الكتاب أود أن أنوه لجون Woolford الأساس الأولي لهذا الأسلوب ، يتم اعتماد TGK المعاهد الوطنية للصحة وGM057483 AI076245 ومعتمد من قبل لجان المقاومة الشعبية GM77073.

1. إعداد التدرجات السكروز 7-47 ٪ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد التدرجات السكروز قبل يوم واحد للسماح للاستخدام تدرجات لتصبح مستمرة. جعل العقيمة 7 ٪ و 47 ٪ سكروز الحلول التي تحتوي على 50mM NH 4 CL ، 50mM 7.0 درجة الحموضة تريس ، وخلات MgCl 12mM (2) ومخزن في 4 درجات مئوية 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لخليط من التدرجات 6 7 ٪ و 47 ٪ سكروز الأسهم حلول لجعل 48 مل من كل من تركيز السكروز التالية. إضافة DTT (1M الأسهم) إلى كل حل السكروز إلى التركيز النهائي لل1MM. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> التركيز النهائي </td><td> 7 ٪ سكروز </td><td> 47 ٪ سكروز </td></tr><tr><td> 7 ٪ </td><td> 48 مل </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 17 ٪ </td><td> 36 مل </td><td> 12 مل </td></tr><tr><td> 27 ٪ </td><td> 24 مل </td><td> 24 مل </td></tr><tr><td> 37 ٪ </td><td> 12 مل </td><td> 36 مل </td></tr><tr><td> 47 ٪ </td><td> 0 </td><td> 48 مل </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل صب التدرجات ، نعلق ماصة باستور لحقنة 20 مل من خلال تأمين وختم مع Parafilm أو استخدام إبر طويلة. إضافة 7 مل من السكروز بنسبة 7 ٪ إلى أسفل (أ) 1 × 3.5 &quot;polyallomer أنبوب نابذة فائقة السرعة. التالي إضافة 7 مل من محلول السكروز 17 ٪ في إطار حل 7 ٪ عن طريق وضع غيض ماصة باستور بالقرب من الجزء السفلي من أنبوب وpipetting بسرعة لا تزيد على 0.3 مل / ثانية. كرر مع 7 مل من كل من 27 ٪ ، 37 ٪ وحلول السكروز 47 ٪. يجب مراقبة خطوط واضحة بين الطبقات ، مشيرا إلى أن الحد الأدنى من الخلط حدث. مخزن التدرجات في 4 درجات مئوية خلال الليل مع الزجاجات والدوارات والأنابيب التي سيتم استخدامها لجني العينات. </li></ol> 2. إعداد خلاصة الخميرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو 125 مل من ثقافة الخميرة إلى OD 600 من 0،8-1،0. إضافة إلى الثقافة سيكلوهيكسيميد إلى تركيز النهائي من 100 ميكروغرام / مل ويستمر اهتزاز عند 30 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفي الوقت نفسه ، وإعداد العازلة تحلل تحتوي على 80 ميكروغرام / مل سيكلوهيكسيميد ، 200 الهيبارين ميكروغرام / مل ، DEPC 0.2 ٪ ، و 10 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5 ، 0.1M كلوريد الصوديوم ، 30mM MgCl 2. ابقاء كل شيء على الجليد من هذه النقطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل ثقافة في زجاجة مل 250 جهاز طرد مركزي وملء مع الثلج. الطرد المركزي في 8000 XG (7250 دورة في الدقيقة في الدوار SLA - 1500) لمدة 5 دقائق على 4 درجات مئوية. بيليه يغسل مرة واحدة مع 10 مل من الجليد العازلة تحلل الباردة ونقل أنابيب البولي بروبلين إلى 15 مل. الطرد المركزي في 5900 XG (~ 6000 دورة في الدقيقة في جيش لبنان الجنوبي ، 600TC الدوار) لمدة 3 دقائق على 4 درجات مئوية. Resuspend الكرية في 0.5 مل من نقل تحلل ، عازلة لأنبوب 1.5mL وإضافة 0.5 مل من ، خبز المبردة الخرز الزجاجي حمض غسلها. دوامة الخلايا لفترات four 30 ثانية ، والتبريد الأنبوب على الجليد لمدة 30 ثانية بين كل فاصل زمني. إضافة آخر مل 0.5 من تحلل عازلة داخل الأنبوب مل 1.5. الطرد المركزي في السرعة القصوى في microcentrifuge (14000 دورة في الدقيقة في microcentrifuge 5417R إيبندورف) لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. طاف لنقل جديد 1.5 مل أنبوب microcentrifuge. إزالة 10 ميكرولتر لأنبوب منفصل لتحديد 260 / 280 OD OD نسبة (انظر الخطوة 3.1 أدناه). مقتطفات المحل في -80 درجة مئوية. </li></ol> 3. إعداد مقتطفات من خلايا الثدييات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لخلايا ملتصقة ، وتنمو في طبق بقطر 100 ملم لالتقاء ~ 70 ٪. سوف تحتاج طبق واحد لكل 100 ملم التدرج مل 11 (العائد النموذجية ~ 20 OD 260 وحدة). مقياس كمية خطيا لأحجام التدرج أكبر أو أصغر. لغير ملتصقة الخلايا ، وهناك حاجة إلى ما يقرب من 1 × 10 7 خلايا التدرج في 11 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل تحلل ، إضافة إلى سيكلوهيكسيميد 100 ميكروغرام / مل. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. نقل صفائح الجليد الى الخلايا وشطف مرتين في الجليد الباردة برنامج تلفزيوني. يجب أن تتم جميع الخطوات المستقبلية في الخروج 0-4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة جميع آثار PBS بواسطة الطموح (لوحات استنزاف على سرير من الثلج الزاوية) وإضافة 1 مل تحلل العازلة ، كشط ونقل مبردة إلى ما قبل 1.5 مل أنبوب. وسوف تحلل مكونات عازلة تحتاج إلى أن يكون الأمثل لنوع من الخلايا وظروف النمو. ومن شأن انطلاق جيدة العازلة هو 20 ملي HEPES - كوه ، ودرجة الحموضة 7.4 ، 15 ملم MgCl 2 ، 200 ملي بوكل ، 1 ٪ تريتون X - 100 (V / V) ، و 100 ميكروغرام / مل سيكلوهيكسيميد ، 2 مم DTT ، و 1 ملغم / مل الهيبارين. المتغيرات الرئيسية هي تركيزات المغنيسيوم وكلوريد البوتاسيوم وكذلك إدراج أو استبعاد غير الأيونية المنظفات لتحسين استخراج هيكل الخلية أو الغشاء polysomes ملزمة. ليز الخلايا التي تمر عبر قياس 27 إبرة حقنة مرتين أو السكتات الدماغية 50-10 من التجانس dounce باستخدام نوع B مدقة. ينبغي أن تكون حقنة أو الخالط قبل المبردة قبل الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور 14000 XG لمدة 5 دقائق في microcentrifuge مبردة. نقل جديدة لlysate التدرج السكروز (للخلايا الثدييات يتم هذا في المخزن تحلل تفتقر تريتون X - 100 ولكن على خلاف ذلك الهيبارين كما هو موضح في 1.2 و 1.3) أو وميض التجميد في النيتروجين السائل للاستخدام في وقت لاحق. </li></ol&gt; 4. الطرد المركزي من التدرجات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أذاب lysates polyribosome على الجليد. تحديد تركيز الحمض النووي في lysate بإضافة 10 عينة محفوظة ميكرولتر إلى 1 مل من الماء وقراءة 260 / 280 OD OD النسبة مع معمل. العائد نموذجية من ثقافة الخميرة نمت كما هو موضح هو 50 وحدة التطوير التنظيمي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة توضع مع طرف ضد جدار الانبوب بالقرب من سطح التدرج ، طبقة بلطف 25 OD 260 وحدات من lysate على أعلى من التدرج. ليتم تحميلها عادة التدرج مل 500 35 ميكرولتر من lysate. ويمكن استخدام العازلة تحلل لضمان يتم تحميل كافة التدرجات مع حجم مساو. انخفاض كميات من المواد العائد أفضل قرار. باستخدام الملقط ، وانخفاض بعناية التدرجات في دلاء من الدوار الدلو المتأرجح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي التدرجات في XG 100000 (23000 دورة في الدقيقة في الدوار Surespin 630) لمدة 4 ساعة على 4 درجات مئوية. يمكن تكييفها لهذا البروتوكول التدرجات حجم أصغر. </li></ol> 5. جمع البيانات والكسور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حوالي 30 دقيقة قبل الانتهاء من زيادة ونقصان 4 ساعة إرفاق الإبرة إلى أنبوب ثاقبة الموديل 184. نعلق القلم لنموذج ISCO الانترنت UA - 5 امتصاص / مراقب الإسفار. السلطة على رصد الامتصاصية للسماح ليتم التوصل إلى خط مستقر قبل تحليل العينات. ويمكن بسهولة الحصول الإلكترونية من ملف polysome يمكن الحصول عليها عن طريق إرفاق الحصول على البيانات DI - 148U الوحدة (DATAQ صكوك) إلى مسجل التخطيط. ويمكن عندئذ أن تكون مواصفات التي تم جمعها في الوقت الحقيقي ، وحفظها للشرح في وقت لاحق باستخدام برنامج WinDaq المرافق له. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شغل مضخة المحاقن مع 50mL استخدام Fluorinert التدفق العكسي ، ووضع السريع. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء الحاضر. بتوصيل خرطوم من الحقنة إلى الأنبوب ثاقبة وبدوره لفترة وجيزة على تدفق Fluorinert في 3 مل / دقيقة في اتجاه واضح إلى الأمام لخرطوم من أي فقاعات هواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دورق مكان النفايات أو سلسلة من الأنابيب إذا جمع الكسور تحت خرطوم في نهاية الخلية التدفق لجمع عينة الجريان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية أنابيب أجهزة الطرد المركزي التي تحتوي على التدرج polyallomer السكروز من الدوار بالطرد المركزي ووضعها على الجليد (ما قبل تشكل الآبار في الجليد مع أنبوب فارغ لتجنب التدرجات مزعجة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مقتطفات من تحليل الخلية ، وضع أنبوب التدرج ثاقبة على الأنبوب. ربط الجزء العلوي من الأنبوب إلى منفذ وآمنة. رفع مرحلة القاع في أنبوب الطرد المركزي بحيث إبرة يثقب قاع الأنبوب. مرة واحدة الإبرة ويبرز من خلال الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي ، يبدأ تدفق Fluorinert في الاتجاه إلى الأمام في 6mL/min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة في Fluorinert بدأت تتدفق على أنبوب ، ورصد حركة الإبرة على رصد الامتصاصية على الانترنت. الإبرة مرة واحدة تبدأ في التحرك ، بدوره على حركة التخطيط لإعداد سرعة 60. سيتم رصد تسجيل 254 OD بدءا من المواد حرة تليها 40S الريباسي الوحيدات ، والكشف المستمر من خلال مجمعات لpolyribosome. إذا كنت جمع الكسور أو تحليل الحمض النووي الريبي للبروتين ، وتؤخذ عادة كسور دقيقة 0.2 (1 مل). لتحليل الحمض النووي الريبي ، ينبغي جمع الكسور في أنابيب تحتوي على مباشرة Trizol (Invitrogen) ، الفينول أو K SDS / بروتين ، اعتمادا على الأسلوب المفضل لاستخراج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تم الوصول إلى نهاية ملف polyribosome ، إيقاف تدفق Fluorinert إلى أنبوب الطرد المركزي وتوقف حركة الرسم البياني للالامتصاصية / رصد مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التراجع عن Fluorinert من أنبوب الطرد المركزي في حقنة قبل بداية تدفق في الاتجاه المعاكس بمعدل سريع مع التأكد من عدم استخلاص السكروز من أنبوب داخل المحقنة. فك أنبوب الطرد المركزي من أنبوب ثاقبة ، وانخفاض الإبرة ، وإزالة الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من خلال 5،5 5،8 لكل التدرج السكروز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تم تحليل جميع التدرجات السكروز ، والتراجع عن Fluorinert من خرطوم مرة أخرى إلى المحقنة. إزالة كل جزء من fractionator (ثاقبة وأنبوب تدفق الخلية) بما في ذلك خرطوم النفايات الموجود في أعلى وشطف جيدا مع الماء. </li></ol> 6. ممثل النتائج <img src="/files/ftp_upload/1948/1948fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. تتبع ممثل الريبوسوم محضرة من مستخلص الخميرة BY4741 سلالة (حصيرة a his3 Δ Δ 0 1 leu2 met15 Δ Δ ura3 0 0) في وجود سيكلوهيكسيميد. كان استخراج الريباسي مجزأة الاستفادة من التدرج السكروز 7 47 ٪ ، وتحليلها باستخدام جهاز ضخ حقنة موصولة إلى كاشف للأشعة فوق البنفسجية. يشار إلى القمم التي تحتوي على polyribosomes و80S ، 60s و 40S ريبوسوم.

