وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة ومؤسسة هيويت E. جورج الزمالة (CNN).

هلام الكهربائي الملاحظة الفنية : قبل بدء هذا الإجراء ، وعينات من البروتين الخاص بك جاهزة. خلال هذه الخطوة الأولى ، يتم فصل البروتينات في العينة وفقا لوزنها الجزيئي باستخدام تغيير طبيعة الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد (PAGE). نموذج NuPAGE LDS ® الاحتياطي محملة دوديسيل سلفات ليثيوم (LDS) يحتفظ البروتينية في حالة التشويه والتحريف بمجرد تسخين عينة البروتين على 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. يستخدم عامل قوي في تخفيف بالتزامن لإزالة هيكل الثانوي والجامعي (DTT ، لكسر السندات ثاني كبريتيد). بالإضافة إلى ذلك ، أصبحت مغطاة البروتينات في عينة LDS سالبة الشحنة وبالتالي التحرك من خلال شبكة من هلام الأكريلاميد نحو القطب موجبة الشحنة. يسمح هذا الفصل وفقا للوزن الجزيئي (كيلو دالتون تقاس ، كيلو دالتون). ويمكن العثور مفصلة خطوة بخطوة لإعداد البروتوكولات العينة وإجراء PAGE على موقع Invitrogen 2 ، أو في دليل تقني NuPAGE 3 نصائح تقنية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في NuPAGE Invitrogen مكرر تريس نظام discontinous العازلة ، والتنقل الكهربي للبروتينات ونطاق الفصل اللاحق للجيل يعتمد على عاملين اثنين : أ) تركيز acrylamid من هلام (مع تركيز أكبر الأكريلاميد يؤدي إلى تحسين دقة أقل الوزن الجزيئي البروتينات) والثاني) وايون زائدة من المنطقة العازلة على التوالي ، أو اجتماعات الأطراف زارة التربية والعلم. لاختيار التشكيلة المناسبة لنطاق الفصل الذي ترغب في تحقيقه ، تشير إلى التخطيط للهجرة جل 1. فإن سمك هلام وعدد الآبار تعتمد على حجم وكمية من العينات التي كنت تخطط لتحميل ، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند تحميل العينات في آبار الخاص للهلام ، ويتم حجز ما لا يقل عن مسار واحد للعلامة الوزن الجزيئي (أو سلم). هذه المعايير بروتين متاحة تجاريا من عدة شركات وعادة ما تتألف من مزيج من البروتينات ذات الأوزان الجزيئية ملطخة محددة ، وذلك لتشكيل فرق مرئية تسمح لك لمتابعة تقدم عملية الترحيل. اختيار مجموعة من الأوزان الجزيئية والتي تتوافق مع قرار الجل الخاص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحقيق نمط الهجرة لطيفة وحتى ونحن نوصي جميع الآبار التحميل من الجل الخاص مع حجم مماثل من عينة أو نموذج LDS 1X العازلة. </li></ol> نقل ملاحظة فنية : قبل الشروع في خطوة نقل ، نقل اعداد العازلة (1X مع الميثانول 10 ٪) وقبل بارد إلى 4 درجات مئوية في غرفة باردة. من أجل جعل الوصول إلى الكشف عن البروتينات الأجسام المضادة ، يتم نقلهم بواسطة electroblotting من الجل على غشاء النيتروسليلوز. ويستند ملزمة البروتين على التفاعلات مسعور ، فضلا عن التفاعلات بين تهمة الغشاء والبروتين. (ويمكن أيضا البولي فينيل فلوريد (PVDF) غشاء تستعمل كبديل. وفي هذه الحالة ، غشاء PVDF يجب أن يكون قبل الرطب في الميثانول 30 ثانية على الأقل قبل الاستخدام.) ويمكن الاطلاع على مفصلة خطوة بخطوة الإجراء بروتوكول نقل في اشارة 4 إذا كنت تستخدم بيو راد البسيطة العابرة لطخة خلية نقل الكهربي ، أو في الإشارات 2-3 إذا تم تجهيز المختبر الخاص مع XCell الثاني في Invitrogen ل™ لطخة وحدة نمطية. نتيجة لهذه العملية ، ويتعرض البروتينات على سطح طبقة رقيقة وعلى استعداد للكشف. يمكن التحقق من فعالية والتوحيد الشامل للنقل البروتين من الهلام إلى الغشاء بواسطة لتلطيخ الشقائقية عكسها غشاء صباغة. الشقائقية S تلطيخ الداخلي (اختياري) : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد نقل البروتينات ، مكان الغشاء في علبة الحضانة (البروتينات التي تواجه متابعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ما يكفي من تلطيخ الشقائقية S لتغطية الغشاء واحتضان ما لا يقل عن 30 ثانية مع الإثارة لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الغشاء بالماء المقطر حتى خلفية واضحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يزيل اللون الغشاء مع تشغيل الماء المقطر لمدة 2-3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الغشاء في محلول الحجب (أنظر أدناه). </li></ol> التقنية النصائح : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نوصي العلامات الغشاء الخاص مع قلم رصاص قبل نقل البروتين في النظام للدلالة على الجانب التي تعرض لها كل من البروتينات والتوجه من العينات الخاصة بك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن استخدام كلا الشقائقية S تلطيخ وعلامات لخفض الوزن الجزيئي الغشاء بعد لبحث نقل أجزاء مختلفة مع الأجسام المضادة الناتجة </li></ol> مناعي : ملاحظة فنية : يتم توفير هذا الإجراء مناعي كدليل فقط. قد تكون مطلوبة لتحسين كل نملةويمكن الاطلاع على معلومات محددة في معظم اوراق البيانات من الأجسام المضادة المتاحة تجاريا (مثل العمل التخفيف ، وفترة حضانة ، الخ) ؛ ibody. خلال هذه العملية الأخيرة ، وسوف يتم الكشف عن بروتين هدف معين باستخدام الأجسام المضادة ، وسوف تبدو وكأنها شريط على الفيلم. موقف الفرقة تعتمد على الوزن الجزيئي للبروتين المستهدف ، في حين أن كثافة الموجات يعتمد على مقدار من البروتين الحاضر الهدف. عادة ، يتم تحقيق ذلك بعد ثلاثة substeps : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حظر : لتجنب التفاعلات غير محددة من الجسم المضاد مع غشاء (وغطت مساحة تزيد على الغشاء بمحلول مخفف من بروتين عامة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقيق : تم الكشف عن بروتين معين الفائدة <a title="الابتدائية الأضداد" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Primary_antibody">الأساسي الأضداد</a> . بعد غسل جسم غير منضم الأولية بعيدا ، يتعرض الغشاء إلى الضد مختلفة مرتبطة مراسل <a title="انزيم" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Enzyme">الانزيم</a> ، <a title="الفجل البيروكسيداز" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Horseradish_peroxidase">البيروكسيداز الفجل</a> (HRP). ويوجه هذا الجسم المضاد الثانوي ضد جزء أنواع معينة من الأجسام المضادة الأولية (مثل جسم مضاد المضادة للأرنب الثانوية وربط أي جسم الأرانب مصدرها الأساسي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكشف : يتم استخدام عامل chemiluminescent باعتبارها الركيزة التي من شأنها أن luminesce عندما تتعرض للHRP على الضد الثانوية. هذا التفاعل ينتج التلألؤ في مكان وبما يتناسب مع كمية البروتين المصرية. ثم يتم الكشف على ضوء بواسطة الأفلام الفوتوغرافية. </li></ol> ويرد عامة خطوة بخطوة الإجراء أدناه. ويمكن الاطلاع على الإجراءات التفصيلية الأخرى في ECL بلس الغربية دليل الكشف عن التنشيف تعليمات الكواشف 5 أو أكثر في ورقة البيانات المصاحبة للأضداد متاحة تجاريا. فترة حضانة ، التخفيف الأضداد ، ومنع والحلول يغسل يجب أن تكون تجريبيا الأمثل لكل الأجسام المضادة. مناعي الداخلي : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كتلة الربط غير محددة من قبل تفرخ مع حجم ما يكفي من حل PBS الكازين 1 ٪ حجب لتغطية كامل الغشاء. مكان على الكرسي الهزاز على الأقل 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأساسي الخاص بك (المحددة لهذا البروتين من الفائدة). وينبغي أن تضعف الجسم المضاد الرئيسي في عرقلة الحل. بالنسبة لمعظم الأجسام المضادة ، ويتحقق الربط الكامل الحضانة بعد 1-2 ساعات في درجة حرارة الغرفة في إطار التحريض لطيف. بدلا من ذلك ، يمكن تنفيذ الخطوة الحضانة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية لزيادة اشارة الى نسبة الضوضاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحل (تجاهل أو الاحتفاظ في 4 درجات مئوية إلى -20 درجة مئوية للاستخدام المتكرر) وتغسل بسرعة الغشاء مرة واحدة. ثم 3X10 دقائق مع برنامج تلفزيوني ، 0.05 ٪ توين 20 (PBST) في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز قوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الغشاء مع الضد HRP - يقترن الثانوية المخفف في عرقلة الحل. اختيار الأضداد التي تعترف مفتش جزء من الأنواع حيث تم رفع الأجسام المضادة الأولية. يتم تنفيذ الحضانة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في إطار التحريض لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل حل بسرعة ، ويغسل الغشاء مرة واحدة. ثم 3X10 دقيقة مع PBST في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز قوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شروع في الكشف عن chemiluminescent وفقا لتعليمات الصانع. نستخدم ECL بلس الغربية الكواشف التنشيف من الرعاية الصحية GE (أنظر المرجع 5 لتعليمات محددة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الغشاء الخاص في التفاف ساران أو الحقيبة ومكان تصوير الإشعاع الذاتي داخل الكاسيت. تأكد من استنزاف أي السائل الزائد وإزالة جميع فقاعات الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعرض الفيلم الفوتوغرافي لغشاء في غرفة مظلمة. تبدأ الساعة 1 دقيقة ، والتعرض للضبط وفقا لشدة الإشارة المطلوبة. </li></ol> التقنية النصائح : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتحقق حجب غير محددة وملزمة بوضع الغشاء في محلول مخفف من البروتين. نستخدم عادة الكازين 1 ٪ ، ولكن <a title="ألبومين المصل البقري" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Bovine_serum_albumin">الأبقار مصل الزلال</a> (BSA ~ 2 ٪) أو منزوع الدسم الحليب الجاف (~ 5 ٪) يمكن استخدامها كبديل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن استخدام تريس مخزنة المالحة (TBS) في جميع أنحاء الداخلي بدلا من برنامج تلفزيوني. ونحن نوصي باستخدام TBS إذا كنت تخطط لتحقيق الغشاء الخاص مع الضد phosphospecific. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استعمال يتوهج في الظلام ملصق (على سبيل المثال ، في Stratagene Glogos ® II علامات Autorad) استغلالها في الجزء السفلي من شريط تصوير الإشعاع الذاتي سوف تساعدك على محاذاة فيلمك الخاص والأغشية خلال الخطوة التحليل. </li></ol> تحليل الآن بعد أن كنت قد عرضت الفيلم الخاص بك ، فسوف ندرك أنه من الناحية العملية ، وليس كل الغرب تكشف عن البروتين والفرقة واحد لطيفة. Additionaقد تظهر أيضا ل العصابات بسبب الربط غير محدد من الأجسام المضادة في المرحلتين الابتدائية والثانوية. ويمكن تخفيض هذه إشارة الخلفية عن طريق تحسين إجراءات مناعي. بالإضافة إلى ذلك ، سوف عنصر التحكم المناسب (على سبيل المثال ، خلايا untransfected ، سيرنا الخلايا المعالجة ، الخ) تكون مفيدة لتحديد خصوصية الضد الخاص والموقع الدقيق للبروتين الهدف على الغشاء. بعد وضع العلامات على الفيلم موقف العصابات الملطخة البروتين القياسية من الغشاء ، مؤامرة سجل كل من الوزن الجزيئي معايير البروتين (المحور الصادي) ضد الحركة النسبية المقابلة (محور س). الحركة النسبية (RF) هو مصطلح يستخدم لنسبة البروتين المسافة انتقلت من نقطة المنشأ (أعلى من هلام) نسبة إلى المسافة التي تتبع صبغ أو علامة منخفضة الوزن الجزيئي انتقلت (الجبهة هلام) . تحديد خط انحدار المنحنى القياسي في الحصول على قيم الميل والتقاطع ذ. ويقدر وزن جزيئي معروف (حجم) من البروتين تستهدفها وذلك باستخدام الترددات اللاسلكية وتعديل المعادلة التالية : سجل الوزن الجزيئي = (المنحدر) (التنقل أو بعلي من البروتين المستهدفة) + التقاطع y (أنظر المرجع 6 للحصول على تعليمات مفصلة). تؤخذ تقريبية مستوى التعبير عن طريق مقارنة شدة الموجات من البروتين لهذا الهدف من البروتين الهيكلي (على سبيل المثال ، أو تويولين أكتين) أو الجين المنتج التدبير المنزلي مثل GAPDH. هذا يجب أن يسمى &quot;السيطرة تحميل&quot; لن تتغير بين العينات وكشف باستخدام الأجسام المضادة المحددة الأولية. قد تكون صورة لمزيد من التحليل من قبل لتقييم كثافة النسبية لكمية البروتين وتلطيخ قياس النتائج من حيث الكثافة البصرية.

