VN נתמך על ידי החברה המלכותית. JPR הוא עתיד עמית מועצה למחקר אוסטרלי (FT0992129). אנו מודים לד&quot;ר מרים גיפורד לקריאה ביקורתית של כתב היד.

הערה: כל הצעדים נעשים בטמפרטורת חדר, אלא אם כן צוין אחרת. 1. הכנה של צמח חומרים וחוצצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנ &#39; benthamiana <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול Agrobacterium tumefaciens זנים של עניין לביטוי חולף (בדוגמא זו PRF-FLAG, PRF-3xHA, PTO-FLAG ווקטור ריק כביקורת) על ידי טלטול (200 סל&quot;ד) בתרבות נוזלית (בינוני L עם אנטיביוטיקה מתאימה) ב28 ° C עד שלב נייח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף וגלולת agrobacteria ידי צנטריפוגה (3,000 XG במשך 5 דקות). בטל supernatant ו resuspend agrobacteria טבליות במאגר הסתננות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את כמות agrobacteria ידי קבלת הצפיפות האופטית ערך (OD) בספיגה של 600 ננומטר (ABS 600 ננומטר). התאם את OD של חיידקים ל0.1-.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחדור נ 4 בן שבוע צמחי benthamiana (22 ° C, שעות אור 16) עם agrobacteria ידי האןד (עם מזרק מחטים 1 מ&quot;ל) או על ידי ואקום (להוסיף 0.02% פעילי שטח V / V). שים לב: השתמש העלה התרחב כמעט באופן מלא, הראשון ושני עלים מייד מבוגרים לביטוי חלבון היעיל ביותר. לגילוי של חלבוני ubiquitinated או acetylated לחדור עלים עם 100 MG-132 או 100 ng ננומטר / מיליליטר Trichostatin, בהתאמה, ב 1 ו 2 ימים לאחר חדירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את העלים הסתננו 2-5 ימים לאחר חדירה והקפאה בחנקן נוזלי. לאחסן דגימות ב-80 ° C במקפיא. הערה: קבע את הרמה הטובה ביותר של ביטוי של החלבון של עניין לפני כן על ידי לקיחת דגימות מעל קורס של 5 ימים זמן ולזהות רמות חלבון על ידי immunoblotting. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור א &#39; thaliana קווים מהונדסים יציבים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול א thaliana זרעים ב6 צלחות היטב בתוספת 5 מיליליטר של מדיום MS הנוזלי (1% w / סוכרוז v) לכל טוב. שים 04:57 זרעים (מעוקר ומרובדת) של הקו המהונדסעניין או בשורת שליטת untransformed לכל טוב. לנער בסל&quot;ד 200 יומיים לפני העברת הצלחת לחדר צמיחה ולהשאיר למשך 2 שבועות (22 C °, 10 אור hr). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות קציר והקפאה בחנקן נוזלי. הערה: ניתן להשתמש כביקורת קו מהונדס מבטא חלבון שאינו קשור עם אותו התג כמו החלבון של עניין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חוצצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן א De-גז הצפת חיץ ל1-2 שעות (לRLKs, חלבוני קרום מחויב אחרים וחלבונים גרעיניים, להוסיף 1% IGEPAL v v / CA-630 53). הערה: ניתן לשמור על מאגר על 4 מעלות צלזיוס לזמן בלתי מוגבל. אתה יכול להשתמש ב1% V / V טריטון במקום IGEPAL CA-360. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 80 מיליליטר של שעה לפחות 1-2 B הצפת קרה לפני החילוץ. הערה: היחס האידיאלי של רקמה לעומת חיץ חילוץ הוא 01:04 (w / v). </li></ol></li></ol> 2. הפקת חלבון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רק לפני המיצוי להכין 80 מיליליטר של הצפת הקרה ג <li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוחנים 20 גרם של נ &#39; רקמת benthamiana (כ 15 עלים) או א thaliana שתילים (2-4 גרם לכל צלחת 6 היטב) בחנקן נוזלי באמצעות מכתש ועלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 80 מיליליטר של קר הצפת C ל20 גרם של רקמת קרקע, ומערבב היטב, ולהפשיר על קרח. הערה: טוחנים את כל הדגימות באותו הזמן (חלבון של עניין ושליטה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize עם 3 התפרצויות של 10 שניות כל אחד במלוא מהירות עם homogenizer רקמות (prechilled על 4 מעלות צלזיוס). לסנן דרך רקמות 22-25 מיקרומטר ו צנטריפוגות ב XG 30,000 עבור 30 דקות ב 4 ° C. הערה: לחלופין, homogenize עם מרגמה prechilled טרי ועלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצעדי חסימה ושטיפה של מטריצת הזיקה, להכין 20 מיליליטר של הצפת ד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> של מטריצת זיקה המתאימה בלוק 100 מיליליטר באמצעות 500 מיליליטר של D מאגר הקר המכיל BSA 1% למשך 5 דקות בשעה 4 ° C. הערה: המועדף afמטריצות finity כוללות agarose אנטי הדגל M2, agarose Streptavidin, ה-GFP-Trap_A וagarose אנטי HA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3x לשטוף עם הצפת 1 ד הקר מיליליטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant של תמצית עליי ומסנן דרך מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר לתוך צינור חדש על קרח. הערה: צבע התמצית צריך להיות ירוק או צהוב, אם המדגם הפך חום, לבטל ולהתחיל מחדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח aliquot של התמצית הגולמי לimmunoblot, להוסיף חיץ טעינת SDS-PAGE 5x, מערבולת ולפגל על ​​ידי דגימות רותחים 10 דקות ב 80-100 ° C בגוש חום. </li></ol> 3. Immunoprecipitation חלבון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפצל את תמצית החלבון לשני 50 צינורות מיליליטר ולהוסיף 50 μl של מטריצת הזיקה תלויה בהצפת D לצינור אחד. דגירה עם סיבוב עדין במשך שעה 2 ב 4 ° C. הערה: incubations הארוך יותר לא נמצא כדי להגדיל את התשואה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 600 μl (חרוז 6x נפח של מטריצת זיקה) של חיץ elution על ידי הוספה להחיץ D (ריכוזים סופיים): BSA 0.5%, פפטיד FLAG 0.25 מ&quot;ג / מיליליטר (לagarose M2 אנטי FLAG) או 10 מ&quot;מ D-ביוטין (לagarose Streptavidin). הערה: Elution אינו מומלץ במקרה של מטריצות ה-GFP-Trap_A ואנטי HA, כך להמשיך ישירות רותח בחיץ טעינת עמוד SDS 1x, צעד 3.11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזרז את מטריצת הזיקה על ידי צנטריפוגה ב 4 ° C (5 דקות ב1,000 XG). