הרשות הפלסטינית היא נמען של מלגה &quot;פייר דוראן&quot; בפקולטה לרפואה של האוניברסיטה לאוול. עבודה זו נתמכה על ידי למדעי הטבע והנדסת מועצת המחקר של קנדה (MOP-CG095386) ל RM fractionator polysome נרכש באמצעות קרן קנדית עבור חדשנות מענק (MOP-GF091050) לRMR M מחזיק הפרס משכורת חוקר חדש CIHR. אנו אסירי תודה לבני זוג. א Khandjian, י Gallouzi, ס &#39;Di-מרקו וא&#39; Cammas לעצות מועילות.

הפרוטוקול כדלקמן ההנחיות שאושר על ידי המועצה לביקורת האתית של לאוואל. 1. הכנת תרביות תאים ומניפולציה המוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי יונקים ודרוזופילה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול הלה תאי סרטן צוואר הרחם ותאים עובריים שניידר דרוזופילה כמומלץ על ידי התרבות האמריקנית אוסף סוג. עבודה עם תאים במעבר נמוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאים כדי להגיע למפגש 80% היום של הניסוי. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, השתמש ~ 12 x 10 6 תאים לכל תנאי ניסוי. לפני קבלת תמציות לניתוח polysome, לעורר תרגום על ידי הוספה בינונית מלא טרי לפחות 90 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד מוח: לבודד את המוח מעכברים בגילים שבין 9 ו16 ימים לאחר לידה. המתת חסד כרוך משאיפת CO 2 אחרי הרדמה ונקע בצוואר הרחם. בעקבות הקרבה, לבודד את המוח כולו וגם מקום שאניt ב -80 מעלות צלזיוס או ישירות להעביר אותו לקר PBS 1X לשימוש מיידי. </li></ol> 2. מערכת ההיפוך החלוקה Gradient הכנת הצפיפות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את מערכת צינורות עם 0.1% SDS למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את מערכת צינורות עם אתנול 70% למשך 5 דקות, ולאחר מכן עם RNaseZAP פתרון עבור 5 דקות לפני שטיפה עם מים DEPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משאבת אוויר כדי לייבש את מערכת צינורות של המנגנון. </li></ol> 3. הכנת עירובי סוכרוז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את פתרונות סוכרוז 15% ו55% ב20 מ&quot;מ טריס-HCl pH 7.4, 1.25 מ&quot;מ MgCl 2, 150 mM NaCl, ו1 מ&quot;מ DTT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור 15-55% שיפוע סוכרוז ליניארי באמצעות ISCO דגם 160 שיפוע לשעבר, כפי שתוארו על ידי הוראות היצרן. עם זאת, חשוב לשלוט גם על מהירות משאבת peristaltic טריס על מנת למנוע יצירה של בועות או מערבולות בהדרגות. שמור הדרגתיים על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הזמן שבו תכנית יצרנית השיפוע פועלת, לקרר את ultracentrifuge עד 4 ° C. </li></ol> 4. הכנת נייד ותמציות מוח עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תמציות סלולריים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת מקום (ים) בתאי קרח ולשטוף 3x עם PBS הקר 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים (~ 12 x 10 6) במאגר 1 תמוגה מיליליטר (20 מ&quot;מ טריס-HCl ב-pH 7.4, 1.25 מ&quot;מ MgCl 2, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 1% P40 Nonidet, 5 מעכב U / מיליליטר RNase, בתוספת עם טבליות מעכבי פרוטאז קוקטייל מלאים מיני ללא EDTA), להעביר אותם לצינור Eppendorf, ומערבבים היטב על ידי העברתם 15x באמצעות מזרק אינסולין U100 1cc 28 G 1/2. בואו lysate התא לנוח על קרח במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים כמה טיפות של lysate תא לשקופית להעריך תמוגה הסלולרית על ידי ההתבוננות במיקרוסקופ לעומת שלב באמצעות מטרת 10X. גרעינים רק צריכים להיות גלויים ולא קרום תא צריך להיות מעיד גלוי לתמוגה תא. כמו שליטה, להתבונןתאי unlysed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבהיר את lysate התא על ידי צנטריפוגה ב11,000 XG עבור 20 דקות על 4 מעלות צלזיוס ולשמור lysate המסיסים המכיל polyribosomes. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תמציות מוח עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize המוח כולו המבודד (~ מ&quot;ג 500) על ידי 10 משיכות בhomogenizer Dounce קר כקרח עם 2 מיליליטר של חיץ תמוגה ולהבהיר את homogenate על ידי צנטריפוגה ב11,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את supernatant וכתוצאה מכך על כרית של סוכרוז 50% ולהמשיך עם שקיעה לשעה 2 ב 200,000 XG באמצעות הרוטור ultracentrifuge TH-641 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדור השקוף המכיל polyribosomes ב 1 מיליליטר של חיץ תמוגה ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה. בואו שאר ההשעיה על הקרח למשך 30 דקות לפני העמסתי על הדרגות. </li></ol></li></ol> 5. טוען תמציות על סוכרוז הדרגות וultracentrifugation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את הריכוזשל RNA הנמצא בתמצית cytoplasmic באמצעות ספקטרופוטומטר. לאט ובזהירות לטעון ~ 20 OD 260 יחידות של התמצית על גבי שיפוע סוכרוז 15% ל55%. ודא שיש 2-3 מ&quot;מ של שטח פנוי על פני השטח של צינור כדי למנוע גדות הצינורות במהלך צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הדרגתיים באמצעות אולטרה צנטריפוגות במשך שעה 2 30 דקות ב 230,000 XG באמצעות הרוטור ultracentrifuge TH-641 ב 4 ° C. כאשר מסתיימת צנטריפוגה, להסיר את הצינורות ומניח אותם על קרח בזהירות שלא להפריע את השיפועים. </li></ol> 6. היפוך חלוק של תמציות cytoplasmic לPolysomes פרופיל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח הדרגתיים סוכרוז על מערכת היפוך חלוקה צפיפות אוטומטית ולהמשיך עם חלוקה ואיסוף אוטומטיים של שברים (0.5 מיליליטר כל אחד), כפי שתואר על ידי היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף כל חלק (~ μl 500) לתוך צינורות Eppendorf אדם עם ניטור רציף של הספיגה ב 254 ננומטר. בparallאל של מבצע חלוקה השיפוע, פרופיל polyribosomal יהיה עריכה על נייר התרשים. לחלופין, השתמש ביחידת רכישת נתונים המצורפת למקליט התרשים יש רכישה אלקטרונית של פרופיל polysome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף כל סיבוב, להעביר eppendorfs נאסף על קרח יבש. בשלב זה, גם חנות שנאספו שברים ב -80 מעלות צלזיוס או ישירות משקע מתחמי החלבון-RNA באופן הבא. </li></ol> 7. מיצוי חלבון וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל שבר שנאסף משיפוע סוכרוז, להוסיף 2 כרכים של 100% אתנול קר ולתת קומפלקסי RNA-חלבון לזרז ב -20 לילה מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה כל משקע RNA-חלבון ב11,000 XG עבור 20 דקות על 4 מעלות צלזיוס ולאחר מכן לשטוף עם 70% אתנול. יבש וresuspend המשקע בחיץ מדגם SDS-PAGE לפני שתמשיך עם כתם מערבי באמצעות נוגדנים ספציפיים (ראה איור 2). </li></ol> 8. RNA חילוץ וnalysis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משקע מתחמי RNA-חלבון כמו בסעיף 7.1. Resuspend כל משקע RNA-חלבון במאגר תמוגה מכיל 0.1% SDS. לעכל את מרכיב החלבון של המשקע עם 2 מ&quot;ג / מיליליטר proteinase K ל30 דקות באמבט מים C ° 55. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ רכיבי RNA של המשקע על ידי הוספת נפח של 1 &quot;פנול: כלורופורם&quot;, 2 כרכים של כלורופורם, ו0.1 נפח של 2-pH M NaOAc 4 וצנטריפוגה ב 10,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. משקע RNA מהשלב וכתוצאה מהמימי של כל דגימת לילה בשעה -20 ° C על ידי הוספת נפח של 1 isopropanol ו0.2 מיקרוגרם / μl של גליקוגן. ספין המשקע עבור שעה 1 ב 10,000 XG ב 4 ° C. שטוף את כדור RNA עם 70% אתנול קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את כדור RNA לנפח קטן של מים חופשיים RNAse. להעריך את הכמות ואיכות של RNA באמצעות ספקטרופוטומטר. </li></ol>

