VN wird von der Royal Society unterstützt. JPR ist ein Zukunfts Fellow (FT0992129) Australian Research Council. Wir danken Dr. Miriam Gifford für das Manuskript kritisch zu lesen.

Hinweis: Alle Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. 1. Herstellung von pflanzlichen Materialien und Puffer <ol><li> Für N. benthamiana <ol><li> Wachsen die Agrobakterium tumefaciens-Stämme von Interesse für die transiente Expression (in diesem Beispiel Prf-FLAG, Prf-3xHA, Pto-FLAG und leeren Vektor als Kontrolle) durch Schütteln (200 rpm) in Flüssigkultur (L-Medium mit entsprechenden Antibiotika) bei 28 ° C bis zur stationären Phase. </li><li> Sammeln und Pellet Agrobakterien durch Zentrifugation (3000 g für 5 min). Überstand verwerfen und resuspendieren pelletiert Agrobakterien in Infiltration Puffer. </li><li> Messung der Menge der Agrobakterien durch Erhalten der optischen Dichte (OD)-Wert bei einer Absorption von 600 nm (Abs 600 nm). Stellen Sie die OD von Bakterien 0,1-0,8. </li><li> Infiltrieren 4 Wochen alt N. benthamiana Pflanzen (22 ° C und 16 Stunden Licht) mit Agrobakterien durch hand (mit einer 1-ml-Spritze ohne Nadel) oder von Vakuum (0,02 hinzuzufügen% v / v Tensid). Hinweis: Mit der ersten nahezu vollständig ausgebaut Blatt, und die beiden älteren Blätter sofort für die effektivste Protein-Expression. Für den Nachweis von Ubiquitin oder acetylierte Proteine ​​infiltrieren Blätter mit 100 nM MG-132 oder 100 ng / ml Trichostatin A, jeweils bei 1 und 2 Tage nach der Infiltration. </li><li> Ernten Sie die Blätter infiltriert 2-5 Tage nach der Infiltration und in flüssigem Stickstoff einfrieren. Lagern Sie die Proben in einem -80 ° C Gefrierschrank. Hinweis: Ermitteln Sie die beste Höhe der Expression des Proteins von Interesse vorher durch die Entnahme von Proben über einen Zeitverlauf von 5 Tagen und Protein-Ebene zu erkennen durch Immunoblotting. </li></ol></li><li> Für A. thaliana stabilen transgenen Linien <ol><li> Wachsen A. thaliana-Samen in 6-Well-Platten mit 5 ml flüssiges MS-Medium (1% w / v Saccharose) pro Vertiefung ergänzt. Legen Sie drei vor fünf Samen (sterilisiert und Schicht) der transgenen Linievon Interesse oder nicht transformierten Steuerleitung pro Vertiefung. Schütteln bei 200 rpm für zwei Tage vor der Übertragung die Platte zu einem Wachstumsraum und lassen für 2 Wochen (22 ° C, 10 h Licht). </li><li> Ernte-Proben und in flüssigem Stickstoff einfrieren. Hinweis: Sie können als Steuer verwenden eine transgene Linie ein nicht verwandtes Protein exprimieren, mit dem gleichen Tag wie das Protein von Interesse. </li></ol></li><li> Puffer <ol><li> Bereiten Buffer A. De-Gas den Puffer für 1-2 h (für RLKs, andere membrangebundenen Proteinen und Kernproteine, fügen Sie 1% v / v IGEPAL CA-630-53). Hinweis: Sie können Puffer A bei 4 ° C auf unbestimmte Zeit zu halten. Sie können 1% v verwenden / v Triton statt IGEPAL CA-360. </li><li> Bereiten Sie 80 ml kaltem Puffer B mindestens 1-2 Stunden vor der Extraktion. Hinweis: Das ideale Verhältnis von Gewebe gegen Extraktionspuffer 1:4 (w / v). </li></ol></li></ol> 2. Proteinextraktion <ol><li> Kurz vor der Extraktion vorzubereiten 80 ml kaltem Puffer C <li> Grind 20 g N. benthamiana Gewebe (ca. 15 Blätter) oder A. thaliana Keimlinge (2-4 g pro 6-well-Platte) in flüssigem Stickstoff mit einem Mörser und Stößel. </li><li> In 80 ml kaltem Puffer C auf die 20 g Grundgewebe, gut mischen und auf Eis auftauen. Hinweis: Grind alle Proben in der gleichen Zeit (Protein von Interesse und Kontrolle). </li><li> Homogenisieren mit 3 Ausbrüche von jeweils 10 Sekunden bei voller Geschwindigkeit mit einem Gewebe-Homogenisator (bei 4 ° C vorgekühlt). Filtriert durch ein 22-25 um Gewebe und Zentrifuge bei 30.000 × g für 30 min bei 4 ° C. Hinweis: Alternativ zu homogenisieren, mit einem frischen vorgekühlten Mörser und Stößel. </li><li> Für die Sperr-und Waschschritte der Affinitätsmatrix, werden 20 ml Puffer D </li><li> Block 100 ml der geeigneten Affinitätsmatrix unter Verwendung von 500 ml kaltem Puffer D, enthaltend 1% BSA für 5 min bei 4 ° C. Hinweis: Bevorzugte affinity Matrices umfassen Anti-FLAG-M2-Agarose, Streptavidin Agarose, GFP-Trap_A und Anti-HA-Agarose. </li><li> 3x Waschen mit 1 ml kaltem Puffer D </li><li> Entfernen der überstehenden Blattextrakt und filtriert durch ein 0,45 um-Spritzenfilter in ein neues Röhrchen auf Eis. Hinweis: Der Extrakt Farbe sollte grün oder gelb sein, wenn die Probe braun geworden, zu verwerfen und von vorn beginnen. </li><li> Einen aliquoten des Rohextraktes für Immunoblot, fügen 5x SDS-PAGE-Ladepuffer, Vortex und denaturiert durch Kochen Proben für 10 min bei 80-100 ° C in einem Wärmeblock. </li></ol> 3. Protein Immunpräzipitation <ol><li> Teilen die Proteinextrakt in zwei 50 ml-Röhrchen und 50 ul der Affinitätsmatrix in Puffer D zu jedem Röhrchen suspendiert. Inkubieren mit leichter Rotation für 2 Stunden bei 4 ° C. Hinweis: Längere Inkubationen nicht gefunden worden, um die Ausbeute zu erhöhen. </li><li> Bereiten Sie 600 ul (6x Perle Volumen von Affinitätsmatrix) Elutionspuffer durch ZugabePuffer D (Endkonzentrationen): 0,5% BSA, 0,25 mg / ml FLAG-Peptid (anti-FLAG-M2-Agarose) oder 10 mM D-Biotin (für Streptavidin-Agarose). Hinweis: Die Elution wird nicht im Falle von GFP-Trap_A und Anti-HA-Matrizen zu empfehlen, so gehen Sie direkt zu Kochen in 1x SDS-PAGE-Ladepuffer, Schritt 3.11. </li><li> Ausfällung der Affinitätsmatrix durch Zentrifugation bei 4 ° C (5 min bei 1000 × g). </li><li> Einen aliquoten des ungebundenen Extrakt für Immunoblot, werfen den Rest der Überstand, so dass etwa 500 ul im Boden des Röhrchens. </li><li> Resuspendieren den Schlamm-Lösung mit einer breiten