نود أن نشكر جميع أعضاء المختبر مكماهون قدموه من مساعدة والدعم. وأيد هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح من / NCI R01 CA176839-01 (لMM) وجائزة البحوث المؤسسية والأكاديمية التطوير الوظيفي (IRACDA لJS).

1. إعداد الخلية لست الجامعة من خلية ثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أطباق زراعة الخلايا على الجليد وإضافة PBS الباردة مع 5 ملي EDTA (مثلا 5 مل من برنامج تلفزيوني مع 5 ملي EDTA/10 سم 2 لوحة). إزالة الخلايا الملتصقة من الطبق باستخدام مكشطة الخلية ومن ثم نقل تعليق خلية إلى الباردة أنبوب 15 مل المخروطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه تعليق خلية بواسطة السرعة المنخفضة الطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة (230 x ج) لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. وضع أنابيب مخروطية على الجليد ونضح بعناية طاف دون الإخلال بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل بيليه مع 1 مل من برنامج تلفزيوني مع 5 ملي EDTA ونقل تعليق خلية إلى 1.5 مل الباردة أنبوب الطرد المركزي. تعليق سريع تدور في 13،000 دورة في الدقيقة (13،226 XG) لمدة 10 ثانية لتكوير الخلايا. إزالة بعناية طاف دون الإخلال بيليه ومكان أنابيب على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend وبيليه في 25-200 ميكرولتر (اعتمادا على حجم بيليه، أي لمدة 3 × 10 6 خلايا إضافة ~ 150 ميكرولتر من العازلة RIPA) فيRIPA العازلة (50 ملي تريس، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.5 ملي EDTA، 10 ملي ناف، 0.1٪ SDS، 0.5٪ deoxycholate الصوديوم، 1٪ NP-40) التي تحتوي على الأنزيم البروتيني وأضاف طازجة ومثبطات إنزيم الفوسفاتيز بتركيز نهائي 2X. لفترة وجيزة دوامة كل أنبوب واحتضان لمدة 20-30 دقيقة التعليق على الجليد. ملاحظة: هناك العديد من مخازن تحلل والتي يمكن استخدامها لاستخراج البروتينات، والتي تختلف في قدرتها على ذوبان البروتينات وقوة على تغيير طبيعة المنظفات (أي SDS، تريتون X-100، أو NP-40). العازلة RIPA مفيد لإعداد لست] خلية كاملة وتعطيل البروتين البروتين التفاعلات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإنشاء جزء آخر النووية، لست] أجهزة الطرد المركزي في 14،000 دورة في الدقيقة (15339 x ج) لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نقل طاف لأنبوب جديد دون تعطيل بيليه ومكان أنابيب التخصيب النووي على الجليد. ملاحظة: بيليه التخصيب النووي قد فصل أيضا من الأنبوب أثناء استخراج طاف. لتجنب جمع بيليه التخصيب النووي، ضع طرف ماصة مباشرة طn لبيليه التخصيب النووي لزجة واستدراجه حتى مع ماصة من أجل التخلص منه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد تركيزات البروتين من كل عينة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة باستخدام هذه المقايسات البروتين الكمي كما BCA أو برادفورد. </li></ol> 2. عينة إعداد والكهربائي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد كل عينة وفقا للجدول التالي المبين أدناه. كبديل، يمكن أن تستخدم أيضا β-المركابتويثانول في تركيز النهائي من 2.5٪. ومع ذلك، يجب إضافة عامل مختزل لكل عينة تصل إلى ساعة قبل تحميل هلام. مجموع الحسابات عن الاختلافات حجم pipetting لمع فقط 20 ميكرولتر من كل عينة أعدت تحميلها لكل بئر. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> REAGENT </td><td> نموذج تخفيض </td></tr><tr><td> البروتين عينة </td><td> X ميكرولتر </td></tr><tr><td> 4X LDS العازلة عينة </td><td> 6 ميكرولتر </td></tr><tr><td> 500 نانومتر DTT الأحمرucing كيل </td><td> 2.4 ميكرولتر </td></tr><tr><td> المياه منزوع الأيونات </td><td> ما يصل إلى 15.6 ميكرولتر </td></tr><tr><td> اجمالى حجم التداول </td><td> 24 ميكرولتر </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات الحرارة عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. في حين أن العينات يتم تسخين، وإعداد 1،000 مل من 1X MES أو اجتماعات الأطراف تشغيل العازلة (50 مل 20x وزارة التربية والعلم أو اجتماعات الأطراف تشغيل المخزن المؤقت بالإضافة إلى 950 مل من الماء منزوع الأيونات). اجتماعات الأطراف تشغيل عازلة يحل البروتينات متوسطة الحجم بين 14-200 كيلو دالتون، في حين MES تشغيل المخزن المؤقت يحل البروتينات الوزن الجزيئي أصغر بين 2-200 كيلو دالتون مع انخفاض الباكاف الحمضية، والذي يسمح للMES تشغيل مؤقت لتشغيل أسرع من اجتماعات الأطراف 4. وبالتالي، هذه المخازن المؤقتة اثنين والمتناقضة الآثار على هجرة الأيونات داخل هلام التراص الذي يؤدي إلى اختلافات في فصل العصابات البروتين 4. جانبا والجمع بين 200 مل من 1X MES أو اجتماعات الأطراف تشغيل المخزن المؤقت مع 500 ميكرولتر من مضادات الأكسدة، والتي سيتم استخدامها لملء الغرفة العازلة العلوي من الحد الأدنىط خلية وحدة الكهربائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حالما يتم الانتهاء من عينات التدفئة، وعينات تدور بسرعة قبل وضعها على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتجميع مسبقة الصنع المواد الهلامية مكرر تريس في وحدة مصغرة الخليوي لالكهربائي اتباع تعليمات الشركة المصنعة. ملاحظة: التأكد من أنها موجهة لكل هلام في مثل هذه الأزياء التي أقصر (أصغر) الكاسيت كل هلام يواجه الداخل نحو العازلة الأساسية والمواد الهلامية هي مستوى والضغط بإحكام ضد العازلة الأساسية لتجنب تسرب من غرفة المخزن العلوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء الغرفة العازلة العلوي مع 200 مل من 1X MES أو اجتماعات الأطراف تشغيل العازلة التي تحتوي على مضادات الأكسدة والغرفة السفلى العازلة وحدة مصغرة الخليوي مع حوالي 600 مل من 1X MES أو اجتماعات الأطراف تشغيل المخزن المؤقت. يمكن حفظ اضافية 200-300 مل من العازلة على التوالي لاستخدامها لاحقا. ومع ذلك، فمن غير المستحسن لإعادة تدوير العازلة المستخدمة أثناء التشغيل الكهربائي مثل الرقم الهيدروجيني ونوعية المخزن المؤقت يمكن تغييرها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 20 ميكرولتر من كل عصيدة البروتينلو في كل بئر. إذا باجتزاء الغشاء في مختلف شرائط من أجل تحقيق عن الأجسام المضادة متعددة (أي أكثر من 2)، فمن المستحسن للغاية لتحميل 2-5 ميكرولتر من مستوى البروتين prestained في الآبار الأول والأخير من كل الجل لأن هذا سيكون بمثابة قطع أدلة لفصل أجزاء مختلفة من الغشاء دون التأثير على التصوير من العصابات البروتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المواد الهلامية في تشغيل 200 V المستمر لمدة 35 دقيقة مع تيار المتوقعة من 110-125 مللي أمبير / هلام في بداية و70-80 مللي أمبير في هلام في نهاية المطاف. الكهربائي اكتمال عندما يهاجر الصبغة تتبع لسلك البلاتين على طول العازلة الأساسية. </li></ol> 3. نقل البروتين باستخدام نظام التنشيف iBlot الجاف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تماما فصل المواد الهلامية-مصغرة عن طريق كسر الجانبين المستعبدين من الكاسيت (و يمكن أن تنتج ضوضاء طقطقة). تجاهل أقصر (أصغر) لوحة ونقل بعناية الجل من أطول (مشقوق) لوحة في وعاء مع الماء منزوع الأيونات وإزالة الجزء السميك القدمين من هلام الموجود في الجزء السفلي. ملاحظة: في حالات نادرة، وهلام قد نعلق على لوحة أقصر بدلا من أطول وفترة زمنية محددة لوحة. في هذه الحالة، تجاهل لفترة أطول، لوحة فترة زمنية محددة وإزالة الجزء السميك القدمين من هلام الموجود في الجزء السفلي. ثم، ونقل بعناية الجل من لوحة أقصر في الماء