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+Migration+chart:+.">Gel Migration chart: .</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+western-blot+protocol+from+the+Invitrogen+website.">Complete western-blot protocol from the Invitrogen website.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NuPAGE+technical+guide.">NuPAGE technical guide.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instruction+Manual,+Mini+Trans-Blot+Cell.">Instruction Manual, Mini Trans-Blot Cell.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECL+Plus+Western+blotting+detection+reagents+instruction.">ECL Plus Western blotting detection reagents instruction.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+protein+molecular+weights+by+SDS+gel+electrophoresis,+GE+Healthcare+Website.">Estimation of protein molecular weights by SDS gel electrophoresis, GE Healthcare Website.</a> , .</li><li>Yeromin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+the+CRAC+channel+by+altered+ion+selectivity+in+a+mutant+of+Orai.">Molecular identification of the CRAC channel by altered ion selectivity in a mutant of Orai.</a> Nature. 443, 226-229 (2006).</li><li>Zhang, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Store-dependent+and+-independent+modes+regulating+CRAC+channel+activity+of+human+Orai1+and+Orai3.">Store-dependent and -independent modes regulating CRAC channel activity of human Orai1 and Orai3.</a> J. Biol. Chem. 283, 17662-17671 (2008).</li><li>Penna, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAC+channel+consists+of+a+tetramer+formed+by+Stim-induced+dimerization+of+Orai+dimers.">The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers.</a> Nature. , .</li></ol>

