This work was supported by an Avenir/ATIP grant to Matteo Bonazzi and a Marie Curie CIG (N&#176; 293731) to Eric Martinez. The authors would like to thank Dr. Robert Heinzen for sharing C. burnetii strains, antibodies and tools, Virginie Georget and Sylvain DeRossi (Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier) for their technical assistance and data analysis.

<ol>
	<li>Maurin, M., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q+fever.">Q fever.</a> Clinical microbiology reviews. 12 (4), 518-553 (1999).</li><li>Kim, S. G., Kim, E. H., Lafferty, C. J., Dubovi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coxiella+burnetii.+in+bulk+tank+milk+samples,+United+States.">Coxiella burnetii. in bulk tank milk samples, United States.</a> Emerging infectious diseases. 11, 619-621 (2005).</li><li>Kazar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coxiella+burnetii.+infection.">Coxiella burnetii. infection.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1063, 105-114 (2005).</li><li>Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Q+fever:+a+biological+weapon+in+your+backyard.">Q fever: a biological weapon in your backyard.</a> The Lancet infectious diseases. 3, 709-721 (2003).</li><li>Der Hoek, W. V. a. n., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemic+Q+fever+in+humans+in+the+Netherlands.">Epidemic Q fever in humans in the Netherlands.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 984, 329-364 (2012).</li><li>Capo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subversion+of+monocyte+functions+by+Coxiella+burnetii.:+impairment+of+the+cross-talk+between+alphavbeta3+integrin+and+CR3.">Subversion of monocyte functions by Coxiella burnetii.: impairment of the cross-talk between alphavbeta3 integrin and CR3.</a> Journal of immunology. 163 (11), 6078-6085 (1999).</li><li>Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+OmpA,+a+Coxiella+burnetii.+protein+involved+in+host+cell+invasion,+by+multi-phenotypic+high-content+screening.">Identification of OmpA, a Coxiella burnetii. protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening.</a> PLoS pathogens. 10 (3), e1004013 (2014).</li><li>Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Ber&#243;n, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+autophagic+pathway+is+actively+modulated+by+phase+II+Coxiella+burnetii.+to+efficiently+replicate+in+the+host+cell.">The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii. to efficiently replicate in the host cell.</a> Cellular microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).</li><li>Newton, H. J., Mcdonough, J. a., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+protein+translocation+by+the+Coxiella+burnetii.+Dot/Icm+type+IV+secretion+system+requires+endocytic+maturation+of+the+pathogen-occupied+vacuole.">Effector protein translocation by the Coxiella burnetii. Dot/Icm type IV secretion system requires endocytic maturation of the pathogen-occupied vacuole.</a> PloS one. 8 (1), e54566 (2013).</li><li>Vogel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+tiger+into+a+house+cat:+using+Legionella+pneumophila.+to+study+Coxiella+burnetii..">Turning a tiger into a house cat: using Legionella pneumophila. to study Coxiella burnetii..</a> Trends in microbiology. 12 (3), 103-105 (2004).</li><li>Van Schaik, E. J., Chen, C., Mertens, K., Weber, M. M., Samuel, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+the+obligate+intracellular+bacterium+Coxiella+burnetii.">Molecular pathogenesis of the obligate intracellular bacterium Coxiella burnetii.</a> Nature reviews. Microbiology. 11, 561-573 (2013).</li><li>Beare, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dot/Icm+type+IVB+secretion+system+requirements+for+Coxiella+burnetii+growth+in+human+macrophages.">Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages.</a> mBio. 2, (2011).</li><li>Omsland, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+from+animal+tissue+and+genetic+transformation+of+Coxiella+burnetii.+are+facilitated+by+an+improved+axenic+growth+medium.">Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii. are facilitated by an improved axenic growth medium.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (11), 3720-3725 (2011).</li><li>Beare, P. a., Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Advances+in+genetic+manipulation+of+obligate+intracellular+bacterial+pathogens.">a Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens.</a> Frontiers in microbiology. 2 (May), 97 (2011).</li><li>Brodin, P., Christophe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+screening+in+infectious+diseases.">High-content screening in infectious diseases.</a> Current opinion in chemical biology. 15 (4), 534-539 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

