وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح AR055686 وAR060836 وزمالة ما بعد الدكتوراه لم من قبل جمعية الضمور العضلي الفرنسية (AFM). يتم دعم مرفق التصوير الخلوية المستخدمة في هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح HD040677.

1. التصوير خلية اصلاح غشاء طريق السائبة (الزجاج الخرزة) إصابة هذا البروتوكول يسمح بمناسبة حدة خلايا المصابين وتلك التي تفشل للشفاء. قياس هؤلاء السكان من الخلايا يتطلب استخدام ثلاثة شروط: 1. اختبار (C1) - يسمح للخلايا لإصلاح في وجود كا 2 +، 2. الرقابة 1 (أي إصابة C2) - يتم تحضين الخلايا في وجود كا 2 +، ولكن لم يصب، و 3. السيطرة 2 (لا إصلاح C3) - يسمح للخلايا لإصلاح في غياب كا 2 +. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخلايا ل&gt; 50٪ التقاء على ثلاثة coverslips معقمة وغسل C1 و C2 مرتين مع CIM عند 37 درجة مئوية وC3 مع برنامج تلفزيوني في 37 درجة مئوية و coverslips نقل على السيليكون O-الخواتم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من حل prewarmed ديكستران FITC في CIM على C1 و C2 أو C3 في برنامج تلفزيوني على. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصابة غشاء البلازما على C1 و C3 من قبل المتداول بلطف 40 الخرز الزجاجي ميلي غرام على مدى ساترة في درجة حرارة الغرفة عن طريق إمالة coverslips يدويا ذهابا وإيابا 6-8 مرات في زاوية من 30 درجة. ملاحظة: لإصابة خفيفة، وضمان وتنتشر حبات الزجاج بشكل موحد، وبالتالي التقليل من تكرار وقوع اصابات. لتحسين استنساخ الإصابة بين العينات، وتحمل في الوقت نفسه من الإصابة الزجاج حبة من عينات مختلفة ليتم مقارنتها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجنب المزيد من المتداول من الخرز، ونقل جميع coverslips إلى الحاضنة 37 درجة مئوية في ثاني المحيطة 2 والسماح الإصلاح والمضي قدما لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دون السماح الخرز لفة، وإزالة الخرز الزجاجي وFITC ديكستران بواسطة الغسيل مع CIM (C1 و C2) أو برنامج تلفزيوني (C3) في 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان coverslips مرة أخرى على خاتم O وإضافة 100 ميكرولتر من prewarmed يسين يمكن حلها حلا TRITC دكستران في CIM على C1 و C2 أو C3 في برنامج تلفزيوني على. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في ثاني المحيطة 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل coverslips مرتين مع prewarmed CIM وإصلاح مع PFA 4٪ لمدة 10 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 2 دقيقة في RT في هويشت الصبغة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل samplوفاق مرتين مع برنامج تلفزيوني، جبل على شريحة باستخدام وسائل الإعلام وتركيب الخلايا صورة باستخدام مجهر epifluorescence. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الخلايا من C2 إلى تحديد خلفية حمراء وخضراء وتلطيخ كثافة استخدام هذه القيمة إلى عتبة القنوات الأحمر والأخضر لجميع العينات (C1-C3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسجل العدد الكلي للخلايا التي يتم أ) الأخضر (الجرحى وإصلاحه) وب) حمراء أو كليهما الأحمر والأخضر (المصاب، لكنها فشلت في إصلاح) في عينات C1 و C3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العد&gt; 100 الخضر خلايا لكل حالة وتعبر عن جزء من الخلايا التي فشلت في إصلاح كنسبة مئوية من جميع الخلايا المصابة (الأخضر والأحمر). </li></ol> 2. التصوير المباشر لحركية إصلاح غشاء الخلية بعد الإصابة الليزر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع prewarmed CIM ومن ثم وضع ساترة في CIM مع وزير الخارجية صباغة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع ساترة في حامل في الحاضنة مرحلة أعلى الحفاظ على 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد 1-2 مم 2 المنطقة من غشاء الخلية، وأشرق ل&lt;؛ 10 ميللي ثانية مع ليزر نابض. تخفيف قوة الليزر من خلال البرنامج إلى 40-50٪ من الطاقة الذروة. الطاقة الأمثل يسمح إصابة متسقة، ولكن غير قاتلة، وهذا يجب أن يتحدد عن طريق التجربة والخطأ لكل صك على حدة وخلية الخط المستخدمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لرصد إصلاح، صورة كل 10 ثانية في epifluorescence وbrightfield، بدءا قبل الاصابة وتستمر لمدة 3-5 دقيقة بعد الاصابة. ملاحظة: للحصول على أي سيطرة إصلاح، كرر الخطوات من 2،1-2،4 مع الخلايا بجروح في برنامج تلفزيوني يحتوي على صبغة FM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقياس حركية إصلاح، وقياس FM الخلوية صبغ مضان ورسم التغير في كثافة (ΔF/F0) أثناء التصوير. ينبغي أن متوسط ​​هذه البيانات لأكثر من 10 خلايا في كل حالة وخططوا كما بلغ متوسط ​​قيمة الخلية أو الفرد، حسب الحاجة. </li></ol> 3. التصوير السائبة (الزجاج الخرزة) إصابة المستحثة الليزوزومية الإيماس وتشمل عينات الخلايا التالية نمت ل&gt; 50٪التقاء: 1. اختبار (C1) - الخلايا يسمح لإصلاح في وجود كا 2 +، 2. الرقابة 1 (C2، لا إصابة) - خلايا لا جرح ولا حضنت مع الأجسام المضادة الأولية، و 3. 