著者は、彼らのサポートとフィードバックのためにオリビエManches博士は、Davor Frleta、博士、ミーガン·オブライエン、MDを承認したいと思います。この研究は、アレルギー感染症研究所によってサポートされ、NIHは、健康関連の研究（AI089030）とRO1（AI081848の多様性を促進するために個々の博士号を取得する前のフェローシップ（F31）用ルースL.キルシュシュタイン国立研究サービス賞を付与からの資金の完了した）。

倫理声明：研究試料を得て、ドナーの同意を得て、研究のために保存されています。全てのサンプルは、符号化され、又は使用前に匿名化されるべきである。このプロトコルは、我々の施設内倫理委員会のガイドラインに従っています。 1。単球由来樹状細胞にヒト末梢血単核細胞の分化。 注：ヒトバフィーコートは、ヒト末梢血細胞（PBMC）のソースとして機能し、ニューヨーク血液センター（ニューヨーク、NY）から入手した。献血者は、健康なボランティアです。 5日間の手順は、組織培養フラスコ35,36上にヒト末梢血単核細胞（PBMC）のメッキで始まる。公開されたプロトコルからの顕著な違いは次のとおりです。 <ol><li>代わりに、10cmのポリスチレン組織培養プレートのフラスコあたり2×10 8 PBMCの合計を接着する225センチメートルのフィルターキャップ付き2非発熱性ポリスチレン組織培養フラスコを使用して、秒（59 cm 2）とする（ステップ1）。 </li><li> 5％のプールしたヒト血清（PHS; 30ml）で培地を調製500mlのRPMI-1640 + L-グルタミン5mlの1 M HEPES緩衝液、および1.4 mlの50 mg / mlのゲンタマイシン（5％PHS培地）を濾過、続いて貫通20μmのフィルター。 225センチメートル2の組織培養フラスコあたり50ミリリットル、5％のPHSメディアの合計を追加します。 </li><li> 25ミリリットルの新鮮なRPMI-1640で接着した細胞を3回洗浄します。各洗浄中に5秒間激しく振ると非付着性細胞（ステップ4）を吸引除去する。 </li><li> 、0日目にフラスコあたり100 IU /μlのGM-CSFの400 IU /μL、IL-4および380μLの190μL（ステップ3）を追加2、および4。日のPBMCを、当初の工程でめっきするように0日が定義されている1（ステップ8）。 </li><li> 1×10 6細胞/ ml（ステップ15）の濃度の収穫5日目のMoDC。 </li><li>その静止状態ですぐにたMoDCを使用しています。ステップ17から22が実行されることはありません。注意：サンプルは最良の結果を得るために、採取後できるだけ速やかに処理する必要がある。 </li><li>濃度のアリコートのMoDC実験のために96ウェル丸底プレート（ウェスタンブロット、ELISA、FACS）またはポリ-L-リジン治療chamberslide（顕微鏡）の上ではよく2×10 5細胞/（1×10 6細胞/ mlの200μl/ウェル）のたTiON 。注：完全に刺激されていない（陰性対照）の活性化に続いてのみ、唯一の活性化、およびプライミングプライミング、少なくとも4条件があります。条件は、必要に応じて希釈R848用コントロールおよびニゲリシンを含むように拡張することができる。ダウンストリームアッセイがICSの場合は、重複はアイソタイプコントロールのために必要である。 </li></ol> 2ソームプライミング - シグナル1 <ol><li>メーカーの指示に従って、DMSO中で凍結乾燥R848を再構成。 RPMI-1640で、RTで作業用ストックを希釈する。 </li><li> 18時間適切なウェルに10μMの最終濃度でR848を追加します。場所37℃でインキュベーター中で細胞を、5％CO 2。 </li></ol> 3 NLRP3ソームのアクティブ化 - 信号2 <ol><li>メーカーの指示に従って、エタノール中で凍結乾燥さナイジェリシンを再構成。適切な条件に加える前に、RPMI-1640で、RTで作業用ストックを希釈する。 </li><li> 20μM最終濃度でニゲリシン載せて、37℃でインキュベーターに戻し、5％CO 2で6時間。いいえ洗浄工程をプライミングの間で活性化中に発生しない。注：IL-1βの分泌はA、モネンシン、ジニトロフェノール、又はカルボニルシアニドクロロフェニル37,38ブレフェルジン、カルシウムイオノフォアの存在により増加する。ソームプライミングまたは活性を分析する際には、IL-1βの分泌が変更されますので、そのため、これらの分泌阻害剤の添加が推奨されていません。 </li></ol> 4、IL-1βのサンプルコレクション<ol><li> 3分間974×gで細胞と上清でプレートを遠心分離する。 </li><li>細胞ペレットを乱すことなく、上清を吸引し、などへの転送eparateラウンド清からのサイトカイン分泌を測定するためにプレート底。注：上清を一時的に-20℃で保存することができる-80又は長期保存のため°C。 </li><li>細胞試料から任意の外IL-1βを取り除くために3分間974×gで1×PBS200μlで携帯ペレットを3回洗浄します。注：96ウェルプレートから細胞ペレットを洗浄する場合、サンプルを乱さないように、収集容器に迅速なプレート反転による洗浄を削除します。 </li></ol> 5。細胞および上清サンプルからのIL-1βの測定<ol><li>細胞内サイトカイン染色（ICS）は：ICSプロトコルは39,40について説明する。注意：ダウンストリームアッセイは顕微鏡であれば細胞を懸濁しないでください。全ての洗浄や願望が（ダウンストリームアッセイに応じて）細胞層/ペレットを乱すことなく行う必要があります。 <ol><li>適切なウェルに5％のPHS100μlの培地を追加します。加えるで10分間の細胞またはアイソタイプコントロール、適切なボリューム（約1μl/2x105細胞、または/ウェル1μL）の蛍光標識されたα-CD11cのα-CD14（クローンB-LY6とMφP9、それぞれの表現型マーカー）暗闇の中でのRT。 </li><li> 3分間974×gで1×PBSで3回洗浄する。 </li><li>暗闇の中で、室温で20分間、4％PFA100μlを加えることにより細胞を固定します。 </li><li>ポイントを一時停止：1X PBS中で4℃、CO / Nで3分間、店舗用に974×gで100μlの1×PBSで洗浄します。 </li><li> 30分間、細胞に透過処理緩衝液100μlを加える。注：透過化緩衝液は、0.3％トリトンX-100で1×PBSで構成され、1％ウシ血清アルブミン（BSA）のために透過処理される。下流のアッセイは、顕微鏡の場合に付着細胞を乱さないようにしてください。 </li><li>適切なα-IL-1β-FITCの量（約62のNG antibody/2x10 5細胞、約2.5μL/ウェル）（クローン8516）またはアイソタイプコントロールを追加します37℃のインキュベーターで2時間</li><li>暗闇の中で3分間974×gで透過化緩衝液200μlで細胞を3回洗浄する。 </li><li>オプション：DAPIで染色は、封入を追加し、スライドガラスの上に静かにカバースリップを配置。封入は、O / N顕微鏡画像を撮影する前に硬化させる。 </li><li> FACをや顕微鏡によってデータを取得する。注意：FACをや顕微鏡によって分析し、適切な染色を条件ごとにアイソタイプを比較してください。 <ol><li>沿磁：一度に1サンプルを収集。 MODC人口プロIL-1β染色を分析する前に、細胞-のCD11c + CD14でゲーティングが続き、生細胞上のFSC / SSCゲートを設定します。 </li><li>顕微鏡：陽性染色試料を用いて露光時間を設定する - R848は、処理した。プロIL-1β発現したMoDCを+の割合を決定するために- 、DAPI +プロIL-1β+とDAPI +プロIL-1βを使用してください。 </li></ol></li></ol></li><li> SDS-ページ：イムノはプロIL-1βを検出するために行われる。注意：以下に説明する技術は、標準的な免疫ブロット法、勾配4〜20％ポリアクリルアミドゲル、および蛍光または化学発光検出41、42を組み合わせたものです。 <ol><li>溶解緩衝液（細胞溶解緩衝液で1:1に希釈し、続いて5μlのβ-mercaptoethanol/950μlのLaemmli試料緩衝液）10μlの変性における直接細胞を溶解。 1.5ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブにライセートを移します。 </li><li> 100℃で10分間乾燥板に熱溶解物</li><li>液量を濃縮するために1分間minicentrifugeに20,800×gで溶解液を紡ぐ。ポイントを一時停止：サンプルは、短期保存のために-20℃で凍結することができる。 </li><li>ポリアクリルアミドゲルに全量をロードします。色素の先端がゲルの底から実行されるまで、約1時間、またはのためのゲルボックスから140 Vを実行します。 </li><li> PVDFイモビロン-FLのmembr上にポリアクリルアミドゲルからタンパク質を転送する100 V.ブロックトリス緩衝生理食塩水に5％のBSAを有する膜/ 0.1％のTween-20（TBS-T）で1時間90分間オクタン。注意：PVDFイモビロン-FLは、蛍光検出で使用するために最適です。他の検出技術は、シグナル対バックグラウンド比を向上させるために異なる組成を有する膜が推奨されます。 </li><li> 5％BSA / TBS-Tを10mlの一次および二次抗体を希釈する。振とうしながら室温で1時間二次抗体を振りながら4℃のCO / Nで、一次抗体インキュベーションを行う。 </li><li>一次および二次抗体インキュベーションし、再び二次インキュベーションと画像の間に振動させながら5分間TBS-Tで膜を3回洗浄します。注：バンドは、蛍光または化学発光検出を用いて検出することができる。検出のため、メーカーの指示に従ってください。 </li></ol></li><li> ELISA：凍結保存されているサンプルは、分析前に室温に平衡にする必要があります。上澄みCONDENSを統合する遠心分離機でサンプルをスピンダウンATION。 IL-1βの測定のため、メーカーの指示に従ってください。注意：このプロトコルでは、IL-1βが具体的に測定する。しかし、TNFα、IL-6、および免疫調節性サイトカインIL-10の同時測定は、適切な条件を確実にプライミングした。 </li></ol>

