و35S: AvrPtoB (الشكل 2A). كل من البروتينات المستجيب بفعل الهجرة أبطأ من جهاز السياحة الملف Prf-التفاعل (الشكل 2A). هذا المستجيب تعتمد على الاعتراف الهجرة بطء جهاز السياحة ويعزى سابقا إلى الفسفرة كما يمكن إزالته عن طريق العلاج مع الفوسفاتيز 44. للكشف عن مواقع الفسفرة المساهمة في هجرة بطيئة من قدرة الإنطلاق، ونحن يتعرض copurifying الملف Prf قدرة الانطلاق لتحليل الطيف الكتلي. على الرغم من التعبير عالية من التسليح والكشف سهلة مع immunoblots نتمكن من استرداد الببتيدات جovering 57٪ فقط من تسلسل جهاز السياحة وفشلنا في تحديد أي المواقع الفسفرة (الشكل 2B). بعد ذلك، قمنا بتغيير استراتيجيات لاستهداف البروتين قدرة الإنطلاق مع المضادة للFLAG. N. تحولت محطات benthamiana WT عابر مع 35S: الملف Prf-35S 3HA و: PTO-FLAG، مع أو بدون 35S: AvrPto و35S: AvrPtoB كان المبلغ الإجمالي للبروتين قدرة الإنطلاق، التي تضم كلا من الملف Prf المعقد وأشكال حرة، immunoprecipitated مع المضادة للFLAG M2 الاغاروز وتعرض للتجزئة SDS-PAGE، في جل الهضم زيتية والتحليل الطيفي الشامل (الشكل 2C). مع هذا النهج حددنا الببتيدات قدرة الإنطلاق تغطي حوالي 80٪ من تسلسل ومجهول 100 كيلو دالتون بروتين التفاعل. حددنا مجموعة من المواقع الفسفرة مفردة ومزدوجة لجهاز السياحة الببتيدات 187-202 188-202 و(الجدول 1). كانت سر-198-199 والثريونين المواقع الفسفرة السائد ولكن بو أخرىكما تم الكشف عن مواقع sphorylation (الجدول 1). وقد تم تحديد الفسفرة الأكثر أهمية مزدوجة على سر-198-199 والثريونين فقط في وجود إما بروتين المستجيب (الجدول 1). حددنا مؤخرا مجموعة مماثلة من مواقع الفسفرة جهاز السياحة ويتضح أهمية هذا الحدث الفسفرة مزدوجة للانزعاج 47. بعد بروتوكول الموصوفة هنا كنا قادرين على تحديد التغيرات الدينامية في الدولة الفسفرة من البروتين الهدف. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51095/51095fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51095/51095fig1.jpg" /> الشكل 1. التصميم التجريبي عام. البروتين المستهدف لمناعي (IP) غير الموسومة، وأعرب في بلانتا، عابر في نيكوتيانا benthamiana أو ثابت في نبات الأرابيدوبسيس thaliana. بعد استخراج البروتين ووimmunoprecipitated البروتين المستهدفة مع مصفوفة تقارب. يتم فصل البروتينات على هلام الأكريلاميد من قبل الكهربائي. يتم استئصال العصابات هلام. يتم استخراج البروتينات من العصابات هلام وتعرض لمطياف الكتلة. ويتم تحديد مواقع الفسفرة والبروتينات المتفاعلة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51095/51095fig1highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a> <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51095/51095fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51095/51095fig2.jpg" /> الشكل 2. الملف Prf وقدرة الانطلاق مناعي ألف). وبناء 35S: أعرب الملف Prf-FLAG عابر في خط 38-12 (35S: جهاز السياحة) جنبا إلى جنب مع ناقلات فارغة (EV)، 35S: AvrPto أو 35S: AvrPtoB. تم immunoprecipitated ثلاثة أيام آخر تسلل الملف Prf استخدام الألغام المضادة للFLAG تقارب المصفوفة. اللقاحاتأجريت noblots (IB) للالملف Prf، AvrPtoB وقدرة الإنطلاق. كما أشار بواسطة السهام في الجزء السفلي من لوحة جهاز السياحة طخة مناعية، AvrPto وAvrPtoB تحفز على الهجرة أبطأ من قدرة الإنطلاق باء). وبناء 35S: أعرب الملف Prf-FLAG عابر في خط 38-12 (35S: جهاز السياحة) جنبا إلى جنب مع ناقلات فارغة (EV)، 35S: AvrPto أو 35S: AvrPtoB. تم immunoprecipitated ثلاثة أيام آخر تسلل الملف Prf استخدام الألغام المضادة للFLAG الاغاروز وفصلها على SDS-PAGE. كانت ملطخة الجل مع الغروية Coomassie بريليانت الأزرق (cCBB) والملف Prf مرئية، تم رفعه جهاز السياحة وAvrPtoB البروتينات العصابات من الجل وتحليلها بواسطة مطياف الكتلة. يشار إلى تغطية نسبة الببتيد قدرة الإنطلاق والملف Prf متواليات التي حددها مطياف الكتلة. C). وأعرب عن قدرة الإنطلاق-FLAG عابر جنبا إلى جنب مع 35S: بنيات 35S: الملف Prf-35S 3xHA وAvrPtoB، 35S: AvrPto أو ناقلات الفارغة (EV) في N. benthamiana. ثلاثة أيام بعد تسلل المبلغ الإجمالي للتم immunoprecipitated قدرة الإنطلاق-FLAG استخدام الألغام المضادة للFLAG الاغاروز وحلها على SDS-PAGE. تم رفعه جهاز السياحة وضوحا وقدرة الإنطلاق-التفاعل نطاقات البروتين من الهلام وتحليلها بواسطة مطياف الكتلة. جهاز السياحة و100 كيلو دالتون قدرة الإنطلاق-التفاعل الفرقة البروتين هي واضحة للعيان على الغروية Coomassie بريليانت الأزرق (cCBB) الملون وهلام، في حين أن الملف Prf قليلا أقل وضوحا (كما يتبين من السهام). IP: مناعي؛ IB: طخة مناعية؛ مصرف البحرين المركزي: Coomassie بريليانت الأزرق تلطيخ؛ cCBB: الغروية Coomassie بريليانت الأزرق تلطيخ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51095/51095fig2highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> PRF </td></tr><tr><td></td><td rowspan="2"> EV </td><td rowspan="2"> AvrPto </td><td rowspan="2"> AvrPtoB </td></tr><tr><td> قدرة الإنطلاق الببتيد 188-202 </td></tr><tr><td> GTELDQ [ص 195 T] HLSTVVK </td><tد&gt; 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> GTELDQTHL [ص S 198] TVVK </td><td> 10 </td><td> 7 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> GTELDQTHLS [ص 199 T] VVK </td><td> 8 </td><td> 3 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> G [ص 190 T] ELDQTHLS [ص 199 T] VVK </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> GTELDQTHL [ص S 198] [ص 199 T] VVK </td><td> 0 </td><td> 8 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> GTELDQTHLSTVVK </td><td> 46 </td><td> 26 </td><td> 48 </td></tr><tr><td> قدرة الإنطلاق الببتيد 187-202 </td><td colspan="3"></td></tr><tr><td> KGTELDQ [ص 195 T] HLS TVVK </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHL [ص S 198] TVVK </td><td> 17 </td><td> 17 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHLS [ص 199 T] VVK </tد&gt; <td> 4 </td><td> 2 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> KGTELDQ [ص 195 T] HLS [ص 199 T] VVK </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHL [ص S 198] [ص 199 T] VVK </td><td> 0 </td><td> 7 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHLSTVVK </td><td> 21 </td><td> 37 </td><td> 18 </td></tr><tr><td> الببتيدات 187-202 188-202 و </td><td> 83 </td><td> 88 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> نسبة الببتيدات مع حدثين الفسفرة </td><td> 0٪ </td><td> 26.9٪ </td><td> 11.2٪ </td></tr><tr><td> قدرة الإنطلاق تسلسل التغطية </td><td> 78٪ </td><td> 79٪ </td><td> 82٪ </td></tr></tbody></table> الجدول 1 الفسفرة مزدوجة من الببتيد قدرة الإنطلاق على تفعيل يشير 35S:. الملف Prf-35S 3xHA و: PTO-FLAG وأعرب عن عابر جنبا إلى جنب مع مشركة خاصة ناقلات (EV)، 35S: AvrPto أو 35S: AvrPtoB في N. benthamiana. ثلاثة أيام آخر تسلل تم immunoprecipitated المبلغ الإجمالي للبروتين قدرة الإنطلاق-FLAG استخدام الألغام المضادة للFLAG تقارب مصفوفة وحلها على SDS-PAGE. تم رفعه العصابات مرئية من قدرة الإنطلاق على الغروية Coomassie الرائعة هلام الملون الأزرق وتحليلها مع مطياف الكتلة. وأشار عدد من الببتيدات تحديدها مع قدرة الإنطلاق 0، 1، 2 والأحداث الفسفرة. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> جدول مخازن </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L المتوسطة </td><td> تريبتون </td><td> 10 ز / L </td></tr><tr><td></td><td> خلاصة الخميرة </td><td> 5 ز / L </td></tr><tr><td></td><td> كلوريد الصوديوم </td><td> 5 ز / L </td></tr><tr><td></td><td> D-الجلوكوز </td><td> 1 جرام / لتر </td></tr><tr><td> العازلة الزراعية تسلل </td><td> MgCl 2 </td><td> 10 ملي </td></tr><tr><td></td><td> MES &lt;/ الدفتيريا&gt; <td> 10 ملي </td></tr><tr><td></td><td> ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 5.5 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Acetosyringone (اختياري) </td><td> 150 ميكرومتر </td></tr><tr><td> العازلة A </td><td> تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5 </td><td> 150 ملي </td></tr><tr><td></td><td> كلوريد الصوديوم </td><td> 150 ملي </td></tr><tr><td></td><td> EDTA </td><td> 5 ملي </td></tr><tr><td></td><td> EGTA </td><td> 2 مم </td></tr><tr><td></td><td> الغليسيرول </td><td> 5٪ (V / V) </td></tr><tr><td> العازلة B </td><td> العازلة A </td><td></td></tr><tr><td></td><td> PVPP </td><td> 2٪ (ث / ت) </td></tr><tr><td> العازلة C </td><td> العازلة B </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Dithiothreitol (DTT) </td><td> 10 ملي </td></tr><tr><td></td><td> مصنع المانع البروتياز كوكتيل </td><td> 1٪ (V / V) </td></tr><tr><td></td><td> Phenylmethylsulfonyl الفلورايد (PMSF) </td><td> 0.5 ملي </td&gt; </tr><tr><td></td><td> Calyculin A </td><td> 50 نانومتر </td></tr><tr><td></td><td> فلوريد الصوديوم (ناف) </td><td> 50 ملي </td></tr><tr><td></td><td> كربونات الصوديوم (نا 2 زارة النفط 4) </td><td> 10 ملي </td></tr><tr><td></td><td> Orthovanadate الصوديوم </td><td> 1 ملم </td></tr><tr><td></td><td> حمض Okadaic </td><td> 100 نانومتر </td></tr><tr><td> العازلة D </td><td> C العازلة دون PVPP </td><td></td></tr><tr><td> 5X SDS-PAGE العازلة تحميل </td><td> تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8 </td><td> 60 ملي </td></tr><tr><td></td><td> SDS </td><td> 2٪ </td></tr><tr><td></td><td> الغليسيرول </td><td> 0.15٪ </td></tr><tr><td></td><td> برموفينول الأزرق </td><td> 0.10٪ </td></tr><tr><td></td><td> التلفزيون الرقمي الأرضي (إضافة فقط قبل الاستخدام) </td><td> 50 ملي </td></tr></tbody></table> الجدول 2. العازلة وصفات وسائل الإعلام.