<ol>
	<li>Baim, S. B., Pietras, D. F., Eustice, D. C., Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutation+allowing+an+mRNA+secondary+structure+diminishes+translation+of+Saccharomyces+cerevisiae+iso-1-cytochrome+C.">A mutation allowing an mRNA secondary structure diminishes translation of Saccharomyces cerevisiae iso-1-cytochrome C.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 1839-1846 (1985).</li><li>Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DRS1+to+DRS7,+novel+genes+required+for+ribosome+assembly+and+function+in+Saccharomyces+cerevisiae.">DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol. Cell. Biol. 13, 7901-7912 (1993).</li><li>Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interactions+between+yeast+translation+eukaryotic+elongation+factor+(eEF)+1A+and+eEF3.">Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3.</a> J Biol Chem. 278, 6985-6991 (2003).</li><li>Serikawa, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptome+and+its+translation+during+recovery+from+cell+cycle+arrest+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell Proteomics. 2, 191-204 (2003).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324, 218-223 (2009).</li><li>Valasek, L., Szamecz, B., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+stabilization+of+preinitiation+complexes+by+formaldehyde+cross-linking.">In vivo stabilization of preinitiation complexes by formaldehyde cross-linking.</a> Methods Enzymol. 429, 163-183 (2007).</li><li>Fletcher, J. E., Copeland, P. R., Driscoll, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+distribution+of+phospholipid+hydroperoxide+glutathione+peroxidase+mRNA:+evidence+for+a+block+in+elongation+at+the+UGA/selenocysteine+codon.">Polysome distribution of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase mRNA: evidence for a block in elongation at the UGA/selenocysteine codon.</a> Rna. 6, 1573-1584 (2000).</li><li>Ruan, H. J., Brown, C. Y., Morris, D. R., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Analysis of mRNA formation and function. , 305-321 (1997).</li><li>Martin, G. W., Berry, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selenocysteine+codons+decrease+polysome+association+on+endogenous+selenoprotein+mRNAs.">Selenocysteine codons decrease polysome association on endogenous selenoprotein mRNAs.</a> Genes Cells. 6, 121-129 (2001).</li><li>Lee, Y. Y., Cevallos, R. C., Jan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+upstream+open+reading+frame+regulates+translation+of+GADD34+during+cellular+stresses+that+induce+eIF2alpha+phosphorylation.">An upstream open reading frame regulates translation of GADD34 during cellular stresses that induce eIF2alpha phosphorylation.</a> J Biol Chem. 284, 6661-6673 (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

