السلطة الفلسطينية هي المستفيدة من منحة &quot;بيير دوران&quot; من كلية الطب من جامعة لافال. وأيد هذا العمل من قبل العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (MOP-CG095386) إلى RM وقد حصلت على المجزئ polysome من خلال المؤسسة الكندية للمنحة الابتكار (MOP-GF091050) لرويدة M حاصل على جائزة جديدة CIHR راتب محقق. نحن ممتنون لالدكاترة. E. Khandjian، I. Gallouzi، S. دي ماركو وA. Cammas للحصول على المشورة المفيدة.

بروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية التي وافق عليها مجلس المراجعة الأخلاقية لافال. 1. التحضير للثقافات الخليوي والتلاعب الدماغ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الثدييات وذبابة الفاكهة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو خلايا هيلا سرطان عنق الرحم والخلايا الجنينية شنايدر ذبابة الفاكهة على النحو الموصى به من قبل الثقافة مجموعة أميركية نوع. العمل مع الخلايا في مرور منخفضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الخلايا من أجل الوصول إلى 80٪ التقاء في يوم من التجربة. للحصول على أفضل النتائج، استخدم ~ 12 × 10 6 خلايا لكل حالة تجريبية. قبل اتخاذ مقتطفات لتحليل polysome، وتحفيز الترجمة عن طريق إضافة جديدة المتوسطة كاملة لمدة 90 دقيقة على الأقل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العزلة الدماغ: عزل العقول من الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين 9 و 16 يوما بعد الولادة. القتل الرحيم ينطوي CO 2 الاستنشاق بعد التخدير وخلع عنق الرحم. بعد التضحية، عزل الدماغ كله وإما مكان طر في -80 درجة مئوية أو نقل بشكل مباشر في برنامج تلفزيوني 1X الباردة للاستخدام الفوري. </li></ol> 2. إعداد التدرج الكثافة نظام التقطير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل نظام أنابيب بنسبة 0.1٪ SDS لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل نظام أنابيب مع الايثانول 70٪ لمدة 5 دقائق، ثم مع RNaseZAP الحل لمدة 5 دقائق قبل غسله بالماء DEPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضخ الهواء من أجل تجفيف نظام أنابيب من الجهاز. </li></ol> 3. إعداد التدرجات السكروز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل 15٪ و 55٪ في حلول السكروز 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.4، 1.25 ملي MgCl 2، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 1 ملي DTT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد الخطي 15-55٪ السكروز التدرج باستخدام نموذج اسكو 160 التدرج السابق، كما وصفها إرشادات الشركة المصنعة. ومع ذلك، فمن المهم للسيطرة جيدا تريس تحوي سرعة المضخة وذلك لتجنب خلق فقاعات أو اضطرابات في التدرجات. الحفاظ على التدرجات في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال ذلك الوقت عندما يتم تشغيل البرنامج صانع التدرج، تبريد نابذة فائقة السرعة إلى 4 درجات مئوية. </li></ol> 4. إعداد الخليوي والفأر الدماغ مقتطفات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مقتطفات الخليوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان لوحة (ق) على خلايا الجليد وغسل 3x أخرى مع الباردة PBS 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الحصاد (~ 12 × 10 6) في 1 مل العازلة تحلل (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك في درجة الحموضة 7.4، 1.25 ملي MgCl 2، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1 ملم DTT، 1٪ P40 Nonidet، 5 U / مل ريبونوكلياز المانع، على أن تستكمل مع أقراص كاملة مثبط البروتياز كوكتيل خالية من EDTA صغيرة)، نقلها إلى أنبوب إيبندورف، ومزيج جيد من قبل تمريرها 15X من خلال حقنة الأنسولين 1CC U100 28 G 1/2. السماح للالمحللة خلية يستريح على الجليد لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع بضع قطرات من المحللة الخلية على شريحة لتقييم تحلل الخلوية من خلال مراقبة في المجهر النقيض من المرحلة باستخدام الهدف 10X. وينبغي أن تكون مرئية فقط نوى وينبغي أن تكون هناك أغشية الخلايا مما يدل مرئية للتحلل الخلية. كعنصر تحكم، ومراقبةخلايا unlysed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توضيح المحللة الخلية بواسطة الطرد المركزي في 11،000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية، وإبقاء المحللة للذوبان التي تحتوي على polyribosomes. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ماوس الدماغ مقتطفات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التجانس الدماغ معزولة بالكامل (~ 500 ملغ) بنسبة 10 ضربات في الخالط Dounce الجليد الباردة مع 2 مل من تحلل العازلة وتوضيح جناسة بواسطة الطرد المركزي في 11،000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل طاف الناتجة على وسادة من 50٪ سكروز والمضي قدما الترسيب لمدة 2 ساعة على 200،000 x ج باستخدام الدوار نابذة فائقة السرعة TH-641 في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية شفافة تحتوي على polyribosomes في 1 مل من تحلل العازلة ومزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا. ترك بقية التعليق على الجليد لمدة 30 دقيقة قبل تحميل على التدرجات. </li></ol></li></ol> 5. تحميل مقتطفات على السكروز التدرجات وتنبيذ فائق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس تركيزمن الحمض النووي الريبي الحاضر في استخراج حشوية باستخدام مقياس الطيف. بعناية وببطء تحميل ~ 20 OD 260 وحدة للاستخراج على 15٪ إلى 55٪ سكروز التدرج. تأكد من أن هناك 2-3 ملم من المساحة المتوفرة على سطح الأنبوب لتجنب تفيض الأنابيب أثناء الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي التدرجات باستخدام الطرد المركزي فائقة لمدة 2 ساعة 30 دقيقة في XG 230،000 باستخدام الدوار نابذة فائقة السرعة TH-641 في 4 درجات مئوية. عندما تنتهي الطرد المركزي، وإزالة الأنابيب ووضعها على الجليد بعناية على عدم تعكير صفو التدرجات. </li></ol> 6. تجزئة من السيتوبلازم خلاصات لPolysomes التنميط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع التدرجات السكروز على النظام الآلي تجزئة الكثافة والمضي قدما في تجزئة الآلي وجمع الكسور (0.5 مل لكل منهما)، كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع كل جزء (~ 500 ميكرولتر) في أنابيب إيبندورف الفردية مع المراقبة المستمرة لالامتصاصية في 254 نانومتر. في parallش للعملية تجزئة التدرج، والوضع polyribosomal سيتم تحرير على ورقة الرسم البياني. بدلا من ذلك، استخدام وحدة الحصول على البيانات التي تعلق على الرسم البياني للمسجل أن يكون هناك اكتساب الإلكترونية من التشكيل الجانبي polysome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نهاية كل شوط، ونقل Eppendorfs جمعها على الثلج الجاف. في هذا الوقت، إما مخزن جمعت الكسور في -80 درجة مئوية أو يعجل مباشرة المجمعات البروتين RNA على النحو التالي. </li></ol> 7. استخراج البروتين وتحليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى كل جزء جمعها من التدرج السكروز، إضافة 2 مجلدات من الايثانول البارد 100٪ والسماح المجمعات الحمض النووي الريبي من البروتين يعجل في -20 درجة مئوية خلال الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي كل راسب الحمض النووي الريبي من البروتين في 11،000 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية ثم تغسل مع الايثانول 70٪. جاف و resuspend راسب في SDS-PAGE العازلة عينة قبل الشروع في طخة غربية باستخدام الأجسام المضادة المحددة (انظر الشكل 2). </li></ol> 8. استخراج الحمض النووي الريبي وAnalysis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعجل المجمعات الحمض النووي الريبي من البروتين كما في القسم 7.1. في resuspend كل راسب الحمض النووي الريبي من البروتين في المخزن المؤقت تحلل تحتوي على 0.1٪ SDS. هضم البروتين المكون للراسب مع 2 ملغ / مل K بروتين لمدة 30 دقيقة في 55 ° C حمام الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج الحمض النووي الريبي من مكونات راسب بإضافة 1 حجم &quot;الفينول: كلوروفورم&quot;، 2 مجلدات من الكلوروفورم، و 0.1 حجم 2 M NaOAc درجة الحموضة 4 و الطرد المركزي في 10،000 XG في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. راسب الحمض النووي الريبي من المرحلة المائية الناتجة من كل عينة بين عشية وضحاها في -20 درجة مئوية بإضافة 1 حجم الأيزوبروبانول و 0.2 ميكروغرام / ميكرولتر من الجليكوجين. تدور راسب لمدة 1 ساعة على 10،000 XG في 4 درجات مئوية. غسل بيليه RNA مع الايثانول البارد 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية RNA إلى حجم صغير من ريبونوكلياز المياه مجانا. تقييم كمية والجودة من الحمض النووي الريبي باستخدام معمل. </li></ol>

