אנו מודים לג&#39;ף דניאלס לקבלת סיוע טכני. עבודה זו מומנה על ידי R01 AI067946 לתזמורת ירושלים

1. Coverslips מעיל עם נוגדן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prewarm (ב 37 מעלות צלזיוס) 30 מיליליטר של תקשורת FCS 10% RPMI ו1 מיליליטר של BD Cytofix / Cytoperm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון של 5 מיקרוגרם / מיליליטר של נוגדן מטוהר בופר פוספט (PBS). להפעלתו של קו NK92 הסלולרי, השימוש באנטי-CD18 ואנטי NKp30 מומלץ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעגל מארק אחד כ אגורה בגודל עבור כל תנאי על coverslip # 1.5 באמצעות עט PAP. לניסוי צבע כפול, לא אמור להיות ארבעה תנאים: ללא רבב, מוכתמים כפול, ושני תנאים צבעוניים אחד. לוותר 200 μl של פתרון נוגדן בכל אזור ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף coverslips ידי בעדינות לטבול כל אחד ב50 מיליליטר של PBS בצינור חרוטי 50 מיליליטר בטמפרטורת חדר. כביסה צריכה להתרחש מייד לפני התוספת יש לקחת תאים וזהירות כדי למנוע ייבוש נוגדן על coverslip. </li></ol></li></ol> 2. הפעל תאי NK בכיסויהתלושים; לתקן וPermeabilize <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד 5 x 10 5 NK92 תאים לכל מצב. צנטריפוגה ולמזוג supernatant. שטפי פעם עם 10 מיליליטר תקשורת prewarmed משלב 1.1. צנטריפוגה ולמזוג supernatant. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי resuspend בתקשורת prewarmed משלב 1.1 בריכוז של 2.5 x 10 6 / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות למזוג 200 μl למרכז האזור שנוצר בסעיף 1.2.1. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות ב 5% CO 2. (הערה: הפעם ניתן להרחיב או להקטין בהתאם לפונקציה הביולוגית של עניין לקיטוב גרגיר תא NK, 20 דקות מספיקות.). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה של תאים, לשטוף בעדינות coverslips ידי טבילת כל אחד ב50 מיליליטר של בטמפרטורת חדר PBS בצינור חרוטי 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של טריטון X-100 1 מיליליטר של תמיסת תקן / פרם prewarmed משלב 1.1 ומערבולת ביסודיות. לתקן וpermeabilize ידי הוספת 200 μl של חיץ תקן / פרם (שלב 2.3) לתאים. דגירה של 10 מ &#39;בחושך בטמפרטורת חדר. </li></ol> 3. תאי כתם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מכתים חיץ: פוספט שנאגרו מלוח (PBS), BSA 1%, 0.1% Saponin. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון של נוגדן עיקרי 200 μl חיץ מכתים (ראה שלב 3.1). (הערה: הנוגדן צריך להיות טיטרציה לפני השימוש). הימנע מהשימוש בנוגדן ראשוני, כי הוא גדל באותו המין משמש מעיל coverslip (שלב 1.2). כמו כן להימנע קשרי Strepatividin-ביוטין הדמיה STED. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות סעיף 2.3.1, לשטוף בעדינות coverslips ב50 מיליליטר מכתים את החיץ. מורח את הקצוות של אזור PAP-עט עם מקלון צמר גפן כדי להסיר חיץ עודף. החל פתרון נוגדן שנוצר בסעיף 3.1.1. דגירה 30 דקות בחושך בטמפרטורת חדר. (מומלץ: דגירה coverslips בתיבת שקופיות עם מגבת נייר לחה כדי לשמור על לחות). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון של שני נוגדנים ב 200 μl הכתמהמאגר. fluorophores המומלץ הוא Alexa פלואוריד 488, פסיפיק אורנג&#39;, וV500. באופן כללי, דילול 1:200 מתאים להדמית STED. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בעדינות coverslips ב50 מיליליטר מכתים את החיץ. מורח את הקצוות של אזור PAP-עט עם מקלון צמר גפן כדי להסיר חיץ עודף. החל פתרון נוגדנים משני. דגירה 30 דקות בחושך בטמפרטורת חדר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הפעולה כביסה וצביעה לחלבונים נוספים של ריבית. אם גילוי ה-F-אקטין עם Phalloidin, זה יכול להיות כלול עם נוגדנים משני, בדרך כלל בדילול 1:200. </li></ol> 4. הר coverslips על שקופיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ההרכבה בינונית. הערה: להאריך או להאריך זהב עדיף. יש להימנע Vectashield, כפי שהוא אינו תואם לSTED. יש להימנע 2,2-thiodioethanol אם Phalloidin משמש. Mowiol מקובל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח כ 10-20 μl של הרכבה בינונית בשקופית. coverslip מרחב זה (תא בצד למטה) והר coverslip בעדינות, מקפידלמנוע כניסה של בועות אוויר. דגירה שקופיות עבור 24 שעות (coverslip מעלה) לפני ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום קצוות של coverslip עם לק. </li></ol> 5. ניסיוני התקנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליזום לייזרים ותוכנה נדרשים. ליזום לייזר דלדול STED ב100% כוח. יישר לייזר STED, אשר במקרה של מערכות מסחריות הוא לעתים קרובות הליך אוטומטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוקוס המדגם, החל בשליטה יחידה מוכתמת, על המיקרוסקופ באמצעות עיניות. </li></ol> 6. אופטימיזציה של הגדרות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את הערוץ הראשון ולייעל את כוח הלייזר, עמדת קרן עירור ומגוון גלאי. במידת האפשר, להימנע מרווח של&gt; 100. ללכוד את התמונה בconfocal כדי לייעל את ההגדרות. קו ו / או מיצוע מסגרת יגדיל את הרזולוציה. הגעה לרווית פיקסל. הערה: רוויה מסוימות מקובלת בconfocal כיישום של STED יפחית את עוצמת הפליטה. לSTED, גודל פיקסל אופטימלי יהיה מתחת 30 ננומטר איךרזולוציה טובה יותר אי פעם תושג עם גודל פיקסל קטן יותר. גודלו של האזור של עניין להיות הדמיה יכתיב את הגבול התחתון של גודל פיקסל. גדלי פיקסל קטנים יותר עשויים להגדיל photobleaching. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל קורה דלדול STED וללכוד תמונה, החל ב50% כוח לייזר דלדול. אם שיפור ברזולוציה נתפס, יכול להיות מיושם יותר כוח לייזר דלדול. בשלב זה, ייתכן שיהיה צורך להתאים את כוח עירור לייזר, ממוצע קו, ו / או רווח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל gating זמן כדי להפחית רקע (0.3 NSEC המינימום). התאם את הגדרות עד שיפור ברזולוציה מעל confocal ניתן לראות. החלטה יכולה להיות מקורב על ידי אומדן חצי מקסימום רוחב מלא (FWHM). זה מייצג את המרחק בעצמה המקסימלי מחצית משיא גאוס נוצר על ידי ציור פרופיל קו על פני המבנה של עניין, והיא שיטה בשימוש נרחבת של הערכה ברזולוציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהערוץ הראשון הוא משביעת רצון, ליזום רצף שני עבור sequential סריקה. באופן כללי, עדיף לסרוק fluorophore אורך הגל הארוך ראשונה. חזור על שלב 6.1 בערוץ שני. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר חוסר החפיפה ספקטרלית על ידי הדמיה פקדים צבעוניים יחיד עם שני רצפי הסריקה. חפיפה ספקטרלית קלה ניתן לתקן באמצעות תכונות ערבוב בלתי רפאים בתוכנה, לעומת זאת יש להימנע במידת האפשר. </li></ol> 7. רכישת תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות. הדמיה כמותיים, מומלץ להשיג לפחות 20 תמונות / מצב. המספר המדויק, לעומת זאת, צריך להיות מוגדר על פי השאלה הניסיונית בתיאום עם גישה סטטיסטית כגון חישוב גודל מדגם. להציל את הניסוי. </li></ol> 8. Deconvolution <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח קובץ עם תוכנת deconvolution או מעבד אצווה. בדקו פרמטרים לכל ערוץ באמצעות תוכנה. אשר הספקטרום של כל ערוץ עירור ופליטה, פליטת דלדול STED, וdirec ההדמיהtion (למעלה או למטה, אם התמונה היא 3 ממדים) בפרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Deconvolve באמצעות אשף deconvolution. הגדרות ברירת מחדל הן בדרך כלל נאותות, אולם יחס אות לרעש (SNTR) ישתנה מfluorophore לfluorophore ויצטרך להיקבע עבור כל ערוץ וכל ניסוי בנפרד. </li></ol>