يمكن الحصول على المعلومات من التشكيل polyribosome توفير معلومات قيمة حول حالة متعدية للخلية. بالإضافة ، يمكن تحديد حالة تجميع مفارز الريباسي أنفسهم 2. على سبيل المثال وجود halfmers أو 80S وأكبر قمم مع الكتف طفيفة إلى اليمين على ملف يشير إلى الالتزام الوحيدات 40S 60S الوحيدات تنتظر الانضمام. تنفيذ التجربة في ظل غياب أي سيكلوهيكسيميد المضافة أو غيرها من مثبطات استطالة يسمح للتحليل في معدل الجريان السطحي ، الذي يشير إلى ما إذا كانت أو لم يتم تبديل استطالة 3. الكسور هي نفسها مصدرا غنيا من الكواشف لقرار لاحق للجمعية من بروتين معين أو مرنا مع المجموعات السكانية الفرعية التي الريباسي النشاف أو الشمالية الغربية من الكسور. يمكن تحديد تجمع مجموعه mRNAs المرتبطة ريبوسوم النشطة عبر ميكروأري المرتبطة 4 أو 5 العميق تحليل التسلسل. كما يمكن للجمعيات أن يستقر البروتين بإضافة المناسبة لربط عبر كاشف 6. تحليل Polyribosome من خلايا الثدييات الجدير بالذكر كبروتوكول متميزة من حيث الصعوبات الواضحة في تهيئة الظروف اللازمة للحصول على polysomes مستقرة. نظم العازلة التي أعلن عنها في الأدبيات هي متغير على نطاق واسع 70-10 ، وبالتالي قد يكون هناك شرط لخلية من نوع التحسين المحددة للتحلل العازلة ، أو أنه أمر وارد أيضا أن نظام المخزن ليس مهما بقدر الاهتمام حريصة على العمل مع أبقى lysates جديدة في درجات حرارة منخفضة. على حد علمنا لم يتم إجراء تقييم منهجي من المعلمات التي تؤثر على تشكيل polysome الثدييات عنها.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>polyallomer ultracentrifuge tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman</td>
<td>326823</td>
<td>1 x 3.5 in. (25x89mm)</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorinert</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>F9755</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cycloheximde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C-7698</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heparin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H3393</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BY4741</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Open Biosystems</td>
<td>YSC1048</td>
<td>Other strains work equally well</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