<ol>
	<li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+translational+control.">Molecular mechanisms of translational control.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (10), 827-835 (2004).</li><li>Jackson, R. J., Hellen, C. U. T., Pestova, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+eukaryotic+translation+initiation+and+principles+of+its+regulation.">The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (2), 113-127 (2010).</li><li>Fournier, M. -. J., Gareau, C., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotherapeutic+agent+bortezomib+induces+the+formation+of+stress+granules.">The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules.</a> Cancer Cell International. 10 (12), (2010).</li><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+stress+and+apoptosis.">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 6 (4), 318-327 (2005).</li><li>Mazroui, R., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trapping+of+messenger+RNA+by+Fragile+X+Mental+Retardation+protein+into+cytoplasmic+granules+induces+translation+repression.">Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression.</a> Human Molecular Genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).</li><li>Mazroui, R., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Boilard, N., Labelle, Y., Khandjian, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+Mental+Retardation+protein+determinants+required+for+its+association+with+polyribosomal+mRNPs.">Fragile X Mental Retardation protein determinants required for its association with polyribosomal mRNPs.</a> Human Molecular Genetics. 12 (23), 3087-3096 (2003).</li><li>Farny, N. G., Kedersha, N. L., Silver, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Metazoan+stress+granule+assembly+is+mediated+by+P-eIF2alpha-dependent+and+-independent+mechanisms.">a Metazoan stress granule assembly is mediated by P-eIF2alpha-dependent and -independent mechanisms.</a> RNA. 15 (10), 1814-1821 (2009).</li><li>Gareau, C., Houssin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+fragile+x+mental+retardation+protein+recruitment+and+dynamics+in+Drosophila+stress+granules.">Characterization of fragile x mental retardation protein recruitment and dynamics in Drosophila stress granules.</a> PLoS ONE. 8 (2), (2013).</li><li>Brackett, D. M., Qing, F., Amieux, P. S., Sellers, D. L., Horner, P. J., Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMR1+transcript+isoforms:+association+with+polyribosomes;+regional+and+developmental+expression+in+mouse+brain.">FMR1 transcript isoforms: association with polyribosomes; regional and developmental expression in mouse brain.</a> PLoS ONE. 8 (3), (2013).</li><li>Khandjian, E. W., Huot, M. -. E., Tremblay, S., Davidovic, L., Mazroui, R., Bardoni, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+evidence+for+the+association+of+fragile+X+mental+retardation+protein+with+brain+polyribosomal+ribonucleoparticles.">Biochemical evidence for the association of fragile X mental retardation protein with brain polyribosomal ribonucleoparticles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (36), 13357-13362 (2004).</li><li>Erikson, A., Winblad, B., Wallace, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+of+gene+expression+in+the+human+brain.">Translational control of gene expression in the human brain.</a> Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 13 (3-4), 469-479 (1989).</li><li>Stephens, S. B., Nicchitta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V+In+vitro+and+tissue+culture+methods+for+analysis+of+translation+initiation+on+the+endoplasmic+reticulum.">V In vitro and tissue culture methods for analysis of translation initiation on the endoplasmic reticulum.</a> Methods in Enzymology. 431, 47-60 (2007).</li><li>Koritzinsky, M., Wouters, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+regulation+of+messenger+RNA+translation.">Hypoxia and regulation of messenger RNA translation.</a> Methods in Enzymology. 435, 247-273 (2007).