الإجراء المعروض هنا يستخدم الجل مكرر تريس مع MES تشغيل العازلة كمثال على تغيير طبيعة الصفحة باستخدام الكهربائي Invitrogen Novex NuPAGE النظام. بالإضافة إلى ذلك ، هذا النظام هلام مسبقة الصنع يسمح فصل البروتين تحت تغيير طبيعة أو عدم تغيير طبيعة الظروف ، وكذلك يستوعب مجموعة واسعة من الأوزان ا...

western blotting using the invitrogen nupage novex bis tris minigels

التنشيف الغربي (أو immunoblotting) هو إجراء المختبر القياسية السماح للمحققين للتحقق من التعبير عن بروتين ، وتحديد القيمة النسبية للحاضر البروتين في عينات مختلفة ، وتحليل نتائج التجارب المشتركة مناعي. في هذا الأسلوب ، يتم الكشف عن بروتين الهدف مع الأضداد ابتدائية معينة في عينة معينة من جناسة الأنسجة أو استخراج. ويتحقق وفقا لفصل البروتين الوزن الجزيئي باستخدام تغيير طبيعة SDS - PAGE. بعد نقلها إلى غشاء ، هو بحث البروتين الهدف مع الأضداد ابتدائية معينة والكشف عنها بواسطة لمعان كيميائي. منذ الوصف الأول ، وقد مرت هذه التقنية الغربي النشاف العديد من التحسينات ، بما في ذلك المواد الهلامية مسبقة الصنع ومعدات صديقة للمستخدم. في مختبرنا ، اخترنا لاستخدام الكهربائي NuPAGE المتاحة تجاريا من نظام Invitrogen. وهو الرقم الهيدروجيني المبتكرة محايدة ، متقطع SDS - PAGE ، مسبقة الصنع مصغرة هلام النظام. هذا النظام يقدم العديد من المزايا التقنية Laemmli التقليدية بما في ذلك : أ) حياة أطول الجرف من المواد الهلامية مسبقة الصنع تتراوح بين 8 أشهر إلى سنة 1 ؛ الثاني) فصل مجموعة واسعة من الأوزان الجزيئية 1-400 كيلو دالتون تبعا لنوع من الجل المستخدمة ؛ والثالث) وزيادة التنوع (مجموعة من نسبة مادة الأكريلاميد ، ونوع من الهلام ، وتركيبة الأيونية للالعازلة على التوالي). الإجراء الموضح في هذه المقالة الفيديو يستخدم نظام مكرر تريس العازلة المتقطعة مع 4-12 ٪ مكرر تريس التدرج المواد الهلامية وزارة التربية والعلم تشغيل العازلة ، وكمثال على كيفية تنفيذ وصمة عار للغرب باستخدام الكهربائي NuPAGE Invitrogen النظام. في المختبر لدينا ، لقد حصلنا على نتائج جيدة وقابلة للتكرار للتطبيقات الحيوية المختلفة باستخدام هذا الأسلوب الغربي النشاف.

Watch this Scientific Journal Video about Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels at JoVE.com

Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

هذا المقال يصف التقنية القياسية الغربي النشاف الإجراء باستخدام الكهربائي NuPAGE المتاحة تجاريا مصغرة جل النظام من Invitrogen.

الغربية التنشيف باستخدام NuPage Invitrogen Novex مكرر تريس MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the ...

western-blotting-using-the-invitrogen-nupage-novex-bis-tris-minigels

Research

JoVE Journal

Biology

37.1K Views.  University of California, Irvine (UCI). هذا المقال يصف التقنية القياسية الغربي النشاف الإجراء باستخدام الكهربائي NuPAGE المتاحة تجاريا مصغرة جل النظام من Invitrogen.