<ol>
	<li>Stinchcombe, J. C., Bossi, G., Booth, S., Griffiths, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse+of+CTL+contains+a+secretory+domain+and+membrane+bridges.">The immunological synapse of CTL contains a secretory domain and membrane bridges.</a> Immunity. 15 (5), 751-761 (2001).</li><li>Grakoui, A., Bromley, S. K., Sumen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li><li>Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells.">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).</li><li>Orange, J. S., Harris, K. E., Andzelm, M. M., Valter, M. M., Geha, R. S., Strominger, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mature+activating+natural+killer+cell+immunologic+synapse+is+formed+in+distinct+stages.">The mature activating natural killer cell immunologic synapse is formed in distinct stages.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (24), 14151-14156 (2003).</li><li>Treanor, B., Lanigan, P. M., Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microclusters+of+inhibitory+killer+immunoglobulin-like+receptor+signaling+at+natural+killer+cell+immunological+synapses.">Microclusters of inhibitory killer immunoglobulin-like receptor signaling at natural killer cell immunological synapses.</a> J. Cell Biol. 174 (1), 153-161 (2006).</li><li>Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+signaling+blocks+activating+receptor+clustering+and+induces+cytoskeletal+retraction+in+natural+killer+cells.">Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells.</a> J. Cell Biol. 192 (4), 675-690 (2011).</li><li>Beemiller, P., Jacobelli, J., Krummel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+the+movement+of+signaling+microclusters+with+cellular+motility+in+immunological+synapses.">Integration of the movement of signaling microclusters with cellular motility in immunological synapses.</a> Nat. Immunol. 13 (8), 787-795 (2012).</li><li>Campi, G., Varma, R., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+agonist+MHC-peptide+complex-dependent+T+cell+receptor+microclusters+as+scaffolds+for+signaling.">Actin and agonist MHC-peptide complex-dependent T cell receptor microclusters as scaffolds for signaling.</a> J. Exp. Med. 202 (8), 1031-1036 (2005).</li><li>Mossman, K. D., Campi, G., Groves, J. T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+TCR+signaling+from+geometrically+repatterned+immunological+synapses.">Altered TCR signaling from geometrically repatterned immunological synapses.</a> Science. 310 (5751), 1191-1193 (2005).</li><li>Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor-proximal+signals+are+sustained+in+peripheral+microclusters+and+terminated+in+the+central+supramolecular+activation+cluster.">T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster.</a> Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).</li><li>Yokosuka, T., Sakata-Sogawa, K., Kobayashi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+generated+T+cell+receptor+microclusters+initiate+and+sustain+T+cell+activation+by+recruitment+of+Zap70+and+SLP-76.">Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76.</a> Nat. Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).</li><li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+wave+of+cellular+imaging.">A new wave of cellular imaging.</a> Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 285-314 (2010).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> J. Cell Biol. 190 (2), 165-175 (2010).</li><li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+microscopy.">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 993-1016 (2009).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+views+of+the+human+NK+cell+immunological+synapse:+recent+advances+enabled+by+super-+and+high-resolution+imaging+techniques.">New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques.</a> Front. Immunol. 3, 421 (2012).</li><li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission:+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy.">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Opt. Lett. 19 (11), 780-782 (1994).</li><li>Klar, T. A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction+resolution+in+far-field+fluorescence+microscopy.">Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy.</a> Opt. Lett. 24 (14), 954-956 (1999).</li><li>Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy+with+diffraction+resolution+barrier+broken+by+stimulated+emission.">Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).</li><li>Rankin, B. R., Moneron, G., Wurm, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscopy+in+a+living+multicellular+organism+expressing+GFP.">Nanoscopy in a living multicellular organism expressing GFP.</a> Biophys. J. 100 (12), 63-65 (2011).</li><li>Willig, K. I., Kellner, R. R., Medda, R., Hein, B., Jakobs, S., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+resolution+in+GFP-based+microscopy.">Nanoscale resolution in GFP-based microscopy.</a> Nat. Methods. 3 (9), 721-723 (2006).</li><li>Rak, G. D., Mace, E. M., Banerjee, P. P., Svitkina, T., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell+lytic+granule+secretion+occurs+through+a+pervasive+actin+network+at+the+immune+synapse.">Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse.</a> PLoS Biol. 9 (9), (2011).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+channel+STED+nanoscopy+of+lytic+granules+on+actin+filaments+in+natural+killer+cells.">Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells.</a> Commun. Integr. Biol. 5 (2), 184-186 (2012).</li><li>Singh, H., Lu, R., Rodriguez, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+quantification+of+cardiac+mitochondrial+protein+clusters+with+STED+microscopy.">Visualization and quantification of cardiac mitochondrial protein clusters with STED microscopy.</a> Mitochondrion. 12 (2), 230-236 (2012).</li><li>Tonnesen, J., Nagerl UV, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superresolution+imaging+for+neuroscience.">Superresolution imaging for neuroscience.</a> Exp. Neurol. 242, 33-40 (2013).</li><li>Kempf, C., Staudt, T., Bingen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+multicolor+STED+nanoscopy+of+presynaptic+proteins+in+the+calyx+of+held.">Tissue multicolor STED nanoscopy of presynaptic proteins in the calyx of held.</a> PLoS One. 8 (4), (2013).</li><li>Jans, D. C., Wurm, C. A., Riedel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+super-resolution+microscopy+reveals+an+array+of+MINOS+clusters+along+human+mitochondria.">STED super-resolution microscopy reveals an array of MINOS clusters along human mitochondria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (22), 8936-8941 (2013).</li><li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Gustafsson, M. G., Shao, L., Carlton, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination).">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination).</a> Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li><li>Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction+multicolor+imaging+of+the+nuclear+periphery+with+3D+structured+illumination+microscopy.">Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy.</a> Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).</li><li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 13 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Nat. Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Banerjee, P. P., Pandey, R., Zheng, R., Suhoski, ., Monaco-Shawver, L., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42-interacting+protein-4+functionally+links+actin+and+microtubule+networks+at+the+cytolytic+NK+cell+immunological.">Cdc42-interacting protein-4 functionally links actin and microtubule networks at the cytolytic NK cell immunological.</a> J. Exp. Med. 204 (10), 2305-2320 (2007).</li><li>Vicidomini, G., Moneron, G., Han, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sharper+low-power+STED+nanoscopy+by+time+gating.">Sharper low-power STED nanoscopy by time gating.</a> Nat. Methods. 8 (7), 571-573 (2011).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים. עלות פרסום חלקית של מאמר זה יכוסה על ידי Leica Microsystems, Inc