<ol>
	<li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+translational+control.">Molecular mechanisms of translational control.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (10), 827-835 (2004).</li><li>Jackson, R. J., Hellen, C. U. T., Pestova, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+eukaryotic+translation+initiation+and+principles+of+its+regulation.">The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (2), 113-127 (2010).</li><li>Fournier, M. -. J., Gareau, C., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotherapeutic+agent+bortezomib+induces+the+formation+of+stress+granules.">The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules.</a> Cancer Cell International. 10 (12), (2010).</li><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+stress+and+apoptosis.">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 6 (4), 318-327 (2005).</li><li>Mazroui, R., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trapping+of+messenger+RNA+by+Fragile+X+Mental+Retardation+protein+into+cytoplasmic+granules+induces+translation+repression.">Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression.</a> Human Molecular Genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).</li><li>Mazroui, R., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Boilard, N., Labelle, Y., Khandjian, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+Mental+Retardation+protein+determinants+required+for+its+association+with+polyribosomal+mRNPs.">Fragile X Mental Retardation protein determinants required for its association with polyribosomal mRNPs.</a> Human Molecular Genetics. 12 (23), 3087-3096 (2003).</li><li>Farny, N. G., Kedersha, N. L., Silver, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Metazoan+stress+granule+assembly+is+mediated+by+P-eIF2alpha-dependent+and+-independent+mechanisms.">a Metazoan stress granule assembly is mediated by P-eIF2alpha-dependent and -independent mechanisms.</a> RNA. 15 (10), 1814-1821 (2009).</li><li>Gareau, C., Houssin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+fragile+x+mental+retardation+protein+recruitment+and+dynamics+in+Drosophila+stress+granules.">Characterization of fragile x mental retardation protein recruitment and dynamics in Drosophila stress granules.</a> PLoS ONE. 8 (2), (2013).</li><li>Brackett, D. M., Qing, F., Amieux, P. S., Sellers, D. L., Horner, P. J., Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMR1+transcript+isoforms:+association+with+polyribosomes;+regional+and+developmental+expression+in+mouse+brain.">FMR1 transcript isoforms: association with polyribosomes; regional and developmental expression in mouse brain.</a> PLoS ONE. 8 (3), (2013).</li><li>Khandjian, E. W., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Davidovic, L., Mazroui, R., Bardoni, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+evidence+for+the+association+of+fragile+X+mental+retardation+protein+with+brain+polyribosomal+ribonucleoparticles.">Biochemical evidence for the association of fragile X mental retardation protein with brain polyribosomal ribonucleoparticles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (36), 13357-13362 (2004).</li><li>Erikson, A., Winblad, B., Wallace, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+of+gene+expression+in+the+human+brain.">Translational control of gene expression in the human brain.</a> Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 13 (3-4), 469-479 (1989).</li><li>Stephens, S. B., Nicchitta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V+In+vitro+and+tissue+culture+methods+for+analysis+of+translation+initiation+on+the+endoplasmic+reticulum.">V In vitro and tissue culture methods for analysis of translation initiation on the endoplasmic reticulum.</a> Methods in Enzymology. 431, 47-60 (2007).</li><li>Koritzinsky, M., Wouters, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+regulation+of+messenger+RNA+translation.">Hypoxia and regulation of messenger RNA translation.</a> Methods in Enzymology. 435, 247-273 (2007).