2 السيطرة (C3؛ لا اصلاح) - خلايا يسمح لإصلاح في غياب كا 2 +. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل coverslips C1 و C2 مرتين مع CIM عند 37 درجة مئوية وC3 مع برنامج تلفزيوني في 37 ° C ونقلها على السيليكون O-الخواتم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من prewarmed يسين يمكن حلها ديكستران TRITC في CIM على C1 و C2 و C3 في برنامج تلفزيوني على. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصابة غشاء البلازما على C1 و C3 كما في الخطوة 1.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجنب المزيد من المتداول من الخرز، ونقل جميع coverslips إلى الحاضنة 37 درجة مئوية في ثاني المحيطة 2 والسماح الإصلاح والمضي قدما لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الخرز الزجاجي وTRITC دكستران بغسل لل coverslips في متوسطة النمو الباردة، وضمان مرة أخرى لا المتداول من الخرز الزجاجي على الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف لل coverslips مرتين مع نمو الباردة متوسطة ونقل إلى O-الخواتم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لC1 و C3، إضافة 100 ميكرولتر من الفئران لمكافحة فأر LAMP1 الأجسام المضادة في وسائل الإعلام كاملة النمو البارد وإضافة الباردة، وسائط النمو الكامل لC2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للسماح الضد ملزمة coverslips احتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل coverslips ثلاث مرات مع CIM الباردة وإصلاح كافة coverslips مع PFA 4٪ لمدة 10 دقيقة في RT ثم شطف 3X مع CIM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان جميع coverslips في 100 ميكرولتر من عرقلة الحل لمدة 15 دقيقة في RT </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان جميع coverslips في 100 ميكرولتر اليكسا فلور 488 الضد مكافحة الفئران لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 2 دقيقة في RT في هويشت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني، جبل على شريحة باستخدام وسائل الإعلام وتركيب الصورة باستخدام المجهر epifluorescence. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الصور من الخلايا C2، تحديد تلطيخ غير محدد الخلفية في المنطقة الحمراء (TRITC دكستران) والأخضر (اليكسا فلور 488 الضد) القنوات واستخدام هذه القيم لتلوين الخلفية عتبة القنوات الأحمر والأخضر لجميع العينات (C1-C3). &lt;/ لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام&gt; 100 الأحمر وصفت الخلايا من C1 و C3 لقياس شدة تلطيخ LAMP1 (الأخضر) في الخلايا المصابة. تجربة ناجحة لتلطيخ LAMP1 في الخلايا من C3 سيكون أقل بكثير مما كانت عليه في الخلايا من C1. </li></ol> 4. التصوير الحي للخلية غشاء الإصابات الحفز الاتجار التحت خلوية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية Fluorescently و مقصورة الفائدة عليها بنقل مراسل المناسبة (مثل CD63-GFP لالجسيمات الحالة 8) أو باستخدام الأصباغ الفلورية 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوضع العلامات الجسيمات الحالة مع صبغة الفلورسنت، واحتضان الخلايا المزروعة إلى 50٪ التقاء في وسائل الإعلام التي تحتوي على النمو FITC-ديكستران </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح ديكستران أن endocytosed لمدة 2 ساعة (أو أكثر حسب الحاجة لوضع العلامات endosomal كافية مع ديكستران من خط الخلية من الفائدة) في حاضنة CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع وسائل الاعلام prewarmed النمو واحتضان فيه لمدة 2 ساعة في CO 2 حاضنة للسماح للجميعendocytosed ديكستران لتتراكم في يحلول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل التصوير، وشطف ساترة في prewarmed CIM وجبل في حامل ساترة على الحاضنة المرحلة الأولى في 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ widefield (للحركة في جميع أنحاء الخلية) أو TIRF (الحركة على سطح الخلية وإيماس) التصوير - الخلايا التي ليس لديها مزدحمة FITC ديكستران الجسيمات الحالة وصفت هي مثالية لتصوير الحركة وإيماس من الجسيمات الحالة الفردية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محاذاة الليزر TIRF المجهر التصوير ل: استخدام 60X أو 100X مع الهدف&gt; 1.45 NA. إعداد زاوية لحادث TIRF شعاع الليزر باستخدام نهج الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصابة غشاء الخلية عن طريق تشعيع منطقة صغيرة (1-2 مم 2) ل&lt;100 ميللي ثانية، مع ليزر نابض في 40-50٪ التوهين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لرصد استجابة يحلول إلى الخلية الإصابة، خلايا الصورة في 4-6 لقطة / ثانية لمدة 2 دقيقة على الأقل أو أكثر اعتمادا على ديناميات إيماس في الخلايا من الفائدة. </li></ol>