השיפור ברזולוציה מעל confocal יהיה קצת תלוי בגורמים שלא ניתן לשלוט. גורמים אלה כוללים סטיות קלות בעובי להחליק את מכסה וחוסר עקביות בתקשורת הרכבה. זה חשוב כדי לשמור על הטמפרטורה והלחות בחדר ההדמיה כעקבי ככל האפשר, ואת קרן STED יש realigned בערך כל 60 דקות. כפי שצוין בנהלים, יש להימנע משימוש במדיום Vectashield גובר, שכן זו אינה תואמת לSTED. בנוסף אליו, יש תמיד להשתמש # 1.5 התלושים לכסות, ואם זמין, להשתמש באותם אשר אומתו לעובי מסוים. שינוי אחד של הגישה שתוארה כאן הוא לערוצים נוספים בתמונה confocal, באמצעות fluorophores שפולט באורך גל ארוך יותר מקורה STED. בדרך זו, תמונה יכול אחד עד ארבעה ערוצים (שני בconfocal, שתיים בSTED). עם זאת, דואר הערוצים עם fluorophores אם לוקח את הגישה הזוmitting מעל לייזר דלדול STED יצטרך להיות צילם ראשון, כיישום של קורה STED יהיה לרוקן פוטונים בערוצים אלה. אחד יתרונות לטכניקה זו הוא היישום של gating הזמן, שגם ישפרו את הרזולוציה בconfocal על ידי ביטול פליטה מפוטונים עם משך חיים קצרים 34. בפרט, השימוש בgating הזמן, העיתוי של גלאי פליטה להתכתב עם עירור פעם STED, יקטן הקרינה רקע מהשתקפות מזכוכית coverslip כאשר הדמיה קרובה אליו. גם בניסוי אינו מתאים לSTED, אם באמצעות מקור עירור פעם, gating הזמן יכול להיות כלי שימושי לשיפור רזולוציה בconfocal. ישנם שינויים שונים שיכול להיות מנוצל כדי לשפר את הרזולוציה בSTED. אחת הוא להקטין את גודל חריר מיחידת Airy 1 הסטנדרטי, אם כי זה גם יקטין את כמות האור המגיע למדגם. זה יכול להיות פיצוי על ידי הגדלת lasכוח אה או רווח. נוסף הוא להגדיל את ממוצע הקו, אשר יגדיל את כמות המידע שנאספה עבור כל פוטון, שיפור ברזולוציה. שוב, עם זאת, זה עשוי להיות בעלות של photobleaching של המדגם, ולכן איזון צריך להיות פגע בין הרזולוציה ולבנה. באופן דומה, שימוש בחלבוני ניאון כגון GFP ידרשו אופטימיזציה זהירה, כדי למנוע הלבנת. ניתן לעשות זאת על ידי הפחתת כוח לייזר STED במידת צורך. נקודות זמן ארוכות יותר תאפשר גם להתאוששות פוטון גדולה יותר ולצמצם את הלבנת. תיקון לphotobleaching יטופל בעת ניתוח STED חיות. כמובן, ההדמיה ב 3 ממדים בSTED היא גם אפשרית, וגם תיתן שיפור לעומת confocal הדמיה קונבנציונלית. זה נכון במיוחד אם זה נעשה בשילוב עם deconvolution, אם כי יש לנקוט זהירות כדי לתקן את סחיפה המתרחשת במהלך ההדמיה מטוסים מרובים בציר ה-z. אם אתם משתמשים בתוכנת הויגנסלdeconvolve, תיקון זה מתקבל באמצעות התכונה &quot;לייצב תמונה&quot;. שימוש בגישה זו, ברזולוציה בציר ה-z תהיה שיפור. זהו שיפור גדול על פני הדמיה קונבנציונלית confocal, שבו יש רזולוציה צירית עניות, ואפילו על סתם STED עצמו, שיש גם ברזולוציה Z-ציר דל יחסית. בעוד רכישת ערימות מרובות בSTED, יש לנקוט בזהירות כדי למנוע הלבנת של המדגם, ובמידת צורך ניתן להפחית מיצוע קו או עוצמת כוח לייזר על מנת לעשות זאת. שוב, יש לציין שאם הדמיה fluorophores האחר שאינם מתאימים לSTED, יישום של קורה דלדול בסריקה סדרתית הראשונה ימנע פליטה מערוצים אלה. לכן, גישת STED / confocal מעורב (בעת השימוש בסריקת confocal בערוצים אשר פולטים באורך גל גדול מ592 ננומטר) תהיה למרבה הצער, לא בהכרח מתאימה ל3D. לסיכום, יש לנו נבחרו STED כגישה בשל קלות היחסית של יישוםlication ושיפור ברזולוציה מעל confocal הדמיה סטנדרטית. הדמיה סינפסה החיסונית, היא הוכיחה טכניקה יעילה ובעל ערך שמאפשרת לנו לראות פרטים בארכיטקטורת ה-F-אקטין לא ניתן ברזולוציה מעל 200 ננומטר. בעוד שרבים מהפרטים האלה נראים עדינים, הם יכולים להיות השפעה עמוקה על תפקוד תא NK. לפיכך, אנו פונים טכנולוגיית ההדמיה הננוסקופי האחרונה להפקת מידע זה הוא קריטי לשמירה על בריאות אדם.