eukaryotic polyribosome profile analysis

تخليق البروتين هو عملية معقدة الخلوية التي تنظم في العديد من المستويات. على سبيل المثال ، يمكن أن تحول دون الترجمة العالمي في مرحلة بدء المرحلة استطالة أو من جانب مجموعة متنوعة من الضغوط الخلوية مثل المجاعة الأحماض الأمينية أو النمو الانسحاب عامل. بدلا من ذلك ، يمكن أن ينظم ترجمة mRNAs الفردية عن طريق توطين مرنا أو وجود microRNAs وما شابه ذلك. دراسات لتصنيع البروتين في كثير من الأحيان استخدام تحليل polyribosome لتسليط الضوء على آليات التنظيم الترجمة أو عيوب في تخليق البروتين. في هذا الاختبار ، يتم عزل مرنا / المجمعات الريبوسوم من خلايا حقيقية النواة. التدرج الكثافة السكروز يفصل mRNAs منضمة إلى ريبوسوم متعددة المعروفة باسم polyribosomes من mRNAs منضم إلى الريبوسوم واحد أو monosome. تجزيء من التدرجات يسمح العزلة والكمي للسكان الريباسي المختلفة والمرتبطة بها أو mRNAs البروتينات. يمكن الاختلاف في نسبة polyribosomes لmonosomes في ظل ظروف محددة يكون مؤشرا على بدء عيوب في الترجمة أو استطالة / الإنهاء. ويمكن النظر في mRNAs موجودة في الكسور polyribosome تكشف ما إذا كان فوج من mRNAs الفردية يترجم التغييرات مع الظروف التجريبية. بالإضافة ، يمكن رصد التجمع الريبوسوم من خلال تحليل قمم الوحيدات الريباسي الصغيرة والكبيرة التي يتم فصلها أيضا عن طريق التدرج. في هذا الفيديو ، نقدم طريقة لإعداد مقتطفات الريباسي الخام من خلايا الخميرة ، وفصل من مستخلص بواسطة التدرج السكروز وتفسير النتائج. هذا الإجراء هو قابلية للتكيف مع خلايا الثدييات.

Watch this Scientific Journal Video about Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis at JoVE.com

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

توضح هذه المقالة على بروتوكول لاستخراج ترجمة ريبوسوم من خلايا حقيقية النواة. استخراج مرة واحدة ، يتم فصلها في ريبوسوم monosomes وpolyribosomes بواسطة تجزيء التدرج السكروز للسماح بتحليل السكان الريباسي مختلفة. على هذا النحو ، فإن هذا الأسلوب هو معيار الذهب لدراسة تنظيم الترجمة.

حقيقية النواة التحليل الشخصي Polyribosome

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

Research

JoVE Journal

Biology

52.4K Views.  University of Medicine and Dentistry of New Jersey, Robert Wood Johnson Medical School. توضح هذه المقالة على بروتوكول لاستخراج ترجمة ريبوسوم من خلايا حقيقية النواة. استخراج مرة واحدة ، يتم فصلها في ريبوسوم monosomes وpolyribosomes بواسطة تجزيء التدرج السكروز للسماح بتحليل السكان الريباسي مختلفة. على هذا النحو ، فإن هذا الأسلوب هو معيار الذهب لدراسة تنظيم ال?...