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח aliquot של התמצית מאוגדת לimmunoblot, לבטל את שאר supernatant, עוזב כ 500 μl בחלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend פתרון slurry עם קצה רחב נשא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את פתרון slurry מעורב משני הצינורות לצינור מיליליטר בודד 1.5. שים לב: מעתה והלאה, השתמש 1.5 מיליליטר דל חלבון מחייב צינורות microfuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3x דופק ל5 שניות באמצעות צנטריפוגות המעבדתיים כדי לזרז את מטריצת הזיקה ולהסיר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3-5x עם 1 מיליליטר חיץ קר ד בין שוטף לזרז את מתרי הזיקהx כפי שתואר לעיל וזורקים supernatant. בכביסה האחרונה להסיר עודפי הצפת D עם המחט של מזרק. הערה: לשטוף סופי באמצעות הצפת D עם IGEPAL 0.1% יכולים לשמש כדי להפחית עוד יותר ספציפי מחייב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute עם 200 μl של חיץ elution המתאים (לאנטי הדגל M2 או Streptavidin צעד ראה agarose 3.2) 3x, 5 דקות בכל פעם עם רעד קבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת 3 eluates בצינור יחיד. לרכז את החלבונים באמצעות 30 μl של שרף קליטה. וורטקס, לתת לעמוד במשך 5 דקות ולזרז את השרף (2 דקות ב 10,000 XG). בטל supernatant. הערה: agarose-GFP-Trap_A ואנטי HA, לדלג על השלבים 3.9 ו3.10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של חיץ טעינת עמוד SDS 1x למטריצת הזיקה זירז או שרף קליטה. ורטקס ורתיחה 10 דקות ב 80-100 ° C בגוש חום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה המטריצה ​​מבושלת זיקה או שרף למשך 2 דקות ב 10,000 X גרם. Aliquot 5 μl של supernatanלא לimmunoblot, ולרוץ עם שברים אחרים על ג&#39;ל SDS-PAGE ~ ארוך 10 סנטימטר (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפרדה וזיהוי של חלבוני פוספורילציה על ידי ספקטרומטריית מסה, טען 45 μl שנותר על ג&#39;ל SDS-PAGE ~ ארוך 19 סנטימטר אם נדרשת הפרדה נוספת (איור 2). הערה: מסלול ריק יכול להיכלל בין כל הדגימות כדי להפחית את הזיהום של דגימות. </li></ol> 4. עיכול חלבון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם ג&#39;ל SDS-PAGE עם כתם מבריק colloidal Coomassie הכחול (cCBB). הערה: מזעור טיפול בג&#39;ל להפחתת זיהום עם keratins. ודא שאף אחד מהציוד או הכלים שימש במשך immunoblotting או פעילויות אחרות שאולי השאירו זיהום חלבון שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Destain ג&#39;ל עם כביסה שופעת במים, רצוי O / נ חותכים את הלהקה של עניין מן הג&#39;ל בסכין גילוח נקי. הערה: יישר את הג&#39;ל עם immunoblot אם necessaר&quot;י כדי לאתר את האזור הנכון. כזרחון יכול לעכב העברה של חלבונים על SDS-PAGE לחתוך את האזור באופן מיידי מעל ומתחת ללהקה של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קוביות הפרוסה ג&#39;ל לקוביות של 2-4 מ&quot;מ (זה מבטיח כי הג&#39;ל יהיה מכוסה על ידי פתרונות בצינור מבלי לחסום טיפים פיפטה). הנח בתוך שפופרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאמוד את ההיקף הנדרש כדי לשמור את הג&#39;ל שקוע היטב. השתמש בסכום זה עבור derivatization, דגירה עם פרוטאז ומיצוי פפטיד, ולאחר מכן להשתמש כפול לכרכים משולשים לרחצה. הערה: בטיפוסי לעכל עם כ 100 μl של חתיכות ג&#39;ל לחתוך, שימוש פתרון 500 μl לשטיפה, 2 x 180 μl להתייבשות, 150 μl להפחתה, 120 μl לאלקילציה, ו120 μl לעיכול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את חתיכות ג&#39;ל 2 x 20 דקות (או עד destained) על ידי הוספת אצטוניטריל 50% (באמוניום ביקרבונט 50 מ&quot;מ, ABC). פיפטה את הפתרון נזהר שלא להסיר את חתיכות ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליבש עם Aceto 100%nitrile למשך 5 דקות ולהסיר נוזל חופשי. הערה: ג&#39;ל אמור להופיע מצומק ולבן. אם הצבע הכחול נמשך, דגירה ארוכה יותר באצטוניטריל / ABC ו / או בטמפרטורה גבוהה (C ° 45-55). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפחית את אגרות חוב דיסולפיד חלבון על ידי הוספת 10 מ&quot;מ DTT במים ודגירה של 30-45 דקות ב56 º C עם רעד. הסרת נוזל חופשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שאריות ציסטאין Alkylate על ידי תוספת של 55 chloroacetamide מ&quot;מ (ב50 מ&quot;מ ABC) של 20-30 דקות (בטמפרטורת חדר, כהה). הסרת נוזל חופשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חתיכות ג&#39;ל 2 x 10 דקות עם אצטוניטריל 50% (ב50 מ&quot;מ ABC). הסרת נוזל חופשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבש את חתיכות ג&#39;ל עם אצטוניטריל 100% למשך 5 דקות ולהסיר נוזל חופשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לtryptic לעכל, להוסיף 40 μl של פתרון עובד טריפסין (של טריפסין 100 ng במאגר עיכול: 50 מ&quot;מ ABC, אצטוניטריל 5% ללהקה צבעונית Coomassie ממוצע). אפשר חתיכות ג&#39;ל לרעננות ל10 דקות. הוסף מספיק של חיץ עיכול כדי לכסות חתיכות ג&#39;ל במידת צורך. לדגור על 37 º CO / נ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעצור את העיכול ולחלץ את הפפטידים חתיכות ג&#39;ל, להוסיף 5% חומצה פורמית (באצטוניטריל 50%) (להוסיף את אותו נפח כמו עיכול הנפח). Sonicate ל5-10 דק &#39;. מעביר את supernatant לצינור חדש. חזור על פעולה החילוץ 3x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את הפפטידים על ידי lyophilization (מועדפת) או רכז ואקום (כגון Speed-Vac או Savant). חנות ב -20 º C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלח המדגם שלך לספקטרומטריית מסה. הערה: הגשנו המדגם שלנו למתקן ספקטרומטריית המסה במעבדה סיינסבורי (Norwich, בריטניה). פרוטוקולים במתקני ספקטרומטריית מסה להשתנות במידה ניכרת, אך בדרך כלל פפטידים יפורק ב0.2% חומצת trifluoroacetic עם אצטוניטריל 2% לפני שהעמיסו על מערכת כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב אלקטרו ריסוס ספקטרומטריית מסת טנדם. </li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים (כספיים או אחרים).