סינפסה החיסונית היא סביבה מורכבת של חלבוני איתות ואלמנטי cytoskeletal. סינפסה cytolytic תוארה במקור כבעל &quot;שוורי עיניים&quot; כמו מבנה עם טבעת של מולקולות אקטין והידבקות סביב תחום הפרשה מרכזי 1-4. עם זאת, עכשיו אנחנו יודעים שזה מורכב מתחומים המיקרוסקופיים של איתות פעילה שדורשים ארגון מחדש cytoskeletal דינמי מתמשך לתפקוד 5-11. חלק גדול מהמידע שיש לנו עכשיו על סינפסה כבר נגזר מיקרוסקופיה, ואימונולוגים היו מאמצים מוקדמים של טכנולוגיות הדמיה חדשניות. טכנולוגיה חדשנית אחד כזה היא מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר. במיקרוסקופ אור הקונבנציונלית מוגבלת מרחבית על ידי מחסום דיפרקציה של אור, אשר מגדיר את הגבול התחתון של רזולוציה לכל מיקרוסקופ פלואורסצנטי, כולל confocal, בערך בשעה 200 ננומטר. בשנים האחרונות, כמה טכניקות היו לפתחד המאפשרים ברזולוציה מתחת למחסום העקיפה. אלה כוללים מיקרוסקופיה גירוי פליטת דלדול (STED), מיקרוסקופיה מובנה תאורה (SIM), מיקרוסקופיה stochastically נפתרה (סערה), וכן במיקרוסקופ photoactivatable האור (PALM). טכניקות אלו נסקרו בהרחבה במקומות אחרים 12-15, אבל הם מפורטים להלן. הרזולוציה מוגבלת Subdiffraction מופקת בדרכים ייחודיות בכל מערכת. הבחירה של טכניקה ברזולוציה סופר, ולכן, צריכה להיות מוכתבת על ידי המערכת ניסיונית הניסוי ושל עניין. ברזולוציה סופר STED מושגת באמצעות קרן דלדול torroidal בעוצמה גבוהה באופן סלקטיבי &quot;שתיקות&quot; הקרינה סביב כל fluorophore העניין הבא עירור, וכתוצאה מכך מיקרוסקופ פלואורסצנטי המוגבל subdiffraction 16-18. אחד יתרונות של STED הוא שרכישת תמונה היא מהירה ודורשת שלאחר עיבוד מועט יחסית. בעוד בחירת צבע מוכתבת על ידי המפרטעמדת tral של קורה האזילה, אשר במערכת זמינה המסחרית ממוקם ב592 ננומטר, כמה צבעים זמינים מסחרי זמינות שהופכים שילובים של שני fluorophores אפשריים. בנוסף, ניתן הדמיה כתבי ניאון נפוץ כגון ה-GFP, מה שהופך את ניסויי תא חיים אפשריים 19,20. יש לנו שימשו בעבר STED לזהות ולכמת אזורים של hypodensity F-אקטין כי הם מנוצלים על ידי תאי NK לdegranulation 21,22. אנו מציעים כי STED היא בחירה טובה עבור ההדמיה סינפסה החיסונית בשל הזמינות גמישה יחסית שלה של fluorophores ושיפור מעולה ברזולוציה בציר XY. בנוסף, על מערכת STED זמינה המסחרית מנוצל לניסויים אלה, השימוש בסורק תהודה במהירות גבוהה (12,000 Hz) מאפשר רכישה מהירה של תמונות עם נזק מינימאלי לדגימות. גמישות מוגבלת בבחירת צבע נחשבת חסרון של 12 STED,עם זאת צבע כפול STED היא פשוטה יחסית עם כמה fluorophores זמין מסחרי. שילוב של STED עם לייזר סריקת מיקרוסקופ confocal גם מאפשר הדמיה confocal נוספת בשילוב עם STED, זאת תוך STED מוגבלת לשני ערוצים, ניתן הדמיה מבנים נוספים בconfocal עם רזולוציה של כ 200 ננומטר (א &#39;מייס, תצפיות שלא פורסמו ). למרות שאנו מתארים את השימוש של STED הדמיה תאים חיסוניים, טכנולוגיה זו היא ליישם במגוון רחב של סוגי תאים, כוללים תאים עצביים, ומאפשר הדמיה של מגוון מבני תא 23-26. ה-SIM משתמשת בגישה שונה כדי להפיק תמונות מוגבלות subdiffraction. על ידי הדמיה דפוסי עירור תקופתי ידועים, אז יכול להיות שהתקבל מידע על המבנה ידוע נחקר בעקבות שינוי מתמטי 27. זה מניב עלייה ברזולוציה ל ~ 100 ננומטר רוחבי 28,29. היתרון של ה-SIM הוא שזה אניים תואם את כל צבעי confocal סטנדרטיים ובדיקות, עם זאת החסרון הוא שזה הרבה יותר איטי לרכוש תמונות ואלה דורשים עיבוד פוסט ארוך 12. זה גם מגביל את השימוש בו להדמית תא חי. לבסוף, יכולות להיות שנוצרו תמונות ברזולוציה סופר על ידי צילום מיתוג סטוכסטיים של fluorophores. גישה זו מנוצלת במיקרוסקופיה לוקליזציה מופעל תמונה (PALM) ומיקרוסקופיה סטוכסטיים שיקום אופטי (STORM). על ידי סריקת מסגרות מצלמה מרובות ולוקליזציה של מולקולות מופעלות באופן אקראי, כי הם הפכו את &quot;על&quot; ו &quot;את&quot; לאורך זמן, תמונות עם הרזולוציה 20-30 ננומטר נוצרות ממסגרות שנצברו 30-32. Trade-off להחלטה זו הוא הזמן הנדרש כדי לרכוש תמונות. כאן אנו מראים, בפירוט, את הפרוטוקול להכנה ודגימות הדמיה צבע כפולים בSTED. במערכת זו, עירור הוא עם פעמו מתכונן, לייזר אור לבן,. בשל האופישל קרן עירור פעם, gating של זיהוי הזמן מתאפשר ורזולוציה עליות נוספות. בנוסף, המערכת מצוידת בגלאים היברידיים גדוליניום (HYD), שהם רגישים יותר מצינורות מכפיל קונבנציונליים, ובכך מאפשרת לדרישות כוח הלייזר נמוכות יותר. קרן דלדול לSTED מיושמת ברציפות, והוא מכוון ל592 ננומטר, אשר יכתיב את הבחירה של צבעים זמינים עבור שתי הצבע STED. שילובי צבע בשימוש נפוץ בדרך כלל כוללים אחד להתרגש ידי 488 ננומטר (כגון Alexa פלואוריד 488, אורגון גרין, DyLights הירוק, או Chromeo 488) ואחד להתרגש ידי 458 ננומטר (כגון פסיפיק אורנג&#39; או אופק V500). וכך, בעוד זיהוי של שני הצבעים יהיה בטווח דומה (ושניהם נגישים על ידי לייזר דלדול), עירור יתרחש באורכי גל שונים. עם גלאי אור לייזר ומתכונן לבנים מתכונן, למקסם את האות תוך ביטול חפיפה ספקטרלית נעשה קל למדי. ככזה, יש לנו הצלחה טובה עם הקומבינאטיונים של צבעים זמינים באופן מסחרי, כגון פסיפיק אורנג&#39; וAlexa פלואוריד 488 (משמש כאן). הפרוטוקול שלנו מותאם כלפי ומתאר את ההערכה של תאי NK אנושיים כפי שמייצג את המוקד ההיסטורי של המעבדה שלנו. אנחנו במיוחד ניצול שורת תאי NK92 בדוגמא זו שכהיא אחד יש לנו ליישם באופן קבוע ב21,33 העבודה הניסויית שלנו.