Video: Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

والخلايا العصبية ونجمية المشارك الثقافة الفحص لتحليل محتوى عال من العصبية

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells

The ability to measure cellular metabolism and understand mitochondrial dysfunction, has enabled scientists worldwide to advance their research in understanding the role of mitochondrial function in obesity, diabetes, aging, cancer, cardiovascular function and safety toxicity.
Cellular metabolism is the process of substrate uptake, such as oxygen, glucose, fatty acids, and glutamine, and subsequent energy conversion through a series of enzymatically controlled oxidation and reduction reactions. These intracellular biochemical reactions result in the production of ATP, the release of heat and chemical byproducts, such as lactate and CO2 into the extracellular environment.
Valuable insight into the physiological state of cells, and the alteration of the state of those cells, can be gained through measuring the rate of oxygen consumed by the cells, an indicator of mitochondrial respiration - the Oxygen Consumption Rate - or OCR. Cells also generate ATP through glycolysis, i.e.: the conversion of glucose to lactate, independent of oxygen. In cultured wells, lactate is the primary source of protons. Measuring the lactic acid produced indirectly via protons released into the extracellular medium surrounding the cells, which causes acidification of the medium provides the Extra-Cellular Acidification Rate - or ECAR.
In this experiment, C2C12 myoblast cells are seeded at a given density in Seahorse cell culture plates. The basal oxygen consumption (OCR) and extracellular acidification (ECAR) rates are measured to establish baseline rates. The cells are then metabolically perturbed by three additions of different compounds (in succession) that shift the bioenergetic profile of the cell.
This assay is derived from a classic experiment to assess mitochondria and serves as a framework with which to build more complex experiments aimed at understanding both physiologic and pathophysiologic function of mitochondria and to predict the ability of cells to respond to stress and/or insults.

A description of a method for profiling mitochondrial function in cells is provided. The mitochondrial profile generated provides four parameters of mitochondrial function that can be measured in one experiment: basal respiration rate, ATP-linked respiration, proton leak, and reserve capacity.

الطاقة البيولوجية التجربة الملف باستخدام الخلايا Myoblast C2C12

The ability to measure cellular metabolism and understand mitochondrial dysfunction, has enabled scientists worldwide to advance their research in ...

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity necessary for proper cellular function. Understanding how the enzymes, proteins, and cytoskeletal components govern and maintain this biochemical segregation is therefore of paramount importance. The use of fluorescently tagged molecules to localize to and/or perturb subcellular compartments has yielded a wealth of knowledge and advanced our understanding of cellular regulation. Imaging techniques such as fluorescent and confocal microscopy make ascertaining the position of a fluorescently tagged small molecule relatively straightforward, however the resolution of very small structures is limited 1.
On the other hand, electron microscopy has revealed details of subcellular morphology at very high resolution, but its static nature makes it difficult to measure highly dynamic processes with precision 2,3. Thus, the combination of light microscopy with electron microscopy of the same sample, termed Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) 4,5, affords the dual advantages of ultrafast fluorescent imaging with the high-resolution of electron microscopy 6. This powerful technique has been implemented to study many aspects of cell biology 5,7. Since its inception, this procedure has increased our ability to distinguish subcellular architectures and morphologies at high resolution. 
Here, we present a streamlined method for performing rapid microinjection followed by CLEM (Fig. 1). The microinjection CLEM procedure can be used to introduce specific quantities of small molecules and/or proteins directly into the eukaryotic cell cytoplasm and study the effects from millimeter to multi-nanometer resolution (Fig. 2). The technique is based on microinjecting cells grown on laser etched glass gridded coverslips affixed to the bottom of live cell dishes and imaging with both confocal fluorescent and electron microscopy. Localization of the cell(s) of interest is facilitated by the grid pattern, which is easily transferred, along with the cells of interest, to the Epon resin used for immobilization of samples and sectioning prior to electron microscopy analysis (Fig. 3). Overlay of fluorescent and EM images allows the user to determine the subcellular localization as well as any morphological and/or ultrastructural changes induced by the microinjected molecule of interest (Fig. 4). This technique is amenable to time points ranging from &le;5 s up to several hours, depending on the nature of the microinjected sample.

Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

The CLEM technique has been adapted to analyze ultrastructural morphology of membranes, organelles, and subcellular structures affected by microinjected molecules. This method combines the powerful techniques of micromanipulation/microinjection, confocal fluorescent microscopy, and electron microscopy to allow millimeter to multi-nanometer resolution. This technique is amenable to a wide variety of applications.

ضوء مترابط والمجهر الإلكتروني (CLEM) كأداة لتصور الجزيئات Microinjected وحقيقية النواة من الأهداف الفرعية الخلوية


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

Establishment of Microbial Eukaryotic Enrichment Cultures from a Chemically Stratified Antarctic Lake and Assessment of Carbon Fixation Potential