</li><li>Khandjian, E. W., Corbin, F., Woerly, S., Rousseau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fragile+X+mental+retardation+protein+is+associated+with+ribosomes.">The fragile X mental retardation protein is associated with ribosomes.</a> Nature Genetics. 12, 91-93 (1996).</li><li>Sivan, G., Kedersha, N., Elroy-Stein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+slowdown+mediates+translational+arrest+during+cellular+division.">Ribosomal slowdown mediates translational arrest during cellular division.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (19), 6639-6646 (2007).</li><li>Thomas, J. D., Johannes, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mRNAs+that+continue+to+associate+with+polysomes+during+hypoxia.">Identification of mRNAs that continue to associate with polysomes during hypoxia.</a> RNA. 13, 1116-1131 (2007).</li><li>Kumaraswamy, S., Chinnaiyan, P., Shankavaram, U. T., L&#252;, X., Camphausen, K., Tofilon, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+gene+translation+profiles+reveal+tumor+type+and+cancer-specific+components.">Radiation-induced gene translation profiles reveal tumor type and cancer-specific components.</a> Cancer Research. 68 (10), 3819-3826 (2008).</li><li>Fournier, M. -. J., Coudert, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+the+mTORC1-eIF4E+Pathway+alters+Stress+Granules+Formation.">Inactivation of the mTORC1-eIF4E Pathway alters Stress Granules Formation.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (11), 2285-2301 (2013).</li><li>Sanchez, G., Dury, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+for+the+survival+motoneuron+protein+as+a+translational+regulator.">A novel function for the survival motoneuron protein as a translational regulator.</a> Human Molecular Genetics. 22 (4), 668-684 (2013).</li><li>B&#233;chade, C., Rostaing, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+distribution+of+survival+motor+neuron+(SMN)+protein:+possible+involvement+in+nucleocytoplasmic+and+dendritic+transport.">Subcellular distribution of survival motor neuron (SMN) protein: possible involvement in nucleocytoplasmic and dendritic transport.</a> The European Journal of Neuroscience. 11 (1), 293-304 (1999).</li><li>Goulet, I., Boisvenue, S., Mokas, S., Mazroui, R., C&#244;t&#233;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDRD3,+a+novel+Tudor+domain-containing+protein,+localizes+to+cytoplasmic+stress+granules.">TDRD3, a novel Tudor domain-containing protein, localizes to cytoplasmic stress granules.</a> Human Molecular Genetics. 17 (19), 3055-3074 (2008).</li><li>Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+let-7a+miRNA+blocks+protein+production+on+actively+translating+polyribosomes.">Human let-7a miRNA blocks protein production on actively translating polyribosomes.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 13 (12), 1108-1114 (2006).</li><li>Genolet, R., Araud, T., Maillard, L., Jaquier-Gubler, P., Curran, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+approach+to+analyse+the+specific+impact+of+rapamycin+on+mRNA-ribosome+association.">An approach to analyse the specific impact of rapamycin on mRNA-ribosome association.</a> BMC Medical Genomics. 1 (33), (2008).</li><li>Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., M&#252;llner, E. W., Garcia-Sanz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Isolation+of+polysome-bound+mRNA+from+solid+tissues+amenable+for+RT-PCR+and+profiling+experiments.">a Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments.</a> RNA. 13 (3), 414-421 (2007).</li><li>Thoreen, C. C., Chantranupong, L., Keys, H. R., Wang, T., Gray, N. S., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unifying+model+for+mTORC1-mediated+regulation+of+mRNA+translation.">A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation.</a> Nature. 485 (7396), 109-113 (2012).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., Mcgeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li><li>Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+footprints+on+a+transcriptome+landscape.">Ribosomal footprints on a transcriptome landscape.</a> Genome Biology. 10 (4), (2009).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