منزوع الأيونات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع القطب الموجب والسالب مداخن نقل وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. ملاحظة: تقديم كل النيتروسليلوز أو PVDF الأغشية عالية الجودة وكفاءة نقل البروتينات ومتوافقة مع كشف الفلورسنت 8. ومع ذلك، غشاء PVDF لديها القدرة ملزمة أعلى (240 ميكروغرام / سم 3) من النيتروسليلوز (200 ميكروغرام / سم 3) 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية وأي فقاعات الهواء المحبوس أو بين جل وغشاء لأن هذا منع أي تشويه للنطاقات البروتين أثناء عملية النقل. ملاحظة: لا تقليم الغشاء أو TRANSFإيه كومة لتتناسب مع حجم الجل الخاص بك وهذا سوف يسبب الاتصال المباشر بين القطب الموجب والسالب المداخن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تجميع صحيح مداخن نقل على الجهاز النشاف الجاف، حدد البرنامج الجهد المناسب (أي البرنامج 3: 20 V لمدة 7 دقائق) وتبدأ عملية النقل. ملاحظة: البروتينات أكبر من 150 كيلو دالتون تميل تهاجر ببطء أكثر، وربما تتطلب وقتا أطول من نقل 8-10 دقيقة. بالإضافة إلى ذلك، سوف الحضانة مسبقة من هلام في الإيثانول 20٪ لمدة 5-10 دقيقة تساعد أيضا على تحسين كفاءة نقل هذه البروتينات الكبيرة. مرة واحدة في برنامج نقل كاملة، سوف تغلق الجهاز تلقائيا الحالي. فمن الأفضل لإزالة الغشاء فورا والشروع في إجراءات حجب لضمان أفضل كشف عن البروتين وتجنب جفاف الغشاء. </li></ol> 4. الأشعة تحت الحمراء كشف عن البروتين الفلوري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كتلة الغشاء (ق) في ما لا يقل عن 0.8 مل / سم 2 من أوديسي حجب العازلة (لا تقم بإضافة توين 20) لمدة 1 ساعة أوبين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. ويمكن أيضا غشاء (ق) يكون قد تم حظره مع الحليب الجاف الخالي، ولكن هذا قد يسبب الخلفية أعلى وتتداخل مع الكشف عن البروتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الغشاء (ق) في الأجسام المضادة الأولية في التركيز المطلوب في أوديسي حظر مؤقت مع 0.1٪ توين 20 بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. للكشف عن اللونين، والتي هي تصور اثنين من مستضدات مختلفة على نفس وصمة عار، ويجب أن تستمد اثنين من الأجسام المضادة الأولية من مختلف الأنواع المضيفة، وأضاف في وقت واحد لغشاء (ق). ملاحظة: قبل احتضان الغشاء (ق) في الأجسام المضادة الأولية، وغشاء (ق) يمكن مقطوع الى قطع مختلفة من أجل تحقيق عن الأجسام المضادة متعددة (أي أكثر من 2) على نفس الغشاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل الغشاء (ق) 3X لمدة 10 دقيقة في TBS بالإضافة إلى 0.1٪ توين 20 مع الهز لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الغشاء (s) مع الأجسام المضادة الثانوية fluorescently المسمى في التخفيف من 1:20،000 للقناة 700 نانومتر و1:6،000-1:10،000 للقناة 800 نانومتر في Odysseذ حظر مؤقت مع 0.1٪ توين 20 لمدة 30-60 دقيقة (تفرخ غشاء (ق) لمدة أطول من 1 ساعة قد تزيد الخلفية). حماية الغشاء (ق) من الضوء. ملاحظة: في حاجة إلى الأجسام المضادة الثانوية التي يمكن جنيها من الأنواع المضيفة نفس كل واحد من الأجسام المضادة الأولية والمسمى مع fluorophores مختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل الغشاء (ق) 3X لمدة 10 دقيقة في TBS بالإضافة إلى 0.1٪ توين 20 مع الهز لطيف. حماية الغشاء (ق) من الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غشاء (ق) قد تكون جافة أو تخزينها في أي TBS أو برنامج تلفزيوني بدون توين 20 في 4 درجات مئوية حتى الممسوحة ضوئيا والمصورة مع نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء. سوف إشارة الفلورسنت تبقى مستقرة لعدة أشهر إذا محمية بشكل صحيح من الضوء. </li></ol>

