המחברים רוצים להכיר אוליבייה Manches, Ph.D., דבור Frleta, Ph.D., וMeagan או &#39;בריין, MD לתמיכה והמשוב שלהם. מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחל מדבקות והושלם במימון NIH מענקי פרסים רות ל &#39;Kirschstein שירות הלאומי למחקר למלגות פרט predoctoral (F31) לקידום גיוון במחקר הקשורות לבריאות (AI089030) וRO1 (AI081848 ).

הצהרת אתיקה: דגימות מחקר מתקבלות ומאוחסנות למחקר בהסכמה של תורמים. צריכה להיות מקודדות כל הדגימות או אנונימי לפני השימוש. פרוטוקול זה עוקב אחר הקווים המנחים של דירקטוריון סקירה המוסדית שלנו. 1. בידול של האדם מונוציטים דם ההיקפיים לתאים דנדריטים מונוציטים נגזרו. הערה: מעילים באפי אדם משמשים כמקור של אדם תאי דם היקפי (PBMCs) והתקבלו ממרכז ניו יורק הדם (ניו יורק, ניו יורק). תורמי דם מתנדבים בריאים. ההליך של 5 הימים מתחיל בציפוי של תאים אנושיים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) על גבי תרבית רקמת צלוחיות 35,36. הבדלים ראויים לציון מהפרוטוקולים שפורסמו הם כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 225 סנטימטר 2 צלוחיות תרבית רקמת קלקר שאינו pyrogenic עם מכסה מסנן לדבוק כולל של 2x10 8 PBMCs לכל בקבוק במקום צלחת תרבית רקמת 10 קלקר סנטימטרs (58 סנטימטר 2) (שלב 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת עם 5% בסרום אדם (PHS; 30 מיליליטר) ונקווה ב500 מיליליטר RPMI-1640 + L-גלוטמין, חיץ 5 מיליליטר 1 M HEPES, ו1.4 מיליליטר 50 מ&quot;ג / מיליליטר גנטמיצין (5% תקשורת PHS) ואחרי סינון דרך סינון 20 מיקרומטר. להוסיף סך של 50 מיליליטר 5% תקשורת PHS ל225 סנטימטר בקבוק תרבות 2 רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים דבקים שלוש פעמים עם 25 מיליליטר RPMI-1640 טריים. לנער במרץ במשך 5 שניות בכל שטיפה ולשאוב תאים חסיד שאינם (שלב 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 190 μl של 400 IU / IL-4 ו380 μl μl של 100 IU / μl GM-CSF לכל בקבוק (שלב 3) ביום 0, 2, ו -4. יום 0 מוגדרת כPBMCs היום לראשונה מצופות בשלב 1 (שלב 8). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 moDCs יום קציר בריכוז של 1x10 6 תאי מיליליטר / (שלב 15). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש moDCs מייד במצב המנוחה שלהם. שלבי 17-22 הם מעולם לא ביצעו. הערה: דוגמאות צריכים להיות מעובד בהקדם האפשרי לאחר איסוף לתוצאות הטובות ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> moDCs aliquot בריכוזtion של 2x10 5 תאים / טוב (200 μl / טוב של 1x10 6 תאים / מיליליטר) ב96 צלחת גם עגול תחתית (כתם מערבי, ELISA, FACS) או על גבי chamberslide פולי-L-ליזין שטופל (מיקרוסקופית) לניסויים . שים לב: יש לפחות 4 תנאים: (בקרה שלילית) לחלוטין unstimulated, תחול רק, הפעלה בלבד, ותחול אחרי הפעלה. ניתן להרחיב תנאים לכלול פקדי diluent לR848 וnigericin אם תרצה בכך. אם assay במורד הזרם הוא ICS, כפילויות נחוצות לפקדי אלוטיפ. </li></ol> . 2 קרקע Inflammasome - 1 איתותים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש R848 lyophilized בDMSO על פי הוראות היצרן. לדלל המניה עובדת ב RT עם RPMI-1640. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת R848 בריכוז סופי 10 מיקרומטר לנכס בארות ל18 שעה. תאי מקום בחממה ב 37 ° C ו-CO 2 של 5%. </li></ol> 3 הפעלת Inflammasome NLRP3 -. איתותים2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש nigericin lyophilized באתנול על פי הוראות היצרן. לדלל המניה עובדת ב RT עם RPMI-1640 לפני הוספה לתנאים המתאימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת nigericin בריכוז סופי 20 מיקרומטר ולחזור לחממה ב 37 ° C ו 5% CO 2 למשך 6 שעות. אין שלבי כביסה להתרחש בין תחול ובמהלך ההפעלה. הערה: ההפרשה של IL-1β מוגברת על ידי הנוכחות של יונופורים סידן, brefeldin chlorophenylhydrazone, monensin, dinitrophenol, או ציאניד קרבוניל 37, 38. לכן, תוספת של מעכבי הפרשה אלה אינן מומלצים בעת ניתוח תחול או פעילות