Spitze-Bohrung. </li><li> Übertragen Sie die Mischaufschlämmung Lösung aus beiden Röhren auf eine einzige 1,5-ml-Tube. Hinweis: Von nun an verwenden 1,5 ml Low-Protein-Bindung Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Pulse 3x für 5 Sekunden mit einer Tischzentrifuge, um die Affinität Matrix ausfallen und den Überstand entfernen. </li><li> Waschen 3-5x mit 1 ml kaltem Puffer D. Zwischen den Wäschen fallen die Affinität Matrix wie zuvor beschrieben, und den Überstand verwerfen. In der letzten Wasch überschüssige Puffer D mit der Nadel einer Spritze. Hinweis: Eine letzte Waschung mit Puffer D mit 0,1% IGEPAL kann verwendet werden, um weiter zu reduzieren unspezifische Bindung werden. </li><li> Eluieren mit 200 ul der geeigneten Elutionspuffer (für Anti-FLAG-M2-Agarose oder Streptavidin siehe Schritt 3.2), 3x, jeweils 5 min unter konstantem Schütteln. </li><li> Pool die 3 Eluate in einem einzigen Rohr. Konzentrieren sich die Proteine, die durch Verwendung von 30 ul Absorptionsharz. Vortex stehen lassen für 5 min und fällt das Harz (2 min bei 10.000 × g). Überstand verwerfen. Hinweis: Für die GFP-Trap_A und Anti-HA Agarose, überspringen Sie die Schritte 3.9 und 3.10. </li><li> In 50 ul 1x SDS-PAGE-Ladepuffer, um das ausgefallene Affinitätsmatrix oder Absorptionsharz. Vortex und kochen für 10 Minuten bei 80-100 ° C in einem Wärmeblock. </li><li> Zentrifuge das gekochte Affinitätsmatrix oder Harz für 2 min bei 10.000 x g. Aliquot 5 ul der supernatant für Immunoblot und mit anderen Fraktionen laufen auf eine ~ 10 cm lang SDS-PAGE-Gel (Abb. 2). </li><li> Für die Trennung und Identifizierung von phosphorylierten Proteinen durch Massenspektrometrie, laden die restlichen 45 ul auf eine ~ 19 cm langen SDS-PAGE-Gel, wenn zusätzliche Trennung erforderlich ist (Abbildung 2). Hinweis: Eine leere Gasse zwischen allen Proben aufgenommen werden, um eine Kontamination der Proben zu reduzieren. </li></ol> 4. Protein Verdauung <ol><li> Flecken auf der SDS-PAGE-Gel mit kolloidalem Coomassie Brilliant Blue (CCBB) Fleck. Hinweis: Minimieren Handhabung des Gels, um eine Kontamination mit Keratine reduzieren. Stellen Sie sicher, dass keines der Geräte oder Werkzeuge für Immunoblotting oder andere Aktivitäten, die Restproteinkontamination verlassen haben könnte verwendet worden. </li><li> Entfärben des Gels mit reichlich Waschen in Wasser, vorzugsweise O / N. Schneiden Sie das Band von Interesse aus dem Gel mit einem sauberen Rasierklinge. Hinweis: Richten Sie das Gel mit dem Immunoblot wenn necessary, um die richtige finden. Wie kann die Migration Phosphorylierung von Proteinen auf SDS-PAGE verzögern schneiden den Bereich unmittelbar oberhalb und unterhalb der Band von Interesse. </li><li> Würfeln Gelscheibe in Würfel von 2-4 mm (dies stellt sicher, dass das Gel von Lösungen in der Röhre, ohne zu blockieren Pipettenspitzen abgedeckt werden). In einem Rohr. </li><li> Schätzen Sie die erforderlich ist, um das Gel auch unter Wasser zu halten Lautstärke. Verwenden Sie diesen Betrag für die Derivatisierung, Inkubation mit Protease-und Peptid-Extraktion, und verwenden Sie dann doppelt auf dreifache Volumen zum Waschen. Anmerkung: Bei einer typischen Synthese mit etwa 100 ul der geschnittenen Gelstücke, verwenden 500 &amp;mgr; l Waschlösung, 2 x 180 ul zur Dehydratisierung, 150 &amp;mgr; l für die Reduktion, 120 &amp;mgr; l für die Alkylierung, und 120 &amp;mgr; l für die Verdauung. </li><li> Durch Zugabe von 50% Acetonitril (in 50 mM Ammoniumbicarbonat, ABC) Waschen der Gelstücke 2 x 20 min (oder bis entfärbt). Pipettieren Sie die Lösung dabei nicht zu Gel-Stücke zu entfernen. </li><li> Entwässern mit 100% AcetoNitril für 5 min und entfernen freie Flüssigkeit. Hinweis: Das Gel sollte geschrumpft und weiß erscheinen. Wenn die blaue Farbe bestehen bleibt, länger inkubieren in Acetonitril / ABC und / oder bei erhöhter Temperatur (45-55 ° C). </li><li> Reduzieren Protein Disulfidbrücken durch Zugabe von 10 mM DTT in Wasser und Inkubation für 30-45 min bei 56 º C unter Schütteln. Freie Flüssigkeit. </li><li> Alkylatqualität Cysteinreste durch Zugabe von 55 mM chloracetamid (in 50 mM ABC) für 20-30 min (Raumtemperatur, dunkel). Freie Flüssigkeit. </li><li> Mit 50% Acetonitril (in 50 mM ABC) waschen Gel-Stück 2 x 10 min. Freie Flüssigkeit. </li><li> Entwässern Gelstücke mit 100% Acetonitril für 5 Minuten, und entfernen Sie freie Flüssigkeit. </li><li> Für die Trypsin zu verdauen, dann werden 40 ul Trypsin-Arbeitslösung (100 ng Trypsin in Verdauungspuffer: 50 mM ABC, 5% Acetonitril für einen durchschnittlichen Coomassie-gefärbten Bande). Lassen Gelstücke 10 min deinen Durst. Fügen Sie genug Puffer, um der Verdauung Gelstücke bei Bedarf zu decken. Bei 37 º CO / N. </li><li> Um die Verdauung zu stoppen und extrahieren Sie die Peptide aus den Gel-Stücke, mit 5% iger Ameisensäure (in 50% Acetonitril) (fügen Sie das gleiche Volumen wie die Verdauung Lautstärke). Beschallen für 5-10 min. Den Überstand in neue Röhre. Die Extraktion 3x. </li><li> Trocknen der Peptide durch Lyophilisation (bevorzugt) oder ein Vakuum-Konzentrator (wie Speed-Vac oder Savant). Lagerung bei -20 ° C. </li><li> Reichen Sie Ihre Probe für die Massenspektrometrie. Hinweis: Wir haben unsere Probe auf die Massenspektrometrie-Anlage an der Sainsbury Laboratory (Norwich, UK). Protokolle auf Massenspektrometrie Einrichtungen sind sehr unterschiedlich, aber in der Regel Peptide in 0,2% Trifluoressigsäure mit 2% Acetonitril, bevor sie auf einem Flüssigkeits-Chromatographie-System gekoppelt, um Elektrospray-Tandem-Massenspektrometrie aufgelöst werden. </li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessen (finanzielle oder andere) haben.

