فإن الكتاب أود أن أنوه اوليفييه Manches، دكتوراه، دافور Frleta، دكتوراه، وميغان أوبراين، العضو المنتدب لدعمهم وردود الفعل. وأيد هذا البحث من قبل المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية وأنجزت بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة منح روث L. كيرشتاين خدمة أبحاث الجوائز الوطنية للفردي دكتوراه مسبقا الزمالات (F31) لتشجيع التنوع في مجال البحوث الصحية ذات الصلة (AI089030) وRO1 (AI081848 ).

بيان الأخلاق: يتم الحصول على عينات البحوث وتخزينها لأبحاث بموافقة الجهات المانحة. يجب أن تكون مشفرة جميع العينات أو مجهولة المصدر قبل استخدامها. هذا البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية لدينا مجلس المراجعة المؤسساتي. 1. تمايز الإنسان المحيطية وحيدات الدم الى الخلايا الجذعية المشتقة الوحيدات. ملاحظة: المعاطف الشهباء الإنسان بمثابة مصدر خلايا الدم المحيطي الإنسان (PBMCs) والتي تم الحصول عليها من مركز نيويورك الدم (نيويورك، نيويورك). المتبرعين بالدم هم من المتطوعين الأصحاء. يبدأ الإجراء 5 أيام مع الطلاء من خلايا الدم المحيطية الإنسان (PBMCs) على زراعة الأنسجة قوارير 35،36. اختلافات ملحوظة من البروتوكولات نشرت ما يلي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 225 سم 2 غير مولد للحمى القوارير زراعة الأنسجة البوليسترين مع قبعة مرشح التمسك مجموعه 2X10 8 PBMCs في القارورة بدلا من 10 سم لوحة البوليسترين زراعة الأنسجةق (58 سم 2) (الخطوة 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد وسائل الاعلام مع 5٪ مجمعة مصل الإنسان (PHS؛ 30 مل) في 500 مل RPMI-1640 + L-الجلوتامين، عازلة 5 مل 1 M HEPES، و 1.4 مل 50 ملغ / مل جنتاميسين (5٪ PHS وسائل الإعلام)، يليه الترشيح من خلال تصفية 20 ميكرومتر. إضافة ما مجموعه 50 مل 5٪ PHS وسائل الإعلام في 225 سم 2 الأنسجة قارورة الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا انضمت ثلاث مرات مع 25 مل الطازجة RPMI-1640. هزة بقوة لمدة 5 ثوانى أثناء كل غسل ونضح الخلايا غير ملتصقة (الخطوة 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 190 ميكرولتر من 400 وحدة دولية / ميكرولتر IL-4 و 380 ميكرولتر من 100 وحدة دولية / ميكرولتر GM-CSF في قارورة (الخطوة 3) في اليوم 0، 2، و 4. يوم 0 تعرف بأنها ومطلي من PBMCs يوم البداية في الخطوة 1 (الخطوة 8). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم الحصاد 5 moDCs بتركيز الخلايا 1x10 6 / مل (الخطوة 15). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام moDCs على الفور في حالة الراحة الخاصة بهم. الخطوات 17-22 تتم أبدا. ملاحظة: يجب أن تتم معالجة عينات في أقرب وقت ممكن بعد جمع للحصول على أفضل النتائج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> moDCs قسامة في تركيزاتنشوئها من الخلايا 2X10 5 / جيد (200 ميكرولتر / جيد من الخلايا 1x10 6 / مل) في 96 لوحة جيدا القاع جولة (لطخة غربية، ELISA، نظام مراقبة الأصول الميدانية) أو الصعود إلى chamberslide بولي-L-يسين المعالجة (المجهر) للتجريب . ملاحظة: هناك على الأقل 4 الشروط: unstimulated تماما (المراقبة السلبية)، فتيلة فقط، وتفعيل فقط، وفتيلة تليها التنشيط. يمكن توسيعها لتشمل الضوابط الظروف مخفف لR848 وnigericin اذا شئت. إذا كان فحص المصب هو ICS، التكرارات ضرورية لعناصر نمط إسوي. </li></ol> 2 فتيلة Inflammasome - إشارة 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة مجفف بالتجميد R848 في DMSO وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تمييع الأسهم تعمل على RT مع RPMI-1640. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة R848 بتركيز نهائي 10 ميكرومتر أن تخصص الآبار لمدة 18 ساعة. خلايا مكان في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. </li></ol> 3 تفعيل NLRP3 Inflammasome - الإشارة2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة nigericin مجفف بالتجميد في الإيثانول وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تمييع الأسهم تعمل على RT مع RPMI-1640 قبل إضافة إلى الظروف الملائمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة nigericin بتركيز نهائي 20 ميكرومتر والعودة إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 6 ساعة. تحدث أية خطوات غسل بين فتيلة وأثناء التنشيط. ملاحظة: إفراز IL-1β وبنسبة حضور ionophores الكالسيوم، brefeldin A، مونينسين، نيتروفينول، أو الكربونيل السيانيد chlorophenylhydrazone 37، 38. لذلك، لا ينصح بإضافة هذه المثبطات إفرازية عند تحليل فتيلة inflammasome أو النشاط لأنه سوف يغير إفراز IL-1β. </li></ol> 4. IL-1SS جمع العينات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لوحة مع الخلايا وsupernatants في 974 x ج لمدة 3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دون الإخلال بيليه الخلية، ونضح طاف ونقلها لكماeparate القاع جولة لوحة من أجل قياس إفراز السيتوكينات من supernatants. ملاحظة: Supernatants يمكن تخزينها مؤقتا في -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الكريات الخلوية ثلاث مرات مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X في 974 x ج لمدة 3 دقائق لإزالة أي خارج الخلية IL-1β من العينات الخلوية. ملاحظة: عند غسل الكريات خلية من 96 لوحة جيدا، وإزالة يغسل السريع لوحة انعكاس إلى بن جمع وذلك لعدم إزعاج العينة. </li></ol> 5. قياس IL-1SS من الخلوية وطاف عينات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا تلطيخ خلوى (ICS): يوصف بروتوكول ICS أدناه 39، 40. ملاحظة: لا تعليق الخلايا إذا كان الفحص المجهري هو المصب. يجب أن تتم جميع يغسل والتطلعات من دون إزعاج طبقة الخلايا / بيليه (اعتمادا على الفحص المصب). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من 5٪ وسائل الإعلام PHS في آبار مناسبة. إضافةحجم مناسب (حوالي 1 μl/2x10 5 خلايا، أو 1 ميكرولتر / جيد) من fluorescently المسمى α-α-CD11c وو CD14 (علامات النمط الظاهري؛ استنساخ B-ly6 وMφP9، على التوالي) أو isotype السيطرة على الخلايا لمدة 10 دقيقة في RT في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X في 974 x ج لمدة 3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من PFA 4٪ لمدة 20 دقيقة في RT في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقفة نقطة: يغسل مع 100 ميكرولتر في برنامج تلفزيوني 1X 974 x ج لمدة 3 دقائق وتخزينها في 4 درجات ثاني / N في برنامج تلفزيوني 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من العازلة permeabilization إلى الخلايا لمدة 30 دقيقة. ملاحظة: يتكون العازلة permeabilization من برنامج تلفزيوني 1X مع 0.3٪ تريتون X-100، و 1٪ ألبومين المصل البقري (BSA) لpermeabilization. لا تخل الخلايا الملتصقة عند الفحص المجهري هو المصب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حجم مناسب (حوالي 62 نانوغرام antibody/2x10 5 خلايا، أو ما يقرب من 2.5 ميكرولتر / جيد) من α-IL-1β-FITC (استنساخ 8516) أو isotype السيطرة ل2 ساعة في حاضنة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا ثلاث مرات مع 200 ميكرولتر من العازلة permeabilization في 974 x ج لمدة 3 دقائق في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري: وصمة عار مع دابي، إضافة مرس، ووضع ساترة بلطف على أعلى شريحة زجاجية. تسمح مرس لعلاج O / N قبل التقاط الصور المجهري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على البيانات من خلال نظام مراقبة الأصول الميدانية أو المجهري. ملاحظة: مقارنة نمط إسوي لكل حالة لتلطيخ المناسبة عند تحليل بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية أو المجهري. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نظام مراقبة الأصول الميدانية: الحصول على عينة واحدة في كل مرة. تعيين FSC / بوابة SSC على الخلايا الحية، تليها تبوب على CD11c و+ CD14 - خلايا قبل تحليل السكان moDC الموالية للIL-1β تلطيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المجهر: تعيين وقت التعرض باستخدام عينة تلطيخ إيجابية - R848 المعالجة. استخدام دابي + المؤيدة للIL-1β + + ودابي الموالية للIL-1β - لتحديد نسبة المؤيدة للIL-1β + moDCs معربا. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SDS-الصفحة: يتم تنفيذ Immunoblotting للكشف الموالية للIL-1β. ملاحظة: هذه التقنية هو موضح أدناه يجمع بين تقنية القياسية immunoblotting، الانحدار 4-20٪ هلام بولي أكريلاميد، والفلورسنت أو chemiluminescent كشف 41، 42. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليز الخلايا مباشرة في 10 ميكرولتر تغيير طبيعة تحلل العازلة (5 ميكرولتر ميكرولتر العازلة β-mercaptoethanol/950 Laemmli عينة تليها تمييع 01:01 مع العازلة تحلل الخلية). نقل المحللة إلى 1.5 مل أنابيب إيبندورف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المحللة الحرارة على طبق جاف لمدة 10 دقيقة في 100 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور المحللة في 20،800 x ج على minicentrifuge لمدة 1 دقيقة على التركيز على حجم السائل. نقطة وقفة: يمكن تجميد العينات في -20 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى القصير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل الحجم الإجمالي على هلام بولي أكريلاميد. تشغيل 140 V من خلال مربع هلام لحوالي 1 ساعة، أو حتى تدير الجبهة صبغ قبالة الجزء السفلي من هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البروتين من هلام بولي أكريلاميد الصعود إلى membr PVDF Immobilon-FLانو لمدة 90 دقيقة في 100 خامسا كتلة الغشاء مع 5٪ BSA في تريس مخزنة المالحة / 0.1٪ توين 20 (TBS-T) لمدة 1 ساعة. ملاحظة: PVDF Immobilon-FL هل الأفضل للاستخدام مع كشف الفلورسنت. ينصح الغشاء مع تكوين مختلف عن تقنيات الكشف الأخرى لزيادة إشارة إلى نسبة الخلفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الأجسام المضادة الأولية والثانوية في 10 مل من 5٪ BSA / TBS-T. أداء حضانات الأجسام المضادة الأولية في 4 درجات ثاني / N حين تهتز والضد الثانوية في RT لمدة 1 ساعة في حين تهتز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل الغشاء 3 مرات مع TBS-T لمدة 5 دقائق في حين تهتز بين حضانات الأجسام المضادة الأولية والثانوية، ومرة ​​أخرى بين حضانات الثانوية والتصوير. ملاحظة: يمكن أن يتم الكشف عن العصابات باستخدام الفلورسنت أو الكشف chemiluminescent. اتبع تعليمات الشركة المصنعة للكشف. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إليسا: عينات التي تم تجميدها لتخزين حاجة لكي تتوازن لRT قبل التحليل. تدور باستمرار العينات في جهاز للطرد المركزي لتعزيز condens طافأوجه. اتبع إرشادات الشركة المصنعة لقياس IL-1β. ملاحظة: في هذا البروتوكول يقاس IL-1β على وجه التحديد؛ ومع ذلك، وقياس وقت واحد من TNFα، IL-6، والمناعية خلوى IL-10 ومعبي ضمان الظروف الملائمة. </li></ol>