著者らは、開示することは、特別の利害関係はありません。

炎症性サイトカインは、ウイルス感染と戦うために、先天性および適応免疫応答を操縦中に一体化されている。分泌されたIL-1βは、インフルエンザ感染症3、43、44の間に増加することが示されている。これらのサイトカインは、ヒト樹状細胞におけるウイルスの認識に応答して処理される正確なメカニズムは完全に理解されていない。骨髄性DC単離キットは、高価で時間がかかる。離?...

先天性免疫系の活性化は、感染、疾患、およびワクチン接種7の間に適応免疫応答を操縦する必要がある。樹状細胞は、自然免疫系の細胞に提示する最も強力な抗原であり;これらは、抗原の取り込み、リンパ節への移行、およびナイーブCD4 +およびCD8 +細胞溶解性T細胞の活性化を8-10に特化されている。迅速な病原体の検出を可能にするために、自然免疫系は、保存病原体に由来するモチーフまたは細胞ストレスおよび損傷のホスト派生マーカーを認識し、多数の生殖細胞系列符号化されたパターン認識受容体（PRR）を利用する。受容体（TLR）Toll様は、特定の細胞外貪食病原体関連分子パターン（PAMP）と危険の関連分子パターン（減衰）を認識膜結合パターン認識受容体である。受容体（NLRs）のようなコントラストのNODによって細胞質ゾルであり、のPAMPおよび減衰の多様な範囲に対応しています。受容体が再うなずく細胞表面とエンドサイトーシスPRRSを回避病原体に対する防御の2行を提示する。由来の病原体、または関連する「危険性」の相互作用は、TLRとNLR配位子を有する因子は、他の免疫細胞とT細胞およびナチュラルキラー細胞の活性化11の推進と増加したDCとの相互作用を生じるDC成熟の状態に至る。 インターロイキン-1βは、感染に対する宿主防御の重要なコンポーネントです。微生物の認識に、高度に炎症性サイトカインIL-1βは、分泌され、化学誘引し、自然免疫と獲得免疫細胞の活性化因子として機能する。 インビボ IL-1βは、発熱や炎症性サイトカインなどの急性期反応の主な原因である合成12。 最もNLRsリガンドセンシング、IMPO中央ヌクレオチド結合ドメイン（NACHT）において機能すると考えられるC末端ロイシンリッチリピート領域を含有するNLRP3のオリゴマー化のためのrtant、およびタンパク質タンパク質相互作用を介して下流の標的へのシグナル伝達を媒介するN末端エフェクタードメイン（NLRP3でPYD）。 NLRP3タンパク質は、最も熱心に研究ソーム複合体を定義しています。このタンパク質は、NLRファミリーのメンバーであり、NLRP3（また、ASCとしても知られる）アダプタータンパク質PYCARD、及びICEの多層高分子タンパク質複合体を形成する能力を有する。ソーム活性化の際にPYCARDはNLRP3 N末端ドメインに結合し、カスパーゼ活性化および動員ドメイン（CARD）ドメインを介して氷を募集しています。インターロイキン-1変換酵素は、最初に、そのN末端CARDモチーフを含む酵素前駆体として生成される。彼らの自己触媒活性化を誘導するのに十分近い2 ICE分子を持って来ることでソーム形成の結果。ソーム複合体は、サイトカイン成熟細胞質プロIL-1βを変換することができ、従ってICEを活性化するために必要である。 イリノイ州の正常な分泌-1βDCにおける、2つの異なる独立した危険信号の検出を必要とします。まず、のPAMP、DAMPS、またはサイトカインシグナル伝達（TNFα又はIL-1β）のTLRの検出は、細胞質プロIL-1βタンパク質発現のアップレギュレーションを引き起こす。第二に、多くの場合、異なる信号を、氷の成熟の上流ソーム複合体形成に必要である。シグナルを刺激するいくつかのソーム（例えばナイジェリシンなど）の毒素、リソソーム撹乱（例えば尿酸一ナトリウム結晶として、MSU）結晶、および細胞外ATPを形成する細菌の膜の孔があります。これらの多様な活性化因子でNLRP3ソームの活性化をもたらす上流メカニズムは不明である。ソーム形成のシグナル伝達の上流を調査研究では、低カリウム血症の誘導や活性酸素種（ROS）のような細胞内イベントは、間接的にソーム13-28を活性化することを提案している。 NLRP3ソームの異なるウイルスの活性化剤の中でBを提供し、インフルエンザ、ですIL-1βの分泌3、29-33のために必要な一次および二次信号をOTH。 NLRP3ノックアウトマウスモデルを用いてそれがDCにおけるIL-1βの分泌が32 NLRP3依存することが見出された。さらに、NLRP3ノックアウトマウスは、感染部位に少ない白血球を集め、より高い死亡率2、5を経験した。二つの最近の論文は、インフルエンザウイルス感染時のNLRP3ソームの活性化のためのメカニズムを示唆している。第一、第二シグナルが続く細胞質プロIL-1β発現を誘導するTLR7またはTLR8（応答細胞のTLR発現に依存する）によって、または他のTLRによる共生細菌の検出を通じてウイルスRNA、NLRP3の活性化の認識を通じてプライミングトランスゴルジ網33、34上のウイルスのイオンチャネルタンパク質M2でソームの形成。後者のステップでは、NLRP3ソームのトリガーは、細胞内のイオンの妨害することによって達成される&lt;EM&gt;ソームを形成するための信号としてNLPR3によって感知され、単純に、あるROS産生につながる環境。しかし、インフルエンザ感染時のICE活動の上流ソーム活性化の正確なメカニズムは依然として不明のままである。 この作品は良くによってソームの活性化に続いてR848とTLR8ライゲーションに応じて、DCベースのIL-1β分泌の基礎となる経路のさらなる調査のための基礎として使用することができ、人間のMoDCにNLRP3ソームを研究するための貴重な技術が記載されているNLRP3の既知の活性化、ナイジェリシン。この方法のバリエーションには、他の細胞型で使用されるが、これらに限定されないことができる：単球、マクロファージ、他のDCサブセット、および上皮細胞。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1081px;" width="1081">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:179px;">Company</td>
			<td style="width:121px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:391px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">IL-4</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">GM-CSF</td>
			<td style="width:179px;">Genzyme</td>
			<td style="width:121px;">NDC 58468-0180-2</td>
			<td>We acquire this item through our local pharmacy with a prescription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">RPMI 1640 with L-glutamine</td>
			<td style="width:179px;">Cellgro</td>
			<td style="width:121px;">10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Peripheral blood mononuclear cells</td>
			<td style="width:179px;">New York Blood Center</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>PBMCs were isolated from the blood of healthy donors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">12-well tissue culture plates</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">96-well round bottom tissue culture plates</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-IL-1&#946;-FITC</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;">IC201F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">FITC isotype control</td>