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes at JoVE.com

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

نحن هنا وصف بروتوكول لتنقية وتوصيف المجمعات البروتين النباتي. علينا أن نظهر ذلك من خلال immunoprecipitating بروتين واحد ضمن مجمع، حتى نتمكن من تحديد التعديلات في مرحلة ما بعد متعدية والشركاء التفاعل فيها.

تحديد التعديلات بعد متعدية من النباتات بروتين المجمعات

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

identification-post-translational-modifications-plant-protein

Research

JoVE Journal

Biology

23.7K Views.  University of Warwick.  نحن هنا وصف بروتوكول لتنقية وتوصيف المجمعات البروتين النباتي. علينا أن نظهر ذلك من خلال immunoprecipitating بروتين واحد ضمن مجمع، حتى نتمكن من تحديد التعديلات في مرحلة ما بعد متعدية والشركاء التفاعل فيها. 

Video: Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

تحديد بروتين المجمعات مع كمية البروتينات في البيرة س.

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within the cell, type III effectors subvert host cellular processes to suppress immune responses and promote pathogen growth. Numerous type III effectors of plant and animal bacterial pathogens have been identified to date, yet only a few of them are well characterized. Understanding the functions of these effectors has been undermined by a combination of functional redundancy in the effector repertoire of a given bacterial strain, the subtle effects that they may exert to increase virulence, roles that are possibly specific to certain infection stages, and difficulties in genetically manipulating certain pathogens. Expression of type III effectors in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae may allow circumventing these limitations and aid to the functional characterization of effector proteins. Because type III effectors often target cellular processes that are conserved between yeast and other eukaryotes, their expression in yeast may result in growth inhibition phenotypes that can be exploited to elucidate effector functions and targets. Additional advantages to using yeast for functional studies of bacterial effectors include their genetic tractability, information on predicted functions of the vast majority of their ORFs, and availability of numerous tools and resources for both genome-wide and small-scale experiments. Here we discuss critical factors for designing a yeast system for the expression of bacterial type III effector proteins. These include an appropriate promoter for driving expression of the effector gene(s) of interest, the copy number of the effector gene, the epitope tag used to verify protein expression, and the yeast strain. We present procedures to induce expression of effectors in yeast and to verify their expression by immunoblotting. In addition, we describe a spotting assay on agar plates for the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. The use of this protocol may be extended to the study of pathogenicity factors delivered into the host cell by any pathogen and translocation mechanism.