</li><li>Khandjian, E. W., Corbin, F., Woerly, S., Rousseau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fragile+X+mental+retardation+protein+is+associated+with+ribosomes.">The fragile X mental retardation protein is associated with ribosomes.</a> Nature Genetics. 12, 91-93 (1996).</li><li>Sivan, G., Kedersha, N., Elroy-Stein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+slowdown+mediates+translational+arrest+during+cellular+division.">Ribosomal slowdown mediates translational arrest during cellular division.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (19), 6639-6646 (2007).</li><li>Thomas, J. D., Johannes, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mRNAs+that+continue+to+associate+with+polysomes+during+hypoxia.">Identification of mRNAs that continue to associate with polysomes during hypoxia.</a> RNA. 13, 1116-1131 (2007).</li><li>Kumaraswamy, S., Chinnaiyan, P., Shankavaram, U. T., L&#252;, X., Camphausen, K., Tofilon, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+gene+translation+profiles+reveal+tumor+type+and+cancer-specific+components.">Radiation-induced gene translation profiles reveal tumor type and cancer-specific components.</a> Cancer Research. 68 (10), 3819-3826 (2008).</li><li>Fournier, M. -. J., Coudert, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+the+mTORC1-eIF4E+Pathway+alters+Stress+Granules+Formation.">Inactivation of the mTORC1-eIF4E Pathway alters Stress Granules Formation.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (11), 2285-2301 (2013).</li><li>Sanchez, G., Dury, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+for+the+survival+motoneuron+protein+as+a+translational+regulator.">A novel function for the survival motoneuron protein as a translational regulator.</a> Human Molecular Genetics. 22 (4), 668-684 (2013).</li><li>B&#233;chade, C., Rostaing, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+distribution+of+survival+motor+neuron+(SMN)+protein:+possible+involvement+in+nucleocytoplasmic+and+dendritic+transport.">Subcellular distribution of survival motor neuron (SMN) protein: possible involvement in nucleocytoplasmic and dendritic transport.</a> The European Journal of Neuroscience. 11 (1), 293-304 (1999).</li><li>Goulet, I., Boisvenue, S., Mokas, S., Mazroui, R., C&#244;t&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDRD3,+a+novel+Tudor+domain-containing+protein,+localizes+to+cytoplasmic+stress+granules.">TDRD3, a novel Tudor domain-containing protein, localizes to cytoplasmic stress granules.</a> Human Molecular Genetics. 17 (19), 3055-3074 (2008).</li><li>Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+let-7a+miRNA+blocks+protein+production+on+actively+translating+polyribosomes.">Human let-7a miRNA blocks protein production on actively translating polyribosomes.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 13 (12), 1108-1114 (2006).</li><li>Genolet, R., Araud, T., Maillard, L., Jaquier-Gubler, P., Curran, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+approach+to+analyse+the+specific+impact+of+rapamycin+on+mRNA-ribosome+association.">An approach to analyse the specific impact of rapamycin on mRNA-ribosome association.</a> BMC Medical Genomics. 1 (33), (2008).</li><li>Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., M&#252;llner, E. W., Garcia-Sanz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Isolation+of+polysome-bound+mRNA+from+solid+tissues+amenable+for+RT-PCR+and+profiling+experiments.">a Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments.</a> RNA. 13 (3), 414-421 (2007).</li><li>Thoreen, C. C., Chantranupong, L., Keys, H. R., Wang, T., Gray, N. S., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unifying+model+for+mTORC1-mediated+regulation+of+mRNA+translation.">A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation.</a> Nature. 485 (7396), 109-113 (2012).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., Mcgeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li><li>Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+footprints+on+a+transcriptome+landscape.">Ribosomal footprints on a transcriptome landscape.</a> Genome Biology. 10 (4), (2009).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