<ol>
	<li>Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-regulated+exocytosis+is+required+for+cell+membrane+resealing.">Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing.</a> Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).</li><li>Togo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+plasma+membrane+stimulates+rearrangement+of+microtubules+and+lipid+traffic+toward+the+wound+site.">Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site.</a> Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).</li><li>Miyake, K., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+accumulation+and+exocytosis+at+sites+of+plasma+membrane+disruption.">Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption.</a> Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).</li><li>Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca2+-regulated+exocytosis+of+lysosomes.">Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106, 157-169 (2001).</li><li>Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Potez, S., Draeger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbing+confers+resistance+against+cell+lysis.">Blebbing confers resistance against cell lysis.</a> Death Differ. 18, 80-89 .</li><li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy.">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li><li>Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Parkhurst, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wound+repair+in+Drosophila+occurs+through+three+distinct+phases+of+membrane+and+cytoskeletal+remodeling.">Cell wound repair in Drosophila occurs through three distinct phases of membrane and cytoskeletal remodeling.</a> Cell Biol. 193, 455-464 (2011).</li><li>Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptotagmin+VII+restricts+fusion+pore+expansion+during+lysosomal+exocytosis.">Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis.</a> PLoS Biol. 2, 1224-1232 (2004).</li><li>McNeil, P. L., Clarke, M. F., Miyake, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wound+assays.">Cell wound assays.</a> Protoc. Cell Biol. Chapter 12, (2001).</li><li>McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+introduction+of+molecules+into+cells.">Direct introduction of molecules into cells.</a> Protoc. Cell Biol. Chapter 20, (2001).</li><li>Knight, M. M., Roberts, S. R., Lee, D. A., Bader, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+using+confocal+microscopy+induces+intracellular+calcium+transients+and+cell+death.">Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death.</a> J. Physiol. Cell Physiol. 284, C1083-C1089 (2003).</li><li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair.">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).</li><li>Benink, H. A., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentric+zones+of+active+RhoA+and+Cdc42+around+single+cell+wounds.">Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds.</a> Cell Biol. 168, 429-439 (2005).</li><li>Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+constitutive+exocytosis+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Cell Biol. 149, 23-32 (2000).</li><li>Steyer, J. A., Horstmann, H., Transport Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=docking+and+exocytosis+of+single+secretory+granules+in+live+chromaffin+cells.">docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells.</a> 388, 474-478 (1997).</li><li>Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proximal+lysosomes+are+the+major+vesicles+responsible+for+calcium-dependent+exocytosis+in+nonsecretory+cells.">Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells.</a> Cell Biol. 159, 625-635 (2002).</li><li>Jaiswal, J. K., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+4.12.">Ch. 4.12.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 4.12.1-4.12.15 (2003).</li><li>Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy+illuminator+for+improved+imaging+of+cell+surface+events.">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events.</a> Protoc. Cytom. Chapter 12, (2012).</li><li>Jaiswal, J. K., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+events+at+the+cell+membrane.">Imaging single events at the cell membrane.</a> Chem. Biol. 3, 92-98 (2007).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