والكتاب ليس لديهم تضارب المصالح في الكشف عنها.

السيتوكينات الالتهابية هي جزء لا يتجزأ في توجيه الاستجابة المناعية الفطرية والتكيفية لمكافحة العدوى الفيروسية. وقد تبين يفرز IL-1β للزيادة خلال عدوى الأنفلونزا 3، 43، 44. ليست مفهومة تماما الآليات الدقيقة التي يتم من خلالها معالجة هذه السيتوكينات ردا على اعتراف ا...

مطلوب تفعيل نظام المناعة الفطرية لتوجيه الاستجابات المناعية التكيفية خلال العدوى والمرض، والتطعيم 7. الخلايا الجذعية هي أقوى مستضد تقديم الخلايا في الجهاز المناعي الفطري؛ فهي متخصصة لامتصاص المستضدات، والهجرة إلى الغدد الليمفاوية، وتفعيل السذاجة CD4 + CD8 + ولحل الخلايا (خلايا تي) 8-10. لتمكين الكشف الممرض السريع نظام المناعة الفطرية يستخدم العديد من سلالة الجرثومية ترميز مستقبلات التعرف على الأنماط (PRR) التي تعترف الممرض الحفظ الزخارف المستمدة أو المضيف المستمدة من علامات الإجهاد الخلية والضرر. حصيلة مثل مستقبلات (TLRs) هي الغشاء ملزمة مستقبلات التعرف على الأنماط التي تعترف بعض الممرض phagocytized خارج الخلية الجزيئية المرتبطة أنماط (PAMPs) والخطر المرتبطة أنماط الجزيئية (DAMPs). على النقيض من ذلك إيماءة مثل مستقبلات (NLRs) هي عصاري خلوي والرد على مجموعة متنوعة من PAMPs وDAMPs. إيماءة مثل مستقبلات إعادةيقدم خط الدفاع الثاني ضد مسببات الأمراض التي تهرب من سطح الخلية وخنازير التقامي. تفاعل الممرض المشتقة، أو &quot;الخطر&quot; المرتبطة بها، مع عوامل TLR وNLR بروابط يؤدي إلى حالة من النضج العاصمة مما أدى إلى زيادة التفاعل مع DC الخلايا المناعية الأخرى، وتعزيز تي خلية وتنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية 11. انترلوكين 1β هو عنصر حاسم في الدفاع المضيف ضد العدوى. عند التحقق من الكائنات الحية الدقيقة، وproinflammatory سايتوكاين للغاية، IL-1β، ويفرز ويعمل بمثابة جاذبة الكيماوي والمنشط للخلايا المناعية الفطرية والتكيفية. في الجسم الحي IL-1β مسؤولة إلى حد كبير عن استجابة المرحلة الحادة بما في ذلك الحمى والتهاب خلوى التوليف 12. معظم NLRs تحتوي على C محطة يسين الغنية تكرار المجال الذي يعتقد أن تعمل في مجال الاستشعار يجند، وهو المجال النوكليوتيدات ملزم المركزية (NACHT) وهذا هو IMPOrtant لNLRP3 oligomerization، وN محطة مجال المستجيب (PYD في NLRP3) التي تتوسط نقل الإشارة إلى أهداف المصب من خلال البروتين البروتين التفاعلات. ويعرف البروتين NLRP3 مجمع inflammasome معظم درس بشكل مكثف. هذا البروتين هو عضو في الأسرة NLR، ولديه القدرة على تشكيل متعددة معقدة البروتين الجزيئي يتألف من NLRP3، وPYCARD البروتين محول (المعروف أيضا باسم ASC)، وICE. عند تفعيل inflammasome PYCARD بربط NLRP3 N المجالات محطة وتجند ICE عبر تفعيل كاسباس والمجال التوظيف (CARD) المجالات. يتم إنشاء انترلوكين 1 تحويل انزيم في البداية باعتبارها زايموجين تحتوي على بطاقة عزر في دورته N-محطة. نتائج تشكيل Inflammasome في جلب اثنين من جزيئات ICE بما فيه الكفاية وثيقة للحث على تنشيط ذاتي التحفيز. مجمع inflammasome هو ضروري لتفعيل ICE الأمر الذي يتيح لها تحويل حشوية الموالية للIL-1β إلى أن تنضج خلوى. إفراز الناجح لIL-1β في البلدان النامية يتطلب الاستشعار عن اثنين مختلفة ومستقلة إشارات الخطر. الأولى، TLR الاستشعار من PAMPs، DAMPs، أو إشارات خلوى (TNFα أو IL-1β) يؤدي إلى upregulation من حشوية الموالية للIL-1β التعبير البروتين. مطلوب الثاني، غالبا ما تكون مختلفة، إشارة لتشكيل مجمع inflammasome المنبع من ICE النضج. وهناك عدد قليل inflammasome تحفيز الإشارات تشمل البكتيريا المسام غشاء تشكيل السموم (مثل nigericin)، الليزوزومية تعطيل البلورات (مثل بلورات أحادية الصوديوم راتي، جامعة ولاية ميشيغان)، وATP خارج الخلية. آلية المنبع مما يؤدي إلى تفعيل NLRP3 inflammasome بهذه تفعيل متنوعة غير واضح. دراسات التحقيق يشير المنبع من تشكيل inflammasome يقترح أن الأحداث داخل الخلايا، مثل تحريض نقص بوتاسيوم الدم أو أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) تنشيط بشكل غير مباشر inflammasome 13-28. بين تفعيل الفيروسية مختلفة من inflammasome NLRP3 هي إنفلونزا، التي تنص بأوراسكوم تليكوم القابضة إشارة الابتدائية والثانوية المطلوبة لإفراز IL-1β 3، 29-33. باستخدام الماوس نماذج NLRP3 خروج المغلوب تبين أن إفراز IL-1β في البلدان النامية هو NLRP3 تعتمد 32. بالإضافة إلى ذلك، جذبت NLRP3 الفئران خروج المغلوب أقل الكريات البيض إلى موقع الإصابة وشهدت أعلى معدل وفيات 2، 5. وتشير ورقتي الأخيرة آلية لتفعيل NLRP3 inflammasome خلال عدوى فيروس الأنفلونزا؛ أولا، من خلال الاعتراف فتيلة من الحمض النووي الريبي الفيروسي بواسطة TLR7 أو TLR8 (اعتمادا على TLR التعبير عن الخلية الاستجابة) أو من خلال الاستشعار من البكتيريا المتعايشة قبل غيرها TLRs للحث على حشوية التعبير الموالية للIL-1β، تليها الإشارة الثانية، وتفعيل NLRP3 تشكيل inflammasome بواسطة البروتين الفيروسي القناة الايونية M2 على شبكة جولجي عبر 33، 34. في الخطوة الأخيرة، مما اثار من inflammasome NLRP3 يتم تحقيق ذلك من خلال اضطراب في الخلايا الأيونية &lt;م&gt; الوسط مما يؤدي إلى إنتاج ريوس، الذي هو، ببساطة، تشعر به NLPR3 كإشارة لتشكيل inflammasome. ومع ذلك، فإن آلية دقيقة من inflammasome المنبع تفعيل النشاط ICE خلال العدوى بالأنفلونزا لا يزال غير واضح. يصف هذا العمل تقنية قيمة لدراسة inflammasome NLRP3 في moDCs الإنسان التي يمكن استخدامها كأساس لإجراء مزيد من التحقيق في مسار الكامنة DC-تستند إفراز IL 1β استجابة لTLR8 ربط مع R848 تليها تفعيل inflammasome بواسطة بئر المنشط المعروف من NLRP3، nigericin. أشكال مختلفة من هذه الطريقة يمكن استخدامها مع أنواع الخلايا الأخرى بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر: حيدات، الضامة، DC مجموعات فرعية أخرى، والخلايا الظهارية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1081px;" width="1081">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:179px;">Company</td>