وقد أثبتت دراسة التفاعلات المضيف / الممرض أن تكون طريقة رائعة لفهم الالتهابات البكتيرية ووضع استراتيجيات بديلة لمواجهة الأمراض المعدية. ولكن نظرا لتنوع الاستراتيجيات التي وضعتها مسببات الأمراض البكتيرية المختلفة، وتحديد وتوصيف عوامل الفوعة البكتيرية وللمضيف مسارات الإشارات التي تستهدف خلال العدوى تمثل تحديا حقيقيا. هذا يدعو إلى تطوير أساليب جديدة لتحديد نطاق واسع من المحاور الرئيسية تفاعل المضيف / الممرض. التطورات الأخيرة في المبتكرة، عالية الإنتاجية وتقنيات فحص عالية المحتوى تمثل مصدرا قيما التي يمكن تكييفها لدراسة مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا 15. هنا، وقد استخدمنا الحيوانية البكتيرية الممرضة الكوكسيلا البورنيتية كنموذج لوضع نهج الفحص التي تجمع بين الطفرات ينقول والمقايسات القائم على مضان. الاهميهTLY، وهذا الأسلوب يسمح فحص رصد في وقت واحد من خطوات متعددة من دورة الخلايا الكوكسيلا، وتوفير نظرة شاملة للاستراتيجيات التي وضعتها هذه البكتيريا لغزو وتكرارها وتستمر داخل الخلايا المصابة. ويستند هذا النهج المبين هنا على اثنين من تقنيات راسخة، الطفرات ينقول والمقايسات القائم على مضان، والتي تم تطبيقها بنجاح في دراسة مسببات الأمراض البكتيرية. الجمع بين هذه التقنيات في سياق شاشات عالية الإنتاجية / عالية المحتوى يسمح لنا لتقييم الآثار المترتبة على عدد كبير من الطفرات البكتيرية عن طريق تحليل عدد كبير جدا من الأحداث (عادة 15000 الخلايا المصابة في الطفرات البكتيرية يتم تصويرها وتحليلها). وهذا يوفر تحليلا إحصائيا مهما من أحداث مثل الغزو الجرثومي للخلايا المضيفة وتكرار داخل الخلايا، والتي هي، بطبيعتها، تخضع لتقلبات عالية. من المهم أن نلاحظ أن خطوط الخلايا الأخرى من الجيش الشعبيithelial يمكن استخدامها لهذا النوع من الفحص. ومع ذلك، الخلايا الظهارية مسطحة وكبيرة هي الأمثل لتحليل الصور كما عضيات الخلية المضيفة هي أسهل للكشف. لأن الغالبية العظمى من المجاهر الآلي يمكن التعامل تلقائيا عدد كبير من لوحات، وتكاد لا توجد أية حدود لعدد من المسوخ التي يمكن فرزهم في وقت واحد. اعتمادا على العوامل المسببة للأمراض، يمكن للمستخدم امتياز استخدام وسيلة epifluorescence أو المجهر متحد البؤر. ووقت الحصول على الصور تعتمد في الغالب على حساسية الكاميرا المجهر، على عدد من المجالات المكتسبة لكل بئر وعلى عدد من القنوات المكتسبة في مجال الرؤية. يمكن للمستخدم أن تقرر كيفية ضبط هذه العوامل لتحسين بروتوكول الفرز. وكمثال على ذلك، ونحن تصوير واحدة 96-جيدا لوحة / ساعة باستخدام الظروف المشار إليها في النقطة 5.1. تحليل الصور يعتمد إلى حد كبير على الجهاز (أو مجموعة من الآلات) المستخدمة. نستخدم النواة 12 (2 × 3.06 جيجاهرتز 6 النواة)، 48 GB RAM محطة العمل. هذا الجهاز يتطلب يقاربالمطاف 40 دقيقة لتحليل الصور تم الحصول عليها من لوحة واحدة. أحد الجوانب الهامة التي يجب أخذها في الاعتبار عند وضع هذه المقايسات هو مجموعة تتكون من جديد (أو الاستفادة المثلى من القائمة) بروتوكولات للسماح للتلاعب وتجهيز عدد كبير من العينات. والمثال النموذجي هو تطوير مستعمرة التمهيدي PCR نهج واحد، الأمر الذي سمح لنا لتضخيم بسرعة وشظايا تسلسل الكوكسيلا DNA يحتوي على موقع الإدراج كل ينقول، من عينات صغيرة جدا. بناء على خبرتنا، والبلمرة عالية الدقة لابد من اختيارها بعناية واختبارها من أجل الحصول على نتائج يمكن استنساخه. والقيد الوحيد من هذا النهج قد يخفي في مراقبة ذلك، في معظم الحالات، حوالي 30٪ من العينات المصنعة ليست عرضة للاستغلال، إما بسبب PCR أو الخطوات التسلسل. ومع ذلك، معتبرا أن عزل الجديدة المسوخ ينقول الكوكسيلا ليس الحد من معدل خطوة، وهذا لا ممثلى أعضاءأرسلت قضية رئيسية. وبالمثل، فإن تطوير مقايسة موثوقة لقياس تركيز البكتيريا الأسهم متحولة الرئيسي لهذا النهج. نظرا لميل الكوكسيلا لتجميع عندما تكون في تعليق، واستخدام قراءات الكثافة الضوئية لا ينطبق على حساب تركيز الثقافات الكوكسيلا والبديل موجود الوحيد كان الكمي PCR (QPCR). هنا، استخدام DNA وكيل الإقحام الموسومة fluorescently تسريع بشكل ملحوظ البكتيريا الكميات. وهذا النهج يمكن أيضا الاستفادة من استخدام خطوط الخلايا مستقرة التعبير عن علامات الفلورسنت لعدة حجرات داخل الخلايا اعتمادا على العوامل المسببة للأمراض المستخدمة. جانب مهم آخر هو استخدام وسائل الإعلام ثقافة الخلية خالية من الفينول الأحمر. لاحظنا أن هذا مؤشر الرقم الهيدروجيني له مضان الطبيعي الذي يمتد الطيف الأحمر والأخضر الذي يشبع الإشارات المسجلة على القارئ مضان الآلي. تيانه الاستراتيجية المقدمة هنا تعتمد على العشوائية ينقول الطفرات. لطفرات من الفائدة، نوصي التحقق من صحة التبديلات فريدة من نوعها (وقابلية التنسيل) باستخدام صمة عار الجنوبية والتكبير PCR للموقع ينقول الإدراج. إلى جانب معدات الموضحة في قسم البروتوكول، فرق الراغبة في استخدام نهج فحص المعروضة هنا، سوف تأخذ ميزة كبيرة في مجموعة تتكون من قاعدة بيانات علائقية لجمع البيانات، الخادم لتخزين البيانات ومحطة عمل لتحليل الصور السريع. الأهم من ذلك، وفرت طريقة الموصوفة هنا هي مناسبة لدراسة مسببات الأمراض البكتيرية بين الخلايا الأخرى وجود أسلوب الطفرات العشوائية لمسببات المرض، خطوط الخلايا يمكن أن يصاب من قبل الممرض وهذا واحد يعرض النمط الظاهري محددة خلال العدوى.