<ol>
	<li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A.">Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal. Biochem. 112, 195-203 (1981).</li><li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera:+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure.">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 3116-3120 (1979).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NuPAGE Technical Guide. Life Technologies Corporation. IM-1001. 60, (2010).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Kubo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+incubation+of+solutions+of+proteins+containing+dodecyl+sulfate+on+the+cleavage+of+peptide+bonds+by+boiling.">Effect of incubation of solutions of proteins containing dodecyl sulfate on the cleavage of peptide bonds by boiling.</a> Anal. Biochem. 225, 351-353 (1995).</li><li>Moos, M., Nguyen, N. Y., Liu, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+high+yield+sequencing+of+proteins+electrophoretically+separated+and+transferred+to+an+inert+support.">Reproducible high yield sequencing of proteins electrophoretically separated and transferred to an inert support.</a> J. Biol. Chem. 263, 6005-6008 (1988).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iBlot+Dry+Blotting+System.">iBlot Dry Blotting System.</a> Life Technologies Corporation. 25-0911, 84 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+Blot+Analysis.">Western Blot Analysis.</a> LI-COR Biosciences. 988-12622, (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odyssey+Infrared+Imaging+System+Application+Software+Version+3.030.">Odyssey Infrared Imaging System Application Software Version 3.030.</a> LI-COR Biosciences. , (2007).</li><li>Hambaeus, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Milk+Composition.">Human Milk Composition.</a> Clin. Nutr. 54, 219-236 (1984).</li><li>DenHollander, N., Befus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+antigens+from+immunoblotting+membranes.">Loss of antigens from immunoblotting membranes.</a> J. Immunol. Methods. 122, 129-135 (1989).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