			<td style="width:121px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:391px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">IL-4</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">GM-CSF</td>
			<td style="width:179px;">Genzyme</td>
			<td style="width:121px;">NDC 58468-0180-2</td>
			<td>We acquire this item through our local pharmacy with a prescription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">RPMI 1640 with L-glutamine</td>
			<td style="width:179px;">Cellgro</td>
			<td style="width:121px;">10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Peripheral blood mononuclear cells</td>
			<td style="width:179px;">New York Blood Center</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>PBMCs were isolated from the blood of healthy donors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">12-well tissue culture plates</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">96-well round bottom tissue culture plates</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-IL-1&#946;-FITC</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;">IC201F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">FITC isotype control</td>
			<td style="width:179px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:121px;">130-092-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-&#946;-Tubulin</td>
			<td style="width:179px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:121px;">SC-9014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-IL-1&#946;</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;">mab201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">PVDF Immobilon-FL membrane</td>
			<td style="width:179px;">Millipore</td>
			<td style="width:121px;">IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">gradient 4-12 % polycrylamide gel</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-1159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">laemmli sample buffer</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">BSA</td>
			<td style="width:179px;">Equitech Bio Inc</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>30% solution sterile/filtered</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">PFA</td>
			<td style="width:179px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:121px;">15710</td>
			<td>16% solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">human inflammatory cytokine bead array kit</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">551811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">nigericin</td>
			<td style="width:179px;">Invivogen</td>
			<td>tlrl-nig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">R848</td>
			<td>3M Corp.</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-CD14</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">340436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-CD11c</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">555392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">TBS</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>On site stock room</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tween-20</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">P2287-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"><a>Nunc EasYFlask 225cm2, Filter Cap, 70mL working volume, 30/Cs</a></td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">159933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">20 &#956;M Sterile Disposable Filter Units</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">569-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Hepes</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">goat &#945;-mouse IRDye 800CW</td>
			<td style="width:179px;">Licor</td>
			<td style="width:121px;">926-32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">donkey &#945;-rabbit IRDye 680RD</td>
			<td style="width:179px;">Licor</td>
			<td style="width:121px;">926-68073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Spectra multicolor broad range protein ladder</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">26634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tris Glycine SDS 10x</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tris Glycine 10x</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-0734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Methanol - 4L</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">A433P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Prolong Gold antifade Reagent with DAPI</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td>P-36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide</td>
			<td style="width:179px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:121px;">354108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activation and measurement of nlrp3 inflammasome activity using il-1&#946; in human monocyte-derived dendritic cells