والناشئة، والبكتيريا المتوطنة الكوكسيلا البورنيتية هو المسؤول عن تفشي كبيرة من حمى Q، موهنة شبيهة بأعراض الانفلونزا حيواني المنشأ مع صحية حادة والأثر الاقتصادي 1. الخزانات الرئيسية للالكوكسيلا هي الحيوانات المنزلية والزراعية، وتشير التقديرات إلى أن أكثر من 90٪ من الأبقار الحلوب في الولايات المتحدة تحمل C. البورنيتية 2. البشر هم المضيفين من قبيل الصدفة ان يصاب عن طريق الاستنشاق من الهباء الجوي الملوث. يظهر حمى Q الإنسان إما مرض حاد أو مزمن، والتي قد يكون لها مضاعفات مميتة مع معدل وفيات تصل إلى 65٪ 1،3. مع جرعة المعدية من 1-10 الكائنات الحية، الكوكسيلا هي العوامل المسببة للأمراض المعدية الأكثر المعروفة وكانت قد أجرت التحقيق أنها المحتملين الحيوي سلاح 4. اندلاع ناسفة في الآونة الأخيرة حمى Q في هولندا (2007 - 2010)، مع الحالات تتصاعد من 182 إلى أكثر من 2000 في السنة، وتقف كمثال على الفوعة الشديدة من هذا الممرض5. كفاءة ملحوظة من التهابات الكوكسيلا المرجح يرتبط مع مقاومته للإجهاد البيئي، جنبا إلى جنب مع التكيف الفريد للخلايا المضيفة. في الواقع، الكوكسيلا موجود في البيئة في شكل غير نشطة عملية الأيض المتغيرات زنزانة صغيرة (SCV)، والتي هي مقاومة ملحوظة لعدة ظروف قاسية (جفاف، ودرجة الحرارة، وغيرها). تؤخذ SCVs من قبل الخلايا البلعمية عبر α V β 3 integrins 6 في حين يتم بوساطة غزو الخلايا غير البلعمية من قبل الكوكسيلا التصاق / الغزو OmpA 7 ومستقبلات بعد مجهولين. بعد امتصاص، الكوكسيلا يقيم في فجوات ضيقة، سواء كان إيجابيا للعلامات endosomal مبكرة Rab5 وEEA1 8. البكتيريا تستجيب للendosomal تحمض عن طريق تحويل إلى المتغيرات زنزانة كبيرة عملية الأيض نشطة (LCVs) وتفعيل نقطة / آي سي إم نوع 4 نظام إفراز (T4SS) 9، مثلي للغاية لأنه من البكتيريا المستروحة 10. إفراز مؤثرات نقطة / آي سي إم تسمح الكوكسيلا لتوليد كبيرة،-LAMP1 إيجابي مقصورة الحمضية التي تحتوي على الانزيمات الليزوزومية نشطة حيث يمكن للبكتيريا تزدهر والعمل بنشاط على حماية الخلايا المصابة من موت الخلايا المبرمج 11. وبالتالي، يتم التحكم في دورة الخلايا من الكوكسيلا من قبل النبات نقطة / آي سي إم بوساطة من المستجيبات البكتيرية 12، ومع ذلك، فإن العوامل الميكروبية المشاركة في غزو الخلية المضيفة، والنسخ البكتيرية ونشر العدوى لا تزال مجهولة إلى حد كبير. الجمع بين الطفرات ينقول والمقايسات القائم على مضان، نحن نعمل على تطوير المناهج مشاركات لتحديد وقت واحد من العوامل البكتيرية المشتركة في الخطوات الرئيسية لالتهابات الكوكسيلا: 1) استيعاب داخل الخلايا المضيفة، 2) تكرار داخل الخلايا، 3) انتشار الخلية الى خلية و4) استمرار. حتى الآن، لدينا فحص ما يزيد على 1000 مترutations في 500 تسلسل الكوكسيلا الترميز، والتي وفرت لنا رؤى غير مسبوقة في التفاعلات المضيف الممرض التي تنظم الكوكسيلا المرضية 7. من المذكرة، فإن هذا النهج يمكن تطبيقها على دراسة مسببات الأمراض بين الخلايا الأخرى التي تشترك في السمات بيولوجيا الخلية مع الكوكسيلا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td align="left">Citric acid</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C0759-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Sodium citrate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>S4641-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Potassium phosphate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>60218-100G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Magnesium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>M2670-100G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Calcium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Iron sulfate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>F8633-250G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Sodium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>S9625-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">L-cysteine</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C6852-25G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Bacto Neopeptone</td>
			<td align="left">BD (Beckton-Dickinson)</td>
			<td>211681</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Casamino acids</td>
			<td align="left">BD (Beckton-Dickinson)</td>
			<td>223050</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Methyl-B-Cyclodextrin</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C4555-10G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">RPMI w/glutamax</td>
			<td align="left">Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">RPMI w/glutamax, without phenol red</td>
			<td align="left">Gibco</td>
			<td>32404-014</td>
			<td align="left">For cell culture and infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Fetal Bovine Serum</td>
			<td align="left">GE healthcare</td>
			<td>SH30071</td>
			<td align="left">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Trypsin EDTA (0.25%)</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td align="left">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Saponin</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>47036</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Ammonium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Bovine Serum Albumine</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Electroporation cuvette 0.1 cm</td>
			<td align="left">Eurogentec</td>
			<td>ce0001-50</td>
			<td align="left">For Coxiella transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Trackmates screw top tubes with caps&#160;</td>
			<td align="left">Thermo Scientific</td>
			<td>3741</td>
			<td align="left">2D barcoded screwcap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well microplate with black walls and bottom&#160;</td>
			<td align="left">Greiner</td>
			<td>655076</td>
			<td align="left">Flat dark bottom, for dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well microplate, &#65533;&#65533;clear, black walls</td>
			<td align="left">Greiner</td>
			<td>655090</td>
			<td align="left">Flat transparent bottom, for cell culture and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well PCR microplate</td>
			<td align="left">Biorad</td>
			<td>2239441</td>
			<td align="left">DNAse/RNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well plate, Deepwell</td>
			<td align="left">Labcon</td>
			<td>949481</td>
			<td align="left">For Coxiella mutants infections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">PicoGreen</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>P7581</td>
			<td align="left">For dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Triton X-100&#160;</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td align="left">For dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Phusion High fidelity DNA Polymerase</td>
			<td align="left">New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td align="left">For single primer colony PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Celltracker Red CMTPX</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>C34552</td>
			<td align="left">For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Anti-LAMP1 antibody</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>94403-1ML</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Hoechst 33258</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>L1418</td>
			<td align="left">For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro</td>
			<td align="left">Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Epifluorescence automated microscope Cellomics</td>
			<td align="left">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and multi-phenotypic high-content screening of coxiella burnetii transposon mutants