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:602px;" width="602">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:230px;">#1.5 cover slips</td>
			<td style="width:222px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">48393-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">BD Cytofix/Cytoperm</td>
			<td style="width:222px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:150px;">554722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:222px;">Sigma</td>
			<td style="width:150px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Cotton tipped applicator</td>
			<td style="width:222px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:150px;">S450941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Falcon centrifuge tubes (50 ml)</td>
			<td style="width:222px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Fetal calf serum (FCS) (500 mL)</td>
			<td style="width:222px;">Atlantic Biologicals</td>
			<td style="width:150px;">S11050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Goat anti-rabbit Pacific Orange</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">P31584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Laboratory tissue wipers</td>
			<td style="width:222px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Nail polish</td>
			<td style="width:222px;">VWR</td>
			<td style="width:150px;">100491-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">NK-92 cells</td>
			<td style="width:222px;">ATCC</td>
			<td style="width:150px;">CRL-2407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Phalloidin Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Prolong anti-fade reagent</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">P7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Purified anti-CD18</td>
			<td style="width:222px;">Biolegend</td>
			<td style="width:150px;">301202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Purified anti-NKp30</td>
			<td style="width:222px;">Biolegend</td>
			<td style="width:150px;">325202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Purified anti-perforin</td>
			<td style="width:222px;">Biolegend</td>
			<td style="width:150px;">308102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">RPMI 1640 medium (500 mL)</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Saponin from Quillaja bark</td>
			<td style="width:222px;">Sigma</td>
			<td style="width:150px;">S4521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Super PAP pen</td>
			<td style="width:222px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:150px;">008899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:230px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:222px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:150px;">22142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:27px;">Material Name</td>
			<td style="height:27px;">Company</td>
			<td style="height:27px;">Catalogue Number</td>
			<td style="height:27px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:27px;">Huygens deconvolution software</td>
			<td style="height:27px;">SVI</td>
			<td style="height:27px;">Contact company</td>
			<td style="height:27px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="height:27px;">Leica SP8 TCS STED microscope</td>
			<td style="height:27px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="height:27px;">Contact company</td>
			<td style="height:27px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (sted) nanoscopy