Die Aufklärung des Mechanismus der Rezeptoraktivierung durch PAMPs und Effektoren können wesentlich zum Verständnis von Pflanzen Immunität beitragen. In den letzten 20 Jahren haben genetische und Hefe-Zwei-Hybrid-Screens war maßgeblich für die Entdeckung des KFV und NB-LRR-Proteine. Kürzlich wurden Massenspektrometrie-basierte Protokolle für die Identifizierung von Proteinen in Immun differentiell Signalisierungs 55-58, deren PTMs 11,33,59,60 geregelt etabliert, die Zusammensetzung der Immunkomplexe 61 und 62 richtet Effektor. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die Identifizierung von PTMs Regulierung der Aktivierung von Immunkomplexen. Im Vergleich mit den zuvor beschriebenen Protokolle ermöglicht dieses Protokoll die detaillierte Ermittlung der dynamischen Veränderungen PTMs. Protokolle von Groß Proteomik Ansätze können PTMs der Proteine ​​zu identifizieren, sind aber nicht in der Lage, die Website Plastizität PTMs aufgrund begrenzen zeigened Proteinmengen. Bei der Protein-Phosphorylierung, Groß Proteomik Ansätze in der Regel nur identifizieren die vorherrschende Phosphorylierungsstellen 11,33,59. Die detaillierte Charakterisierung eines Proteins Phosphorylierungsstatus erfordert eine erhebliche Menge an Protein, die nur durch teilweise Reinigung des Zielproteins 47 erhalten werden können. Das hier beschriebene Protokoll Paare eine Proteinreinigung Ansatz, der eine wesentliche Menge des Zielproteins führt, mit der Massenspektrometrie-Analyse des gereinigten Proteins. Nach diesem Protokoll wurde die Einzel Phosphorylierung von Puerto überwiegend an Ser-198 zugeschrieben, wie zuvor beschrieben, aber einige 52-Massenspektrometrie Spektren auch eine einzelne Phosphorylierung an Thr-195 oder Thr-199 unterstützt. Wenn Doppel Phosphorylierungsereignisse von Puerto beobachtet wurden, die vorherrschende Kombination von Aminosäuren phosphoryliert war Ser-198 und Thr-199, obwohl Kombinationen auf anderen Websites wurden ebenfalls beobachtet (Tabelle 1). Diese Ergebnisse zeigen deutlich die Phosphorylierungsstelle Plastizität von Proteinkinasen und die Fähigkeit des beschriebenen Protokolls, im Detail beschreiben sämtliche möglichen Phosphorylierungsstellen. Die wichtigsten Schritte dieses Protokolls sind: 1) ausreichende Extraktion von Proteinen, 2) Schutz des PTMs, und 3) ausreichende Menge an Zielprotein. Erste, für eine ausreichende Extraktion von Proteinen, ist es wichtig, das Gewebe in flüssigem Stickstoff zermahlen und anschließend in ein Gewebe-Homogenisator verwendet, wie im Protokoll beschrieben. Wenn ein Gewebe-Homogenisator nicht verfügbar ist, kann ein Mörser und Pistill verwendet werden. Es ist auch wichtig, ein Verhältnis von eins zu drei (oder vier) Gramm Gewebe zu Volumen Extraktionspuffer verwenden. Dieses Gewebe-Verhältnis und die hohe Festigkeit Puffer, die wir vorschlagen Puffer stellt sicher, dass der pH-Wert während der Extraktion neutral bleiben. Wir fanden, dass dies ist von besonderer Bedeutung für A. thaliana und Tomate Extractions 52. Schutz der PTM kann, indem in allen Puffern geeignete Inhibitoren von Enzymen, die PTM zu entfernen, kann erreicht werden. Es ist auch wichtig, um alle Schritte bei 4 ° C durchzuführen und Puffer und Instrumente Vorkühlung. Höhere Ausbeuten an Zielprotein kann durch die Verwendung von Pflanzen, die das Protein exprimieren, in ausreichenden Mengen und unter Verwendung von hohen Mengen an Gewebe (etwa 20 g) erreicht werden. Der entscheidende Schritt für den Erhalt von ausreichenden Mengen an Zielprotein Konzentration des Zielproteins durch direkte Immunopräzipitation. Die Bedeutung dieses Schrittes durch unser Versagen, PTMs von Pto nach einer Immunpräzipitation Prf aufgrund der begrenzten Menge an co-immunpräzipitiert Pto (2B) identifizieren hervorgehoben. Im Gegensatz direkte Immunopräzipitation von Pto ergab deutlich mehr messbar Peptide (Fig. 2C), die zu etwa 80% Abdeckung der Proteinsequenz und Identifizierung von PTM (Tabelle 1). Wir haben auch strongly empfehlen die Verwendung von Epitop-Tags für Protein Immunpräzipitation. Im Vergleich zu Antikörpern gegen native Proteine ​​Epitop-Tags Affinitätsmatrix angehoben werden können, höhere Mengen an teilweise gereinigten Protein zu erhalten. Durch die Verwendung eines Antikörpers gegen Mutter Pto Protein 51 (2A) für die Immunpräzipitation erhoben, konnten wir nur einzelne Phosphorylierung der beiden vorherrschenden Phosphorylierungsstellen von Puerto identifizieren. Dieses Protokoll wurde in erster Linie für die partielle Reinigung von N. entwickelt benthamiana Zytoplasma-Proteinen und anschließende Identifizierung der Phosphorylierungsstellen. jedoch unter Verwendung der hier beschriebenen Änderungen, dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, für A. thaliana Proteine ​​und membrangebundenen Proteinen. Das Hauptziel dieses Protokolls ist, ausreichende Mengen des Zielproteins für die Identifizierung von PTMs Ausbeute und die höchste Reinheit des Komplexes nicht zu erreichen. Wenn höhere Reinheitdes Komplexes benötigt einen zweiten Schritt der Reinigung kann dieses Protokoll 52 hinzugefügt werden. In diesem Fall wird der erste Schritt ermöglicht die Elution des Zielproteins von der Affinitätsmatrix ohne die Verwendung von hohen Salzen oder Säure und dem nachfolgenden Schritt kann eine Matrix beinhalten, welche harte Elutionsbedingungen erfordert. Es ist wichtig zu betonen, dass wir nur dieses Protokoll getestet, für die Identifizierung von Phosphorylierungsstellen und dass wir testen derzeit ihre Fähigkeit zur detaillierten Ermittlung der zusätzlichen PTMs. Unsere repräsentative Ergebnisse zeigen deutlich die Phosphorylierungsstelle Plastizität von Proteinkinasen und die Fähigkeit des beschriebenen Protokolls zu Phosphorylierungsstellen charakterisieren. Am wichtigsten ist, markieren Sie sie, dass die Identifizierung von Phosphorylierungsstellen die sich in geringen Menge von Proteinen durch Massenspektrometrie und durch einzelne Punktmutationen von Auto-Phosphorylierungsstellen kann verwirrend Ergebnisse. Wir zeigen hier und zuvor 47 </sup&gt; Doppel, dass die Phosphorylierung von Pto auf Ser-198 und Thr-199 ist mit der Aktivierung des Prf / Pto Komplex assoziiert. Dagegen bisher veröffentlichten Ergebnisse zeigen, dass 47,63 Einzelpunktmutationen von Ser-198 und Thr-199 zu Alanin, die Phosphorylierung an diesen Stellen eine Voraussetzung für komplexe Aktivierung zu verhindern, sind in der Lage von Signalisierungs darauf hindeutet, dass die Phosphorylierung dieser Seiten ist nicht . Diese Ergebnisse können nun durch Phosphorylierung des sekundären Standorts Thr-195 erläutert. Ähnliche Einblick in die Phosphorylierungsstelle Plastizität von anderen Proteinkinase kann nach diesem Protokoll erhalten werden. Ferner ist ein kombinierter Ansatz aus Phosphorylierungsstellen Punktmutationen, Proteine, die spezifische Kinasen (Effektoren), die mit Protein-Immunpräzipitation und Massenspektrometrie-Analyse zu hemmen, kann zu einem besseren Verständnis der Bedeutung der Evolutions Phosphorylierungsstelle Plastizität von Protein-Kinasen führen.