			<td style="width:179px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:121px;">130-092-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-&#946;-Tubulin</td>
			<td style="width:179px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:121px;">SC-9014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-IL-1&#946;</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;">mab201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">PVDF Immobilon-FL membrane</td>
			<td style="width:179px;">Millipore</td>
			<td style="width:121px;">IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">gradient 4-12 % polycrylamide gel</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-1159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">laemmli sample buffer</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">BSA</td>
			<td style="width:179px;">Equitech Bio Inc</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>30% solution sterile/filtered</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">PFA</td>
			<td style="width:179px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:121px;">15710</td>
			<td>16% solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">human inflammatory cytokine bead array kit</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">551811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">nigericin</td>
			<td style="width:179px;">Invivogen</td>
			<td>tlrl-nig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">R848</td>
			<td>3M Corp.</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-CD14</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">340436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-CD11c</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">555392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">TBS</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>On site stock room</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tween-20</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">P2287-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"><a>Nunc EasYFlask 225cm2, Filter Cap, 70mL working volume, 30/Cs</a></td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">159933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">20 &#956;M Sterile Disposable Filter Units</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">569-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Hepes</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">goat &#945;-mouse IRDye 800CW</td>
			<td style="width:179px;">Licor</td>
			<td style="width:121px;">926-32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">donkey &#945;-rabbit IRDye 680RD</td>
			<td style="width:179px;">Licor</td>
			<td style="width:121px;">926-68073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Spectra multicolor broad range protein ladder</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">26634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tris Glycine SDS 10x</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tris Glycine 10x</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-0734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Methanol - 4L</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">A433P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Prolong Gold antifade Reagent with DAPI</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td>P-36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide</td>
			<td style="width:179px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:121px;">354108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activation and measurement of nlrp3 inflammasome activity using il-1&#946; in human monocyte-derived dendritic cells