التحليل الشخصي polysome على التدرجات السكروز يسمح قياس الترجمة بدء من خلال تحليل كثافة polysomes المعزولة من الخلايا أو الأنسجة 9،11-14. هذا الأسلوب هو أفضل (إن لم تكن فريدة من نوعها) النهج لقياس بدء الترجمة في الجسم الحي. يتم استخدامه لمراقبة حالة متعدية من الخلايا ن?...

الخلايا حقيقية النواة تواجه باستمرار مجموعة من ظروف الإجهاد الفسيولوجية والبيئية الضارة التي تتطلب استجابة الخلية على التكيف السريع. يتضمن الاستجابة للضغط النفسي خلية توازن دقيق بين معاداة البقاء والمؤيدة للبقاء العوامل التمثيل. يمكن تعطيل هذا التوازن له عواقب لا رجعة فيه الرائدة في تطوير أمراض الإنسان مثل السرطان وأمراض الاعصاب. خلال الخطوة الأولى من الاستجابة للضغط النفسي، وخلايا تفعيل مسارات مؤيدة للبقاء على قيد الحياة التي تنطوي على السيطرة منسقة من التغيرات في التعبير الجيني على مستوى الترجمة مرنا. ترجمة مرنا في حقيقيات النوى هو عملية معقدة تنطوي الخلوية التفاعلات بين العوامل منسقة ترجمة بدء (EIFS)، والبروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي محددة (RBDS)، وجزيئات الحمض النووي الريبي 1. وتنقسم الترجمة مرنا إلى ثلاث مراحل متميزة: بدء، واستطالة، وإنهاء الخدمة. على الرغم من جميع هذه المراحل الثلاث تخضع لreguآليات latory، آليات الرقابة متعدية تستهدف في الغالب مرحلة الشروع في الترجمة، والتي بالتالي تشكل خطوة تحد من معدل تخليق البروتين 2. بدء الترجمة هي عملية أمر غاية التي تبدأ مع تشكيل eIF2a.GTP.Met-الحمض الريبي النووي النقال التقيت معقدة الثلاثي واللاحقة ملزمة تجاه 40S الوحيدات الريبوسوم، مما يؤدي إلى تشكيل مجمع قبل البدء. والخطوة التالية هي تجنيد مجمع preinitiation لمرنا، والذي ينطوي على النشاط من العوامل الترجمة الشروع مثل eIF4F وeIF3. مجمع preinitiation 48S بالتالي شكلت يخضع لتغيرات متعلق بتكوين محددة تمكن هذه الآلات لبدء مسح المنطقة 5&#39;-غير مترجمة من مرنا حتى تعترف بدء كودون أغسطس ثم يتم الإفراج معظم العوامل الترجمة والشروع يتم تجنيد 60S مفارز لتشكيل الريبوسوم 80S معقدة المختصة للترجمة، ور الذي يبدأ تخليق البروتين نقطة (الشكل 1). أكثر من 80S صبغي جنسي أحادي يمكن ترجمة نفس مرنا في وقت إنتاج ما يسمى polysomes (أو polyribosomes). كثافة polysomes على مرنا يعكس بدء، واستطالة ومعدلات إنهاء وبالتالي هو مقياس لترجمتها من نسخة معينة. ومع ذلك، يتم استخدام البيانات الشخصية polysome أساسا لتقييم التغيرات في الترجمة مرنا في خطوة البدء. نحن هنا قد استخدمت مثبطات proteasome والترجمة كما بدء المانع. علاج الخلايا السرطانية مع هذا الدواء يؤدي الى الاستجابة للضغط النفسي تتميز تفعيل كيناز الإجهاد اسمه HRI التي phosphorylates عامل الترجمة الشروع eIF2a 3. الفسفرة من eIF2a هي واحدة من الأحداث الرئيسية التي تؤدي إلى تثبيط الترجمة الشروع في خلايا الثدييات 4.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="875">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td style="width:311px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">HeLa cervical cancer cells</td>
			<td style="width:311px;">American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC)</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Schneider Drosophila embryonic cells</td>
			<td style="width:311px;">American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC)</td>
			<td>CRL-1963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td style="width:311px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Culture medium and Supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Schneider&#8217;s Drosophila Medium</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>SO146-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">DMEM</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11995-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">FBS</td>
			<td>Fisher Scientist Scientist</td>
			<td>SH30396-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td style="width:311px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Sucrose solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">D-Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientist</td>
			<td>BP220-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Glycerol</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>49767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Blue Bromophenol</td>
			<td>Fisher Scientist</td>
			<td>B3925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td style="width:311px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Tris Hydrochloride</td>
			<td>Fisher Scientist</td>
			<td>BP153-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:279px;">MgCl2 </td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M2670-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">NaCl</td>
			<td>Tekniscience</td>
			<td>3624-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">DTT</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D 9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Nonidet P40 (Igepal CA-630 )</td>
			<td>MJS Biolynx</td>
			<td>19628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">SDS</td>
			<td>Tekniscience</td>
			<td>4095-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">RNase inhibitor (RnaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10777-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Antiproteases (complete, mini, EDTA free)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11,836,170,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td style="width:311px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Proteinase K</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM2542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Phenol: Chloroforme</td>
			<td>Fisher Scientist</td>
			<td style="width:119px;">BP1754I-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Chloroforme</td>
			<td style="width:311px;">Fisher Scientist</td>
			<td style="width:119px;">C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Glycogen</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10814-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:311px;">Acros organics</td>
			<td>327270010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td style="width:311px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">anti-FMRP antibody</td>
			<td colspan="2" style="width:429px;">Fournier et al., Cancer Cell International, 2010</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">anti-Ribosomal Protein L28 antibody</td>
			<td style="width:311px;">Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">SC-50362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td style="width:311px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Others</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Proteasome inhibitor : Bortezomib</td>
			<td style="width:311px;">LC Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">B-1408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">DEPC (Diethylpyrocarbonate)</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5758-25ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">RNaseZAP Solution</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td style="width:311px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Materials</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">T25 cell culture flask</td>
			<td style="width:311px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">1cc U100 Insulin Syringe 28 G1/2</td>
			<td>Fisher Scientist</td>
			<td>148291B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Tube ultra-centrifugation, PA, 12ml</td>
			<td>Fisher Scientist</td>
			<td>FSSP9763205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Isco Model 160 gradient former</td>
			<td style="width:311px;">Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultracentrifuge Sorvall OTD Combi</td>
			<td style="width:311px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Thermo Scientific Sorvall Rotor TH-641</td>
			<td style="width:311px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:119px;">54295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Automated Density Fractionation System</td>
			<td style="width:311px;">Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA</td>
			<td style="width:119px;">67-9000-177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Isco UA-6 UV-vis detector</td>
			<td style="width:311px;">Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td style="width:311px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ultracentrifuge C 5415</td>
			<td style="width:311px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Optical Microscope</td>
			<td style="width:311px;">Olympus CK2</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling

مراقبة دقيقة من ترجمة مرنا أمر أساسي لتوازن الخلايا حقيقية النواة، وبخاصة في الاستجابة للإجهاد الفسيولوجية والمرضية. تعديلات من هذا البرنامج يمكن أن يؤدي إلى نمو الخلايا التالفة، وهي السمة المميزة لتطور مرض السرطان، أو لموت الخلايا المبكرة مثل ينظر في الأمراض العصبية. لقد تم الحصول على معظم ما هو معروف بشأن الأساس الجزيئي للسيطرة متعدية من تحليل polysome باستخدام التدرج نظام التجزئة الكثافة. تعتمد هذه التقنية على تنبيذ فائق مقتطفات حشوية على الانحدار الخطي السكروز. بمجرد الانتهاء من زيادة ونقصان، ونظام يسمح تجزئة وتقدير من مناطق طرد الموافق مختلفة ترجمة ريبوسوم السكان، مما أدى إلى لمحة polysome. التغييرات في التشكيل الجانبي polysome تدل على تغييرات أو عيوب في الترجمة بدء التي تحدث كاستجابة لأنواع مختلفة من الإجهاد. كما يسمح هذا الأسلوب لتقييم عشر(ه) من دور بروتينات معينة على الترجمة البدء، وقياس النشاط متعدية من mRNAs ومحددة. نحن هنا وصف بروتوكول لدينا لأداء الشخصية polysome من أجل تقييم بدء ترجمة حقيقية النواة الخلايا والأنسجة في ظل ظروف النمو إما طبيعية أو الإجهاد.