الخطوات الحاسمة في توليد عالية الجودة، والبقع الغربية الكمي وفقا لهذا البروتوكول هي التالية: 1) قياس تركيزات البروتين؛ 2) إعداد العينات؛ 3) منع الغشاء و؛ 4) ذات جودة وعيار الأجسام المضادة الأولية. دقة قياس تركيزات البروتين الكلي يم?...

<html> وقد تم تطوير هذه التقنية من النشاف الغربية الأولى بين عامي 1977 و 1979 من أجل خلق أفضل طريقة للكشف عن البروتينات باستخدام الأجسام المضادة 1-3. هذا الإجراء يستخدم الكهربي نقل البروتينات من الهلام إلى الغشاء من SDS-PAGE مع البروتينات الهدف تصور باستخدام الأجسام المضادة الثانوي والكشف عنها بواسطة تصوير الإشعاع الذاتي، وعلى ضوء الأشعة فوق البنفسجية، أو ناتج التفاعل البيروكسيديز 3. وبالتالي، لا تزال تستخدم على نطاق واسع نفس هذه المبادئ الأساسية في البروتوكولات لطخة غربية اليوم. ومع ذلك، هذه التقنية النشاف الغربية الكلاسيكية يفعل الحاضر العديد من العيوب، مثل أوقات الشدة المدى الكهربائي، دقة منخفضة وشرائح البروتين الاصطناعي، وقابلية للتحلل البروتين، وحساسية محدودة فضلا عن ضعف جودة البيانات 4. لذا، يصف هذا البروتوكول السلف وتحسينات كبيرة لإجراء طخة غربية القياسية التي يولد البيانات النوعية والكمية أكثر دقة. &quot;&gt; نظام Laemmli لفصل مجموعة واسعة من البروتينات باستخدام SDS-PAGE هو النظام الأكثر استخداما على نطاق واسع هلام لالنشاف الغربية 5. على الرغم من شعبية هذا النظام النشاف الغربية، ويمكن هذا الأسلوب يؤدي إلى تشويه الفرقة، وفقدان القرار، و نطاقات زائفة 4. هذا قد يكون نتيجة لنزع الأمين والألكلة من البروتينات نظرا لارتفاع درجة الحموضة (9.5) من هلام فصل، عودة التأكسد انخفاض السندات ثاني كبريتيد بسبب حالة الأكسدة متفاوتة من هلام، والانقسام من aspartyl-prolyl السندات الببتيد بسبب تسخين البروتين في Laemmli العازلة (درجة الحموضة 5.2) 4،6. نظام هلام مكرر تريس، التي تعمل في درجة الحموضة محايد (7.0)، ويوفر فوائد كبيرة على النظام Lamemmli. يحسن هذا النظام الاستقرار البروتين، ويقلل التعديلات البروتين، ويحافظ على البروتينات في ولاياتهم انخفاض، ويمنع aspartyl-prolyl الانقسام خلال الكهربائي، والأهم من ذلك، الكهربائي تشغيل الوقت هو 35 دقيقة 4،6،7. وبالإضافة إلى ذلك، رنظام هلام انه مكرر تريس تنتج أيضا العصابات أكثر وضوحا، وارتفاع القرار، والانفصال، وزيادة حساسية مما أدى إلى المزيد من البيانات الموثوقة 4. بالتزامن مع نظام هلام مكرر تريس، يستخدم النظام النشاف الجاف iBlot عالية القوة الميدانية والتيارات إلى الحد بشكل كبير من الوقت نقل البروتينات من الهلام على الأغشية خلال 7 دقائق 8. ويستند هذا النظام على طريقة نقل النشاف الجاف الذي يولد نقل أكثر كفاءة وموثوق بها من البروتينات 8. لمقارنة تفصيلية لفعالية نظام التحويل iBlot إلى أنظمة نقل التقليدية يرجى الرجوع إلى الموقع التالي: <a href="http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html">http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Application</a>s/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . فإنه يستخدم أنود والكاثود المكدس، والتي تتألف من مصفوفة هلام التي تحتوي على مخازن النقل المناسب، والتي تكون بمثابة خزانات أيون 8. أثناء عملية النقل، التحليل الكهربائي للماء يساعد على منع توليد الأكسجين من الأنود النحاس مما أدى إلى نقل بروتين أكثر اتساقا دون التسبب في تشويه الفرقة 8. وعلاوة على ذلك، فإن هذا النظام نقل أيضا يزيد من سرعة نقل عن طريق تقليل المسافة بين أقطاب 8. على الرغم من أن لمعان كيميائي هو الأسلوب الأكثر شيوعا والتقليدية للكشف عن البروتين لطخة غربية التحليلات، وهما لونا الأشعة تحت الحمراء كشف الفلورسنت يحسن إلى حد كبير حساسية، والجودة، ودقة البيانات لطخة غربية. يستخدم هذا الأسلوب الكشف بالأشعة تحت الحمراء ليزر الإثارة في اثنين من موجات الأمثل، 700 نانومترو 800 نانومتر، لتوليد صورة بيانات واضحة مع نسبة أكبر إشارة إلى الضوضاء وأعلى حساسية 9. وبالتالي، يمكن تصور اثنين من البروتينات المستهدفة في وقت واحد على نفس الغشاء باستخدام نانومتر 700 و 800 نانومتر القنوات كشف الفلورسنت. الأهم من ذلك، والنطاق الديناميكي الخطي مضان الأشعة تحت الحمراء يسمح للتحليل الكمي الدقيق للنطاقات البروتين سواء القوي والضعيف 9. علاوة على ذلك، يوفر هذا البروتوكول مزايا وتحسينات هائلة على تقنية النشاف الغربية الكلاسيكية من خلال خفض الكهربائي ومرات نقل هذه التجربة دون المساس فعالية هذه العمليات وذلك باستخدام الأشعة تحت الحمراء كشف عن البروتين الفلوري لإنتاج أكبر لطخة غربية البيانات النوعية والكمية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="624">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:297px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:204px;">Thermo Scientific/Pierce</td>
			<td style="width:123px;">23225</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">4x NuPAGE&#174; LDS Sample Buffer&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">10x NuPAGE&#174; Sample Reducing Agent&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0004</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">20x NuPAGE&#174; MES SDS Running Buffer</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0002</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">20x NuPAGE&#174; MOPS SDS Running Buffer</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0001</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NuPAGE&#174; Antioxidant</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0005</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:297px;">NuPAGE&#174; Novex&#174; 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10 well&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0335BOX</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:297px;">NuPAGE&#174; Novex&#174; 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15 well</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0336BOX</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">SeeBlue&#174; Plus2 Pre-Stained Standard&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>LC5925</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">XCell SureLock&#174; Mini-Cell&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>EI0001</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174; Transfer Stack, PVDF Regular</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB4010-01</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174;Transfer Stack, PVDF Mini</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB4010-02</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174; Transfer Stack, Nitrocellulose Regular</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB3010-01</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174;Transfer Stack, Nitrocellulose Mini</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB3010-02</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174; Gel Transfer Device&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB1001</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;-Actin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2228</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Phospho-BIM (S69)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Total BIM</td>
			<td>Epitomics</td>
			<td>1036-1</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4370</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Total ERK1/2</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9107</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Odyssey&#174; Blocking Buffer&#160;</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>927-40000&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-32211&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG&#160;</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-68020&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Western Incubation Box, Medium&#160;</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>929-97205&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Odyssey&#174; Classic Imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Odyssey&#174; Application Software V3.0.30</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the fastest western in town: a contemporary twist on the classic western blot analysis