תאי רוצח טבעיים יוצרים סינפסות מוסדרות היטב, מכוון היטב חיסוניים (IS) כדי lyse תאים בנגיף נגוע או סרטניים. ארגון מחדש אקטין דינמי הוא קריטי לתפקוד של תאי NK וההיווצרות של IS. ההדמיה של ה-F-אקטין בסינפסה ניצלה באופן מסורתי מיקרוסקופיה confocal, עם זאת לגבול ההשתברות של אור מגביל את הרזולוציה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי, כולל confocal, כ 200 ננומטר. ההתקדמות שחלה באחרונה בטכנולוגיית הדמיה אפשרה הפיתוח של הדמיה ברזולוציה סופר המוגבלת subdiffraction. על מנת להמחיש ארכיטקטורת ה-F-אקטין בהוא שאנחנו לשחזר את סינפסה ציטוטוקסיות תא NK על ידי עמידה תאי NK להפעלת קולטן על זכוכית. לאחר מכן, אנו חלבוני תמונה של עניין באמצעות מיקרוסקופ דלדול פליטה מאולץ בשני צבעים (STED). התוצאה היא &lt;80 ננומטר ברזולוציה בסינפסה. במסמך זה אנו מתארים את השלבים של הכנת מדגם ורכישת תמונות באמצעות col הכפולאו Nanoscopy STED לדמיין F-אקטין בNK IS. אנחנו גם להמחיש אופטימיזציה של רכישת מדגם באמצעות תוכנת SP8 יקה וSTED מגודרת זמן. לבסוף, אנו מנצלים תוכנת הויגנס לdeconvolution שלאחר העיבוד של תמונות.

ברור, מטרה העיקרית של הדמיה ברזולוציה הסופר תהיה שיפור לעומת מיקרוסקופיה confocal הקונבנציונלית. יחד עם זאת, יש כמה מכשולים נפוצים שעלולות להוביל להחלטה שאינה אופטימלית. אלה דורשים כי כל ניסוי להיות מותאם באופן אינדיבידואלי. בניסוי הנציג שלנו, אנחנו ההדמיה רשת ה-F-אקטין בתא NK מופעל על ידי הנוגדן מאוגד זכוכית. גורמים שכיחים ל( ותיקונים ל) חוסר ברזולוציה משופרת של STED מעל confocal הם כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחת לדגימה (איור 1 א). זה עשוי להוביל לגרעיניות ואובדן של מידע פיקסל, כפי שמוצג על ידי רזולוציה נמוכה של סיבי ה-F-אקטין. שורה מוגברת או מיצוע מסגרת לעתים קרובות יכולה לתקן את זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הלבנת ו / או מעל הדגימה (איור 1b). זו עלולה להיגרם על ידי פיקסל להתעכב זמן ממושך, כתוצאה ממיצוע שורה המוגזמת. לחלופין, הוא עשוי להיות תוצאה של סריקת יתר של התמונה לפני הרכישה, ובכלל זה שימוש יתר שללייזר דלדול. התוצאה היא בדרך כלל בתמונות מעורפלות או מטושטשות. ניתן לתקן זאת על ידי סריקת השדה של ריבית בלבד מינימאלי לפני הרכישה או, אם אפשר, הגדלת מהירות סריקת לייזר. אם הבעיה נמשכת, ניתן לצמצם את כוח לייזר דלדול. </li></ol> על ידי השגת האיזון הנכון של זמן להתעכב פיקסל, כוח לייזר עירור, וכוח לייזר האזילה, תמונה עם רזולוציה משופרת ומידע מספיק יכול להיות שנוצר (איור 1 ג&#39;). רזולוציה ניתן לשפר עוד יותר על ידי השימוש בdeconvolution (1D איור). כאשר הרכישה היא מותאמת, deconvolution תשפר את הרזולוציה הן איכותית וכמותית ותת -100 הרזולוציה ננומטר צריכה להיות באופן שגרתי להשגה. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51100/51100fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51100/51100fig1.jpg" /> איור 1. אופטימיזציה של רכישה ומלכודות נפוצות של ההדמיה STED. NK92 תאים הופעלו על זכוכית מצופה אנטי CD18 ו- NKp30 עבור 20 דקות לאחר מכן קבועות, permeabilized ומוכתמת עבור ה-F-אקטין עם Phalloidin אלקסה פלואוריד 488.) דוגמא של אובדן של מידע תמונה בשל. ב מתחת לדגימה) דוגמא לאובדן הרזולוציה בשל תנאי הלבנת / ג על הדגימה) ד מותאם) תנאים מותאמים להוביל לשיפור גדול יותר ברזולוציה עם deconvolution. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy at JoVE.com

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

כאן אנו מדגימים את הפרוטוקול להדמיה על ידי Nanoscopy STED שני צבעים סינפסה החיסונית ציטוטוקסיות של תאי NK סכמו על זכוכית. שימוש בשיטה זו אנו מקבלים רזולוציה ננומטר תת -100 של חלבוני סינפסה ושלד התא.