العمليات الالتهابية الناجمة عن إفراز الإنترلوكين (IL) -1 السيتوكينات الأسرة من قبل خلايا المناعة يؤدي إلى التهاب المحلية أو النظامية، وإعادة عرض الأنسجة وإصلاحها، ومراقبة فيروسية 1 و 2. انترلوكين 1β عنصرا أساسيا من الاستجابة المناعية الفطرية ويساهم في القضاء على مسببات الأمراض الغازية في حين منع إقامة العدوى المستمرة 1-5. Inflammasomes هي منصة الإشارات الرئيسية لتفعيل انترلوكين 1 تحويل انزيم (ICE أو كاسباس 1). وinflammasome NLRP3 يتطلب اثنين على الأقل في البلدان النامية إلى إشارات تسبب إفراز IL-1β 6. الموالية للIL-1β البروتين التعبير محدودة في يستريح الخلايا؛ لذا لا بد من الإشارة فتيلة لالنسخ IL-1β والبروتين التعبير. والإشارة الثانية لمست من خلال النتائج NLRP3 في تشكيل البروتين متعددة NLRP3 inflammasome. قدرة الخلايا الجذعية المسؤولة لد للإشارات المطلوبة لإفراز IL-1β يمكن اختبارها باستخدام البيورين الاصطناعية، R848، الذي تشعر به TLR8 في الوحيدات الإنسان مشتق الخلايا الجذعية (moDCs) إلى خلايا رئيس، تليها تفعيل inflammasome NLRP3 مع السم البكتيري و حامل الأيون البوتاسيوم، nigericin. ويتم إنتاج البلدان النامية الوحيدات المستمدة بسهولة في الثقافة وتوفير أكثر بكثير من الخلايا النقية البلدان النامية النخاعي الإنسان. طريقة المقدمة هنا يختلف عن المقايسات inflammasome الأخرى في أنه يستخدم في المختبر الإنسان، بدلا من الماوس مشتقة، البلدان النامية وبالتالي السماح لدراسة inflammasome في مرض الإنسان والعدوى.