إصابة غشاء الخلية في الجسم الحي يحدث نتيجة لمجموعة متنوعة من الضغوطات الفيزيولوجية ولقد تم تطوير العديد من الطرق التجريبية لتقليد هذه. وتشمل هذه إصابة غشاء الخلية من الخلايا الملتصقة عن طريق كشط لهم قبالة صحن أو الركض من خلال الضيقة تتحمل حقنة 9،10. بعد هذه ...

يحافظ على غشاء الخلية على سلامة الخلايا من خلال توفير حاجز بين الخلية والبيئة خارج الخلية. A التحفيز الكيميائية والكهربائية والميكانيكية أو التي تتجاوز عتبة فسيولوجية طبيعية وكذلك وجود غزو مسببات الأمراض يمكن لكل نتيجة في إصابة غشاء الخلية وتثير رد فعل الخلوية اللاحقة لإصلاح هذا الضرر. البقاء على قيد الحياة هذه الإصابات لغشاء الخلية، والخلايا تمتلك آلية فعالة للإصلاح. هذه الآلية هي التي تعتمد الكالسيوم وينطوي الاتجار داخل الخلايا من البروتينات مثل annexins وMG53 وغيرها فضلا عن المقصورات التحت خلوية مثل الإندوسومات، الجسيمات الحالة، جولجي والميتوكوندريا الحويصلات المشتقة من غشاء الخلية أصيب 1-7. ومع ذلك، فإن تفاصيل تسلسل الأحداث الجزيئية والتحت خلوية المشاركة في إصلاح غشاء الخلية التالفة لا تزال غير مفهومة تماما. يمكن فصل استجابة إصلاح الخلية في الأذنلاي والاستجابات في وقت متأخر. الردود في وقت مبكر، والتي تحدث في غضون ثوان إلى دقائق النطاق الزمني، مهمة بشكل كبير في تحديد طبيعة الاستجابات في وقت متأخر مما يؤدي إلى إصلاح الخلية ناجحة أو موت الخلية. وقد ساعدت المقايسات نقطة النهاية على أساس الأكبر تحليل الكيمياء الحيوية والخلوية إثبات تورط العمليات الجزيئية والخلوية في الإصلاح. ولكن، نظرا لعدم التجانس وسرعة الاستجابة إصلاح الخلوية، تفشل المقايسات نقطة النهاية لتقديم التفاصيل الحركية والمكانية للتسلسل الأحداث التي أدت إلى إصلاح. هي مناسبة النهج التي تمكن من إصابة تسيطر غشاء الخلية وتسمح برصد إصلاح غشاء الخلية والاستجابات المرتبطة التحت خلوية في القرار المكانية والزمانية عالية مثالي لمثل هذه الدراسات. هنا، وقد عرضت هذه النهج. اثنين من البروتوكولات وصف النهج لرصد حركية في الوقت الحقيقي من إصلاح غشاء الخلية والردود التحت خلوية المرتبطة بعملية الإصلاح في الخلايا الحية التالية ينج الليزرأوروغواي. كتكملة لهذه المقايسات التصوير الخلية الحية تستند، كما تم وصفها المقايسات نقطة النهاية التي توفر مقياسا على السكان لإصلاح رصد الخلايا الفردية وردود التحت خلوية المرتبطة بها. لإثبات فائدتها وقد استخدمت هذه الأساليب لمراقبة الاتجار وإيماس من الجسيمات الحالة في استجابة لإصابة غشاء الخلية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="814" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1387</td>
			<td>Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP410</td>
			<td>Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC dextran (Lysine fixable)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1820</td>
			<td>2 mg/ml in CIM or PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC dextran (Lysine fixable)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1818</td>
			<td>2 mg/ml in CIM or PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA 16%</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15710</td>
			<td>4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>1/10 000 in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3163</td>
			<td>1 &#181;g/&#181;l in CIM or PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>FD40S</td>
			<td>2 mg/ml in growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAMP1&#160;</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-19992</td>
			<td>1/300 in growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21470</td>
			<td>1/500 in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-545-86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom petridish</td>
			<td>MatTek corporation</td>
			<td>P35G-1.0-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone O ring</td>
			<td>Bellco</td>
			<td>1943-33315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip holder</td>
			<td>Bellco</td>
			<td>1943-11111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-7816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12001-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MP1400-500H</td>
			<td>Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Sreptomycin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12001-350</td>
			<td>Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5405</td>
			<td>5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Ca2+ and Mg2+ free)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12001-664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Olympus America, PA</td>
			<td>IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIRF illuminator&#160;</td>
			<td>Olympus America, PA</td>
			<td>Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence illuminator</td>
			<td>Sutter Instruments, Novato CA</td>
			<td>Lambda DG-4 (DG-4 30)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD Camera</td>
			<td>Photometrics, Tucson, AZ</td>
			<td>Evolve 512 EMCCD&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition and anaysis software</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO</td>
			<td>Slidebook 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulsed laser</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO</td>
			<td>Ablate (3iL13)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokaihit, Japan</td>
			<td>INUBG2ASFP-ZILCS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging cell membrane injury and subcellular processes involved in repair