Immunwege beruhen auf verschiedenen post-translationalen Modifikationen (PTM) von Proteinen schnell übertragen Signale und aktiviert Immunantworten 1. PTMs sind schnell, reversibel und sehr spezifische chemische Veränderungen der Proteinstruktur, die Protein-Konformation, Aktivität, Stabilität, Lokalisierung und Protein-Protein-Wechselwirkungen 04.02 beeinflussen können. In Pflanzen mehr als 300 Arten von PTM wurden identifiziert, einschließlich Ubiquitinierung sumoylation, Sulfatierung, Glycosylierung, Phosphorylierung und 2,5. Eine wachsende Zahl von Hinweisen unterstreicht die Bedeutung der PTMs in verschiedene Aspekte der Anlagen Immunität 1,5,6. Protein-Phosphorylierung, die reversible Befestigung einer Phosphatgruppe an ein Serin, Threonin oder Tyrosin-Rest ein Regulator von vielen Zellfunktionen und nicht überraschend die sehr sucht PTM im Pflanzenabwehrsignalkaskaden 5-11. Phosphorylierungsabhängige Signalisierung ist ein integraler Bestandteil der Anlage Defensense Aktivierung initiiert nach extrazellulären Wahrnehmung von Mikroben durch Transmembranrezeptoren oder intrazelluläre Erkennung von Multidomänen-Resistenzproteine ​​5,8. Nach der Invasion Pflanzen, Mikroben, werden durch Plasmamembran-Rezeptoren genannt pattern recognition receptors (PRR) 12 erfasst. Bekannt KFVs entweder Rezeptor-ähnliche Proteine ​​(RLP) oder Rezeptor-ähnliche Kinase (RLKs), beide, der eine Liganden-Bindungs ​​Ektodomäne und einem Single-Pass-Transmembrandomäne. Im Gegensatz zu RLPs haben RLKs eine intrazelluläre Kinase-Domäne 13-15. Die Ektodomäne von PRRS bindet an konservierte Mikrobe Elicitor Moleküle genannt pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) führenden, im Falle RLKs, Autophosphorylierung und Transphosphorylierungs innerhalb der intrazellulären Domäne 6, 16. Stromabwärts der Wahrnehmung-induzierte Phosphorylierung von PRRs anschließende Phosphorylierung von Zytoplasma-Proteinen, einschließlich Kinasen 17, </sup&gt; 18, E3-Ligasen 19, Mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAPK) 20, 21, Calcium-abhängigen Proteinkinasen (CDPK) 22, 23 und Transkriptionsfaktoren 24, 25 zu PAMP-Immunität ausgelöst (PTI). Zusätzlich zu extrazellulären Wahrnehmung KFVs wird intrazelluläre Erkennung von Pathogenen durch zytoplasmatische Rezeptoren erzielt. Diese Multidomänen Widerstand (R)-Proteine ​​enthalten eine variable N-terminale Domäne, eine zentrale Nukleotid-Bindung (NB)-Motiv, und C-terminalen Leucin-reichen Wiederholungen (LRR) und damit NB-LRR Proteinen 26, 27 bezeichnet. R-Proteinen, die direkt oder indirekt erkennen pathogen-abgeleiteten Moleküle genannt Virulenz Effektoren bekannt PRRS und andere Knoten des Immunsystems Ziel. Anerkennung induziert starke Verteidigung, die zu-Effektor-Immunität ausgelöst (ETI) 28-31. NB-LRR-Proteine ​​haben eine requisite ATP-Bindungsmotiv im NB-Domäne 30, 32, aber es fehlt eine Kinase-Domäne. Die Phosphorylierung von konservierten Domänen von NB-LRR hat in einer groß angelegten Umfrage Proteom-33 berichtet worden, aber ihre Bedeutung für die ETI, ist unklar. Ähnlich wie PTI, Aktivierung der NB-LRR-Proteine ​​führt zu Phosphorylierung von Zytoplasma-Proteinen, einschließlich MAPK 34-37 und 38-40 CDPKs. Vor allem aber können Effektor Anerkennung Phosphorylierung von akzessorischen Proteinen, die direkt interagieren mit den NB-LRR-Proteine ​​41 führen. Einige Beispiele sind RIN4 (Arabidopsis thaliana) und Pto (Tomaten, Solanum lycopersicum) Proteine, die mit NB-LRR-Proteine ​​interagieren, RPM1 42, 43 und Prf 44. Während der Infektion durch Pseudomonas syringae Bakterien, die Effektor-Protein induziert AVRB RIN4 Phosphorylierung, durch den Rezeptor-ähnliche Kinase RIPK 45 wahrscheinlich, <sup&gt; 46. Auch in der Tomaten P. syringae Effektoren AvrPto und AvrPtoB induzieren die Phosphorylierung von Pto 47. Im Gegensatz zu RIN4, die eine Kinase-Domäne fehlt und muss trans-phosphoryliert werden, ist eine aktive Pto-Kinase in der Lage, Auto-Phosphorylierung 48 und trans-Phosphorylierung der Substrate 49, 50. Während Pto benötigt seine Kinase-Aktivität für die Effektor-abhängigen Initiation der Signalisierung sind Kinase-dead Pto Mutanten noch in der Lage, in einem Effektor-unabhängigen Weg 51 zu signalisieren. Wir haben vor kurzem erklärt, diese Beobachtungen durch den Nachweis, dass die Prf / Pto oligomeren Komplex ist, mit mehreren Prf und Pto Moleküle 52 und Pto Moleküle innerhalb der gleichen Komplex trans-phosphorylieren seitig 47. Wir ein Modell vorgeschlagen, in dem ein Molekül Pto (Sensor) mit dem Effektor-Protein, was eine Konformationsänderung an das NB-LRR-Protein (Prf), das wiederum aktiviert einen zweiten PTO-Molekül (Helfer) witHin die Anlage. Anschließend Molekül trans-phosphoryliert der Helfer den Sensor Pto Pto die volle Aktivierung der Widerstand Komplex 47 führt. Diese Beispiele zeigen, dass die Identifizierung der Immunkomplex-Komponenten und deren Potential PTM bei der Effekterkennung kann zu einem besseren Verständnis der Signale von Effektor Wahrnehmung nachgeschalteten Ziele transduzierte führen. Hier beschreiben wir eine Methode zur Proteinreinigung NB-LRR-Proteine ​​interagieren und der anschließenden Identifizierung ihrer PTMs. Wir verwenden Nicotiana benthamiana und das Tomaten Prf / Pto Komplex als Modell, aber das gleiche Protokoll kann leicht zu RLKs von N. angewendet werden benthamiana und A. thaliana 53 mit kleinen Änderungen, wie wir innerhalb des Protokolls zu beschreiben.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1108">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:296px;">MgCl2</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">M8266</td>
			<td style="width:436px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetosyringone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D134406</td>
			<td>toxic - 1 M stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 1mL sterile</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2525R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Silwet L-77 (surfactant)</td>
			<td>Lehle Seeds</td>
			<td>VIS-01</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MG-132 (Z-Leu-Leu-Leu-al)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2211</td>
			<td>1 M stock in DMSO, store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MS salts</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5524</td>
			<td>oxidizing, toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>adjust pH with 1 N HCl to make 1 M Tris-HCl buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>5 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td>toxic - 0.5 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>EC-606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td>corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PVPP (polyvinylpolypyrrolidone)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5288</td>
			<td>do not confuse with PVP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DTT (DL-dithiothreitol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815</td>
			<td>toxic - 1 M stock, store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plant protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9599</td>
			<td>do not freeze/thaw too many times</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>corrosive, toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calyculin A</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Fluoride (NaF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7920</td>
			<td>toxic - 1 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Molybdate (Na2MoO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6646</td>
			<td>0.5 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="95">
			<td height="95" style="height:95px;">Sodium orthovanadate (Na3VO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>450243</td>
			<td>toxic - Prepare a 200 mM solution of sodium orthovanadate. Adjust the pH to 10.0 using either 1N NaOH or 1N HCl. The starting pH of the sodium orthovanadate solution may vary with lots of the chemical. At pH 10.0 the solution will be yellow. Boil the solution until it turns colorless (approximately 10 minutes). Cool to room temperature.Readjust the pH to 10.0 and repeat steps 3 and 4 until the solution remains colorless and the pH stabilizes at 10.0.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Okadaic acid</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kinematica Polytron tissue homogeniser</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-451-320&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Miracloth</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>475855-1R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-FLAG M2 agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2220</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptavidin-agarose</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>20347</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GFP-Trap_A</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>gta-20</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-HA-Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2095</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.45 &#956;m filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>513-1902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FLAG peptide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">StrataClean resin</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>400714</td>
			<td>this absorption resin is recommended for protein precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PROTEAN II XL Cell</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>this stain is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protein low-binding tubes (LoBind)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 108.116</td>
			<td>these tubes are recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium bicarbonate (ABC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83639</td>
			<td>toxic, flammable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2-chloroacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>22790</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
			<td>irritant, sensitizing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14265</td>
			<td>toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water-bath sonicator</td>
			<td>Ultravawe</td>
			<td>Ultra BT Ultrasonic Bath</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LTQ-Orbitrap XL</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trichostatin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8552</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of post-translational modifications of plant protein complexes