ניתוח פרופיל polysome על הדרגתיים סוכרוז מאפשר מדידה של חניכה תרגום על ידי ניתוח הצפיפות של polysomes מבודד תאים או רקמות 9,11-14. טכניקה זו היא הטובה ביותר (אם לא ייחודית) הגישה למדידת ייזום תרגום in vivo. הוא משמש כדי לפקח על מצב translational של גידול תאים בתא מחזור 15, וכ?...

תאי אוקריוטים נתקלים כל הזמן במגוון של מצבים פיסיולוגיים וסביבתיים מזיקים מתח שדורשים תגובת תא הסתגלות מהירה. תגובת לחץ תא כרוכה באיזון מדויק בין גורמים הפועלים נגד הישרדות והפרה הישרדות. לשבש את האיזון הזה יכול להיות השלכות בלתי הפיכות המובילות את הפיתוח של פתולוגיות אדם כגון סרטן ומחלות ניווניות. במהלך השלב הראשון של תגובת הלחץ, תאים להפעיל מסלולים הפרו הישרדות שכוללים שליטה מתואמת של שינויים בביטוי גנים ברמה של תרגום ה-mRNA. תרגום ה-mRNA באאוקריוטים הוא תהליך תאי מורכב שכרוכים באינטראקציות מתואמות בין גורמי חניכה התרגום (EIFS), חלבוני RNA הספציפי מחייבים (ריב &#39;), ומולקולות RNA 1. תרגום ה-mRNA מתחלק לשלושה שלבים ברורים: ייזום, התארכות, וסיום. למרות שכל שלושת השלבים כפופים לreguמנגנוני latory, מנגנוני בקרת translational למקד בעיקר בשלב הייזום של תרגום, אשר ובכך מהווה את צעד שער הגבלה של חלבון סינתזה 2. חניכה תרגום היא תהליך הורה מאוד שמתחיל עם הקמתה של eIF2a.GTP.Met-tRNA פגשתי מורכב משולשת ולאחר מכן מחייבת שלה למקטע הריבוזום 40S, מה שמוביל להיווצרות של המתחם טרום החניכה. השלב הבא הוא הגיוס של מתחם preinitiation mRNA, הכולל את הפעילות של גורמי חניכה תרגום כגון eIF4F וeIF3. מורכב preinitiation 48S וכך נוצרו עובר שינויי קונפורמציה ספציפיים המאפשרים למנגנון הזה כדי להתחיל לסרוק את אזור 5&#39;-מתורגם של ה-mRNA עד שהוא מזהה את הייזום קודון אוגוסט אז רוב גורמי החניכה התרגום משתחררים ויחידות משנת 60S מגויסות כדי ליצור 80S הריבוזום מורכב מוסמך לתרגום,לא שמתחיל את סינתזת חלבון נקודה (איור 1). יותר מפעם אחת 80S monosome ניתן לתרגם את אותו mRNA בזמן הפקת polysomes שנקרא (או polyribosomes). הצפיפות של polysomes על mRNA משקפת ייזום, התארכות ושיעורי סיום ובכך הוא מדד של translatability של תעתיק מסוים. עם זאת, polysome פרופיל משמש בעיקר כדי להעריך את השינויים בתרגום ה-mRNA בשלב הייזום. כאן השתמשנו מעכב הפרוטאזום כמעכב ייזום תרגום. טיפול בתאי סרטן עם תרופה זו גורם לתגובת לחץ המאופיינת בהפעלה של קינאז בשם המתח HRI שphosphorylates גורם החניכה תרגום eIF2a 3. זירחון של eIF2a הוא אחד האירועים המרכזיים שהובילו לעיכוב של חניכה תרגום בתאי יונקים 4.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="875">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td style="width:311px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">HeLa cervical cancer cells</td>
			<td style="width:311px;">American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC)</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">Schneider Drosophila embryonic cells</td>
			<td style="width:311px;">American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC)</td>
			<td>CRL-1963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td style="width:311px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Culture medium and Supplements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Schneider&#8217;s Drosophila Medium</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>SO146-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">DMEM</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11995-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">FBS</td>
			<td>Fisher Scientist Scientist</td>
			<td>SH30396-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td style="width:311px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Sucrose solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">D-Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientist</td>
			<td>BP220-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Glycerol</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>49767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Blue Bromophenol</td>
			<td>Fisher Scientist</td>
			<td>B3925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td style="width:311px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Tris Hydrochloride</td>
			<td>Fisher Scientist</td>
			<td>BP153-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:279px;">MgCl2 </td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M2670-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">NaCl</td>
			<td>Tekniscience</td>
			<td>3624-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">DTT</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D 9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Nonidet P40 (Igepal CA-630 )</td>
			<td>MJS Biolynx</td>
			<td>19628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">SDS</td>
			<td>Tekniscience</td>
			<td>4095-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">RNase inhibitor (RnaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10777-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Antiproteases (complete, mini, EDTA free)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11,836,170,001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td style="width:311px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Proteinase K</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM2542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Phenol: Chloroforme</td>
			<td>Fisher Scientist</td>
			<td style="width:119px;">BP1754I-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Chloroforme</td>
			<td style="width:311px;">Fisher Scientist</td>
			<td style="width:119px;">C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Glycogen</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10814-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:311px;">Acros organics</td>
			<td>327270010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td style="width:311px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">anti-FMRP antibody</td>
			<td colspan="2" style="width:429px;">Fournier et al., Cancer Cell International, 2010</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">anti-Ribosomal Protein L28 antibody</td>
			<td style="width:311px;">Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">SC-50362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td style="width:311px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Others</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Proteasome inhibitor : Bortezomib</td>
			<td style="width:311px;">LC Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">B-1408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">DEPC (Diethylpyrocarbonate)</td>
			<td style="width:311px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5758-25ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">RNaseZAP Solution</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td style="width:311px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Materials</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">T25 cell culture flask</td>
			<td style="width:311px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">1cc U100 Insulin Syringe 28 G1/2</td>
			<td>Fisher Scientist</td>
			<td>148291B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Tube ultra-centrifugation, PA, 12ml</td>
			<td>Fisher Scientist</td>
			<td>FSSP9763205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Isco Model 160 gradient former</td>
			<td style="width:311px;">Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultracentrifuge Sorvall OTD Combi</td>
			<td style="width:311px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Thermo Scientific Sorvall Rotor TH-641</td>
			<td style="width:311px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:119px;">54295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Automated Density Fractionation System</td>
			<td style="width:311px;">Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA</td>
			<td style="width:119px;">67-9000-177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Isco UA-6 UV-vis detector</td>
			<td style="width:311px;">Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:279px;">NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td style="width:311px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Ultracentrifuge C 5415</td>
			<td style="width:311px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:279px;">Optical Microscope</td>
			<td style="width:311px;">Olympus CK2</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling

שליטה מדויקת של תרגום ה-mRNA היא יסוד להומאוסטזיס תא אוקריוטים, בעיקר בתגובה ללחץ פיסיולוגי ופתולוגיים. שינויים של תכנית זו יכול להוביל לצמיחה של תאים שניזוקו, סימן היכר של התפתחות הסרטן, או למוות של תאים מוקדמים כגון ראה במחלות ניווניות. הרבה ממה שידוע בנוגע לבסיס המולקולרי לבקרת translational כבר מתקבלים מניתוח polysome באמצעות מערכת חלוקה שיפוע צפיפות. טכניקה זו מסתמכת על ultracentrifugation של תמציות cytoplasmic על שיפוע סוכרוז ליניארי. ברגע שהספין הושלם, המערכת מאפשרת חלוקה וכימות של אזורי centrifuged המתאימים לתרגום שונה הריבוזומים אוכלוסיות, ובכך וכתוצאה מכך פרופיל polysome. שינויים בפרופיל polysome מעידים על שינויים או פגמים בייזום תרגום המתרחשים בתגובה לסוגים שונים של מתח. טכניקה זו מאפשרת גם להעריך את התפקיד דואר של חלבונים ספציפיים על ייזום תרגום, וכדי למדוד את פעילות translational של mRNAs הספציפי. כאן אנו מתארים הפרוטוקול שלנו לביצוע פרופילי polysome על מנת להעריך חניכה תרגום של תאים ורקמות אוקריוטים בתנאי גידול נורמלים או מתח.