הבהרת המנגנון של הפעלת קולט ידי PAMPs וeffectors יכולה לתרום רבה להבנה של חסינות מפעל שלנו. בשנים האחרונות 20, מסכי שני היברידיים גנטיים ושמרים כבר סייעו לגילוי PRRs והחלבונים NB-LRR. לאחרונה, פרוטוקולים מבוססי ספקטרומטריית מסה הוקמו לצורך זיהוי של חלבונים מווסתים באופן דיפרנציאלי במהלך חיסוניים מאותתים 55-58, PTMs 11,33,59,60, ההרכב של קומפלקסים חיסוניים 61 ומפעיל מטרות 62. כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוט לזיהוי PTMs המסדיר את ההפעלה של מתחמים חיסוניים. בהשוואה לפרוטוקולים שתוארו קודם לכן, פרוטוקול זה מאפשר זיהוי מפורט של שינויים דינמיים של PTMs. פרוטוקולים של גישות פרוטאומיקה בקנה מידה גדולה יכולים לזהות PTMs של חלבונים אבל לא מסוגל לחשוף את פלסטיות האתר של PTMs בשל להגבילed הסכומים של חלבון. במקרה של זירחון חלבון, גישות פרוטאומיקה בקנה מידה גדולה בדרך כלל לזהות רק אתרי זירחון השולט 11,33,59. האפיון מפורט של מעמד זירחון החלבון דורש כמות משמעותית של חלבון שיכול להיות מושגת רק באמצעות טיהור חלקית של חלבון המטרה 47. הפרוטוקול מתואר כאן זוגות גישת טיהור חלבונים שמניבה כמות משמעותית של חלבון המטרה, עם ניתוח ספקטרומטריית מסה של החלבון מטוהר. בעקבות פרוטוקול זה, אירוע זירחון היחיד של Pto יוחס בעיקר לSer-198 כפי שתואר קודם לכן 52 אבל כמה ספקטרום ספקטרומטריית מסה נתמך גם על אירוע זירחון יחיד על THR-195 או THR-199. כאשר אירועי זירחון כפולים של Pto נצפו, שילוב הדומיננטי של חומצות אמינו פוספורילציה היה Ser-198 וTHR-199 למרות שילובים באתרים אחרים נצפו גם (טבלה 1). תוצאות אלו מראות בבירור פלסטיות אתר זירחון של קינאזות חלבון והיכולת של הפרוטוקול המתואר לאפיין בפרטים כל אתרי זירחון האפשריים. השלבים הקריטיים ביותר של פרוטוקול זה הם: 1) מיצוי מספק של חלבונים, 2) הגנה על PTMs: 3) כמות מספקת של חלבון המטרה של. ראשית, למיצוי מספק של חלבונים, חשוב לטחון את הרקמות בחנקן נוזלי ולאחר מכן להשתמש homogenizer רקמות כפי שתואר בפרוטוקול. אם homogenizer רקמות אינו זמין, ניתן להשתמש במכתש ועלי. כמו כן, חשוב להשתמש ביחס של אחד לשלוש (או ארבעה) של גרמים של רקמה לנפח של מיצוי מאגר. רקמה זו למאגר יחס וחיץ החוזק הגבוה שאנו מציעים תבטיח כי את ה-pH תישאר ניטראלית במהלך תהליך החילוץ. מצאנו שזו היא בעלת חשיבות מיוחדת עבור א thaliana ועגבניות נוספותctions 52. הגנה של PTMs יכולה להיות מושגת על ידי כולל בכל מאגרי מעכבים המתאימים של אנזימים שיכולים להסיר PTMs. זה גם קריטי לבצע את כל צעדים על 4 מעלות צלזיוס וprechill מאגרים ומכשירים. תשואות גבוהות יותר חלבון המטרה של יכולות להיות מושגת על ידי שימוש בצמחים המבטאים את החלבון בכמויות מספיקות ועל ידי שימוש בכמויות גדולות של רקמה (כ 20 ז). הצעד החשוב ביותר להשגת כמות מספקת של חלבון המטרה של מתרכז חלבון המטרה על ידי immunoprecipitation הישירה. המשמעות של הצעד הזה מודגש על ידי כישלוננו לזהות PTMs של Pto לאחר immunoprecipitation PRF בשל הכמות המוגבלת של coimmunoprecipitated Pto (איור 2). לעומת זאת, immunoprecipitation הישירה של Pto הניבה פפטידים באופן משמעותי יותר למדידה (איור 2 ג) שמוביל לכיסוי כ 80% מרצף החלבון וזיהוי של PTMs (טבלת 1). אנחנו גם strongly ממליץ על שימוש בepitope תגים לimmunoprecipitation חלבון. בהשוואה לנוגדנים שהועלו נגד מטריצת זיקת epitope תגי חלבונים האם יכול להניב כמויות גדולות יותר של חלבון מטוהר באופן חלקי. באמצעות נוגדן שהועלה נגד חלבון ילידי Pto 51 (איור 2 א) לimmunoprecipitation, הצלחנו לזהות זירחון אחד בלבד של שני אתרי זירחון השולט של Pto. פרוטוקול זה בעיקר פותחו לטיהור חלקית של נ &#39; benthamiana חלבון cytoplasmic וההזדהות הבאה של אתרי זירחון שלהם. עם זאת, באמצעות השינויים המתוארים במסמך, פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות לא חלבוני thaliana וחלבונים קרום מחויב. המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא להניב כמויות מספיקות של חלבון המטרה לזיהוי PTMs ולא כדי להשיג את הטוהר הגבוה ביותר של המתחם. אם טוהר גבוה יותרמנדרש המורכב ניתן להוסיף שלב שני של טיהור לפרוטוקול זה 52. במקרה זה, צעד ראשון יאפשר elution של חלבון המטרה ממטריצת הזיקה ללא השימוש במלחים או חומצה גבוהות והשלב הבא עלול להיות כרוך במטריקס, אשר דורש תנאי elution קשים. חשוב להדגיש שיש לנו רק נבדקו פרוטוקול זה לזיהוי אתרי זירחון ושאנו בודקים את יכולתה לזיהוי מפורט של PTMs נוסף כרגע. תוצאות הנציג שלנו הראו בבירור את פלסטיות אתר זירחון של קינאזות חלבון והיכולת של הפרוטוקול המתואר לאפיין אתרי זרחון. והכי חשוב, הם מדגישים כי זיהוי של אתרי זירחון להסתמך בכמות נמוכה של חלבונים על ידי ספקטרומטריית מסה ועל ידי מוטציות נקודה אחת של אתרים האוטומטי זרחון יכול לתת תוצאות מבלבלות. אנחנו מראים כאן בעבר ו47 </sup&gt; כי זירחון הכפול של Pto על Ser-198 וTHR-199 קשור להפעלה של מתחם PRF / Pto. לעומת זאת, תוצאות שפורסמו בעבר 47,63 הראו כי מוטציות נקודה אחת של Ser-198 וTHR-199 לאלאנין, המונעים זירחון באתרים אלו, מסוגלים איתות המצביעה על זירחון שהאתרים האלה הוא לא תנאי הכרחי להפעלה מורכבת . כעת ניתן להסביר תוצאות אלו על ידי זירחון של האתר המשני THR-195. ניתן להשיג תובנה דומה לפלסטיות אתר זירחון של חלבון קינאז השונה הבאה בפרוטוקול זה. יתר על כן, גישה משולבת בשימוש באתרי זירחון להצביע מוטציות, חלבונים שיכולים לעכב קינאז הספציפי (מפעיל) בשילוב עם immunoprecipitation חלבון וניתוח ספקטרומטריית מסה יוביל להבנה טובה יותר של המשמעות האבולוציונית של פלסטיות אתר זירחון של קינאזות חלבון.