ויזואליזציה של סינפסה החיסונית על ידי פליטה מאולצת דלדול מגודרת בזמן צבע כפול (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

visualization-immunological-synapse-dual-color-time-gated-stimulated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

77.9K Views.  Texas Children's Hospital and Baylor College of Medicine.  כאן אנו מדגימים את הפרוטוקול להדמיה על ידי Nanoscopy STED שני צבעים סינפסה החיסונית ציטוטוקסיות של תאי NK סכמו על זכוכית. שימוש בשיטה זו אנו מקבלים רזולוציה ננומטר תת -100 של חלבוני סינפסה ושלד התא. 

Video: Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

דלדול של אוכלוסיות תאים ספציפיים על ידי דלדול משלים

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Facilitating the Analysis of Immunological Data with Visual Analytic Techniques

Visual analytics (VA) has emerged as a new way to analyze large dataset through interactive visual display. We demonstrated the utility and the flexibility of a VA approach in the analysis of biological datasets. Examples of these datasets in immunology include flow cytometry, Luminex data, and genotyping (e.g., single nucleotide polymorphism) data. Contrary to the traditional information visualization approach, VA restores the analysis power in the hands of analyst by allowing the analyst to engage in real-time data exploration process. We selected the VA software called Tableau after evaluating several VA tools. Two types of analysis tasks analysis within and between datasets were demonstrated in the video presentation using an approach called paired analysis. Paired analysis, as defined in VA, is an analysis approach in which a VA tool expert works side-by-side with a domain expert during the analysis. The domain expert is the one who understands the significance of the data, and asks the questions that the collected data might address. The tool expert then creates visualizations to help find patterns in the data that might answer these questions. The short lag-time between the hypothesis generation and the rapid visual display of the data is the main advantage of a VA approach.

Visual analytics (VA) is a new approach of analyzing data interactively. In this video, we discuss the data overload problem brought on by high-throughput biological experiments, and propose VA as a solution to such problem. The video demonstrates analysis within and between immunological datasets using a VA tool called Tableau.

להקל על ניתוח נתונים החיסוני עם טכניקות Analytic חזותית

Visual analytics (VA) has emerged as a new way to analyze large dataset through interactive visual display. We demonstrated the utility and the ...

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Macrophages are critical players in the innate immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune response and directing the acquired immune response. Macrophage dysfunction can lead to an inability to mount an appropriate immune response and as such, has been implicated in many disease processes, including inflammatory bowel diseases. Macrophages display polarized phenotypes that are broadly divided into two categories. Classically activated macrophages, activated by stimulation with IFN&gamma; or LPS, play an essential role in response to bacterial challenge whereas alternatively activated macrophages, activated by IL-4 or IL-13, participate in debris scavenging and tissue remodeling and have been implicated in the resolution phase of inflammation. During an inflammatory response in vivo, macrophages are found amid a complex mixture of infiltrating immune cells and may participate by exacerbating or resolving inflammation. To define the role of macrophages in situ in a whole animal model, it is necessary to examine the effect of depleting macrophages from the complex environment. To ask questions about the role of macrophage phenotype in situ, phenotypically defined polarized macrophages can be derived ex vivo, from bone marrow aspirates and added back to mice, with or without prior depletion of macrophages. In the protocol presented here clodronate-containing liposomes, versus PBS injected controls, were used to deplete colonic macrophages during dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis in mice. In addition, polarized macrophages were derived ex vivo and transferred to mice by intravenous injection. A caveat to this approach is that clodronate-containing liposomes deplete all professional phagocytes, including both dendritic cells and macrophages so to ensure the effect observed by depletion is macrophage-specific, reconstitution of phenotype by adoptive transfer of macrophages is necessary. Systemic macrophage depletion in mice can also be achieved by backcrossing mice onto a CD11b-DTR background, which is an excellent complementary approach. The advantage of clodronate-containing liposome-mediated depletion is that it does not require the time and expense involved in backcrossing mice and it can be used in mice regardless of the background of the mice (C57BL/6, BALB/c, or mixed background).

Macrophages play a central role in homeostasis and pathology in many tissues. The protocol presented here describes methods for depleting macrophages in vivo, deriving polarized macrophages from bone marrow aspirates, and adoptively transferring macrophages into mice. These techniques allow determination of the role that polarized macrophages play in health and disease.

דלדול המשאבים ואת הכינון מחדש של מקרופאגים בעכברים

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

כולסטרול מקרופאג דלדול והשפעתו על phagocytosis של<em&gt; Neoformans קריפטוקוקוס</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

הדמיה ברזולוציה סופר של תא הרוצח הטבעי החיסונית סינפסה על מישורי שומנים bilayer נתמך-זכוכית

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological synapses&#39;. Within these intimate cell-cell interfaces discrete sub-cellular clusters of MHC/Ag-TCR, F-actin, adhesion and signaling molecules form and remodel rapidly. These dynamics are thought to be critical determinants of both the efficiency and quality of the immune responses that develop and therefore of protective versus pathologic immunity. Current understanding of immunological synapses with physiologic APCs is limited by the inadequacy of the obtainable imaging resolution. Though artificial substrate models (e.g., planar lipid bilayers) offer excellent resolution and have been extremely valuable tools, they are inherently non-physiologic and oversimplified. Vascular and lymphatic endothelial cells have emerged as an important peripheral tissue (or stromal) compartment of &#39;semi-professional APCs&#39;. These APCs (which express most of the molecular machinery of professional APCs) have the unique feature of forming virtually planar cell surface and are readily transfectable (e.g., with fluorescent protein reporters). Herein a basic approach to implement endothelial cells as a novel and physiologic &#39;planar cellular APC model&#39; for improved imaging and interrogation of fundamental antigenic signaling processes will be described.