هذه التقنيات قياس TLR8 فتيلة مع R848. الخلايا تلطيخ خلوى للالموالية للIL-1β يسمح للفحص المجهري ونظام مراقبة الأصول الميدانية قراءات من CD14 - CD11c و+ moDCs. كل التقنيات يمكن قياسها كميا نسبة إلى غير معبي، أو يستريح، ومراقبة الخلايا فضلا عن isotype السيطرة (الشكلان 1 و ...

Watch this Scientific Journal Video about Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1Î² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells at JoVE.com

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&amp;#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

الخلايا الجذعية (DCS) تفرز IL-1β ردا على اعتراف TLR8 من البيورين الاصطناعية، R848، تليها NLRP3 تفعيل inflammasome مع nigericin، وبالتالي، IL-1β يمكن استخدامها لقياس النشاط NLRP3 inflammasome. وتستخدم الخلايا تلطيخ خلوى، immunoblotting، وELISA لقياس بدقة NLRP3 inflammasome فتيلة والتنشيط عبر IL-1β التعبير.

تفعيل وقياس NLRP3 Inflammasome آخر عن طريق IL-1β في الخلايا الجذعية المشتقة من الوحيدات الإنسان

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

activation-measurement-nlrp3-inflammasome-activity-using-il-1-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

20.7K Views.  New York University School of Medicine.  الخلايا الجذعية (DCS) تفرز IL-1β ردا على اعتراف TLR8 من البيورين الاصطناعية، R848، تليها NLRP3 تفعيل inflammasome مع nigericin، وبالتالي، IL-1β يمكن استخدامها لقياس النشاط NLRP3 inflammasome. وتستخدم الخلايا تلطيخ خلوى، immunoblotting، وELISA لقياس بدقة NLRP3 inflammasome فتيلة والتنشيط...

Video: Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin which forms an insoluble clot that stops hemorrhage. Factor V (FV) in its activated form, FVa, is a critical cofactor for the protease FXa and accelerator of thrombin generation during fibrin clot formation as part of prothrombinase 1, 2. Manual FV assays have been described 3, 4, but they are time consuming and subjective. Automated FV assays have been reported 5-7, but the analyzer and reagents are expensive and generally provide only the clot time, not the rate and extent of fibrin formation. The microplate platform is preferred for measuring enzyme-catalyzed events because of convenience, time, cost, small volume, continuous monitoring, and high-throughput 8, 9. Microplate assays have been reported for clot lysis 10, platelet aggregation 11, and coagulation Factors 12, but not for FV activity in human plasma. The goal of the method was to develop a microplate assay that measures FV activity during fibrin formation in human plasma.
This novel microplate method outlines a simple, inexpensive, and rapid assay of FV activity in human plasma. The assay utilizes a kinetic microplate reader to monitor the absorbance change at 405nm during fibrin formation in human plasma (Figure 1) 13. The assay accurately measures the time, initial rate, and extent of fibrin clot formation. It requires only &mu;l quantities of plasma, is complete in 6 min, has high-throughput, is sensitive to 24-80pM FV, and measures the amount of unintentionally activated (1-stage activity) and thrombin-activated FV (2-stage activity) to obtain a complete assessment of its total functional activity (2-stage activity - 1-stage activity).
Disseminated intravascular coagulation (DIC) is an acquired coagulopathy that most often develops from pre-existing infections 14. DIC is associated with a poor prognosis and increases mortality above the pre-existing pathology 15. The assay was used to show that in 9 patients with DIC, the FV 1-stage, 2-stage, and total activities were decreased, on average, by 54%, 44%, and 42%, respectively, compared with normal pooled human reference plasma (NHP).
The FV microplate assay is easily adaptable to measure the activity of any coagulation factor. This assay will increase our understanding of FV biochemistry through a more accurate and complete measurement of its activity in research and clinical settings. This information will positively impact healthcare environments through earlier diagnosis and development of more effective treatments for coagulation disorders, such as DIC.

This study describes a novel microplate assay that measures FV coagulation activity during fibrin clot formation in human plasma which has not been reported previously. The method uses a kinetic microplate reader to continuously measure the change in absorbance at 405nm during fibrin clot formation in human plasma.

قياس نشاط V عامل في البلازما البشرية باستخدام الفحص التخثر صفيحة ميكروسكوبية

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and pathogenesis of inflammation. Isolation and study of DCs have been important in biological research because of their distinctive features. Although they are essential key mediators of the immune system, DCs are very rare in blood, accounting for approximately 0.1 - 1% of total blood mononuclear cells. Therefore, alternatives for isolation methods rely on the differentiation of DCs from monocytes isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The utilization of proper isolation techniques that combine simplicity, affordability, high purity, and high yield of cells is imperative to consider. In the current study, two distinct methods for the generation of DCs will be compared. Monocytes were selected by adherence or negatively enriched using magnetic separation procedure followed by differentiation into DCs with IL-4 and GM-CSF. Monocyte and MDDC viability, proliferation, and phenotype were assessed using viability dyes, MTT assay, and CD11c/ CD14 surface marker analysis by imaging flow cytometry. Although the magnetic separation method yielded a significant higher percentage of monocytes with higher proliferative capacity when compared to the adhesion method, the findings have demonstrated the ability of both techniques to simultaneously generate monocytes that are capable of proliferating and differentiating into viable CD11c+ MDDCs after seven days in culture. Both methods yielded &gt; 70% CD11c+ MDDCs. Therefore, our results provide insights that contribute to the development of reliable methods for isolation and characterization of human DCs.