قدرة الخلايا المصابة للشفاء هو عملية الخلوية الأساسية، ولكن الآليات الخلوية والجزيئية المشاركة في خلايا الشفاء بجروح ولا يزال الغموض يكتنف. هنا يتم وصف فحوصات لرصد القدرة وحركية للشفاء من إصابة الخلايا المستزرعة التالية مترجمة. يصف البروتوكول الأول نهجا يستند إلى نقطة النهاية في وقت واحد لتقييم قدرة الخلايا إصلاح غشاء من مئات الخلايا. يصف البروتوكول الثاني نهج التصوير في الوقت الحقيقي لمراقبة حركية إصلاح غشاء الخلية في الخلايا الفردية بعد الاصابة المترجمة مع ليزر نابض. كما أصيب خلايا الشفاء ينطوي الاتجار بروتينات معينة ومقصورات التحت خلوية إلى موقع الإصابة، ويصف البروتوكول الثالث استخدام نهج نقطة النهاية أعلاه استنادا إلى تقييم واحد مثل الاتجار الحدث (الليزوزومية إيماس) في مئات من الخلايا في وقت واحد وجرح بروتوكول مشاركة يصف استخدام الليزر النبضي الإصابة جنبا إلى جنب مع صغار TIRFنسخة لرصد ديناميات مقصورات التحت خلوية الفردية في الخلايا المصابة في القرار المكانية والزمانية عالية. في حين تصف بروتوكولات هنا استخدام هذه الأساليب لدراسة العلاقة بين إصلاح غشاء الخلية وإيماس الليزوزومية في خلايا العضلات مثقف، يمكن تطبيقها على هذا النحو لأية خلية أخرى ملتصقة مثقف ومقصورة التحت خلوية من خيار.