כאמור, polysome פרופיל מאפשר הניתוח של שינויים של חניכה תרגום בתנאי לחץ. איור 1 היא תצוגה פשוטה של ייזום תרגום אשר כפי שתואר קודם לכן הוא תהליך רב שלבי מעורבים הרכבה מסודרת של מתחמי ייזום תרגום. תחת תנאי גידול רגילים, מתחמי ייזום תרגום מומרים לpolyribosomes גילויו על יד?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling at JoVE.com

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

כאן, אנו מתארים שיטה לניתוח שינויים בייזום של תרגום ה-mRNA של תאי אוקריוטים בתגובה למצבי לחץ. שיטה זו מבוססת על הפרדת המהירות בשיפועי סוכרוז של תרגום ריבוזומים מהריבוזומים שאינם תרגום.

ניתוח של תרגום ייזום בתנאי לחץ ידי Polysome פרופיל

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

analysis-translation-initiation-during-stress-conditions-polysome

Research

JoVE Journal

Biology

18.2K Views.  Laval University.  כאן, אנו מתארים שיטה לניתוח שינויים בייזום של תרגום ה-mRNA של תאי אוקריוטים בתגובה למצבי לחץ. שיטה זו מבוססת על הפרדת המהירות בשיפועי סוכרוז של תרגום ריבוזומים מהריבוזומים שאינם תרגום. 

Video: Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Monitoring Plant Hormones During Stress Responses

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. Among the most severe stresses are insect herbivory, pathogen infection, and drought stress. For each of these stresses a specific set of hormones and/or combinations thereof are known to fine-tune the responses, thereby ensuring the plant's survival. The major hormones involved in the regulation of these responses are jasmonic acid (JA), salicylic acid (SA), and abscisic acid (ABA). To better understand the role of individual hormones as well as their potential interaction during these responses it is necessary to monitor changes in their abundance in a temporal as well as in a spatial fashion. For the easy, sensitive, and reproducible quantification of these and other signaling compounds we developed a method based on vapor phase extraction and gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) analysis (1, 2, 3, 4). After extracting these compounds from the plant tissue by acidic aqueous 1-propanol mixed with dichloromethane the carboxylic acid-containing compounds are methylated, volatilized under heat, and collected on a polymeric absorbent. After elution into a sample vial the analytes are separated by gas chromatography and detected by chemical ionization mass spectrometry. The use of appropriate internal standards then allows for the simple quantification by relating the peak areas of analyte and internal standard.

A simple method is provided that allows for the rapid extraction and analysis of multiple plant hormones from small tissue samples. The procedure uses vapor phase extraction as the solemn purification step. Samples are analyzed by GC/MS with chemical ionization that produces mainly (M+1)+ ions.

ניטור הורמונים צמחיים במהלך התגובות מתח

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. ...