Pflanzen passen sich rasch an wechselnde Umgebungen aufgrund von Wahrnehmung und Signalanlagen zu erarbeiten. Während Erreger angreifen, schnell Pflanzen, um eine Infektion über die Rekrutierung und Aktivierung von Immunkomplexen zu reagieren. Aktivierung von Immunkomplexen wird mit post-translationalen Modifikationen (PTM) von Proteinen, wie Phosphorylierung, Glycosylierung, Ubiquitinierung oder verbunden. Verstehen, wie diese PTMs choreografiert werden zu einem besseren Verständnis, wie Widerstand erreicht führen. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Proteinreinigung Nukleotid-bindenden leucine-rich repeat (NB-LRR)-interagierende Proteine ​​und die anschließende Identifizierung der post-translationalen Modifikationen (PTM). Mit kleinen Modifikationen kann das Protokoll für die Reinigung von anderen pflanzlichen Proteinkomplexen eingesetzt werden. Das Verfahren beruht auf der Expression eines Epitop markierte Version des Proteins von Interesse, das anschließend teilweise gereinigt wird b basierendy Immunpräzipitation und Massenspektrometrie zur Identifizierung von interagierenden Proteinen und PTMs unterzogen. Dieses Protokoll zeigt, dass: i). Dynamische Änderungen in PTMs wie Phosphorylierung kann durch Massenspektrometrie nachgewiesen werden, ii). Es ist wichtig, ausreichende Mengen des Proteins von Interesse, und dies kann für den Mangel an Reinheit des Immunpräzipitats kompensieren; iii). Um PTMs eines Proteins von Interesse zu erfassen, hat dieses Protein immunpräzipitiert werden, um eine ausreichende Menge an Protein zu erhalten.