In this video, we describe a procedure for the expression of bacterial type III effectors in yeast and the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. Such phenotypes can be subsequently exploited to elucidate effector functions and targets.

تحديد الظواهر المستحثة بواسطة تثبيط النمو البكتيري نوع من التعبير المستجيبات الثالث في الخميرة

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 base pairs of DNA associated with two each of histones H2A, H2B, H3, and H41. The N-terminal tails of histones are rich in lysine and arginine and are modified post-transcriptionally by acetylation, methylation, and other post-translational modifications (PTMs). The PTM configuration of nucleosomes can affect the transcriptional activity of associated DNA, thus providing a mode of gene regulation that is epigenetic in nature 2,3. We developed a method called nucleosome ELISA (NU-ELISA) to quantitatively determine global PTM signatures of nucleosomes extracted from cells. NU-ELISA is more sensitive and quantitative than western blotting, and is useful to interrogate the epiproteomic state of specific cell types. This video journal article shows detailed procedures to perform NU-ELISA analysis.

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) is a sensitive and quantitative method to detect global patterns of post-translational modifications in preparations of native, intact nucleosomes. These modifications include methylations, acetylations, and phosphorylations at specific histone amino acid residues, and hence NU-ELISA provides a global proteomic assay of the overall chromatin modification states of specific cell types.

الكشف عن مرحلة ما بعد التعديلات متعدية على Nucleosomes سليمة الأصلية بواسطة ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent modifications on the amino-terminal tails of histones H3 and H4 play essential roles1-2. H3 and H4 histone modifications include methylation of lysine and arginine, acetylation of lysine, and phosphorylation of serine residues1-2. These modifications are associated either with gene activation, repression, or a primed state of gene that supports more rapid and robust activation of expression after perception of appropriate signals (microbe-associated molecular patterns, light, hormones, etc.)3-7. 
Here, we present a method for the reliable and sensitive detection of specific chromatin modifications on selected plant genes. The technique is based on the crosslinking of (modified) histones and DNA with formaldehyde8,9, extraction and sonication of chromatin, chromatin immunoprecipitation (ChIP) with modification-specific antibodies9,10, de-crosslinking of histone-DNA complexes, and gene-specific real-time quantitative PCR. The approach has proven useful for detecting specific histone modifications associated with C4 photosynthesis in maize5,11 and systemic immunity in Arabidopsis3.

A reliable and useful approach to detect histone modifications on specific plant genes is described. The approach combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) and real-time quantitative PCR. It allows detection of histone modifications on specific genes with a role in diverse physiological processes.

الكشف عن تعديلات بسيطة في أوراق النبات

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and readily available form of data collection. In many research and disease models however, steady state levels of target gene mRNA does not always directly correlate with steady state protein levels. Post-transcriptional gene regulation is a likely explanation of the divergence between the two. Driven by the binding of RNA Binding Proteins (RBP), post-transcriptional regulation affects mRNA localization, stability and translation by forming a Ribonucleoprotein (RNP) complex with target mRNAs. Identifying these unknown de novo mRNA targets from cellular extracts in the RNP complex is pivotal to understanding mechanisms and functions of the RBP and their resulting effect on protein output. This protocol outlines a method termed RNP immunoprecipitation-microarray (RIP-Chip), which allows for the identification of specific mRNAs associated in the ribonucleoprotein complex, under changing experimental conditions, along with options to further optimize an experiment for the individual researcher. With this important experimental tool, researchers can explore the intricate mechanisms associated with post-transcriptional gene regulation as well as other ribonucleoprotein interactions.

A step by step protocol to isolating and identifying RNA associated complexes through RIP-Chip.

طريقة لعزل وتحديد من microRNAs، وmRNAs ومكونات البروتين من بروتين نووي ريبوزي مجمعات من مقتطفات خلية باستخدام رقاقة RIP

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

تحديد بروتين في مجمعات<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المتعاقبة تنقية تقارب الببتيد في تركيبة مع جنبا إلى جنب الطيف الكتلي

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

بروتوكول لتحديد البروتين البروتين التفاعلات على أساس<sup&gt; 15</sup&gt; N صفها الأيض، مناعي، الكمي والتحوير الطيف الكتلي الانجذاب

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

مهدها الخميرة استخراج البروتين وتنقية لدراسة وظيفة، والتفاعلات، والتعديلات بعد متعدية

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

نهج جديد لتحليل مقارن لMultiprotein مجمعات بناء على<sup&gt; 15</sup&gt; N الأيض وصفها والكمية الطيف الكتلي

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

الإنتاجية العالية كريسبر ناقل البناء وتوصيف التعديلات الحمض النووي عن طريق توليد جذور الطماطم مشعر

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...