غزو ​​واستعمار الخلايا المضيفة التي كتبها مسببات الأمراض البكتيرية تعتمد على نشاط عدد كبير من البروتينات بدائية النواة، الذي يعرف بأنه عوامل الفوعة، والتي يمكن تخريب والتلاعب وظائف المضيفة الرئيسية. دراسة التفاعلات المضيف / الممرض ولذا فإن من المهم جدا فهم الالتهابات البكتيرية ووضع استراتيجيات بديلة لمواجهة الأمراض المعدية. هذا النهج ومع ذلك، يتطلب تطوير فحوصات عالية الإنتاجية الجديدة للمتحيز، وتحديد الآلية وتوصيف محددات الفوعة البكتيرية. هنا، نحن تصف طريقة لتوليد مكتبة متحولة الموسومة GFP التي كتبها ينقول الطفرات وتطوير فحص عالية المحتوى نهج لتحديد وقت واحد من عدة الظواهر المرتبطة ينقول. لدينا نموذج عمل هو داخل الخلايا البكتيرية البورنيتية الممرض الكوكسيلا، العامل المسبب للمرض من هذه الأمراض حمى Q، الذي يرتبط مع ذاتهاتفشي فير مع ما يترتب على صحة والعبء الاقتصادي. طبيعة الخلايا تلزم هذه العوامل المسببة للأمراض وحتى وقت قريب، أعاقت بشدة تحديد العوامل البكتيرية تشارك في التفاعلات الممرض المضيف، مما يجعل من الكوكسيلا النموذج المثالي لتنفيذ النهج عالية الإنتاجية / عالية المحتوى.