Wir beschreiben hier ein Protokoll für die Reinigung der markierten Proteine ​​aus stabilen transgenen A. thaliana-Linien oder nach transienter Expression von Proteinen in N. benthamiana. Wie in Fig. 1 veranschaulicht die Reinigung des Zielproteins mit Massenspektrometrie gekoppelt, um die Identifizierung von interagierenden Proteinen und den PTM des Zielproteins zu ermöglichen. Das Protokoll wurde für die Reinigung von Proteinen in pflanzlichen Immunität und Identifizierung ihrer PTMs beteiligt entwickelt, kann aber auf die Reinigung von jedem markiert Pflanzenprotein aufgetragen werden. Als Beispiel verwenden wir die Reinigung des Prf / Pto-Komplexes aus N. benthamiana. Die transgenen N. benthamiana Linie 38-12 54, zum Ausdruck 35S: Pto wurde vorübergehend mit 35S verwandelt: Prf-FLAG und der Komplex wurde mit Anti-FLAG-M2-Agarose (2A) immunpräzipitiert. Die Immunoblots (IB) in 2Azeigen, dass die meisten Zielprotein (Prf) immunpräzipitiert wurde. Zapfwelle und das wechselwirkende Protein AvrPtoB Effektorzellen wurden mit Prf gemeinsam gereinigten und unter Verwendung von Antikörpern und Massenspektrometrie-Analyse (Fig. 2A und 2B). Wir fanden, dass die Zapfwelle, die mit Prf gemeinsam gereinigten langsamer migriert auf SDS-PAGE-Gel, wenn es mit der Effektor-Konstrukte 35S coexprimierten: AvrPto und 35S: AvrPtoB (Abbildung 2A). Beide Effektor-Proteine ​​induzierte langsamere Migration der Prf-Interaktion Pto (Abbildung 2A). Diese Anerkennung Effektor-abhängigen langsame Wanderung von Puerto wurde zuvor die Phosphorylierung zugeschrieben, wie es konnte durch die Behandlung mit Phosphatase 44 entfernt werden. Um die Phosphorylierungsstellen, die zur langsamen Migration von Pto erkennen, unterzogen wir die Prf copurifying Pto Massenspektrometrie-Analyse. Trotz der hohen Expression von Puerto und die einfache Detektion mit Immunoblots konnten wir Peptide c abrufenovering nur 57% der Pto-Sequenz und wir konnten keine Phosphorylierungsstellen (2B) zu identifizieren. Anschließend wechselten wir Strategien, um das Pto Protein mit anti-FLAG. N. Ziel Prf-3HA und 35S: Pto-FLAG, mit oder ohne 35S: AvrPto und 35S: benthamiana WT Pflanzen wurden vorübergehend mit 35S umgewandelt. AvrPtoB Der Gesamtbetrag der Pto Protein, das sowohl die Prf-komplexierten und die freien Formen, war immunpräzipitiertem mit Anti-FLAG-M2-Agarose-und SDS-PAGE-Fraktionierung, in-Gel-Trypsin-Verdauung und massenspektrometrische Analyse (2C) unterzogen. Mit diesem Ansatz haben wir festgestellt Pto Peptide überspannt etwa 80% seiner Sequenz und eine unbekannte 100 kDa interacting protein. Wir identifizierten eine Reihe von Einzel-und Doppel Phosphorylierungsstellen für Pto Peptide 187-202 und 188-202 (Tabelle 1). Ser-198 und Thr-199 waren die vorherrschenden Phosphorylierungsstellen aber andere phosphorylation Stellen wurden ebenfalls nachgewiesen (Tabelle 1). Am wichtigsten Doppel Phosphorylierung an Ser-198 und Thr-199 wurde nur in Gegenwart von entweder Effektor-Protein (Tabelle 1) identifiziert. Wir haben kürzlich eine ähnliche Reihe von Pto Phosphorylierungsstellen und illustriert die Bedeutung der Doppel Phosphorylierung zur Signalisierung 47. Nach dem hier beschriebenen Protokoll waren wir in der Lage, um dynamische Änderungen im Phosphorylierungszustand des Zielproteins zu identifizieren. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51095/51095fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51095/51095fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. Allgemeine Versuchsplanung. Das Zielprotein zur Immunpräzipitation (IP) wird markiert und in der Pflanze exprimiert, transient in Nicotiana benthamiana oder stabil in Arabidopsis thaliana. Nach der ProteinextraktionZielproteins mit einer Affinitätsmatrix immunpräzipitiert. Die Proteine ​​werden auf einem Acrylamid-Gel durch Elektrophorese getrennt. Gel Banden ausgeschnitten. Proteine ​​werden aus dem Gel extrahiert und Bänder Massenspektrometrie unterworfen. Phosphorylierungsstellen und interagierende Proteine ​​identifiziert werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51095/51095fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51095/51095fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51095/51095fig2.jpg" /> Abbildung 2. Prf und Pto Immunpräzipitation. A). Die Konstrukt 35S: Prf-FLAG wurde vorübergehend in 38-12 Linie (35S: Pto) ausgedrückt zusammen mit leerem Vektor (EV), 35S: 35S oder AvrPto: AvrPtoB. Drei Tage nach der Infiltration Prf wurde mit anti-FLAG-Affinitätsmatrix immunpräzipitiert. Immunoblots (IB) für Prf, AvrPtoB und Pto wurden durchgeführt. Wie durch die Pfeile am unteren Rand des Pto Immunoblot Tafel hingewiesen, AvrPto und AvrPtoB induzieren eine langsamere Migration von Pto. B). Die Konstrukt 35S: Prf-FLAG wurde vorübergehend in 38-12 Linie (35S: Pto) ausgedrückt zusammen mit leerem Vektor (EV), 35S: 35S oder AvrPto: AvrPtoB. Drei Tage nach der Infiltration Prf wurde mit anti-FLAG-Agarose immungefällt und auf SDS-PAGE getrennt. Das Gel wurde mit kolloidalem Coomassie Brilliant Blue (CCBB) und der sichtbaren Prf gefärbt wurden Pto AvrPtoB und Proteine ​​aus dem Gel ausgeschnitten und mittels Massenspektrometrie analysiert. Der Prozentsatz Peptid Abdeckung der Zapfwelle und Prf-Sequenzen durch Massenspektrometrie identifiziert wird angezeigt. C). Die Konstrukte 35S: Prf-3xHA und 35S: Pto-FLAG wurden transient mit 35S ausgedrückt: AvrPtoB, 35S: AvrPto oder Leervektor (EV) in N. benthamiana. Drei Tage nach der Infiltration die GesamtmengePto-FLAG wurde mit Anti-FLAG-Agarose immunpräzipitiert und auf SDS-PAGE aufgelöst. Die sichtbare und Pto Pto-interacting protein Banden wurden aus dem Gel ausgeschnitten und mittels Massenspektrometrie analysiert. Zapfwelle und die 100 kDa Pto-interacting protein Band sind deutlich auf dem kolloidalem Coomassie Brilliant Blue (CCBB) gefärbt-Gel sichtbar, während Prf ist etwas weniger sichtbar (wie durch Pfeile angedeutet). IP: Immunpräzipitation; IB: Immunoblot; CBB: Coomassie Brilliant-Blau-Färbung; CCBB: kolloidalem Coomassie Brilliant Blue Färbung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51095/51095fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> Prf </td></tr><tr><td></td><td rowspan="2"> EV </td><td rowspan="2"> AvrPto </td><td rowspan="2"> AvrPtoB </td></tr><tr><td> Pto Peptid 188-202 </td></tr><tr><td> GTELDQ [S. 195 T] HLSTVVK </td><td&gt; 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> GTELDQTHL [S. S 198] TVVK </td><td> 10 </td><td> 7 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> GTELDQTHLS [S. 199 T] VVK </td><td> 8 </td><td> 3 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> G [p T 190] ELDQTHLS [S. 199 T] VVK </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> GTELDQTHL [S. S 198] [p T 199] VVK </td><td> 0 </td><td> 8 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> GTELDQTHLSTVVK </td><td> 46 </td><td> 26 </td><td> 48 </td></tr><tr><td> Pto Peptid 187-202 </td><td colspan="3"></td></tr><tr><td> KGTELDQ [S. 195 T] HLS TVVK </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHL [S. S 198] TVVK </td><td> 17 </td><td> 17 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHLS [S. 199 T] VVK </td&gt; <td> 4 </td><td> 2 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> KGTELDQ [S. 195 T] HLS [S. 199 T] VVK </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHL [S. S 198] [p T 199] VVK </td><td> 0 </td><td> 7 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHLSTVVK </td><td> 21 </td><td> 37 </td><td> 18 </td></tr><tr><td> Peptide 187-202 und 188-202 </td><td> 83 </td><td> 88 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Prozentualer Anteil der Peptide mit zwei Phosphorylierungsereignisse </td><td> 0% </td><td> 26,9% </td><td> 11,2% </td></tr><tr><td> Pto Sequenzabdeckung </td><td> 78% </td><td> 79% </td><td> 82% </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 Doppel Phosphorylierung einer Pto Peptid bei der Aktivierung von Signal 35S:.. Prf-3xHA und 35S: Pto-FLAG wurden transient mit em ausgedrücktPTY Vektor (EV), 35S: 35S oder AvrPto: AvrPtoB in N. benthamiana. Drei Tage nach der Infiltration die Gesamtmenge der Pto-FLAG-Protein wurde unter Verwendung von Anti-FLAG-Affinitätsmatrix immunpräzipitiert und auf SDS-PAGE aufgelöst. Die sichtbaren Banden von Pto auf der kolloidalen Coomassie-Brilliantblau gefärbten Gel ausgeschnitten und mit der Massenspektrometrie analysiert. Die Anzahl der Pto Peptide mit 0 identifiziert, 1 und 2 Phosphorylierungsereignisse angezeigt. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Tabelle der Puffer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-Medium </td><td> Tryptone </td><td> 10 g / L </td></tr><tr><td></td><td> Hefe-Extrakt </td><td> 5 g / L </td></tr><tr><td></td><td> NaCl </td><td> 5 g / L </td></tr><tr><td></td><td> D-Glucose </td><td> 1 g / L </td></tr><tr><td> Agro-Infiltration Puffer </td><td> MgCl 2 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td></td><td> MES &lt;/ Td&gt; <td> 10 mM </td></tr><tr><td></td><td> Auf pH 5,5 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Acetosyringon (optional) </td><td> 150 uM </td></tr><tr><td> Puffer A </td><td> Tris-HCl pH 7,5 </td><td> 150 mM </td></tr><tr><td></td><td> NaCl </td><td> 150 mM </td></tr><tr><td></td><td> EDTA </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td></td><td> EGTA </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td></td><td> Glycerol </td><td> 5% (v / v) </td></tr><tr><td> Puffer B </td><td> Puffer A </td><td></td></tr><tr><td></td><td> PVPP </td><td> 2% (w / v) </td></tr><tr><td> Puffer C </td><td> Puffer B </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Dithiothreitol (DTT) </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td></td><td> Pflanzen Protease Inhibitor Cocktail </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td></td><td> Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) </td><td> 0,5 mM </td&gt; </tr><tr><td></td><td> Calyculin A </td><td> 50 nM </td></tr><tr><td></td><td> Natriumfluorid (NaF) </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td></td><td> Natriummolybdat (Na 2 MoO 4) </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td></td><td> Natriumorthovanadat </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td></td><td> Okadainsäure </td><td> 100 nM </td></tr><tr><td> Puffer D </td><td> Puffer C ohne PVPP </td><td></td></tr><tr><td> 5x SDS-PAGE-Ladepuffer </td><td> Tris-HCl pH 6,8 </td><td> 60 mM </td></tr><tr><td></td><td> SDS </td><td> 2% </td></tr><tr><td></td><td> Glycerol </td><td> 0,15% </td></tr><tr><td></td><td> Bromphenolblau </td><td> 0,10% </td></tr><tr><td></td><td> DTT (fügen Sie einfach vor Gebrauch) </td><td> 50 mM </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Puffer und Medien-Rezepte.