البروتوكولات وصفها هنا للتصوير خلية واحدة هي القدرة على رصد وحركية إصلاح غشاء الخلية (البروتوكولات 1 و 2) والاتجار التحت خلوية والانصهار من خلال إصلاح الجسيمات الحالة (بروتوكولات 3 و 4). بروتوكول 1 يظهر الفحص الأكبر الذي يسمح وضع عل?...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair at JoVE.com

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

عملية الشفاء من الخلايا جرح ينطوي الاتجار بروتينات معينة ومقصورات التحت خلوية إلى موقع الإصابة غشاء الخلية. يصف هذا البروتوكول فحوصات لرصد هذه العمليات.

التصوير خلية غشاء من الإصابات والعمليات التحت خلوية المشاركة في اصلاح

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

imaging-cell-membrane-injury-subcellular-processes-involved

Research

JoVE Journal

Biology

14.9K Views.  Children's National Medical Center.  عملية الشفاء من الخلايا جرح ينطوي الاتجار بروتينات معينة ومقصورات التحت خلوية إلى موقع الإصابة غشاء الخلية. يصف هذا البروتوكول فحوصات لرصد هذه العمليات. 

Video: Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many degenerative human diseases. The recent discovery of MG53 as a key component of the membrane resealing machinery allows for a better molecular understanding of the basic biology of tissue repair, as well as for potential translational applications in regenerative medicine. Here we detail the experimental protocols for exploring the in vivo function of MG53 in repair of muscle injury using treadmill exercise protocols on mouse models, for testing the ex vivo membrane repair capacity by measuring dye entry into isolated muscle fibers, and for monitoring the dynamic process of MG53-mediated vesicle trafficking and cell membrane repair in cultured cells using live cell confocal microscopy.

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Described here are protocols used to visualize the dynamic process of MG53-mediated cell membrane repair in whole animals and at the cellular level. These methods can be applied to investigate the cell biology of plasma membrane resealing and regenerative medicine.

MG53 تصور بوساطة غشاء الخلية عن طريق إصلاح في الجسم الحي و في المختبر أنظمة

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease conditions1, 2. Network growth is commonly attributed to angiogenesis, defined as the growth of new vessels from pre-existing vessels. The angiogenic process is also directly linked to arteriogenesis, defined as the capillary acquisition of a perivascular cell coating and vessel enlargement. Needless to say, angiogenesis is complex and involves multiple players at the cellular and molecular level3. Understanding how a microvascular network grows requires identifying the spatial and temporal dynamics along the hierarchy of a network over the time course of angiogenesis. This information is critical for the development of therapies aimed at manipulating vessel growth.
The exteriorization model described in this article represents a simple, reproducible model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. It was adapted from wound-healing models in the rat mesentery4-7, and is an alternative to stimulate angiogenesis in the mesentery via i.p. injections of pro-angiogenic agents8, 9. The exteriorization model is attractive because it requires minimal surgical intervention and produces dramatic, reproducible increases in capillary sprouts, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows for the two-dimensional visualization of entire microvascular networks down to single cell level. The stimulated growth reflects natural angiogenic responses in a physiological environment without interference of foreign angiogenic molecules. Using immunohistochemical labeling methods, this model has been proven extremely useful in identifying novel cellular events involved in angiogenesis. Investigators can readily correlate the angiogenic metrics during the time course of remodeling with time specific dynamics, such as cellular phenotypic changes or cellular interactions4, 5, 7, 10, 11.

This article describes a simple model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. The model produces dramatic increases in capillary sprouting, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows en face visualization of entire microvascular networks down to the single cell level.

جرذ الاهتمام لأمور ظاهرية مساريق: نموذج للتحقيق في حيوية الخلوي شارك في الأوعية الدموية

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event that triggers the repair of mechanical wounds on the plasma membrane within ~30 sec. Recent studies revealed that mammalian cells also reseal their plasma membrane after permeabilization with pore forming toxins in a Ca2+-dependent process that involves exocytosis of the lysosomal enzyme acid sphingomyelinase followed by pore endocytosis. Here, we describe the methodology used to demonstrate that the resealing of cells permeabilized by the toxin streptolysin O is also rapid and dependent on Ca2+ influx. The assay design allows synchronization of the injury event and a precise kinetic measurement of the ability of cells to restore plasma membrane integrity by imaging and quantifying the extent by which the liphophilic dye FM1-43 reaches intracellular membranes. This live assay also allows a sensitive assessment of the ability of exogenously added soluble factors such as sphingomyelinase to inhibit FM1-43 influx, reflecting the ability of cells to repair their plasma membrane. This assay allowed us to show for the first time that sphingomyelinase acts downstream of Ca2+-dependent exocytosis, since extracellular addition of the enzyme promotes resealing of cells permeabilized in the absence of Ca2+.