كما سبق ذكره، polysome الشخصي يسمح للتحليل التغيرات الترجمة الشروع في ظل ظروف الإجهاد. الشكل 1 نسخة مبسطة من بدء الترجمة التي كما هو موضح سابقا هي عملية متعددة الخطوات التي تنطوي على تجميع أمر من المجمعات بدء الترجمة. في ظل ظروف النمو الطبيعي، يتم تحويل المجمعات ...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling at JoVE.com

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

هنا، نحن تصف طريقة لتحليل التغيرات في الشروع في ترجمة مرنا من خلايا حقيقية النواة في الاستجابة لنؤكد الظروف. ويستند هذا الأسلوب على سرعة الفصل في التدرجات السكروز من ترجمة ريبوسوم من ريبوسوم غير ترجمة.

تحليل ترجمة بدء أثناء حالة الإجهاد التي كتبها Polysome التنميط

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

analysis-translation-initiation-during-stress-conditions-polysome

Research

JoVE Journal

Biology

18.2K Views.  Laval University.  هنا، نحن تصف طريقة لتحليل التغيرات في الشروع في ترجمة مرنا من خلايا حقيقية النواة في الاستجابة لنؤكد الظروف. ويستند هذا الأسلوب على سرعة الفصل في التدرجات السكروز من ترجمة ريبوسوم من ريبوسوم غير ترجمة. 

Video: Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Monitoring Plant Hormones During Stress Responses

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. Among the most severe stresses are insect herbivory, pathogen infection, and drought stress. For each of these stresses a specific set of hormones and/or combinations thereof are known to fine-tune the responses, thereby ensuring the plant's survival. The major hormones involved in the regulation of these responses are jasmonic acid (JA), salicylic acid (SA), and abscisic acid (ABA). To better understand the role of individual hormones as well as their potential interaction during these responses it is necessary to monitor changes in their abundance in a temporal as well as in a spatial fashion. For the easy, sensitive, and reproducible quantification of these and other signaling compounds we developed a method based on vapor phase extraction and gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) analysis (1, 2, 3, 4). After extracting these compounds from the plant tissue by acidic aqueous 1-propanol mixed with dichloromethane the carboxylic acid-containing compounds are methylated, volatilized under heat, and collected on a polymeric absorbent. After elution into a sample vial the analytes are separated by gas chromatography and detected by chemical ionization mass spectrometry. The use of appropriate internal standards then allows for the simple quantification by relating the peak areas of analyte and internal standard.

A simple method is provided that allows for the rapid extraction and analysis of multiple plant hormones from small tissue samples. The procedure uses vapor phase extraction as the solemn purification step. Samples are analyzed by GC/MS with chemical ionization that produces mainly (M+1)+ ions.

الهرمونات النباتية خلال رصد استجابات التوتر

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. ...