على عزل المسوخ ينقول، مستعمرة التمهيدي واحدة PCR هو القوي، طريقة الإنتاجية العالية لتحديد موقع ينقول الإدراج لكل متحولة. هذا النهج مستمد من بروتوكول PCR متداخلة نموذجية ولكن هنا التمهيدي واحد يهجن تحديدا و / أو غير تحديدا على الحمض النووي القالب اعتمادا على التشدد في درجة الحرارة الصلب (الشكل 1A). تتكون المنتجات PCR نموذجية من شظايا متعددة DNA، وهي في معظمها محددة (الشكل 1B). استخدام التمهيدي التسلسل المختلفة التي anneals الحق المنبع من ITR ينقول، والمصب من تسلسل المعترف بها من قبل التمهيدي التضخيم يوفر خصوصية للخطوة التسلسل (الشكل 1C). برامج الحاسوب الآلي لتحليل تسلسل محاذاة تسلسل الحصول على الجينوم الكوكسيلا تقديم الموقع الدقيق للالإدراج ينقول (الشكل 1C). ويمكن لجميع الملاحق ينقول عندئذ آنotated على الجينوم الكوكسيلا (1D الشكل). يتم عزل كل متحولة الكوكسيلا وتضخيم axenically في ACCM-2 متوسطة قبل إما تخزين أو فحص الشكل 2 يوضح مثال 38 المسوخ ينقول في 16 نقطة / ICM الجينات الكوكسيلا (الشكل 2A). لتقييم الجدوى من المسوخ الكوكسيلا، ويتم الحصول على منحنيات النمو ممحوضة عن طريق أخذ عينات الثقافات البكتيرية لمدة 7 أيام بعد التلقيح وتطبيق فحص تركيز البكتيريا وصفها في 1.5 (Figurie 2B). ثم يتم تحضين المسوخ تضخيم مع الخلايا الظهارية، في ثلاث نسخ لوحات 96-جيدا لمدة 7 أيام. كل المسوخ الكوكسيلا ولدت يجري الموسومة GFP، ويتم الحصول على منحنيات النمو داخل الخلايا عن طريق قياس كثافة GFP مضان من كل جانب، كل 24 ساعة، والتآمر القيم المقاسة بوصفها وظيفة من الزمن (الشكل 2C). INTRتوفر منحنيات النمو ديكي التحليل الكمي من الظواهر المرتبطة مع كل الإدراج ينقول في الجينوم الكوكسيلا. لإضافة معلومات نوعية حول نفس المسوخ ينقول، اخترنا لاكتساب صورة الآلي والتحليل. سبعة أيام إصابة آخر، يتم إصلاحها لوحات، والمجهزة للالمناعي كما هو موضح في 4 و تحليلها باستخدام الآلي، المجهر epifluorescence كما هو موضح في الصورة 5. الآلي برامج التحليل مثل CellProfiler (معهد برود، <a href="http://www.cellprofiler.com/" target="_blank">www.cellprofiler.com</a> ) بمعالجة قنوات المكتسبة بشكل مستقل والقطاعات التي تم تحديدها الأجسام للتحليل المقارن (الشكل 3). وهذا يسمح للتحديد وتوصيف الصرفي من نوى الخلايا المضيفة، ملامح الخلية، الجسيمات الحالة والمستعمرات الكوكسيلا (الشكل 3 العليا لوحات). ربط المستعمرات الكوكسيلا مع الخلايا والجسيمات الحالة يسمح للidentificatiعلى والتحليل الصرفي محدد من الكوكسيلا الفجوات التي تحتوي (والتي هي LAMP1 إيجابي، الشكل 3 اللوحة اليسرى السفلى). ربط المستعمرات الكوكسيلا مع ملامح الخلية المضيفة يسمح للتحديد وتحليل الصرفي محدد من الخلايا المصابة (الشكل 3 أسفل لوحة في الوسط). وأخيرا، يتم دمج 4 قنوات من أجل التوضيح وأغراض مراقبة الجودة (الشكل 3 اللوحة اليمنى السفلى). البيانات التي تم الحصول عليها من تحليل الصور الآلي يمكن رسم ضد بعضها البعض للحصول على &quot;المؤامرات مبعثر متعددة المظهرية&quot;. على سبيل المثال، في الشكل 4A متوسط ​​مساحة (في ميكرون 2) من المستعمرات الكوكسيلا المرسومة ضد عدد من المستعمرات في كل خلية (الشكل 4A)، من أجل تحديد الطفرات التي تؤثر على تكرار الخلايا من الكوكسيلا (تكرار النمط الظاهري) و / أو قدرة البكتيريا على غزو الخلايا المضيفة (الغائرlization النمط الظاهري). تم استخدام التحليل الإحصائي لتحديد المناطق في الناتج مؤامرة مبعثر الموافق خفيفة (-4 &lt;Z-درجة ≤ -2) والشديدة (Z-درجة ≤ -4) الظواهر. وقد لوحظت المسوخ في 3 مجموعات رئيسية: تم تجميع الطفرات التي أسفرت عن نمو الخلايا عيب من الكوكسيلا في اليسرى معظم جزء من مؤامرة (الشكل 4A، والوردي والنقاط الحمراء)؛ تم تجميع الطفرات التي تؤثر على استيعاب الكوكسيلا في الخلايا في الجزء السفلي من مؤامرة (الشكل 4A، وعلى ضوء الأزرق الداكن نقاط) وأخيرا، النقاط الخضراء في أقصى اليمين المنطقة من مؤامرة تتوافق مع الطفرات الناتجة في الظواهر غير هامة ( Z-درجة&gt; -2). الأهم من ذلك، المسوخ التي تفشل في تكرار لكنها لا تزال قادرة على غزو الخلايا المضيفة، يتم الكشف بعد 7 أيام من العدوى عن البكتيريا واحدة، أو مستعمرات صغيرة، المجاورة لاستضافة نواة الخلية (الشكل 4C، الفريق الثاني). وبالتالي، فإن حجم الكوكسيلا &quot;كولوالاقتصادات الحديثة التصنيع &quot;ستتأثر بشكل كبير إلا أن عدد الخلايا المصابة لا تختلف بالمقارنة مع خلايا -infected WT الكوكسيلا. على العكس من ذلك، والطفرات التي تؤثر على قدرة الكوكسيلا لغزو الخلايا المضيفة تؤدي إلى انخفاض في عدد المستعمرات / خلية. عندما يكون هذا الرقم هو أقل بكثير من 1، فإنه يشير إلى أنه، في المتوسط، هناك انخفاض في العدد الكلي للخلايا المصابة. بدلا من ذلك، كان متوسط ​​مساحة (في ميكرون 2) من المستعمرات الكوكسيلا يمكن رسم على عدد من الخلايا المضيفة على قيد الحياة العدوى (الشكل 4B)، لتحديد الطفرات التي تضفي السمية الخلوية لالكوكسيلا (النمط الظاهري السامة للخلايا). على النحو الوارد أعلاه، تم استخدام التحليل الإحصائي لتحديد المناطق في الناتج مؤامرة مبعثر الموافق خفيفة (-4 &lt;Z-درجة ≤ -2) والشديدة (Z-درجة ≤ -4) الظواهر. الأكثر عرضه لم الطفرات لا تؤثر تأثيرا كبيرا على بقاء الخلية، بغض النظر عن تكرار البكتيريا داخل المضيفالخلايا (الشكل 3B النقاط الخضراء). وكانت 37 الطفرات بقاء الخلية المضيفة المتضررين بشكل معتدل (الشكل 3B، النقط الحمراء الخفيفة)، و 7 الطفرات الضارة لا سيما لاستضافة بقاء الخلية (الشكل 3B، بقع حمراء داكنة). يرجى ملاحظة أن المعلمات الإضافية التي حصلت عليها صورة إجراء التحليل الآلي يمكن استخدامها لاستخلاص المخططات الأخرى، وفقا لاحتياجات التجريبية. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" width="700" /> يستخدم تسلسل والشرح من الكوكسيلا المسوخ ينقول (A) التمهيدي واحدة مستعمرة PCR لتضخيم شظايا الحمض النووي الذي يحتوي على موقع ينقول الإدراج: الرقم 1. يتم استخدام التمهيدي التضخيم (الأمبير) على حد سواء باعتبارها التمهيدي محدد وغير محدد اعتمادا على التشدد في درجة الحرارة الصلب. (B) نتيجة النموذجية للمستعمرة واحدة التمهيدي PCR. كل reactiعلى تنتج عددا من شظايا من حجم متغير، وبعضها يحتوي الموقع ينقول الإدراج. البعض الآخر وتتضخم بشكل عشوائي بوصفه من المنتجات من انخفاض صرامة PCR دورة. (C) استخدام التمهيدي تسلسل (تسلسل) أن يهجن لتسلسل ينقول يسمح تسلسل شظايا من الفائدة. برنامج (D) تحليل تسلسل يسمح الشرح التلقائي الإدراج ينقول على جينوم بكتيري. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" width="700" /> الشكل 2: ممحوضة والنمو داخل الخلايا الكوكسيلا المسوخ ينقول (A) في شاشة الطيار، لقد عزل، التسلسل وفحص 38 المسوخ ينقول في الأساسية 16 زأنيس للنظام إفراز نقطة / ICM الكوكسيلا (أشار باللون الأحمر). (B) من أجل تقييم جدوى كل متحولة ينقول، ونمو كل عزل في ممحوضة مستنبت يتم رصد أكثر من 8 أيام باستخدام الموسومة fluorescently وكيل الإقحام DNA. يستخدم بعد ذلك (C) كل متحولة لتصيب الخلايا الظهارية. كما ينقول يمتلك الكاسيت GFP، ويتم رصد نمو البكتيريا داخل الخلايا خلال 7 أيام من العدوى عن طريق اتباع أشكال مختلفة من مضان GFP المرتبطة الكوكسيلا النسخ المتماثل باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" width="700" /> الرقم 3: الآلي تحليل الصور من التهابات الكوكسيلا لصناعة السيارات.ويستخدم المجهر epifluorescence تزاوج إلى صورة 21 مناصب لكل بئر من ثلاث نسخ لوحات 96-جيدا. شرائح برمجيات تحليل الصور الكائنات في كل القنوات المكتسبة للالكمي والتحليل. في جميع الحالات، يتم استبعاد الأشياء لمس الحدود من الصور. (A) ويستخدم قناة هويشت لتحديد نواة الخلية المضيفة (دائري باللون الأخضر). (B) وتستخدم هذه البذور لتحديد ملامح الخلية المضيفة في القناة CY3 (وحلقت موقف نوى في الزرقاء، ملامح الخلية هي باللون الأخضر). (C) ويستخدم قناة Cy5 لتحديد مقصورات LAMP1 الإيجابي (دائري باللون الأخضر)؛ فقط يتم الاحتفاظ الكائنات المدرجة في محيط الخلية التي تم تحديدها سابقا (باللون الأحمر) لتحليل الصور. يستخدم (D) القناة GFP لتحديد المستعمرات الكوكسيلا (دائري باللون الأخضر). (E) ربط المستعمرات الكوكسيلا مع مقصورات LAMP1 إيجابي يسمح بتحديد الكوكسيلا </em&gt; الفجوات التي تحتوي (CCVs)؛ فقط يتم الاحتفاظ الكائنات المدرجة في محيط الخلية التي تم تحديدها سابقا (باللون الأخضر) لتحليل الصور. (F) ربط المستعمرات الكوكسيلا مع ملامح خلية يسمح بتحديد الخلايا المصابة (pseudocolored). (G) الصور المكتسبة في القنوات مضان 4 (الموافق المستعمرات الكوكسيلا (الأخضر)، ونواة الخلية المضيفة (الأزرق)، وغشاء الخلية المضيفة البلازما (الرمادي)، مقصورات LAMP1 إيجابي (الحمراء)) تم دمجها واستخدامها من أجل التوضيح والجودة التحكم. على نطاق ويمنع 10 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" width="700" /> الرقم 4: تحديد نطاق واسع من العوامل الكوكسيلا تشارك في المضيف / تتفاعل العوامل المسببة للأمراضالأيونات. (A) منطقة المتوسط ​​(في ميكرون 2) من المستعمرات الكوكسيلا يتم رسم مقابل العدد النسبي للمستعمرات في كل خلية، لتحديد التكرار واستيعاب الظواهر المثيرة للاهتمام. وتمثل النقاط الخضراء الظواهر التي تحيد عن WT الكوكسيلا من Z-درجة&gt; -2 (لا كبيرة). الوردي والأزرق الفاتح النقاط تمثل تكرار واستيعاب الظواهر على التوالي، مع Z-النتيجة بين -2 و -4 (الظواهر خفيفة). الأحمر والأزرق الداكن النقاط تمثل الظواهر مع ≤ Z-درجة -4 (الظواهر قوية). وقد تآمر (B) ومتوسط ​​مساحة (في ميكرون 2) من المستعمرات الكوكسيلا ضد العدد الكلي للخلايا (المصابين وغير المصابين) التي نجت 7 أيام من العدوى لتقدير تأثير السامة للخلايا الناتجة من عمليات الإدراج ينقول. وتمثل النقاط الخضراء الظواهر التي تحيد عن WT الكوكسيلا من Z-درجة&gt; -2 (لا كبيرة). النقاط الوردية تمثل السامة للخلايا فتاهenotypes مع Z-النتيجة بين -2 و -4 (الظواهر خفيفة). وتمثل النقاط الحمراء الظواهر السامة للخلايا مع ≤ Z-درجة -4 (الظواهر قوية). السهام تشير المسوخ يتضح من حرف صغير المقابلة في C. (C) صور الممثل النسخ المتماثل، واستيعاب والظواهر السامة للخلايا. في جميع الحالات، نواة الخلية المضيفة باللون الأحمر، المستعمرات الكوكسيلا هي باللون الأخضر. على نطاق ويمنع 50 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants at JoVE.com