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live imaging of cells exposed to the lipophilic dye FM1-43 allows precise determination of the kinetics by which pore-forming toxins are removed from the plasma membrane. This is a sensitive assay that can be used to assess requirements for Ca2+, sphingomyelinase and other factors on plasma membrane repair.

يعيش التصوير الفحص لتقييم أدوار كا<sup&gt; 2 +</sup&gt; وSphingomyelinase في إصلاح مسام تشكيل الجروح السمية

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

حيوي داخلي المجهري للهياكل التصوير التحت خلوية في الفئران لايف تعرب عن البروتينات الفلورية

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

الدولة الأرض استنفاد القرار فائقة التصوير في خلايا الثدييات

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

فائقة الدقة تصوير الخلايا الحية من الهياكل دون الخلوية

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Photodiode-Based Optical Imaging for Recording Network Dynamics with Single-Neuron Resolution in Non-Transgenic Invertebrates

The development of transgenic invertebrate preparations in which the activity of specifiable sets of neurons can be recorded and manipulated with light represents a revolutionary advance for studies of the neural basis of behavior. However, a downside of this development is its tendency to focus investigators on a very small number of &#8220;designer&#8221; organisms (e.g., C. elegans and Drosophila), potentially negatively impacting the pursuit of comparative studies across many species, which is needed for identifying general principles of network function. The present article illustrates how optical recording with voltage-sensitive dyes in the brains of non-transgenic gastropod species can be used to rapidly (i.e., within the time course of single experiments) reveal features of the functional organization of their neural networks with single-cell resolution. We outline in detail the dissection, staining, and recording methods used by our laboratory to obtain action potential traces from dozens to ~150 neurons during behaviorally relevant motor programs in the CNS of multiple gastropod species, including one new to neuroscience &#8211; the nudibranch Berghia stephanieae. Imaging is performed with absorbance voltage-sensitive dyes and a 464-element photodiode array that samples at 1,600 frames/second, fast enough to capture all action potentials generated by the recorded neurons. Multiple several-minute recordings can be obtained per preparation with little to no signal bleaching or phototoxicity. The raw optical data collected through the methods described can subsequently be analyzed through a variety of illustrated methods. Our optical recording approach can be readily used to probe network activity in a variety of non-transgenic species, making it well suited for comparative studies of how brains generate behavior.

This protocol presents a method for imaging neuronal population activity with single-cell resolution in non-transgenic invertebrate species using absorbance voltage-sensitive dyes and a photodiode array. This approach enables a rapid workflow, wherein imaging and analysis can be pursued over the course of a single day.

التصوير البصري المستند إلى الصمامات الثنائية الضوئية لتسجيل ديناميكيات الشبكة بدقة أحادية الخلايا العصبية في اللافقاريات غير المعدلة وراثيا

The development of transgenic invertebrate preparations in which the activity of specifiable sets of neurons can be recorded and manipulated with light ...

Isolating and Imaging Live, Intact Pacemaker Regions of Mouse Renal Pelvis by Vibratome Sectioning

The renal pelvis (RP) is a funnel-shaped, smooth muscle structure that facilitates normal urine transport from the kidney to the ureter by regular, propulsive contractions. Regular RP contractions rely on pacemaker activity, which originates from the most proximal region of the RP at the pelvis-kidney junction (PKJ). Due to the difficulty in accessing and preserving intact preparations of the PKJ, most investigations on RP pacemaking have focused on single-cell electrophysiology and Ca2+ imaging experiments. Although important revelations on RP pacemaking have emerged from such work, these experiments have several intrinsic limitations, including the inability to accurately determine cellular identity in mixed suspensions and the lack of in situ imaging of RP pacemaker activity. These factors have resulted in a limited understanding of the mechanisms that underlie normal rhythmic RP contractions. In this paper, a protocol is described to prepare intact segments of mouse PKJ using a vibratome sectioning technique. By combining this approach with mice expressing cell-specific reporters and genetically encoded Ca2+ indicators, investigators may be able to more accurately study the specific cell types and mechanisms responsible for peristaltic RP contractions that are vital for normal urine transport.