インターロイキン（IL）の分泌によって生じる炎症過程-1ファミリーのサイトカインの免疫細胞による組織リモデリングおよび修復、局所または全身性炎症につながる、とウイルス学的コントロール1、2。インターロイキン-1βは、自然免疫応答の重要な要素であり、持続感染1-5の確立を防止しながら、侵入する病原体を排除するために貢献しています。 ソームは1変換酵素（ICEまたはカスパーゼ1）、インターロイキンの活性化のための重要なシグナル伝達プラットフォームである。 NLRP3ソームは、IL-1β分泌6を起こしたDCに少なくとも2つの信号を必要とする。プロIL-1βタンパク質の発現は、休止細胞に限定される;従ってプライミング信号がIL-1βの転写およびタンパク質発現のために必要とされる。多タンパク質NLRP3ソームの形成にNLRP3結果によって感知された第二の信号。責任への樹状細胞の能力IL-1βの分泌に必要な信号をDが細菌毒素とNLRP3ソームの活性化に続いて首相細胞への樹状細胞（のMoDC）を誘導されたヒト単球にTLR8によって感知される合成プリン、R848を用いて試験することができ、カリウムイオ、ナイジェリシン。 単球由来DCは簡単に培養中に生産され、精製されたヒト骨髄性樹状細胞よりもはるかに多くの細胞を提供している。それは代わりにマウス由来の、樹状細胞は、このように人間の病気や感染症におけるソームの研究を可能にし、in vitroでヒトにおいて使用することをここで紹介する方法は、他のソームアッセイとは異なります。

これらの技術は、R848でプライミングTLR8を測定します。のCD11c +たMoDC -プロIL-1βのための細胞内サイトカイン染色は、CD14から顕微鏡およびFACS読み出しが可能になります。両方の技術は、非プライミング、又は休止、電池制御ならびにアイソタイプ対照（ 図1および2）と比較して定量することができる。プロIL-1β+染色細胞の割合は中央値蛍光強度（MFI）を?...