Video: Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Surgical Induction of Endolymphatic Hydrops by Obliteration of the Endolymphatic Duct

Surgical induction of endolymphatic hydrops (ELH) in the guinea pig by obliteration and obstruction of the endolymphatic duct is a well-accepted animal model of the condition and an important correlate for human Meniere's disease. In 1965, Robert Kimura and Harold Schuknecht first described an intradural approach for obstruction of the endolymphatic duct (Kimura 1965). Although effective, this technique, which requires penetration of the brain's protective covering, incurred an undesirable level of morbidity and mortality in the animal subjects. Consequently, Andrews and Bohmer developed an extradural approach, which predictably produces fewer of the complications associated with central nervous system (CNS) penetration.(Andrews and Bohmer 1989) 
The extradural approach described here first requires a midline incision in the region of the occiput to expose the underlying muscular layer. We operate only on the right side. After appropriate retraction of the overlying tissue, a horizontal incision is made into the musculature of the right occiput to expose the right temporo-occipital suture line. The bone immediately inferio-lateral the suture line (Fig 1) is then drilled with an otologic drill until the sigmoid sinus becomes visible. Medial retraction of the sigmoid sinus reveals the operculum of the endolymphatic duct, which houses the endolymphatic sac. Drilling medial to the operculum into the area of the endolymphatic sac reveals the endolymphatic duct, which is then packed with bone wax to produce obstruction and ultimately ELH. 
In the following weeks, the animal will demonstrate the progressive, fluctuating hearing loss and histologic evidence of ELH.

This video shows how to surgically obstruct the guinea pig's endolymphatic duct to produce endolymphatic hydrops.

الجراحية تحريض موه اللمف الباطن عن طريق محو القناة اللمف الباطن

Surgical induction of endolymphatic hydrops (ELH) in the guinea pig by obliteration and obstruction of the endolymphatic duct is a well-accepted animal ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

الغربية التنشيف : إعداد نموذج لكشف

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This technique quickly proved advantageous over its solution-phase predecessor in both time and labor. Improvements concerning the nature of solid support, the protecting groups employed and the coupling methods employed over the last five decades have only increased the usefulness of Merrifield's original system. Today, use of a Boc-based protection and base/nucleophile cleavable resin strategy or Fmoc-based protection and acidic cleavable resin strategy, pioneered by R.C. Sheppard, are most commonly used for the synthesis of peptides1.
Inspired by Merrifield's solid supported strategy, we have developed a Boc/tert-butyl solid-phase synthesis strategy for the assembly of functionalized bis-peptides2, which is described herein. The use of solid-phase synthesis compared to solution-phase methodology is not only advantageous in both time and labor as described by Merrifield1, but also allows greater ease in the synthesis of bis-peptide libraries. The synthesis that we demonstrate here incorporates a final cleavage stage that uses a two-step "safety catch" mechanism to release the functionalized bis-peptide from the resin by diketopiperazine formation.
Bis-peptides are rigid, spiro-ladder oligomers of bis-amino acids that are able to position functionality in a predictable and designable way, controlled by the type and stereochemistry of the monomeric units and the connectivity between each monomer. Each bis-amino acid is a stereochemically pure, cyclic scaffold that contains two amino acids (a carboxylic acid with an &alpha;-amine)3,4. Our laboratory is currently investigating the potential of functional bis-peptides across a wide variety of fields including catalysis, protein-protein interactions and nanomaterials.

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using &quot;Safety Catch&quot; Methodology

The efficient solid-phase peptide synthesis of a functionalized bis-peptide trimer utilizing a "safety catch" cleavage procedure from HMBA resin is described.

الصلبة التجميعي المرحلة من الببتيد البس Functionalized استخدام &quot;سلامة الصيد&quot; منهجية

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

باستخدام التصوير المقطعي عالي الدقة لتصور البنية الثلاثية وظيفة الأوعية الدموية النباتية