מסלולים חיסוניים להסתמך על שלאחר translational שינויים שונים (PTMs) של חלבונים לtransduce במהירות אותות ולהפעיל את תגובה חיסונית 1. PTMs הם שינויים כימיים מהירים, הפיכים, ומאוד ספציפיים של מבנה חלבון שיכול להשפיע על קונפורמציה בחלבון, פעילות, יציבות, לוקליזציה, ואינטראקציות בין חלבונים 2-4. בצמחים, יותר מ -300 סוגי PTMs זוהו כוללים ubiquitination, sumoylation, sulfation, glycosylation, וזירחון 2,5. גוף הולך וגדל של ראיות מדגיש את החשיבות של PTMs בהיבטים שונים של חסינות צמח 1,5,6. זירחון חלבון, הקובץ המצורף הפיך של קבוצת פוספט לסרין, שאריות תראונין או טירוזין הוא רגולטור של פונקציות רבות תאיות, שאינו מפתיע למדו PTM גבוה ביותר בהגנת צמח איתות מפלים 5-11. איתות זירחון תלוי היא חלק בלתי נפרד מהמפעל defeהפעלת NSE יזם לאחר תפיסה תאית של חיידקים על ידי קולטנים הטרנסממברני, או הכרה תאית על ידי חלבוני התנגדות multidomain 5,8. עם פלישה לצמחים, חיידקים זוהו על ידי קולטני קרום פלזמה נקרא קולטנים זיהוי תבניות (PRRs) 12. PRRs ידוע הם או חלבונים כמו קולטן (RLPs) או קינאזות כמו קולטן (RLKs), שניהם נושאים ectodomain מחייב ליגנד ותחום הטרנסממברני אחת לעבור. בניגוד לRLPs, יש לי RLKs תחום קינאז תאיים 13-15. Ectodomain של PRRs נקשר למולקולות elicitor חיידק שימור נקראות הקשורים דפוסים מולקולריים הפתוגן מוביל (PAMPs), במקרה של RLKs, לautophosphorylation וtransphosphorylation בתוך התחום תאיים 6, 16. במורד הזרם של זירחון-Induced תפיסת PRRs, זירחון הבא של חלבוני cytoplasmic כולל קינאזות 17, </sup&gt; 18, E3 ligases 19, קינאז החלבון מופעל mitogen (MAPKs) 20, 21, קינאז חלבון סידן תלוי (CDPK) 22, 23, ושעתוק גורמי 24, 25 מוביל לחסינות מופעלת-PAMP (PTI). בנוסף לתפיסה תאיים על ידי PRRs, הכרה תאית של פתוגנים מושגת באמצעות קולטנים cytoplasmic. חלבוני התנגדות multidomain אלה (R) מכילים תחום משתנה N-סופית, מוטיב מרכזי מחייב נוקלאוטיד (NB), וחוזר בטרמינל C-לאוצין עשיר (LRR) ונקראים לכן חלבוני NB-LRR 26, 27. חלבוני R במישרין או בעקיפין להכיר במולקולות המופקת ממחולל מחל ארסיות נקראות effectors, הידוע גם למקד PRRs וצומת אחרים של מערכת החיסון. הכרה גורמת לגינות חזקות שמובילות לחסינות-מופעל על מפעיל (ETI) 28-31. יש חלבוני NB-LRR requisite ATP מחייב מוטיב בתוך תחום NB 30, 32, אך הם חסרים תחום קינאז. זירחון של תחומים שימור של NB-LRRs כבר דיווח בסקר proteomic בקנה מידה גדולה 33, אבל הרלוונטיות שלה לETI אינן ברורה. בדומה לPTI, הפעלה של חלבוני NB-LRR מובילה לזירחון של חלבוני cytoplasmic כולל MAPKs 34-37 וCDPKs 38-40. והכי חשוב, הכרת מפעיל יכולה להוביל לזירחון של חלבוני אבזר המתקשרים ישירות עם חלבוני NB-LRR 41. כמה דוגמאות כוללות RIN4 (thaliana ארבידופסיס) וPto (עגבנייה, Solanum lycopersicum) חלבונים הפועלים באינטראקציה עם חלבוני NB-LRR, 42 RPM1, 43 ו44 PRF, בהתאמה. במהלך זיהום על ידי חיידקי Pseudomonas syringae, חלבון מפעיל AvrB גורם זירחון RIN4, ככל הנראה על ידי קינאז כמו קולטן RIPK 45, <sup&gt; 46. באופן דומה, בעגבניות פ syringae effectors AvrPto וAvrPtoB לגרום זירחון של Pto 47. בניגוד לRIN4 שחסר תחום קינאז וחייב להיות טרנס פוספורילציה, PTO הוא קינאז פעיל מסוגל האוטומטי זירחון 48 וטרנס זירחון של מצעים 49, 50. בעוד Pto דורש פעילות קינאז לייזום מפעיל תלוי של איתות, מוטציות Pto קינאז מת עדיין מסוגלת לאותת בדרך מפעיל עצמאי 51. לאחרונה הסבירו את התצפיות הללו על ידי הוכחת כי מורכב PRF / Pto הוא oligomeric, המכיל PRF מרובה וPto מולקולות 52 וכי מולקולות Pto בתוך אותו מורכב יכולות טרנס phosphorylate אחד את השני 47. הצענו מודל שבו מולקולה אחת של Pto (חיישן) אינטראקציה עם חלבון מפעיל, וגרמה לשינוי קונפורמציה לחלבון NB-LRR (PRF) שבתורו מפעיל מולקולה שנייה Pto (עוזר) שנינותהין המורכב. בהמשך לכך, העוזר Pto טרנס phosphorylates מולקולת החיישן Pto מוביל להפעלה מלאה של ההתנגדות המורכבת 47. דוגמאות אלו מראות כי זיהוי של רכיבים מורכבים חיסוניים וPTMs את הפוטנציאל שלהם בעת הכרת מפעיל יכול להוביל להבנה טובה יותר של כיצד אותות transduced מתפיסת מפעיל למטרות במורד הזרם. כאן אנו מתארים שיטת טיהור חלבונים לחלבוני NB-LRR-אינטראקציה וההזדהות הבאה של PTMs. אנו משתמשים benthamiana ניקוטיאנה ומורכב עגבניות PRF / Pto כמודל, אבל באותו הפרוטוקול בקלות יכול להיות מיושם על RLKs מנ benthamiana וא &#39; thaliana 53 עם שינויים קטנים כפי שאנו מתארים במסגרת הפרוטוקול.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1108">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:296px;">MgCl2</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">M8266</td>
			<td style="width:436px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetosyringone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D134406</td>
			<td>toxic - 1 M stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 1mL sterile</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2525R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Silwet L-77 (surfactant)</td>
			<td>Lehle Seeds</td>
			<td>VIS-01</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MG-132 (Z-Leu-Leu-Leu-al)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2211</td>
			<td>1 M stock in DMSO, store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MS salts</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5524</td>
			<td>oxidizing, toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>adjust pH with 1 N HCl to make 1 M Tris-HCl buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>5 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td>toxic - 0.5 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>EC-606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td>corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PVPP (polyvinylpolypyrrolidone)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5288</td>
			<td>do not confuse with PVP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DTT (DL-dithiothreitol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815</td>
			<td>toxic - 1 M stock, store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plant protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9599</td>
			<td>do not freeze/thaw too many times</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>corrosive, toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calyculin A</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Fluoride (NaF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7920</td>
			<td>toxic - 1 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Molybdate (Na2MoO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6646</td>
			<td>0.5 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="95">
			<td height="95" style="height:95px;">Sodium orthovanadate (Na3VO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>450243</td>
			<td>toxic - Prepare a 200 mM solution of sodium orthovanadate. Adjust the pH to 10.0 using either 1N NaOH or 1N HCl. The starting pH of the sodium orthovanadate solution may vary with lots of the chemical. At pH 10.0 the solution will be yellow. Boil the solution until it turns colorless (approximately 10 minutes). Cool to room temperature.Readjust the pH to 10.0 and repeat steps 3 and 4 until the solution remains colorless and the pH stabilizes at 10.0.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Okadaic acid</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kinematica Polytron tissue homogeniser</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-451-320&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Miracloth</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>475855-1R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-FLAG M2 agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2220</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptavidin-agarose</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>20347</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GFP-Trap_A</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>gta-20</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-HA-Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2095</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.45 &#956;m filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>513-1902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FLAG peptide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">StrataClean resin</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>400714</td>
			<td>this absorption resin is recommended for protein precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PROTEAN II XL Cell</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>this stain is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protein low-binding tubes (LoBind)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 108.116</td>
			<td>these tubes are recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium bicarbonate (ABC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83639</td>
			<td>toxic, flammable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2-chloroacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>22790</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
			<td>irritant, sensitizing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14265</td>
			<td>toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water-bath sonicator</td>
			<td>Ultravawe</td>
			<td>Ultra BT Ultrasonic Bath</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LTQ-Orbitrap XL</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trichostatin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8552</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of post-translational modifications of plant protein complexes