This study compares two different methods of human monocyte isolation for obtaining in vitro dendritic cells (DCs). Monocytes are selected by adherence or negatively enriched by magnetic separation. Monocyte yield and viability along with MDDC viability, proliferation and CD11c/CD14 surface marker expression will be compared between both methods.

توصيف الخلايا الجذعية البشرية الوحيدات المستمدة من التصوير التدفق الخلوي: مقارنة بين اثنين من بروتوكولات الوحيدات عزل

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

جيل من الوحيدات المستمدة الخلايا الجذعية البشرية من الدم الكامل

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

التنمية والتحقق من جزيء واحد أولتراسينسيتيفي الصفيف الرقمي المرتبط بالانزيم مقايسة الممتز للبشرية انترفيرون-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.

الكشف عن التنشيط إينفلاماسومي وموت الخلايا بيروبتوتيك في مورين الضامة المشتقة من نخاع العظام

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of monocyte-derived macrophages can impair wound healing. We showed that high fat and high sugar diets promote monocyte priming and dysfunction, converting healthy blood monocytes into a hyper chemotactic phenotype poised to differentiate into macrophages with dysregulated activation profiles and impaired phenotypic plasticity. The over-recruitment of monocyte-derived macrophages and recruitment of macrophages with dysregulated activation profiles is believed to be a major contributor to the development of chronic inflammatory diseases associated with metabolic disorders, including atherosclerosis and obesity. The goal of this protocol is to quantify the chemotactic activity of blood monocytes as a biomarker for monocyte priming and dysfunction and to characterize the macrophage phenotype blood monocytes are poised to differentiate into in these mouse models. Using single cell Western blot analysis, we show that after 24 h 33%of cells recruited into MCP-1-loaded basement membrane-derived gel plugs injected into mice are monocytes and macrophages; 58% after day 3. However, on day 5, monocyte and macrophage numbers were significantly decreased. Finally, we show that this assays also allows for the isolation of live macrophages from the surgically retrieved basement membrane-derived gel plugs, which can then be subjected to subsequent characterization by single cell Western blot analysis.

Here we present a protocol to quantify the chemotactic activity of blood monocytes in mouse models, to assess the effects of nutritional, pharmacological and genetic interventions on blood monocyte and to characterize the blood monocytes derived macrophages in mouse models using monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-loaded basement membrane-derived gel plugs.

تحديد كمية النشاط الكيميائي للخلايا الأحادية في الجسم الحي وتوصيف الضامة المشتقة من خلايا الدم

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas autophagic flux is only observed in iDCs. To gain mechanistic insights, we developed efficient strategies to interfere with HSV-1-induced autophagic turnover. An inhibitor-based strategy, to modulate HSV-1-induced autophagy, constitutes the first choice, since it is an easy and fast method. To circumvent potential unspecific off-target effects of such compounds, we developed an alternative siRNA-based strategy, to modulate autophagic turnover in iDCs upon HSV-1 infection. Indeed, electroporation of iDCs with FIP200-specific siRNA prior to HSV-1 infection is a very specific and successful method to ablate FIP200 protein expression and thereby to inhibit autophagic flux. Both presented methods result in the efficient inhibition of HSV-1-induced autophagic turnover in iDCs, whereby the siRNA-based technique is more target specific. An additional siRNA-based approach was developed to selectively silence the protein expression of KIF1B and KIF2A, facilitating autophagic turnover upon HSV-1 infection in mDCs. In conclusion, the technique of siRNA electroporation represents a promising strategy, to selectively ablate the expression of distinct proteins and to analyze their influence upon an HSV-1 infection.

In this study, we present inhibitor- and siRNA-based strategies to interfere with autophagic flux in Herpes simplex virus type-1 (HSV-1)-infected monocyte-derived dendritic cells.