Lake Bonney is one of numerous permanently ice-covered lakes located in the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. The perennial ice cover maintains a chemically stratified water column and unlike other inland bodies of water, largely prevents external input of carbon and nutrients from streams. Biota are exposed to numerous environmental stresses, including year-round severe nutrient deficiency, low temperatures, extreme shade, hypersalinity, and 24-hour darkness during the winter 1. These extreme environmental conditions limit the biota in Lake Bonney almost exclusively to microorganisms 2.
Single-celled microbial eukaryotes (called "protists") are important players in global biogeochemical cycling 3 and play important ecological roles in the cycling of carbon in the dry valley lakes, occupying both primary and tertiary roles in the aquatic food web. In the dry valley aquatic food web, protists that fix inorganic carbon (autotrophy) are the major producers of organic carbon for organotrophic organisms 4, 2. Phagotrophic or heterotrophic protists capable of ingesting bacteria and smaller protists act as the top predators in the food web 5. Last, an unknown proportion of the protist population is capable of combined mixotrophic metabolism 6, 7. Mixotrophy in protists involves the ability to combine photosynthetic capability with phagotrophic ingestion of prey microorganisms. This form of mixotrophy differs from mixotrophic metabolism in bacterial species, which generally involves uptake dissolved carbon molecules. There are currently very few protist isolates from permanently ice-capped polar lakes, and studies of protist diversity and ecology in this extreme environment have been limited 8, 4, 9, 10, 5. A better understanding of protist metabolic versatility in the simple dry valley lake food web will aid in the development of models for the role of protists in the global carbon cycle.
We employed an enrichment culture approach to isolate potentially phototrophic and mixotrophic protists from Lake Bonney. Sampling depths in the water column were chosen based on the location of primary production maxima and protist phylogenetic diversity 4, 11, as well as variability in major abiotic factors affecting protist trophic modes: shallow sampling depths are limited for major nutrients, while deeper sampling depths are limited by light availability. In addition, lake water samples were supplemented with multiple types of growth media to promote the growth of a variety of phototrophic organisms.
RubisCO catalyzes the rate limiting step in the Calvin Benson Bassham (CBB) cycle, the major pathway by which autotrophic organisms fix inorganic carbon and provide organic carbon for higher trophic levels in aquatic and terrestrial food webs 12. In this study, we applied a radioisotope assay modified for filtered samples 13 to monitor maximum carboxylase activity as a proxy for carbon fixation potential and metabolic versatility in the Lake Bonney enrichment cultures.

Microbial eukaryotes are both a source of photosynthetically-derived carbon and top predatory species in permanently ice-covered Antarctic lakes. This report describes an enrichment culture approach to isolate metabolically versatile microbial eukaryotes from the Antarctic lake, Lake Bonney, and assesses inorganic carbon fixation potential using a radioisotope assay for Ribulose-1,5-bisphophate carboxylase oxygenase (RubisCO) activity.

إنشاء الميكروبية إثراء الثقافات حقيقية النواة من بحيرة القطب الجنوبي الطبقية كيميائيا وتقييم القدرة على تثبيت الكربون

Lake Bonney is one of numerous permanently ice-covered lakes located in the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. The perennial ice cover maintains a ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

الأيض تحليل الملف من الأجنة الزرد

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and composed of mature enterocytes, goblet cells and enteroendocrine cells; and crypts, residing proximal to the submucosa and the muscularis, harboring adult stem and progenitor cells and mature Paneth cells, as well as stromal and immune cells of the crypt microenvironment. Until the last few years, in vitro studies of small intestine was limited to cell lines derived from either benign or malignant tumors, and did not represent the physiology of normal intestinal epithelia and the influence of the microenvironment in which they reside. Here, we demonstrate a method adapted from Sato et al. (2009) for culturing primary mouse intestinal crypt organoids derived from C57BL/6 mice. In addition, we present the use of crypt organoid cultures to assay the crypt metabolic profile in real time by measurement of basal oxygen consumption, glycolytic rate, ATP production and respiratory capacity. Organoids maintain properties defined by their source and retain aspects of their metabolic adaptation reflected by oxygen consumption and extracellular acidification rates. Real time metabolic studies in this crypt organoid culture system are a powerful tool to study crypt organoid energy metabolism, and how it can be modulated by nutritional and pharmacological factors.

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Small intestinal crypt organoids cultured ex vivo provide a tissue culture system that recapitulates growth of crypts dependent on stem cells and their niche. We established a method to assay the metabolic profile in real time in primary mouse crypt organoids. We found organoids maintain physiological properties defined by their source.