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

الكوكسيلا البورنيتية هو سلبية الغرام بين الخلايا بكتيريا تلزم مسؤولة عن حمى المرض Q الحيوانية. نحن هنا وصف الطرق لتوليد الكوكسيلا المسوخ ينقول الفلورسنت وكذلك تحديد الآلية وتحليل الناتج الداخلي، والنسخ والسامة للخلايا الظواهر.

جيل ومتعدد المظهري فحص عالية المحتوى من<em&gt; الكوكسيلا البورنيتية</em&gt; المسوخ ينقول

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

generation-multi-phenotypic-high-content-screening-coxiella-burnetii

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

9.7K Views.  Université Montpellier.  الكوكسيلا البورنيتية هو سلبية الغرام بين الخلايا بكتيريا تلزم مسؤولة عن حمى المرض Q الحيوانية. نحن هنا وصف الطرق لتوليد الكوكسيلا المسوخ ينقول الفلورسنت وكذلك تحديد الآلية وتحليل الناتج الداخلي، والنسخ والسامة للخلايا الظواهر. ...

Video: Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

شاشة الوراثية لعزل التوكسوبلازما جوندياي المسوخ الخروج المضيف الخلية

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and observation, as well as the fact that compounds can simply be added to the bathing water and are readily absorbed when administered in a &lt;1% DMSO solution. Due to the optical clarity of zebrafish larvae and the availability of transgenic lines expressing fluorescent proteins in leukocytes, zebrafish offer the unique advantage of monitoring an acute inflammatory response in vivo. Consequently, utilizing the zebrafish for high-content small molecule screens aiming at the identification of immune-modulatory compounds with high throughput has been proposed3-6, suggesting inflammation induction scenarios e.g. localized nicks in fin tissue, laser damage directed to the yolk surface of embryos7 or tailfin amputation3,5,6. The major drawback of these methods however was the requirement of manual larva manipulation to induce wounding, thus preventing high-throughput screening. Introduction of the chemically induced inflammation (ChIn) assay8 eliminated these obstacles. Since wounding is inflicted chemically the number of embryos that can be treated simultaneously is virtually unlimited. Temporary treatment of zebrafish larvae with copper sulfate selectively induces cell death in hair cells of the lateral line system and results in rapid granulocyte recruitment to injured neuromasts. The inflammatory response can be followed in real-time by using compound transgenic cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 zebrafish larvae that express a green fluorescent protein in neuromast cells, as well as a red fluorescent protein labeling granulocytes.
In order to devise a screening strategy that would allow both high-content and high-throughput analyses we introduced robotic liquid handling and combined automated microscopy with a custom developed software script. This script enables automated quantification of the inflammatory response by scoring the percent area occupied by red fluorescent leukocytes within an empirically defined area surrounding injured green fluorescent neuromasts. Furthermore, we automated data processing, handling, visualization, and storage all based on custom developed MATLAB and Python scripts.
In brief, we introduce an automated HC/HT screen that allows testing of chemical compounds for their effect on initiation, progression or resolution of a granulocytic inflammatory response. This protocol serves a good starting point for more in-depth analyses of drug mechanisms and pathways involved in the orchestration of an innate immune response. In the future, it may help identifying intolerable toxic or off-target effects at earlier phases of drug discovery and thereby reduce procedural risks and costs for drug development.

Here we describe a novel high-content chemically induced inflammation assay aiming at the identification of immune-modulatory bioactives. We have successfully combined automated microscopy with custom developed software scripts enabling automated quantification of the inflammatory response as well as further data processing, analysis, mining, and storage.

تسهيل اكتشاف المخدرات: مؤتمتة فحص التهاب عالية المحتوى في الزرد

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

piggyBac تعديل النظام الأساسي للخلايا ينقول T الإنسان

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

فحص فينوطيبيك مجهري للقياس الكمي للبكتيريا الفطرية داخل الخلايا المكيفة للفحص عالي الإنتاجية/عالي المحتوى