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS)

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease mechanisms and may elucidate new markers to substratify disease with different clinical features and better understand pathogenesis. We have developed a highly quantitative method called Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS) for profiling patient sera antibody responses to autoantigens and pathogen antigens associated with infection. Unlike ELISAs, the highly sensitive LIPS is easily implemented to survey humoral serological response profiles to different antigens in a universal format and produces dynamic antibody titer ranges up to 6 log10 for some antigens. In these studies, quantitative profiling by LIPS of patient humoral responses against panels of antigens or even the entire proteome of some pathogens (i.e. HIV), is typically more informative than testing a single antigen by ELISA. In addition, LIPS also eliminates time and effort needed to produce highly purified antigens as well as the labor-intensive assay optimization steps needed for standard ELISAs. Here we provide a detailed protocol describing the technical aspects of performing LIPS assays for readily profiling antibody responses to single or multiple antigens.

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems LIPS

The technical aspects of performing LIPS (Luciferase Immunoprecipitation Systems) are described. The overall approach involves expressing chimeric genes encoding antigens fused to Renilla luciferase (Ruc) in mammalian cells. Crude Ruc-antigen extracts are then prepared and, without purification, employed in immunoprecipitation assays to quantify antibodies.

נוגדן פרופיל על ידי מערכות immunoprecipitation בלוציפראז (שפתיים)

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

ניתוח של סטרס חמצוני בעוברי דג הזברה

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

אפיון תאי גזע עוברי האנושי על ידי הפרט כמותי RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

Polysome היפוך חלוק וניתוח של יונקי Translatomes בקנה מידת הגנום

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown to allow to selective translation of specific mRNAs, which typically encode for proteins required for a particular stress response. Identification of these mRNAs, as well as the characterization of regulatory mechanisms responsible for selective translation has been at the forefront of molecular biology for some time. Polysome profiling is a cornerstone method in these studies. The goal of polysome profiling is to capture mRNA translation by immobilizing actively translating ribosomes on different transcripts and separate the resulting polyribosomes by ultracentrifugation on a sucrose gradient, thus allowing for a distinction between highly translated transcripts and poorly translated ones. These can then be further characterized by traditional biochemical and molecular biology methods. Importantly, combining polysome profiling with high throughput genomic approaches allows for a large scale analysis of translational regulation.

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

הערכת סלקטיבי mRNA התרגום בתאי יונקים ידי Polysome פרופיל

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

ניתוח Glucocorticoid צואה: לא פולשני ניטור הכליה ב Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

שיטה קלה הצמח Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents in the treatment of several diseases. The development of new, innovative strategies for miRNA/siRNA therapy is based on an extensive knowledge of the underlying mechanisms. Recent data suggest that small RNAs are exchanged between cells in a gap junction-dependent manner, thereby inducing gene regulatory effects in the recipient cell. Molecular biological techniques and flow cytometric analysis are commonly used to study the intercellular exchange of miRNA. However, these methods do not provide high temporal resolution, which is necessary when studying the gap junctional flux of molecules. Therefore, to investigate the impact of miRNA/siRNA as intercellular signaling molecules, novel tools are needed that will allow for the analysis of these small RNAs at the cellular level. The present protocol describes the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) microscopy to elucidating the gap junction-dependent exchange of miRNA molecules between cardiac cells. Importantly, this straightforward and non-invasive live-cell imaging approach allows for the visualization and quantification of the gap junctional shuttling of fluorescently labeled small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution. The data obtained by 3D-FRAP confirm a novel pathway of intercellular gene regulation, where small RNAs act as signaling molecules within the intercellular network.

Here, we describe the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) for the analysis of the gap junction-dependent shuttling of miRNA. In contrast to commonly applied methods, 3D-FRAP allows for the quantification of the intercellular transfer of small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution.

ניתוח של המעבר צומת הפער תלוי מירנה עם מיקרוסקופיה 3D-FRAP

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

במבחנה ניתוח של E3 אוביקוויטין פונקציית ליגאז

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...