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS)

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease mechanisms and may elucidate new markers to substratify disease with different clinical features and better understand pathogenesis. We have developed a highly quantitative method called Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS) for profiling patient sera antibody responses to autoantigens and pathogen antigens associated with infection. Unlike ELISAs, the highly sensitive LIPS is easily implemented to survey humoral serological response profiles to different antigens in a universal format and produces dynamic antibody titer ranges up to 6 log10 for some antigens. In these studies, quantitative profiling by LIPS of patient humoral responses against panels of antigens or even the entire proteome of some pathogens (i.e. HIV), is typically more informative than testing a single antigen by ELISA. In addition, LIPS also eliminates time and effort needed to produce highly purified antigens as well as the labor-intensive assay optimization steps needed for standard ELISAs. Here we provide a detailed protocol describing the technical aspects of performing LIPS assays for readily profiling antibody responses to single or multiple antigens.

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems LIPS

The technical aspects of performing LIPS (Luciferase Immunoprecipitation Systems) are described. The overall approach involves expressing chimeric genes encoding antigens fused to Renilla luciferase (Ruc) in mammalian cells. Crude Ruc-antigen extracts are then prepared and, without purification, employed in immunoprecipitation assays to quantify antibodies.

التنميط الضد من قبل أنظمة مناعي Luciferase (الشفاه)

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

تحليل الاكسدة في الزرد الأجنة

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

التنميط الفردية الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من خلال الكمي RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

Polysome تجزئة وتحليل الثدييات Translatomes على مقياس الجينوم على نطاق

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown to allow to selective translation of specific mRNAs, which typically encode for proteins required for a particular stress response. Identification of these mRNAs, as well as the characterization of regulatory mechanisms responsible for selective translation has been at the forefront of molecular biology for some time. Polysome profiling is a cornerstone method in these studies. The goal of polysome profiling is to capture mRNA translation by immobilizing actively translating ribosomes on different transcripts and separate the resulting polyribosomes by ultracentrifugation on a sucrose gradient, thus allowing for a distinction between highly translated transcripts and poorly translated ones. These can then be further characterized by traditional biochemical and molecular biology methods. Importantly, combining polysome profiling with high throughput genomic approaches allows for a large scale analysis of translational regulation.

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

تقييم الانتقائية مرنا الترجمة في خلايا الثدييات من قبل Polysome التنميط

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

برازي تحليل جلايكورتيكود: رصد الغدة الكظرية غير الغازية في الخيليات

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

طريقة سهلة لمحطة Polysome التنميط

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents in the treatment of several diseases. The development of new, innovative strategies for miRNA/siRNA therapy is based on an extensive knowledge of the underlying mechanisms. Recent data suggest that small RNAs are exchanged between cells in a gap junction-dependent manner, thereby inducing gene regulatory effects in the recipient cell. Molecular biological techniques and flow cytometric analysis are commonly used to study the intercellular exchange of miRNA. However, these methods do not provide high temporal resolution, which is necessary when studying the gap junctional flux of molecules. Therefore, to investigate the impact of miRNA/siRNA as intercellular signaling molecules, novel tools are needed that will allow for the analysis of these small RNAs at the cellular level. The present protocol describes the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) microscopy to elucidating the gap junction-dependent exchange of miRNA molecules between cardiac cells. Importantly, this straightforward and non-invasive live-cell imaging approach allows for the visualization and quantification of the gap junctional shuttling of fluorescently labeled small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution. The data obtained by 3D-FRAP confirm a novel pathway of intercellular gene regulation, where small RNAs act as signaling molecules within the intercellular network.

Here, we describe the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) for the analysis of the gap junction-dependent shuttling of miRNA. In contrast to commonly applied methods, 3D-FRAP allows for the quantification of the intercellular transfer of small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution.

تحليل الفجوة تعتمد على تقاطع نقل ميرنا مع المجهر 3D فراب

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

في فيترو تحليل E3 يوبيكيتين ليجاز وظيفة

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...