צמחים להסתגל במהירות לשינויים בסביבה בשל לפרט תפיסה ומערכות איתות. במהלך התקפת הפתוגן, צמחים במהירות להגיב לזיהום באמצעות הגיוס וההפעלה של מתחמים חיסוניים. הפעלה של מתחמים חיסוניים קשורה לאחר translational שינויים (PTMs) של חלבונים, כגון זרחון, glycosylation, או ubiquitination. ההבנה כיצד PTMs אלה כוריאוגרפיה תוביל להבנה טובה יותר של איך התנגדות מושגת. כאן אנו מתארים שיטת טיהור חלבונים לחוזרים מחייב נוקלאוטיד לאוצין עשיר (NB-LRR)-אינטראקציה חלבונים וזיהוי הבא של שינוייהם שלאחר translational (PTMs). עם שינויים קטנים, הפרוטוקול יכול להיות מיושם לטיהור של קומפלקסי חלבונים צמחיים אחרים. השיטה מבוססת על הביטוי של גרסה מתויג epitope של החלבון של עניין, אשר לאחר מכן הוא מטוהר באופן חלקי בimmunoprecipitation y ונתון ספקטרומטריית מסה לצורך זיהוי של חלבונים וPTMs אינטראקציה. פרוטוקול זה מוכיח כי: ט). שינויים דינמיים בPTMs כגון זרחון יכולים להיות מזוהים על ידי ספקטרומטריית מסה; השני). זה חשוב לנו כמויות מספיקות של החלבון של עניין, וזה יכול לפצות על חוסר טוהר immunoprecipitate; iii). על מנת לזהות PTMs של חלבון של עניין, חלבון זה יש immunoprecipitated כדי לקבל כמות מספקת של חלבון.