The goal of this protocol is to isolate intact pacemaker regions of the mouse renal pelvis using vibratome sectioning. These sections can then be used for in situ Ca2+ imaging to elucidate Ca2+ transient properties of pacemaker cells and other interstitial cells in vibratome slices.

عزل والتصوير لايف، سليمة مناطق منظم ضربات القلب من الحوض الكلوي الماوس عن طريق تقسيم الهزاز

The renal pelvis (RP) is a funnel-shaped, smooth muscle structure that facilitates normal urine transport from the kidney to the ureter by regular, ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the zebrafish cardiovascular tissues have been limiting in studying their electrophysiological properties. Previous methods have been described for dissection of zebrafish hearts and isolation of ventricular cardiac myocytes. However, the isolation of zebrafish atrial and vascular myocytes for electrophysiological characterization was not detailed. This work describes new and modified enzymatic protocols that routinely provide isolated juvenile and adult zebrafish ventricular and atrial cardiomyocytes, as well as vascular smooth muscle (VSM) cells from the bulbous arteriosus, suitable for patch-clamp experiments. There has been no literary evidence of electrophysiological studies on zebrafish cardiovascular tissues isolated at embryonic and larval stages of development. Partial dissociation techniques that allow patch-clamp experiments on individual cells from larval and embryonic hearts are demonstrated.

The present protocol describes the acute isolation of viable cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval, and embryonic zebrafish (Danio rerio), suitable for electrophysiological studies.

عزل خلايا العضلات الملساء القلبية والوعائية عن أسماك الزرد البالغة واليافعة واليرقات والجنينية للدراسات الكهروفسيولوجية

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...

Imaging Neutrophil Migration in the Mouse Skin to Investigate Subcellular Membrane Remodeling Under Physiological Conditions

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first immune cells to reach the site of inflammation and to participate in the innate immune response during infection or tissue damage. So far, neutrophil migration has been successfully visualized using various in vitro experimental systems based on uniform stimulation, or confined migration under agarose, or micro-fluidic channels. However, these models do not recapitulate the complex microenvironment that neutrophils encounter in vivo. The development of multiphoton microscopy (MPM)-based techniques, such as intravital subcellular microscopy (ISMic), offer a unique tool to visualize and investigate neutrophil dynamics at subcellular resolutions under physiological conditions. In particular, the ear of a live anesthetized mouse provides an experimental advantage to follow neutrophil interstitial migration in real-time due to its ease of accessibility and lack of surgical exposure. ISMic provides the optical resolution, speed, and depth of acquisition necessary to track both cellular and, more importantly, subcellular processes in 3D over time (4D). Moreover, multi-modal imaging of the interstitial microenvironment (i.e., blood vessels, resident cells, extracellular matrix) can be readily accomplished using a combination of transgenic mice expressing select fluorescent markers, exogenous labeling via fluorescent probes, tissue intrinsic fluorescence, and second/third harmonic generated signals. This protocol describes 1) the preparation of neutrophils for adoptive transfer into the mouse ear, 2) different settings for optimal sub-cellular imaging, 3) strategies to minimize motion artifacts while maintaining a physiological response, 4) examples of membrane remodeling observed in neutrophils using ISMic, and 5) a workflow for the quantitative analysis of membrane remodeling in migrating neutrophils in vivo.

Neutrophil migration relies on the rapid and continuous remodeling of the plasma membrane in response to chemoattractant and its interactions with the extracellular microenvironment. Described herein is a procedure based on Intravital Subcellular Microscopy to investigate the dynamic of membrane remodeling in neutrophils injected in the ear of anesthetized mice.

تصوير هجرة العدلات في جلد الفأر للتحقيق في إعادة تشكيل الغشاء تحت الخلوي في ظل الظروف الفسيولوجية

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first ...