لا تزال تستخدم تقنيات لطخة غربية التي أنشئت أصلا في أواخر 1970s بنشاط اليوم. ومع ذلك، وهذه الطريقة التقليدية للالنشاف الغربية لديها العديد من السلبيات التي تشمل دقة منخفضة الجودة، والعصابات زائفة، وانخفاض حساسية، وضعف النزاهة البروتين. التطورات الحديثة قد تحسنت بشكل كبير جوانب عديدة من بروتوكول لطخة غربية القياسية لإنتاج بيانات نوعية وكمية أعلى. نظام هلام مكرر تريس، بديلا لنظام Laemmli التقليدية، ويولد أفضل فصل البروتين والقرار، ويحافظ على سلامة البروتين، ويقلل الكهربائي لفترة 35 دقيقة التشغيل. وعلاوة على ذلك، فإن النظام النشاف الجاف iBlot، ويحسن بشكل كبير من فعالية وسرعة نقل البروتين إلى غشاء في 7 دقائق، والذي هو على النقيض من الأساليب نقل البروتين التقليدية التي غالبا ما تكون غير فعالة أكثر مع أوقات نقل طويلة. في تركيبة مع هذه التعديلات المبتكرة، البروتين دetection باستخدام نتائج التصوير بالأشعة تحت الحمراء الفلورسنت في ذات جودة أعلى وأكثر دقة وبيانات متسقة بالمقارنة مع تقنية النشاف الغربية القياسية من معان كيميائي. هذه التكنولوجيا يمكن الكشف عن مستضدات مختلفة في وقت واحد اثنين على نفس الغشاء من خلال الاستفادة من اللونين الأصباغ القريب من الأشعة تحت الحمراء التي تصور في قنوات مختلفة الفلورسنت. وعلاوة على ذلك، والخطي واسعة النطاق الديناميكي التصوير الفلورسنت يسمح لتقدير الدقيق للنطاقات على حد سواء القوي والضعيف البروتين. وهكذا، يصف هذا البروتوكول التحسينات الرئيسية لطريقة النشاف الغربية الكلاسيكية، والتي هذه التطورات إلى زيادة كبيرة في نوعية البيانات مع خفض كثيرا من الوقت أداء هذه التجربة.

اللونين مضان الأشعة تحت الحمراء بالكشف عن العصابات القوية والضعيفة على حد سواء على نفس الغشاء مع زيادة في الحساسية وإشارة إلى نسبة الضوضاء أعلى لإنتاج واضحة الصور لطخة غربية. ومن الأمثلة على النتائج النموذجية التي تم إنشاؤها بواسطة اللونين الكشف طخة غربية تصور في ك?...

Watch this Scientific Journal Video about The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis at JoVE.com

The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

هذا البروتوكول يستكشف أحدث التطورات في أداء تحليلات لطخة غربية. هذه التعديلات رواية توظف نظام هلام مكرر تريس مع 35 دقيقة الكهربائي تشغيل الوقت، جافة نظام نقل النشاف 7 دقائق، والأشعة تحت الحمراء كشف عن البروتين الفلوري والتصوير الذي يولد دقة أعلى، والجودة، والحساسية، وتحسين دقة البيانات الغربية.

أسرع الغربية في المدينة: لمسة عصرية على تحليل كلاسيكي غربي وصمة عار

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of ...

the-fastest-western-town-contemporary-twist-on-classic-western-blot

Research

JoVE Journal

Biology

26.9K Views.  University of California, San Francisco.  هذا البروتوكول يستكشف أحدث التطورات في أداء تحليلات لطخة غربية. هذه التعديلات رواية توظف نظام هلام مكرر تريس مع 35 دقيقة الكهربائي تشغيل الوقت، جافة نظام نقل النشاف 7 دقائق، والأشعة تحت الحمراء كشف عن البروتين الفلوري والتصوير الذي يولد دق?...