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

דגם תא האנדותל מישורי הדמיה החיסוני סינפסה Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

ניתוחים כמותיים של הסינפסה המערכת החיסונית בגוף האדם באמצעות הדמיה Cytometry זרימה

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure that optimizes B-cell receptor (BCR) signaling and BCR-mediated antigen acquisition. Both the remodeling of the actin cytoskeleton and the reorientation of the microtubule network towards the antigen contact site are essential for immune synapse formation. Remodeling of the actin cytoskeleton into a dense peripheral ring of F-actin is accompanied by polarization of the microtubule-organizing center towards the immune synapse. Microtubule plus-end binding proteins, as well as cortical plus-end capture proteins mediate physical interactions between the actin and microtubule cytoskeletons, which allow them to be reorganized in a coordinated manner. Elucidating the mechanisms that control this cytoskeletal reorganization, as well as understanding how these cytoskeletal structures shape immune synapse formation and BCR signaling, can provide new insights into B cell activation. This has been aided by the development of super-resolution microscopy approaches that reveal new details of cytoskeletal network organization. We describe here a method for using stimulated emission depletion (STED) microscopy to simultaneously image actin structures, microtubules, and transfected GFP-tagged microtubule plus-end binding proteins in B cells. To model the early events in immune synapse formation, we allow B cells to spread on coverslips coated with anti-immunoglobulin (anti-Ig) antibodies, which initiate BCR signaling and cytoskeleton remodeling. We provide step-by-step protocols for expressing GFP fusion proteins in A20 B-lymphoma cells, for anti-Ig-induced cell spreading, and for subsequent cell fixation, Immunostaining, image acquisition, and image deconvolution steps. The high-resolution images obtained using these procedures allow one to simultaneously visualize actin structures, microtubules, and the microtubule plus-end binding proteins that may link these two cytoskeletal networks.

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy

We present a protocol for using STED microscopy to simultaneously image actin structures, microtubules, and microtubule plus-end binding proteins in B cells that have spread on coverslips coated with antibodies to the B-cell receptor, a model for the initial phase of immune synapse formation.

להמחיש את אקטין ואת Microtubule Cytoskeletons על הסינפסה B-cell המערכת החיסונית באמצעות מיקרוסקופ דלדול (STED) פליטה מאולצת

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure ...

Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both signaling&#160;and antigen uptake are coordinated. IS formation involves dynamic actin remodeling accompanied by the polarized recruitment to the synaptic membrane of the centrosome and associated intracellular organelles such as lysosomes and the Golgi apparatus. Initial stages of actin remodeling allow B cells to increase their cell surface and maximize the quantity of antigen-BCR complexes gathered at the synapse. Under certain conditions, when B cells recognize antigens associated to rigid surfaces, this process is coupled to the local recruitment and secretion of lysosomes, which can facilitate antigen extraction. Uptaken antigens&#160;are internalized into specialized endo-lysosome compartments for processing into peptides, which are loaded onto major histocompatibility complex II (MHC-II) molecules for further presentation to T helper cells. Therefore, studying organelle dynamics associated with the formation of an IS is crucial to understanding how B cells are activated. In the present article we will discuss both imaging and a biochemical technique used to study changes in intracellular organelle positioning and cytoskeleton rearrangements that are associated with the formation of an IS in B cells.

Herein we describe two approaches to characterize cell polarization events in B lymphocytes during the formation of an IS. The first, involves quantification of organelle recruitment and cytoskeleton rearrangements at the synaptic membrane. The second is a biochemical approach, to characterize changes in composition of the centrosome, which undergoes polarization to the immune synapse.

לומדת אורגל דינמיקה ב-B תאים במהלך היווצרות סינפסה החיסונית

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both ...

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF)

Elimination of harmful antibodies from organisms is a valuable approach for the intervention of antibody-associated diseases, such as Dengue hemorrhagic fever and autoimmune diseases. Since thousands of antibodies with different epitopes are circulating in blood, no universal method, except for the dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF), was reported to target specific harmful antibodies. The development of DCAF molecules makes significant contribution to the progress of targeted therapy, which were demonstrated to eliminate the antibody dependent enhancement (ADE) effect in a Dengue virus (DENV) infection model and to boost the acetylcholine receptor activity in a myasthenia gravis model. Here, we describe a protocol for the synthesis of a DCAF molecule (DCAF1), which can selectively block 4G2 antibody to attenuate ADE effect during Dengue virus infection, and illustrate the binding of DCAF1 to 4G2 antibody by an ELISA assay. In our method, DCAF1 is synthesized by the conjugation of a hydrazine derivative of a Fc-III peptide and a recombinant expressed long &#945;-helix with antigenic sequence through native chemical ligation (NCL). This protocol has been successfully applied to DCAF1 as well as other DCAF molecules for targeting their cognate antibodies.

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF

Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) is novel for the elimination of harmful antibodies. Here, we describe a detailed protocol for the synthesis of DCAF1 molecule, which can selectively block 4G2 antibody to eliminate antibody dependent enhancement effect during Dengue virus infection.

נוגדנים ממוקד חסימה על ידי המשלים כפול תפקודית של פפטיד Antigenic ו-השלישי מימטיקה (בית קפה)

Elimination of harmful antibodies from organisms is a valuable approach for the intervention of antibody-associated diseases, such as Dengue hemorrhagic ...