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial pathogen which establishes chronic pulmonary infections in patients with cystic fibrosis (CF). The overproduction of a capsular polysaccharide called alginate, also known as mucoidy, promotes the formation of mucoid biofilms which are more resistant than planktonic cells to antibiotic chemotherapy and host defenses. Additionally, the conversion from the nonmucoid to mucoid phenotype is a clinical marker for the onset of chronic infection in CF. Alginate overproduction by P. aeruginosa is an endergonic process which heavily taxes cellular energy. Therefore, alginate production is highly regulated in P. aeruginosa. To better understand alginate regulation, we describe a protocol using the mini-himar1 transposon mutagenesis for the identification of novel alginate regulators in a prototypic strain PAO1. The procedure consists of two basic steps. First, we transferred the mini-himar1 transposon (pFAC) from host E. coli SM10/&#955;pir into recipient P. aeruginosa PAO1 via biparental conjugation to create a high-density insertion mutant library, which were selected on Pseudomonas isolation agar plates supplemented with gentamycin. Secondly, we screened and isolated the mucoid colonies to map the insertion site through inverse PCR using DNA primers pointing outward from the gentamycin cassette and DNA sequencing. Using this protocol, we have identified two novel alginate regulators, mucE (PA4033) and kinB (PA5484), in strain PAO1 with a wild-type mucA encoding the anti-sigma factor MucA for the master alginate regulator AlgU (AlgT, &#963;22). This high-throughput mutagenesis protocol can be modified for the identification of other virulence-related genes causing change in colony morphology.

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Here we describe a protocol using the mini-himar1 mariner transposon-mediated mutagenesis for generating a high-density insertion mutant library to screen, isolate and identify novel alginate regulators in the prototypic Pseudomonas aeruginosa strain PAO1.

تحديد جينات جديدة ترتبط مع الجينات في الإنتاج<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; استخدام ميني<em&gt; himar1</em&gt; مارينر الطفرات ينقول بوساطة

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

تطوير بوساطة حلقة-المجففة بالتبريد متساوي التضخيم الكواشف للكشف عن<em&gt; الكوكسيلا البورنيتية</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

تطبيق نقل الإسفار الرنين الطاقة (الحنق) لدراسة المستجيب إزفاء الكفاءة من قبل<em&gt; الكوكسيلا البورنيتية</em&gt; أثناء سيرنا إسكات

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness during infection of Golden Syrian hamsters. Tn-Seq combines random transposon mutagenesis with the power of high-throughput sequencing technology. Animals are challenged with a pool of transposon mutants (input pool), followed by harvesting of blood and tissues a few days later to identify and quantify the number of mutants in each organ (output pools). The output pools are compared to the input pool to evaluate the in vivo fitness of each mutant. This approach enables screening of a large pool of mutants in a limited number of animals. With minor modifications, this protocol can be performed with any animal model of leptospirosis, reservoir host models such as rats and acute infection models such as hamsters, as well as in vitro studies. Tn-Seq provides a powerful tool to screen for mutants with in vivo and in vitro fitness defects.

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

We describe here a technique that combines transposon mutagenesis with high-throughput sequencing to identify and quantify transposon leptospiral mutants in tissues after a challenge of hamsters. This protocol can be used to screen mutants for survival and dissemination in animals and can also be applied to in vitro studies.

التسلسل الفائق موازية "قياس اللياقة البدنية" الإصابة إينتيروجانس Leptospira ينقول الإدراج طفرات خلال الذهبي السوري الهامستر

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa is able to form biofilms, develop antibiotic resistance, produce virulence factors, and rapidly evolve in the course of a chronic infection. Thus P. aeruginosa can cause both acute and chronic, difficult to treat infections, resulting in significant morbidity in certain patient populations. P. aeruginosa strain PA14 is a human clinical isolate with a conserved genome structure that infects a variety of mammalian and nonvertebrate hosts making PA14 an attractive strain for studying this pathogen. In 2006, a nonredundant transposon insertion mutant library containing 5,459 mutants corresponding to 4,596 predicted PA14 genes was generated. Since then, distribution of the PA14 library has allowed the research community to better understand the function of individual genes and complex pathways of P. aeruginosa. Maintenance of library integrity through the replication process requires proper handling and precise techniques. To that end, this manuscript presents protocols that describe in detail the steps involved in library replication, library quality control and proper storage of individual mutants.

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa infection causes significant morbidity in vulnerable hosts. The nonredundant transposon insertion mutant library of P. aeruginosa strain PA14, designated as PA14NR Set, facilitates analysis of gene functionality in numerous processes. Presented here is a protocol to generate high-quality copies of the PA14NR Set mutant library.

النسخ المتماثل لمطلوب، "مكتبة نونريدوندانت" من سلالة الزّنجاريّة Pseudomonas PA14 ينقول طفرات الإدراج

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of antibiotics and other secondary metabolites. Streptomyces coelicolor is a well-characterized, non-pathogenic species that is amenable to a variety of analyses in the lab. The phenotyping methods described here use S. coelicolor as a model streptomycete; however, the methods are applicable to all members of this large genus as well as some closely related actinomycetes. Phenotyping is necessary to characterize new species of Streptomyces identified in the environment, and it is also a vital first step in characterizing newly isolated mutant strains of Streptomyces. Proficiency in phenotyping is important for the many new researchers who are entering the field of Streptomyces research, which includes the study of bacterial development, cell division, chromosome segregation, and second messenger signaling. The recent crowdsourcing of antibiotic discovery through the isolation of new soil microbes has resulted in an increased need for training in phenotyping for instructors new to the field of Streptomyces research and their college or high school students. This manuscript describes methods for bacterial strain propagation, storage, and characterization through visual and microscopic examination. After reading this article, new researchers (microbiology education laboratories and citizen scientists) should be able to manipulate Streptomyces strains and begin visual characterization experiments.

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Here we present protocols for novice researchers to initiate phenotyping for the pharmacologically important bacterial genus Streptomyces.

التقييم المرئية والمجهرية من طفرات إنمائية متسلسلة

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...