Video: The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the relative amount of the protein present in different samples, and analyze the results of co-immunoprecipitation experiments. In this method, a target protein is detected with a specific primary antibody in a given sample of tissue homogenate or extract. Protein separation according to molecular weight is achieved using denaturing SDS-PAGE. After transfer to a membrane, the target protein is probed with a specific primary antibody and detected by chemiluminescence.
Since its first description, the western-blotting technique has undergone several improvements, including pre-cast gels and user-friendly equipment. In our laboratory, we have chosen to use the commercially available NuPAGE electrophoresis system from Invitrogen. It is an innovative neutral pH, discontinuous SDS-PAGE, pre-cast mini-gel system. This system presents several advantages over the traditional Laemmli technique including: i) a longer shelf life of the pre-cast gels ranging from 8 months to 1 year; ii) a broad separation range of molecular weights from 1 to 400 kDa depending of the type of gel used; and iii) greater versatility (range of acrylamide percentage, the type of gel, and the ionic composition of the running buffer).
The procedure described in this video article utilizes the Bis-Tris discontinuous buffer system with 4-12% Bis-Tris gradient gels and MES running buffer, as an illustration of how to perform a western-blot using the Invitrogen NuPAGE electrophoresis system. In our laboratory, we have obtained good and reproducible results for various biochemical applications using this western-blotting method.

This technical article describes a standard western-blotting procedure using the commercially available NuPAGE electrophoresis Mini-Gel system from Invitrogen.

الغربية التنشيف باستخدام NuPage Invitrogen Novex مكرر تريس MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the ...

Surgical Induction of Endolymphatic Hydrops by Obliteration of the Endolymphatic Duct

Surgical induction of endolymphatic hydrops (ELH) in the guinea pig by obliteration and obstruction of the endolymphatic duct is a well-accepted animal model of the condition and an important correlate for human Meniere's disease. In 1965, Robert Kimura and Harold Schuknecht first described an intradural approach for obstruction of the endolymphatic duct (Kimura 1965). Although effective, this technique, which requires penetration of the brain's protective covering, incurred an undesirable level of morbidity and mortality in the animal subjects. Consequently, Andrews and Bohmer developed an extradural approach, which predictably produces fewer of the complications associated with central nervous system (CNS) penetration.(Andrews and Bohmer 1989) 
The extradural approach described here first requires a midline incision in the region of the occiput to expose the underlying muscular layer. We operate only on the right side. After appropriate retraction of the overlying tissue, a horizontal incision is made into the musculature of the right occiput to expose the right temporo-occipital suture line. The bone immediately inferio-lateral the suture line (Fig 1) is then drilled with an otologic drill until the sigmoid sinus becomes visible. Medial retraction of the sigmoid sinus reveals the operculum of the endolymphatic duct, which houses the endolymphatic sac. Drilling medial to the operculum into the area of the endolymphatic sac reveals the endolymphatic duct, which is then packed with bone wax to produce obstruction and ultimately ELH. 
In the following weeks, the animal will demonstrate the progressive, fluctuating hearing loss and histologic evidence of ELH.

This video shows how to surgically obstruct the guinea pig's endolymphatic duct to produce endolymphatic hydrops.

الجراحية تحريض موه اللمف الباطن عن طريق محو القناة اللمف الباطن

Surgical induction of endolymphatic hydrops (ELH) in the guinea pig by obliteration and obstruction of the endolymphatic duct is a well-accepted animal ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

الغربية التنشيف : إعداد نموذج لكشف

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

تحليل المركز دورة الخلية في خلايا الثدييات

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

التصوير والإعمار 3D من الهياكل الدماغية في الجنينية اسماك الزرد

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

التفريق بين الأطفال حديثي الولادة ماوس خلايا الجلد الجذعية المشتقة في مثل جرثومة خلايا<em&gt; في المختبر</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins within complex biological samples. Since then, western blotting methodology has become a common component of the molecular biologists experimental repertoire. A cursory search of PubMed using the term &#8220;western blot&#8221; suggests that in excess of two hundred and twenty thousand published manuscripts have made use of this technique by the year 2014. Importantly, the last ten years have seen technical imaging advances coupled with the development of sensitive fluorescent labels which have improved sensitivity and yielded even greater ranges of linear detection. The result is a now truly Quantifiable Fluorescence based Western Blot (QFWB) that allows biologists to carry out comparative expression analysis with greater sensitivity and accuracy than ever before. Many &#8220;optimized&#8221; western blotting methodologies exist and are utilized in different laboratories. These often prove difficult to implement due to the requirement of subtle but undocumented procedural amendments. This protocol provides a comprehensive description of an established and robust QFWB method, complete with troubleshooting strategies.