سيرنا اليكتروبوريشن لتعدل اوتوهاغي في الهربس البسيط الفيروسات نوع 1-الخلايا الجذعية المصابة بالبويضات المشتقة

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic inflammation. Neutrophil ETs (NETs) consist of a mesh of DNA, histone proteins, and various granule proteins (i.e., myeloperoxidase, elastase, and cathepsin G). Other immune cells, including macrophages, can also produce ETs; however, to what extent this occurs in vivo and whether macrophage extracellular traps (METs) play a role in pathological mechanisms has not been examined in detail. To better understand the role of METs in inflammatory pathologies, a protocol was developed for visualizing MET release from primary human macrophages in vitro, which can also be exploited in immunofluorescence experiments. This allows further characterization of these structures and their comparison to ETs released from neutrophils. Human monocyte-derived macrophages (HMDM) produce METs upon exposure to different inflammatory stimuli following differentiation to the M1 pro-inflammatory phenotype. The release of METs can be visualized by microscopy using a green fluorescent nucleic acid stain that is impermeant to live cells (e.g., SYTOX green). Use of freshly isolated primary macrophages, such as HMDM, is advantageous in modeling in vivo inflammatory events that are relevant to potential clinical applications. This protocol can also be used to study MET release from human monocyte cell lines (e.g., THP-1) following differentiation into macrophages with phorbol myristate acetate or other macrophage cell lines (e.g., the murine macrophage-like J774A.1 cells).

Presented here is a protocol to detect macrophage extracellular trap (MET) production in live cell culture using microscopy and fluorescence staining. This protocol can be further extended to examine specific MET protein markers by immunofluorescence staining.

في المختبر التحفيز والتصور من الإفراج عن فخ خارج الخلية في الضامة البشرية المتمايزة المشتقة

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct regulation of inflammatory signaling and is activated by proximity-induced dimerization following recruitment to inflammasomes. Caspase-1 is abundant in the monocytic cell lineage and induces maturation of the pro-inflammatory cytokines interleukin (IL)-1&#946; and IL-18 to active secreted molecules. The other inflammatory caspases, caspase-4 and -5 (and their murine homolog caspase-11) promote IL-1&#946; release by inducing pyroptosis. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is a tool used to measure inflammatory caspase induced proximity as a readout of caspase activation. The caspase-1, -4, or -5 prodomain, which contains the region that binds to the inflammasome, is fused to non-fluorescent fragments of the yellow fluorescent protein Venus (Venus-N [VN] or Venus-C [VC]) that associate to reform the fluorescent Venus complex when the caspases undergo induced proximity. This protocol describes how to introduce these reporters into primary human monocyte-derived macrophages (MDM) using nucleofection, treat the cells to induce inflammatory caspase activation, and measure caspase activation using fluorescence and confocal microscopy. The advantage of this approach is that it can be used to identify the components, requirements, and localization of the inflammatory caspase activation complex in living cells. However, careful controls need to be considered to avoid compromising cell viability and behavior. This technique is a powerful tool for the analysis of dynamic caspase interactions at the inflammasome level as well as for the interrogation of the inflammatory signaling cascades in living MDM and monocytes derived from human blood samples.

This protocol describes the workflow to obtain monocytes-derived macrophages (MDM) from human blood samples, a simple method to efficiently introduce inflammatory caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) reporters into human MDM without compromising cell viability and behavior, and an imaging-based approach to measure inflammatory caspase activation in living cells.

تصور الكاسباز الالتهابي الناجم عن القرب في البلاعم المشتقة من الخلايا الأحادية البشرية

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and play a unique role within the immune system by linking the innate and adaptive immune responses. These cells can phagocytize and then present captured antigens to effector immune cells, triggering a diverse range of immune responses. This paper demonstrates a standardized method for the in vitro generation of bovine monocyte-derived dendritic cells (MoDCs) isolated from cattle peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and their application in evaluating vaccine immunogenicity.
Magnetic-based cell sorting was used to isolate CD14+ monocytes from PBMCs, and the supplementation of complete culture medium with interleukin (IL)-4 and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) was used to induce the differentiation of CD14+ monocytes into naive MoDCs. The generation of immature MoDCs was confirmed by detecting the expression of major histocompatibility complex II (MHC II), CD86, and CD40 cell surface markers. A commercially available rabies vaccine was used to pulse the immature MoDCs, which were subsequently co-cultured with naive lymphocytes.
The flow cytometry analysis of the antigen-pulsed MoDCs and lymphocyte co-culture revealed the stimulation of T lymphocyte proliferation through the expression of Ki-67, CD25, CD4, and CD8 markers. The analysis of the mRNA expression of IFN-&#947; and Ki-67, using quantitative PCR, showed that the MoDCs could induce the antigen-specific priming of lymphocytes in this in vitro co-culture system. Furthermore, IFN-&#947; secretion assessed using ELISA showed a significantly higher titer (**p &#60; 0.01) in the rabies vaccine-pulsed MoDC-lymphocyte co-culture than in the non-antigen-pulsed MoDC-lymphocyte co-culture. These results show the validity of this in vitro MoDC assay to measure vaccine immunogenicity, meaning this assay can be used to identify potential vaccine candidates for cattle before proceeding with in vivo trials, as well as in vaccine immunogenicity assessments of commercial vaccines.

The methodology describes the generation of bovine monocyte-derived dendritic cells (MoDCs) and their application for the in vitro evaluation of antigenic candidates during the development of potential veterinary vaccines in cattle.

تحديد مناعة اللقاح باستخدام الخلايا المتغصنة المشتقة من وحيدات الأبقار

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...