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Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

樹状細胞（DC）は、ニゲリシンとNLRP3ソーム活性化に続いて、合成プリン、R848のTLR8認識に応答してIL-1βを分泌し、したがって、IL-1βはNLRP3ソーム活性を測定するために使用することができる。細胞内サイトカイン染色、イムノブロッティング、およびELISAを正確にIL-1βの発現を介してNLRP3ソームプライミングおよび活性化を測定するために使用される。

ヒト単球由来樹状細胞におけるIL-1βを用いて活性化し、NLRP3ソーム活性の測定

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

activation-measurement-nlrp3-inflammasome-activity-using-il-1-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.7K ビュー.  New York University School of Medicine. 樹状細胞（DC）は、ニゲリシンとNLRP3ソーム活性化に続いて、合成プリン、R848のTLR8認識に応答してIL-1βを分泌し、したがって、IL-1βはNLRP3ソーム活性を測定するために使用することができる。細胞内サイトカイン染色、イムノブロッティング、およびELISAを正確にIL-1βの発現を介してNLRP3ソームプライミングおよび活性化を測定するために使用される。 

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Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin which forms an insoluble clot that stops hemorrhage. Factor V (FV) in its activated form, FVa, is a critical cofactor for the protease FXa and accelerator of thrombin generation during fibrin clot formation as part of prothrombinase 1, 2. Manual FV assays have been described 3, 4, but they are time consuming and subjective. Automated FV assays have been reported 5-7, but the analyzer and reagents are expensive and generally provide only the clot time, not the rate and extent of fibrin formation. The microplate platform is preferred for measuring enzyme-catalyzed events because of convenience, time, cost, small volume, continuous monitoring, and high-throughput 8, 9. Microplate assays have been reported for clot lysis 10, platelet aggregation 11, and coagulation Factors 12, but not for FV activity in human plasma. The goal of the method was to develop a microplate assay that measures FV activity during fibrin formation in human plasma.
This novel microplate method outlines a simple, inexpensive, and rapid assay of FV activity in human plasma. The assay utilizes a kinetic microplate reader to monitor the absorbance change at 405nm during fibrin formation in human plasma (Figure 1) 13. The assay accurately measures the time, initial rate, and extent of fibrin clot formation. It requires only &mu;l quantities of plasma, is complete in 6 min, has high-throughput, is sensitive to 24-80pM FV, and measures the amount of unintentionally activated (1-stage activity) and thrombin-activated FV (2-stage activity) to obtain a complete assessment of its total functional activity (2-stage activity - 1-stage activity).
Disseminated intravascular coagulation (DIC) is an acquired coagulopathy that most often develops from pre-existing infections 14. DIC is associated with a poor prognosis and increases mortality above the pre-existing pathology 15. The assay was used to show that in 9 patients with DIC, the FV 1-stage, 2-stage, and total activities were decreased, on average, by 54%, 44%, and 42%, respectively, compared with normal pooled human reference plasma (NHP).
The FV microplate assay is easily adaptable to measure the activity of any coagulation factor. This assay will increase our understanding of FV biochemistry through a more accurate and complete measurement of its activity in research and clinical settings. This information will positively impact healthcare environments through earlier diagnosis and development of more effective treatments for coagulation disorders, such as DIC.

This study describes a novel microplate assay that measures FV coagulation activity during fibrin clot formation in human plasma which has not been reported previously. The method uses a kinetic microplate reader to continuously measure the change in absorbance at 405nm during fibrin clot formation in human plasma.

マイクロ波凝固アッセイを用いたヒト血漿中の第V因子活性の測定

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

免疫・感染学

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

不定冠詞<em&gt;のin vitro</em研究する&gt;共同感染モデル<em&gt;熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）</emヒトの第一次単球由来の免疫細胞に&gt;-HIV-1の相互作用

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

HIV-1感染CD4の生得センシングを評価<sup&gt; +</sup&gt;使用して形質細胞様樹状細胞によるT細胞<em&gt;エクスビボ</em&gt;共培養系。