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

دليل لمودرن الكمية نيون الغربية التنشيف مع استراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be successful for many plant species. However, flax (Linum usitatissimum) transformation by floral-dip has not been reported. The goal of this protocol is to establish that Agrobacterium and the floral-dip method can be used to generate transgenic flax. We show that this technique is simple, inexpensive, efficient, and more importantly, gives a higher transformation rate than the current available methods of flax transformation.
In summary, inflorescences of flax were dipped in a solution of Agrobacterium carrying a binary vector plasmid (T-DNA fragment plus the Linum Insertion Sequence, LIS-1) for 1 - 2 min. The plants were laid flat on their side for 24 hr. Then, plants were maintained under normal growth conditions until the next treatment. The process of dipping was repeated 2 - 3 times, with approximately 10 - 14 day intervals between dipping. The T1 seeds were collected and germinated on soil. After approximately two weeks, treated progenies were tested by direct PCR; 2 - 3 leaves were used per plant plus the appropriate T-DNA primers. Positive transformants were selected and grown to maturity. The transformation rate was unexpectedly high, with 50 - 60% of the seeds from treated plants being positive transformants. This is a higher transformation rate than those reported for Arabidopsis thaliana and other plant species, using floral-dip transformation. It is also the highest, which has been reported so far, for flax transformation using other methods for transformation.

Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Here, we present a protocol to transform flax using Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip. This protocol is simple to perform and inexpensive, yet yields a higher transformation rate than the current available methods for flax transformation.

الأزهار وتراجع التحول من الكتان (<em&gt; LINUM usitatissimum</em&gt;) لتوليد المعدلة وراثيا السلالات مع معدل التحويل عالية

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

طريقة لتقييم الآثار المترتبة على مجموعة من موجات وشدة الأحمر / الأشعة تحت الحمراء القريبة العلاج بالضوء على الإجهاد التأكسدي<em&gt; في المختبر</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the sequential cleavage of Amyloid Precursor Protein (APP) by &#946; and &#947;-secretases. Despite the importance of A&#946; to AD pathology, the subcellular localization of these cleavages is not well established. Work in our laboratory and others implicate the endosomal/lysosomal system in APP processing after internalization from the cell surface. However, the intracellular trafficking of APP is relatively understudied.
While cell-surface proteins are amendable to many labeling techniques, there are no simple methods for following the trafficking of membrane proteins from the Golgi. To this end, we created APP constructs that were tagged with photo-activatable GFP (paGFP) at the C-terminus. After synthesis, paGFP has low basal fluorescence, but it can be stimulated with 413 nm light to produce a strong, stable green fluorescence. By using the Golgi marker Galactosyl transferase coupled to Cyan Fluorescent Protein (GalT-CFP) as a target, we are able to accurately photoactivate APP in the trans-Golgi network. Photo-activated APP-paGFP can then be followed as it traffics to downstream compartments identified with fluorescently tagged compartment marker proteins for the early endosome (Rab5), the late endosome (Rab9) and the lysosome (LAMP1). Furthermore, using inhibitors to APP processing including chloroquine or the &#947;-secretase inhibitor L685, 458, we are able to perform pulse-chase experiments to examine the processing of APP in single cells.
We find that a large fraction of APP moves rapidly to the lysosome without appearing at the cell surface, and is then cleared from the lysosome by secretase-like cleavages. This technique demonstrates the utility of paGFP for following the trafficking and processing of intracellular proteins from the Golgi to downstream compartments.

While the transport of cell surface proteins is relatively easily studied, visualizing the trafficking of intracellular proteins is much more difficult. Here, we use constructs incorporating photoactivatable GFP and demonstrate a method to accurately follow the amyloid precursor protein from the Golgi apparatus to down-stream compartments and follow its clearance.

تصوير الاتجار بين الخلايا من APP مع GFP Photoactivatable

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...