אנו מתארים כאן פרוטוקול לטיהור של חלבונים מתויגים מא המהונדס היציב thaliana קווים או אחרי ביטוי חולף של חלבונים בנ benthamiana. כפי שמודגם באיור 1 הטיהור של החלבון הממוקד בשילוב עם ספקטרומטריית מסה כדי לאפשר זיהוי של חלבוני אינטראקציה וPTMs של חלבון המטרה. הפרוטוקול תוכנן לטיהור של חלבונים מעורבים בחסינות צמח וזיהוי של PTMs שלהם, אבל יכול להיות מיושם לטיהור של כל חלבון צמחי מתויג. כדוגמא אנו משתמשים בטיהור המורכבת PRF / Pto מנ benthamiana. נ המהונדס שורת benthamiana 38-12 54, להביע 35S: PTO, הפכה transiently עם 35S: PRF-FLAG והמורכב היה immunoprecipitated עם agarose אנטי הדגל M2 (איור 2 א). Immunoblots (IB) באיור 2 אלהמחיש כי רוב החלבון הממוקד (PRF) היה immunoprecipitated. PTO וחלבון מפעיל האינטראקציה AvrPtoB היו copurified עם PRF וזוהה באמצעות נוגדנים וניתוח ספקטרומטריית מסה (2A דמויות ו2B). מצאנו כי Pto שcopurified עם PRF היגר איטי יותר על ג&#39;ל SDS-PAGE כאשר coexpressed עם מפעיל בונה 35S: (איור 2 א) AvrPtoB: AvrPto ו35S. שני חלבוני מפעיל מושרה הגירה איטית יותר של Pto PRF-האינטראקציה (איור 2 א). הגירה זו מפעיל ההכרה תלויה איטית של Pto יוחסה בעבר לזירחון כפי שניתן להסירו באמצעות טיפול עם phosphatase 44. כדי לזהות אתרי זירחון תורמים להגירה האיטית של PTO, אנחנו חשופים copurifying PRF Pto לניתוח ספקטרומטריית מסה. למרות הביטוי הגבוה של Pto וזיהוי קל שלה עם immunoblots אנחנו יכולים לאחזר פפטידים גovering רק 57% מהרצף Pto ואנחנו לא הצלחנו לזהות את כל אתרי זרחון (איור 2). בהמשך לכך, שינינו אסטרטגיות למקד את חלבון Pto עם אנטי דגל. נ צמחי benthamiana WT נהפכו transiently עם 35S: PRF-3HA ו35S: PTO-דגל, עם או בלי 35S: AvrPto ו35S:. AvrPtoB הסכום הכולל של חלבון PTO, הכולל גם את המורכבת-PRF וצורות חופשיות, היה immunoprecipitated עם אנטי הדגל M2 agarose וכפוף לחלוקה-SDS, עיכול tryptic בג&#39;ל וניתוח ספקטרומטריה (איור 2 ג). עם גישה זו זיהינו פפטידים Pto פורש כ 80% מהרצף שלו וחלבון kDa ידוע 100 אינטראקציה. זיהינו סדרה של אתרי זירחון יחיד וכפולים לפפטידים Pto 187-202 ו188-202 (טבלה 1). Ser-198 וTHR-199 היו אתרי זירחון הדומיננטיים אבל פו האחראתרי sphorylation גם התגלו (טבלה 1). זירחון והכי חשוב כפול על Ser-198 וTHR-199 זוהה רק בנוכחות של או חלבון מפעיל (טבלת 1). לאחרונה זיהו מערכת דומה של אתרי זירחון Pto ומאויר המשמעות של האירוע הכפול זירחון לאיתות 47. בעקבות הפרוטוקול שתואר כאן היינו מסוגלים לזהות שינויים דינמיים במדינת זירחון של חלבון המטרה. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51095/51095fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51095/51095fig1.jpg" /> איור 1. כללי עיצוב ניסיוני. חלבון המטרה לimmunoprecipitation (IP) מתויג ובא לידי ביטוי בPlanta, transiently בbenthamiana Nicotiana או ביציבות בthaliana ארבידופסיס. בעקבות מיצוי חלבוןחלבון המטרה הוא immunoprecipitated עם מטריצת זיקה. החלבונים מופרדים על ג&#39;ל אלקטרופורזה acrylamide ידי. להקות ג&#39;ל הם נכרת. חלבונים המופקים מלהקות ג&#39;ל ונתונים לספקטרומטריית מסה. אתרי זירחון וחלבונים אינטראקציה מזוהים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51095/51095fig1highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51095/51095fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51095/51095fig2.jpg" /> איור 2. PRF וimmunoprecipitation Pto.). 35S המבנה: PRF-FLAG התבטא transiently ב38-12 קו (35S: PTO), יחד עם וקטור ריק (EV), 35S: AvrPto או 35S: AvrPtoB. שלושה ימים לאחר חדירה-PRF היה immunoprecipitated באמצעות מטריצת זיקה אנטי דגל. אימונוגלובולינnoblots (IB) לPRF, AvrPtoB וPto בוצע. כפי שצוינו על ידי חצים בחלק התחתון של פנל immunoblot PTO, AvrPto וAvrPtoB לגרום להגירה איטית יותר של Pto. ב &#39;). 35S המבנה: PRF-FLAG התבטא transiently ב38-12 קו (35S: PTO), יחד עם וקטור ריק (EV), 35S: AvrPto או 35S: AvrPtoB. שלושה ימים לאחר חדירה-PRF היה immunoprecipitated באמצעות agarose נגד הדגל ונפרד ב- SDS. ג&#39;ל היה מוכתם בcolloidal הכחול Coomassie מבריק (cCBB) וPRF הגלוי, להקות חלבוני Pto וAvrPtoB היו נכרתה מן ג&#39;ל ונותחו על ידי ספקטרומטריית מסה. כיסוי פפטיד אחוז רצפי Pto וPRF זוהו על ידי ספקטרומטריית מסה מצויינים. C). מבני 35S: PRF-3xHA ו35S: PTO-FLAG באו לידי ביטוי transiently יחד עם 35S: AvrPtoB, 35S: AvrPto או וקטור ריק (EV) בנ benthamiana. שלושה ימים לאחר חדירת הסכום הכולל שלPTO-דגל immunoprecipitated באמצעות אנטי הדגל agarose ונפתר ב- SDS. Pto הגלוי ולהקות חלבון PTO-אינטראקציה שנכרתו מן ג&#39;ל ונותחו על ידי ספקטרומטריית מסה. PTO ולהקת חלבון 100 kDa PTO-האינטראקציה נראה בבירור בכחול colloidal Coomassie מבריק (cCBB) הצבעוני ג&#39;ל, ואילו PRF הוא מעט פחות גלוי לעין (כפי שצוין על ידי חיצים). IP: Immunoprecipitation; IB: immunoblot; CBB: מכתים הכחול מבריק Coomassie; cCBB: מכתים colloidal Coomassie מבריק הכחול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51095/51095fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> PRF </td></tr><tr><td></td><td rowspan="2"> EV </td><td rowspan="2"> AvrPto </td><td rowspan="2"> AvrPtoB </td></tr><tr><td> פפטיד PTO 188-202 </td></tr><tr><td> GTELDQ [ט עמ &#39;195] HLSTVVK </td><tד&gt; 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> GTELDQTHL [S p 198] TVVK </td><td> 10 </td><td> 7 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> GTELDQTHLS [ט עמ &#39;199] VVK </td><td> 8 </td><td> 3 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> G [T p 190] ELDQTHLS [ט עמ &#39;199] VVK </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> GTELDQTHL [S p 198] [ט עמ &#39;199] VVK </td><td> 0 </td><td> 8 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> GTELDQTHLSTVVK </td><td> 46 </td><td> 26 </td><td> 48 </td></tr><tr><td> פפטיד PTO 187-202 </td><td colspan="3"></td></tr><tr><td> KGTELDQ [ט עמ &#39;195] HLS TVVK </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHL [S p 198] TVVK </td><td> 17 </td><td> 17 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHLS [ט עמ &#39;199] VVK </tד&gt; <td> 4 </td><td> 2 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> KGTELDQ [ט עמ &#39;195] HLS [ט עמ&#39; 199] VVK </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHL [S p 198] [ט עמ &#39;199] VVK </td><td> 0 </td><td> 7 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHLSTVVK </td><td> 21 </td><td> 37 </td><td> 18 </td></tr><tr><td> פפטידים 187-202 ו188-202 </td><td> 83 </td><td> 88 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> אחוז של פפטידים עם שני אירועי זירחון </td><td> 0% </td><td> 26.9% </td><td> 11.2% </td></tr><tr><td> PTO רצף כיסוי </td><td> 78% </td><td> 79% </td><td> 82% </td></tr></tbody></table> טבלת 1 זירחון זוגי של פפטיד Pto עם הפעלה של איתות 35S:.. PRF-3xHA ו35S: PTO-FLAG בא לידי ביטוי transiently יחד עם אותםוקטור Pty (EV), 35S: AvrPtoB בנ: AvrPto או 35S benthamiana. שלושה ימים לאחר חדירה, הסכום הכולל חלבון PTO-הדגל היה immunoprecipitated באמצעות מטריצת זיקה נגד דגל והחליט על SDS-PAGE. הלהקות גלויות של Pto על הג&#39;ל colloidal Coomassie המבריק הכחול המוכתם היו נכרת וניתחו עם ספקטרומטריית מסה. מספר פפטידים Pto המזוהה עם 0, 1, ו -2 אירועי זירחון מצויינים. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> טבלה של חוצצים </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מדיום L </td><td> Tryptone </td><td> 10 g / L </td></tr><tr><td></td><td> תמצית שמרים </td><td> 5 גר &#39;/ ליטר </td></tr><tr><td></td><td> NaCl </td><td> 5 גר &#39;/ ליטר </td></tr><tr><td></td><td> D-גלוקוז </td><td> גרם 1 / L </td></tr><tr><td> חיץ Agro-הסתננות </td><td> MgCl 2 </td><td> 10 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> MES &lt;/ Td&gt; <td> 10 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> התאם לpH 5.5 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Acetosyringone (אופציונלי) </td><td> 150 מיקרומטר </td></tr><tr><td> חיץ </td><td> pH טריס-HCl 7.5 </td><td> 150 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> NaCl </td><td> 150 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> EDTA </td><td> 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> EGTA </td><td> 2 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> גליצרול </td><td> 5% (v / v) </td></tr><tr><td> הצפת B </td><td> חיץ </td><td></td></tr><tr><td></td><td> PVPP </td><td> 2% (w / v) </td></tr><tr><td> החיץ C </td><td> הצפת B </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Dithiothreitol (DTT) </td><td> 10 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> קוקטייל צמחים מעכבי פרוטאז </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td></td><td> פלואוריד Phenylmethylsulfonyl (PMSF) </td><td> 0.5 מ&quot;מ </td&gt; </tr><tr><td></td><td> Calyculin </td><td> 50 ננומטר </td></tr><tr><td></td><td> פלואוריד הנתרן (NAF) </td><td> 50 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> molybdate נתרן (Na 2 Moo 4) </td><td> 10 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> נתרן orthovanadate </td><td> 1 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> חומצת Okadaic </td><td> 100 ננומטר </td></tr><tr><td> החיץ D </td><td> החיץ C ללא PVPP </td><td></td></tr><tr><td> חיץ טעינת 5x-SDS </td><td> pH טריס-HCl 6.8 </td><td> 60 מ&quot;מ </td></tr><tr><td></td><td> SDS </td><td> 2% </td></tr><tr><td></td><td> גליצרול </td><td> 0.15% </td></tr><tr><td></td><td> Bromophenol כחול </td><td> 0.10% </td></tr><tr><td></td><td> DTT (להוסיף רק לפני השימוש) </td><td> 50 מ&quot;מ </td></tr></tbody></table> טבלה 2. חיץ ומתכונים תקשורת.