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Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Reinigung und Charakterisierung von Pflanzenproteinkomplexen. Wir zeigen, dass durch Immunpräzipitation ein einzelnes Protein in einem Komplex, so können wir seine post-translationale Modifikationen und seinen Interaktionspartner zu identifizieren.

Bezeichnung des Post-translationale Modifikationen von Pflanzenproteinkomplexe

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

identification-post-translational-modifications-plant-protein

Research

JoVE Journal

Biology

23.7K Aufrufe.  University of Warwick.  Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Reinigung und Charakterisierung von Pflanzenproteinkomplexen. Wir zeigen, dass durch Immunpräzipitation ein einzelnes Protein in einem Komplex, so können wir seine post-translationale Modifikationen und seinen Interaktionspartner zu identifizieren. 

Serie: Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

Identifizierung von Protein-Komplexen mit der quantitativen Proteomik in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Forschung

Biologie

Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within the cell, type III effectors subvert host cellular processes to suppress immune responses and promote pathogen growth. Numerous type III effectors of plant and animal bacterial pathogens have been identified to date, yet only a few of them are well characterized. Understanding the functions of these effectors has been undermined by a combination of functional redundancy in the effector repertoire of a given bacterial strain, the subtle effects that they may exert to increase virulence, roles that are possibly specific to certain infection stages, and difficulties in genetically manipulating certain pathogens. Expression of type III effectors in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae may allow circumventing these limitations and aid to the functional characterization of effector proteins. Because type III effectors often target cellular processes that are conserved between yeast and other eukaryotes, their expression in yeast may result in growth inhibition phenotypes that can be exploited to elucidate effector functions and targets. Additional advantages to using yeast for functional studies of bacterial effectors include their genetic tractability, information on predicted functions of the vast majority of their ORFs, and availability of numerous tools and resources for both genome-wide and small-scale experiments. Here we discuss critical factors for designing a yeast system for the expression of bacterial type III effector proteins. These include an appropriate promoter for driving expression of the effector gene(s) of interest, the copy number of the effector gene, the epitope tag used to verify protein expression, and the yeast strain. We present procedures to induce expression of effectors in yeast and to verify their expression by immunoblotting. In addition, we describe a spotting assay on agar plates for the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. The use of this protocol may be extended to the study of pathogenicity factors delivered into the host cell by any pathogen and translocation mechanism.

In this video, we describe a procedure for the expression of bacterial type III effectors in yeast and the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. Such phenotypes can be subsequently exploited to elucidate effector functions and targets.

Identification of Growth Inhibition Phänotypen durch Expression von bakteriellen Typ III Effektoren in Hefe Induced

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

Analyse großer Proteinkomplexe von Structural-Massenspektrometrie

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 base pairs of DNA associated with two each of histones H2A, H2B, H3, and H41. The N-terminal tails of histones are rich in lysine and arginine and are modified post-transcriptionally by acetylation, methylation, and other post-translational modifications (PTMs). The PTM configuration of nucleosomes can affect the transcriptional activity of associated DNA, thus providing a mode of gene regulation that is epigenetic in nature 2,3. We developed a method called nucleosome ELISA (NU-ELISA) to quantitatively determine global PTM signatures of nucleosomes extracted from cells. NU-ELISA is more sensitive and quantitative than western blotting, and is useful to interrogate the epiproteomic state of specific cell types. This video journal article shows detailed procedures to perform NU-ELISA analysis.

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) is a sensitive and quantitative method to detect global patterns of post-translational modifications in preparations of native, intact nucleosomes. These modifications include methylations, acetylations, and phosphorylations at specific histone amino acid residues, and hence NU-ELISA provides a global proteomic assay of the overall chromatin modification states of specific cell types.

Erkennung von Post-translationale Modifikationen auf Native Intact Nukleosomen mittels ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent modifications on the amino-terminal tails of histones H3 and H4 play essential roles1-2. H3 and H4 histone modifications include methylation of lysine and arginine, acetylation of lysine, and phosphorylation of serine residues1-2. These modifications are associated either with gene activation, repression, or a primed state of gene that supports more rapid and robust activation of expression after perception of appropriate signals (microbe-associated molecular patterns, light, hormones, etc.)3-7. 
Here, we present a method for the reliable and sensitive detection of specific chromatin modifications on selected plant genes. The technique is based on the crosslinking of (modified) histones and DNA with formaldehyde8,9, extraction and sonication of chromatin, chromatin immunoprecipitation (ChIP) with modification-specific antibodies9,10, de-crosslinking of histone-DNA complexes, and gene-specific real-time quantitative PCR. The approach has proven useful for detecting specific histone modifications associated with C4 photosynthesis in maize5,11 and systemic immunity in Arabidopsis3.

A reliable and useful approach to detect histone modifications on specific plant genes is described. The approach combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) and real-time quantitative PCR. It allows detection of histone modifications on specific genes with a role in diverse physiological processes.

Erkennung von Histon-Modifikationen in Pflanzenblättern

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and readily available form of data collection. In many research and disease models however, steady state levels of target gene mRNA does not always directly correlate with steady state protein levels. Post-transcriptional gene regulation is a likely explanation of the divergence between the two. Driven by the binding of RNA Binding Proteins (RBP), post-transcriptional regulation affects mRNA localization, stability and translation by forming a Ribonucleoprotein (RNP) complex with target mRNAs. Identifying these unknown de novo mRNA targets from cellular extracts in the RNP complex is pivotal to understanding mechanisms and functions of the RBP and their resulting effect on protein output. This protocol outlines a method termed RNP immunoprecipitation-microarray (RIP-Chip), which allows for the identification of specific mRNAs associated in the ribonucleoprotein complex, under changing experimental conditions, along with options to further optimize an experiment for the individual researcher. With this important experimental tool, researchers can explore the intricate mechanisms associated with post-transcriptional gene regulation as well as other ribonucleoprotein interactions.

A step by step protocol to isolating and identifying RNA associated complexes through RIP-Chip.

Verfahren zur Isolierung und Identifizierung von mRNAs, microRNAs und Protein-Komponenten des Ribonucleoprotein Komplexe aus Zellextrakten mit RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identifizierung von Protein-Komplexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Mit Sequential Peptide Affinity Purification in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Ein Protokoll für die Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen Basierend auf<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolische Markierung, Immunpräzipitation, Quantitative Massenspektrometrie und Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Bäckerhefe Protein Extraktion und Reinigung für das Studium der Funktion, Wechselwirkungen, und post-translationale Modifikationen

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

High-throughput CRISPR Vector Konstruktion und Charakterisierung von DNA-Modifikationen durch Erzeugung von Tomaten Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...