تحليل الوقت الحقيقي ايض الملف في<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; الثقافات ماوس المعوية سرداب عضي

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs contribute to genetic variation among somatic cells in multicellular organisms and to evolution of unicellular eukaryotes. Sensitive methods for detecting eccDNA are needed to clarify how these elements affect genome stability and how environmental and biological factors&#160;induce their formation in eukaryotic cells. This video presents a sensitive eccDNA-purification method called Circle-Seq. The method encompasses column purification of circular DNA, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification of eccDNA, deep sequencing, and mapping. Extensive exonuclease treatment&#160;was&#160;required for sufficient linear chromosomal DNA degradation. The rolling-circle amplification step by &#966;29 polymerase enriched for circular DNA over linear DNA. Validation of the Circle-Seq method on three S. cerevisiae CEN.PK populations of 1010 cells detected hundreds of eccDNA profiles in sizes larger than 1 kilobase. Repeated findings of ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30,&#160;HXT6, HXT7 genes on circular DNA in both S288c and CEN.PK suggests that DNA circularization is conserved between strains at these loci. In sum, the Circle-Seq method has broad applicability for genome-scale screening for eccDNA in eukaryotes as well as for detecting specific eccDNA types.

This paper presents a sensitive method called Circle-Seq for purifying extrachromosomal circular DNA (eccDNA). The method encompasses column purification, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification and high-throughput sequencing. Circle-Seq is applicable to genome-scale screening of eukaryotic eccDNA and studying genome instability and copy-number variation.

تنقية الجينوم على نطاق خارج الصبغي التعميم الحمض النووي من خلايا حقيقية النواة

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

بروتوكول مختبر لتحليل محتوى الأمعاء الوراثية ماكروينفيرتيبراتيس المائية استخدام مجموعة محددة المتاشب كبسولة تفجير

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to cells, tissues, organelles, and even whole organisms. This protocol focuses on two chemical drying methods, hexamethyldisilazane (HMDS) and t-butyl alcohol (TBA), and their application to imaging of both prokaryotic and eukaryotic organisms using SEM. In this article, we describe how to fix, wash, dehydrate, dry, mount, sputter coat, and image three types of organisms: cyanobacteria (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp., and an unknown sp.), two euglenoids from the genus Monomorphina (M. aenigmatica and M. pseudopyrum), and the fruit fly (Drosophila melanogaster). The purpose of this protocol is to describe a fast, inexpensive, and simple method to obtain detailed information about the structure, size, and surface characteristics of specimens that can be broadly applied to a large range of organisms for morphological assessment. Successful completion of this protocol will allow others to use SEM to visualize samples by applying these techniques to their system.

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

SEM analysis is an effective method to aid in species identification or phenotypic discrimination. This protocol describes the methods for examining specific morphological details of three representative types of organisms and would be broadly applicable to examining features of many organismal and tissue types.

إعداد الكائنات الحية بدائية وحقيقية النواة باستخدام التجفيف الكيميائية للتحليل المورفولوجي في المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Image Rendering Techniques in Postmortem Computed Tomography: Evaluation of Biological Health and Profile in Stranded Cetaceans

With 6 years of experience in implementing virtopsy routinely into the Hong Kong cetacean stranding response program, standardized virtopsy procedures, postmortem computed tomography (PMCT) acquisition, postprocessing, and evaluation were successfully established. In this pioneer cetacean virtopsy stranding response program, PMCT was performed on 193 stranded cetaceans, providing postmortem findings to aid necropsy and shed light on the biological health and profile of the animals. This study aimed to assess 8 image rendering techniques in PMCT, including multiplanar reconstruction, curved planar reformation, maximum intensity projection, minimum intensity projection, direct volume rendering, segmentation, transfer function, and perspective volume rendering. Illustrated with practical examples, these techniques were able to identify most of the PM findings in stranded cetaceans and served as a tool to investigate their biological health and profile. This study could guide radiologists, clinicians and veterinarians through the often difficult and complicated realm of PMCT image rendering and reviewing.

The Hong Kong cetacean stranding response program has incorporated postmortem computed tomography, which provides valuable information on the biological health and profile of the deceased animals. This study describes 8 image rendering techniques that are essential for the identification and visualization of postmortem findings in stranded cetaceans, which will help clinicians, veterinarians and stranding response personnel worldwide to fully utilize the radiological modality.

تقنيات تقديم الصور في التصوير المقطعي بعد الوفاة: تقييم الصحة البيولوجية والملامح الشخصية في الحيتانيات التي تقطعت بها السبل

With 6 years of experience in implementing virtopsy routinely into the Hong Kong cetacean stranding response program, standardized virtopsy procedures, ...