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

التصوير والإعمار 3D من الهياكل الدماغية في الجنينية اسماك الزرد

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

التفريق بين الأطفال حديثي الولادة ماوس خلايا الجلد الجذعية المشتقة في مثل جرثومة خلايا<em&gt; في المختبر</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black box&#34; because an experimentalist does not know if it has been performed successfully until the last of several steps. Moreover, the quality of western blot data is sometimes challenged due to a lack of effective quality control tools in place throughout the western blotting process. Here we describe the V3 western workflow, which applies stain-free technology to address the major concerns associated with the traditional western blot protocol. This workflow allows researchers: 1) to run a gel in about 20-30 min; 2) to visualize sample separation quality within 5 min after the gel run; 3) to transfer proteins in 3-10 min; 4) to verify transfer efficiency quantitatively; and most importantly 5) to validate changes in the level of the protein of interest using total protein loading control. This novel approach eliminates the need of stripping and reprobing the blot for housekeeping proteins such as &#946;-actin, &#946;-tubulin, GAPDH, etc. The V3 stain-free workflow makes the western blot process faster, transparent, more quantitative&#160;and reliable.

V3 workflow is a western blot procedure using stain-free gels. The stain-free technology allows researchers to visualize protein separation quality, to verify the transfer efficiency, and most importantly, to validate the change in the protein of interest using total protein quantification as a reliable loading control.

V3 سير العمل خالية من وصمة عار لمراقبة عملية ومريحة وموثوق بها مجموع البروتين تحميل في النشاف الغربية

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black ...

The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of Western blotting has several drawbacks that include low quality resolution, spurious bands, decreased sensitivity, and poor protein integrity. Recent advances have drastically improved numerous aspects of the standard Western blot protocol to produce higher qualitative and quantitative data. The Bis-Tris gel system, an alternative to the conventional Laemmli system, generates better protein separation and resolution, maintains protein integrity, and reduces electrophoresis to a 35 min run time. Moreover, the iBlot dry blotting system, dramatically improves the efficacy and speed of protein transfer to the membrane in 7 min, which is in contrast to the traditional protein transfer methods that are often more inefficient with lengthy transfer times. In combination with these highly innovative modifications, protein detection using infrared fluorescent imaging results in higher-quality, more accurate and consistent data compared to the standard Western blotting technique of chemiluminescence. This technology can simultaneously detect two different antigens on the same membrane by utilizing two-color near-infrared dyes that are visualized in different fluorescent channels. Furthermore, the linearity and broad dynamic range of fluorescent imaging allows for the precise quantification of both strong and weak protein bands. Thus, this protocol describes the key improvements to the classic Western blotting method, in which these advancements significantly increase the quality of data while greatly reducing the performance time of this experiment.

This protocol explores the latest advancements in performing Western blot analyses.&#160;These novel modifications employ a Bis-Tris gel system with a 35&#160;min electrophoresis run time, a 7&#160;min dry blotting transfer system, and infrared fluorescent protein detection and imaging that generates higher resolution, quality, sensitivity, and improved accuracy of Western data.

أسرع الغربية في المدينة: لمسة عصرية على تحليل كلاسيكي غربي وصمة عار

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins within complex biological samples. Since then, western blotting methodology has become a common component of the molecular biologists experimental repertoire. A cursory search of PubMed using the term &#8220;western blot&#8221; suggests that in excess of two hundred and twenty thousand published manuscripts have made use of this technique by the year 2014. Importantly, the last ten years have seen technical imaging advances coupled with the development of sensitive fluorescent labels which have improved sensitivity and yielded even greater ranges of linear detection. The result is a now truly Quantifiable Fluorescence based Western Blot (QFWB) that allows biologists to carry out comparative expression analysis with greater sensitivity and accuracy than ever before. Many &#8220;optimized&#8221; western blotting methodologies exist and are utilized in different laboratories. These often prove difficult to implement due to the requirement of subtle but undocumented procedural amendments. This protocol provides a comprehensive description of an established and robust QFWB method, complete with troubleshooting strategies.

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

دليل لمودرن الكمية نيون الغربية التنشيف مع استراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

طريقة لتقييم الآثار المترتبة على مجموعة من موجات وشدة الأحمر / الأشعة تحت الحمراء القريبة العلاج بالضوء على الإجهاد التأكسدي<em&gt; في المختبر</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...