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

マクロファージコロニー刺激因子分化したヒト単球由来マクロファージの文化

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and pathogenesis of inflammation. Isolation and study of DCs have been important in biological research because of their distinctive features. Although they are essential key mediators of the immune system, DCs are very rare in blood, accounting for approximately 0.1 - 1% of total blood mononuclear cells. Therefore, alternatives for isolation methods rely on the differentiation of DCs from monocytes isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The utilization of proper isolation techniques that combine simplicity, affordability, high purity, and high yield of cells is imperative to consider. In the current study, two distinct methods for the generation of DCs will be compared. Monocytes were selected by adherence or negatively enriched using magnetic separation procedure followed by differentiation into DCs with IL-4 and GM-CSF. Monocyte and MDDC viability, proliferation, and phenotype were assessed using viability dyes, MTT assay, and CD11c/ CD14 surface marker analysis by imaging flow cytometry. Although the magnetic separation method yielded a significant higher percentage of monocytes with higher proliferative capacity when compared to the adhesion method, the findings have demonstrated the ability of both techniques to simultaneously generate monocytes that are capable of proliferating and differentiating into viable CD11c+ MDDCs after seven days in culture. Both methods yielded &gt; 70% CD11c+ MDDCs. Therefore, our results provide insights that contribute to the development of reliable methods for isolation and characterization of human DCs.

This study compares two different methods of human monocyte isolation for obtaining in vitro dendritic cells (DCs). Monocytes are selected by adherence or negatively enriched by magnetic separation. Monocyte yield and viability along with MDDC viability, proliferation and CD11c/CD14 surface marker expression will be compared between both methods.

イメージングフローサイトメトリーによるヒト単球由来樹状細胞の特徴付け：二つの単球の分離プロトコルの比較

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

全血からのヒト単球由来樹状細胞の生成

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

超高感度単一分子の開発と検証配列人間のインターフェロン-α のデジタルの酵素免疫測定法

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.

インフラマソーム活性化とマウス骨髄由来マクロファージにおける Pyroptotic の細胞死の検出

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of monocyte-derived macrophages can impair wound healing. We showed that high fat and high sugar diets promote monocyte priming and dysfunction, converting healthy blood monocytes into a hyper chemotactic phenotype poised to differentiate into macrophages with dysregulated activation profiles and impaired phenotypic plasticity. The over-recruitment of monocyte-derived macrophages and recruitment of macrophages with dysregulated activation profiles is believed to be a major contributor to the development of chronic inflammatory diseases associated with metabolic disorders, including atherosclerosis and obesity. The goal of this protocol is to quantify the chemotactic activity of blood monocytes as a biomarker for monocyte priming and dysfunction and to characterize the macrophage phenotype blood monocytes are poised to differentiate into in these mouse models. Using single cell Western blot analysis, we show that after 24 h 33%of cells recruited into MCP-1-loaded basement membrane-derived gel plugs injected into mice are monocytes and macrophages; 58% after day 3. However, on day 5, monocyte and macrophage numbers were significantly decreased. Finally, we show that this assays also allows for the isolation of live macrophages from the surgically retrieved basement membrane-derived gel plugs, which can then be subjected to subsequent characterization by single cell Western blot analysis.

Here we present a protocol to quantify the chemotactic activity of blood monocytes in mouse models, to assess the effects of nutritional, pharmacological and genetic interventions on blood monocyte and to characterize the blood monocytes derived macrophages in mouse models using monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-loaded basement membrane-derived gel plugs.

生体内における単球血球活性の定量化と血液単球由来マクロファージの特性化

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas autophagic flux is only observed in iDCs. To gain mechanistic insights, we developed efficient strategies to interfere with HSV-1-induced autophagic turnover. An inhibitor-based strategy, to modulate HSV-1-induced autophagy, constitutes the first choice, since it is an easy and fast method. To circumvent potential unspecific off-target effects of such compounds, we developed an alternative siRNA-based strategy, to modulate autophagic turnover in iDCs upon HSV-1 infection. Indeed, electroporation of iDCs with FIP200-specific siRNA prior to HSV-1 infection is a very specific and successful method to ablate FIP200 protein expression and thereby to inhibit autophagic flux. Both presented methods result in the efficient inhibition of HSV-1-induced autophagic turnover in iDCs, whereby the siRNA-based technique is more target specific. An additional siRNA-based approach was developed to selectively silence the protein expression of KIF1B and KIF2A, facilitating autophagic turnover upon HSV-1 infection in mDCs. In conclusion, the technique of siRNA electroporation represents a promising strategy, to selectively ablate the expression of distinct proteins and to analyze their influence upon an HSV-1 infection.

In this study, we present inhibitor- and siRNA-based strategies to interfere with autophagic flux in Herpes simplex virus type-1 (HSV-1)-infected monocyte-derived dendritic cells.

ヒト単球由来樹状細胞におけるIL-1βを用いて活性化し、NLRP3ソーム活性の測定

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