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes at JoVE.com

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

אנו מתארים כאן פרוטוקול לטיהור והאפיון של קומפלקסי חלבוני צמח. אנו מראים כי על ידי immunoprecipitating חלבון יחיד בתוך מתחם, כדי שנוכל לזהות לאחר translational השינויים שלה והשותפים באינטראקציה שלה.

זיהוי לאחר translational השינויים של קומפלקסי חלבוני צמח

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

identification-post-translational-modifications-plant-protein

Research

JoVE Journal

Biology

23.7K Views.  University of Warwick.  אנו מתארים כאן פרוטוקול לטיהור והאפיון של קומפלקסי חלבוני צמח. אנו מראים כי על ידי immunoprecipitating חלבון יחיד בתוך מתחם, כדי שנוכל לזהות לאחר translational השינויים שלה והשותפים באינטראקציה שלה. 

Video: Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

זיהוי של קומפלקסים חלבונים עם proteomics כמותיים cerevisiae ס

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within the cell, type III effectors subvert host cellular processes to suppress immune responses and promote pathogen growth. Numerous type III effectors of plant and animal bacterial pathogens have been identified to date, yet only a few of them are well characterized. Understanding the functions of these effectors has been undermined by a combination of functional redundancy in the effector repertoire of a given bacterial strain, the subtle effects that they may exert to increase virulence, roles that are possibly specific to certain infection stages, and difficulties in genetically manipulating certain pathogens. Expression of type III effectors in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae may allow circumventing these limitations and aid to the functional characterization of effector proteins. Because type III effectors often target cellular processes that are conserved between yeast and other eukaryotes, their expression in yeast may result in growth inhibition phenotypes that can be exploited to elucidate effector functions and targets. Additional advantages to using yeast for functional studies of bacterial effectors include their genetic tractability, information on predicted functions of the vast majority of their ORFs, and availability of numerous tools and resources for both genome-wide and small-scale experiments. Here we discuss critical factors for designing a yeast system for the expression of bacterial type III effector proteins. These include an appropriate promoter for driving expression of the effector gene(s) of interest, the copy number of the effector gene, the epitope tag used to verify protein expression, and the yeast strain. We present procedures to induce expression of effectors in yeast and to verify their expression by immunoblotting. In addition, we describe a spotting assay on agar plates for the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. The use of this protocol may be extended to the study of pathogenicity factors delivered into the host cell by any pathogen and translocation mechanism.

In this video, we describe a procedure for the expression of bacterial type III effectors in yeast and the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. Such phenotypes can be subsequently exploited to elucidate effector functions and targets.

זיהוי של פנוטיפים עיכוב גדילה מושרה על ידי הבעת effectors סוג חיידקית השלישי שמרים

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 base pairs of DNA associated with two each of histones H2A, H2B, H3, and H41. The N-terminal tails of histones are rich in lysine and arginine and are modified post-transcriptionally by acetylation, methylation, and other post-translational modifications (PTMs). The PTM configuration of nucleosomes can affect the transcriptional activity of associated DNA, thus providing a mode of gene regulation that is epigenetic in nature 2,3. We developed a method called nucleosome ELISA (NU-ELISA) to quantitatively determine global PTM signatures of nucleosomes extracted from cells. NU-ELISA is more sensitive and quantitative than western blotting, and is useful to interrogate the epiproteomic state of specific cell types. This video journal article shows detailed procedures to perform NU-ELISA analysis.

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) is a sensitive and quantitative method to detect global patterns of post-translational modifications in preparations of native, intact nucleosomes. These modifications include methylations, acetylations, and phosphorylations at specific histone amino acid residues, and hence NU-ELISA provides a global proteomic assay of the overall chromatin modification states of specific cell types.

איתור של פוסט translational שינויים על nucleosomes אינטקט Native ידי ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent modifications on the amino-terminal tails of histones H3 and H4 play essential roles1-2. H3 and H4 histone modifications include methylation of lysine and arginine, acetylation of lysine, and phosphorylation of serine residues1-2. These modifications are associated either with gene activation, repression, or a primed state of gene that supports more rapid and robust activation of expression after perception of appropriate signals (microbe-associated molecular patterns, light, hormones, etc.)3-7. 
Here, we present a method for the reliable and sensitive detection of specific chromatin modifications on selected plant genes. The technique is based on the crosslinking of (modified) histones and DNA with formaldehyde8,9, extraction and sonication of chromatin, chromatin immunoprecipitation (ChIP) with modification-specific antibodies9,10, de-crosslinking of histone-DNA complexes, and gene-specific real-time quantitative PCR. The approach has proven useful for detecting specific histone modifications associated with C4 photosynthesis in maize5,11 and systemic immunity in Arabidopsis3.

A reliable and useful approach to detect histone modifications on specific plant genes is described. The approach combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) and real-time quantitative PCR. It allows detection of histone modifications on specific genes with a role in diverse physiological processes.

זיהוי של שינויים היסטון בעלים הצמח

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and readily available form of data collection. In many research and disease models however, steady state levels of target gene mRNA does not always directly correlate with steady state protein levels. Post-transcriptional gene regulation is a likely explanation of the divergence between the two. Driven by the binding of RNA Binding Proteins (RBP), post-transcriptional regulation affects mRNA localization, stability and translation by forming a Ribonucleoprotein (RNP) complex with target mRNAs. Identifying these unknown de novo mRNA targets from cellular extracts in the RNP complex is pivotal to understanding mechanisms and functions of the RBP and their resulting effect on protein output. This protocol outlines a method termed RNP immunoprecipitation-microarray (RIP-Chip), which allows for the identification of specific mRNAs associated in the ribonucleoprotein complex, under changing experimental conditions, along with options to further optimize an experiment for the individual researcher. With this important experimental tool, researchers can explore the intricate mechanisms associated with post-transcriptional gene regulation as well as other ribonucleoprotein interactions.

A step by step protocol to isolating and identifying RNA associated complexes through RIP-Chip.

שיטה לבידוד וזיהוי mRNAs, רנ&quot;א ורכיבי חלבון של מכלולי Ribonucleoprotein מתמציות סלולריות באמצעות שבב RIP

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

פרוטוקול לזיהוי של אינטראקציות בין חלבונים על הסמך<sup&gt; 15</sup&gt; תיוג N מטבולית, immunoprecipitation, כמותית המונית ספקטרומטריית וזיקת ​​אפנון

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

הפקת ניצני שמרים וטיהור חלבון לחקר תפקוד, האינטראקציות, ולאחר translational השינויים

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

גישה חדשה לניתוח השוואתי של multiprotein מכלולים בהתבסס על<sup&gt; 15</sup&gt; N מטבולית תיוג וכמותי ספקטרומטריית המסה

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

CRISPR וקטור בינוי אפיון תפוקה גבוהה של שינויי DNA על ידי דור של שורשי עגבניות שעירים

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...