inflammasome שכן הוא ישנה את ההפרשה של IL-1β. </li></ol> 4. אוסף דוגמאות IL-1SS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הצלחת עם תאים וsupernatants ב974 XG במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבלי להפריע לתא גלולה, לשאוב supernatant ולהעביר כלeparate עגול עם תחתית צלחת על מנת למדוד את הפרשת ציטוקינים מsupernatants. הערה: Supernatants ניתן לאחסן באופן זמני ב -20 מעלות צלזיוס או -80 ° C עבור אחסון לטווח ארוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את כדורים הסלולריים שלוש פעמים עם 200 μl של 1x PBS ב974 XG במשך 3 דקות כדי להסיר כל IL-1β תאיים מהדגימות הסלולריות. שים לב: כאשר שוטפים את כדורי תא מצלחת גם 96, להסיר לשטוף על ידי היפוך צלחת מהיר לפח אוסף, כדי לא להפריע לדוגמה. </li></ol> 5. מדידת IL-1SS מדוגמאות נייד וSupernatant <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאיים ציטוקין מכתים (ICS): פרוטוקול ICS מתואר להלן 39, 40. שים לב: אין להשעות את התאים אם assay במורד הזרם הוא מיקרוסקופית. צריכים לעשות את כל הכביסות והשאיפות מבלי להפריע את שכבת תאים / גלולה (תלוי בassay במורד). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של מדיה PHS 5% 100 μl לתוך בארות מתאימות. להוסיףנפח מתאים (כ 1 μl/2x10 5 תאים, או μl 1 / טוב) של כותרתו fluorescently α-CD11c וα-CD14 (סמני פנוטיפ; שיבוט B-ly6 וMφP9, בהתאמה) או שליטת אלוטיפ התאים 10 דקות ב RT בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים עם 1x PBS ב974 XG במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים על ידי הוספה של 4% PFA 100 μl עבור 20 דקות ב RT בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השהה פוינט: לשטוף עם 100 PBS μl 1x ב974 XG במשך 3 דקות ולאחסן ב 4 ° CO / N ב 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של חיץ permeabilization 100 μl לתאים ל30 דקות. הערה: חיץ permeabilization מורכב של 1x PBS עם 0.3% טריטון X-100, ו -1% אלבומין בסרום שור (BSA) לpermeabilization. נא לא להפריע תאים חסיד כאשר assay במורד הזרם הוא מיקרוסקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נפח מתאים (5 תאים כ 62 antibody/2x10 ng, כ או 2.5 μl / טוב) של α-IL-1β-FITC (שיבוט 8516) או שליטת אלוטיפ עבורשעה 2 באינקובטור ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים שלוש פעמים עם 200 μl של חיץ permeabilization ב974 XG במשך 3 דקות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: כתם עם DAPI, להוסיף mountant, ומניח coverslip בעדינות על גבי שקופיות זכוכית. לאפשר mountant לרפא O / N לפני צילום תמונות במיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש את הנתונים על ידי FACS או במיקרוסקופ. הערה: השווה את אלוטיפ עבור כל תנאי לצביעה המתאימה בעת ניתוח על ידי FACS או במיקרוסקופ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> FACS: רוכשת את הדגימה אחת בכל פעם. הגדר את / שער SSC FSC בתאים חיים, ואחריו gating על CD11c + CD14 - תאים לפני ניתוח מכתים פרו-IL-1β אוכלוסיית moDC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופית: הגדר את זמן החשיפה באמצעות מדגם מכתים החיובי - R848 שטופל. השתמש DAPI + פרו-IL-1β + וDAPI + פרו-IL-1β - כדי לקבוע אחוז פרו-IL-1β + moDCs להביע. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SDעמוד-S: immunoblotting מבוצע כדי לזהות פרו-IL-1β. הערה: הטכניקה המתוארת להלן משלבת טכניקה סטנדרטית immunoblotting, ג&#39;ל polyacrylamide 4-20% שיפוע, וגילוי ניאון או chemiluminescent 41, 42. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי Lyse ישירות ב10 μl denaturing מאגר תמוגה (5 μl β-mercaptoethanol/950 חיץ מדגם μl Laemmli אחרי דילול 1:01 עם חיץ תמוגה תא). העבר את lysate ל1.5 צינורות מיליליטר Eppendorf. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> lysate חום על צלחת יבשה 10 דקות ב 100 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין lysate ב20,800 XG על minicentrifuge דקות 1 לרכז את נפח הנוזל. השהה נקודה: אפשר להקפיא דגימות ב -20 ° C לאחסון לטווח קצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את הנפח הכולל על ג&#39;ל polyacrylamide. הפעל 140 V דרך תיבת ג&#39;ל למשך כ 1 שעות, או עד שצבען מול בורח תחתית הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את החלבון מן ג&#39;ל polyacrylamide על membr PVDF Immobilon-FLane ל90 דקות ב100 V. בלוק הקרום עם BSA 5% בטריס בופר / 0.1% Tween-20 (TBS-T) במשך שעה 1. הערה: PVDF Immobilon-FL הוא הטוב ביותר לשימוש בזיהוי ניאון. קרום עם הרכב שונה מומלץ לטכניקות זיהוי אחרות כדי להגדיל את יחס האות לרקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל נוגדנים ראשוניים ומשניים ב10 מיליליטר של BSA 5% / TBS-T. בצע incubations נוגדן הראשוני על 4 מעלות CO / N תוך רעד ונוגדנים משני ב RT עבור שעה 1 ואילו רועדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הממברנה 3 פעמים עם TBS-T במשך 5 דקות תוך כדי הטלטול בין incubations נוגדן הראשוני והמשני ושוב בין incubations והדמיה משני. הערה: ניתן לאתר להקות באמצעות ניאון או זיהוי chemiluminescent. עקוב אחר ההוראות של היצרן לצורך זיהוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ELISA: דוגמאות שהם קפואים לאחסון צריכה לאזן לRT לפני הניתוח. ספין למטה דגימות בצנטריפוגה כדי לגבש condens supernatantation. עקוב אחר ההוראות של היצרן למדידה של IL-1β. הערה: בפרוטוקול זה IL-1β נמדדים במיוחד; עם זאת, מדידה בו זמנית של TNFα, IL-6, וציטוקינים המערכת החיסונית IL-10 להבטיח את התנאים המתאימים היו דרוכים. </li></ol>

יש המחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

ציטוקינים דלקתיים הם חלק בלתי נפרד בהיגוי תגובת החיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות כדי להילחם בזיהום נגיפי. IL-1β מופרשים הוכח להגדיל בשפעת זיהום 3, 43, 44. המנגנון המדויק שבאמצעותו ציטוקינים אלה מעובדים בתגובה להכרה נגיפית בתאים הדנדריטים אנושיים אינם מובנה במלואם....

הפעלה של מערכת חיסון מולדת נדרשת לנווט את התגובה חיסונית אדפטיבית במהלך זיהום, מחלה, וחיסון 7. תאים הדנדריטים הם אנטיגן החזק ביותר הצגה בתאים של מערכת החיסון המולדת; הם מתמחים לספיגה של אנטיגנים, הגירה לבלוטות הלימפה, והפעלה של CD4 + נאיבי וcytolytic CD8 + T-תאי 8-10. כדי לאפשר את גילוי פתוגן מהיר מערכת החיסון המולדת מנצלת קולטנים רבים germline מקודד זיהוי תבניות (PRR) שיכירו מוטיבים נגזרו הפתוגן שימור או סמני מארח נגזר של מתח תא ונזק. אגרה כמו קולטנים (TLRs) הן קולטנים זיהוי תבניות קרום מחויבים שמזהים פתוגן phagocytized תאי מסוים הקשורים דפוסים מולקולריים (PAMPs) ודפוסים מולקולריים סכנה קשורה (damps). על ידי הנהון ניגוד כמו קולטנים (NLRs) הם cytosolic ולהגיב למגוון רחב של PAMPs וdamps. תהנהן כמו קולטנים מחדשלהציג קו הגנה שני נגד פתוגנים המפרים את תא שטח וPRRs endocytic. האינטראקציה של הפתוגן נגזר, או &quot;סכנה&quot; קשורה, גורמים עם ligands TLR וNLR מובילים למצב של התבגרות DC וכתוצאה מאינטראקצית DC גדלה עם תאים אחרים של מערכת חיסון וקידום של תא T והפעלת תא הרג טבעי 11. אינטרלויקין 1β הוא מרכיב חיוני של ההגנה המארחת נגד זיהום. בעת ההכרה של מיקרואורגניזם, ציטוקינים מעודדי דלקת מאוד, IL-1β, מופרש ופונקציות כמו attractant הכימותרפיה וactivator של תאי מערכת החיסון מולדים ובעלי כושר הסתגלות. בvivo IL-1β היא אחראית במידה רבה לתגובת השלב החריף, כולל חום וציטוקינים דלקתיים סינתזה 12. רוב NLRs מכיל תחום חוזר עשיר לאוצין מסוף C שהוא חשב לתפקד בחישת יגנד, תחום מרכזי נוקלאוטיד מחייב (נכט) שהוא important לoligomerization NLRP3, ותחום N מסוף מפעיל (PYD בNLRP3) שמתווך הולכים אותות למטרות במורד דרך אינטראקציות חלבון חלבון. חלבון NLRP3 מגדיר מורכב inflammasome הנחקר ביותר בעוצמה. חלבון זה הוא חבר של משפחת NLR ויש לו את היכולת ליצור חלבונים מורכבים מולקולרי רב מורכב מNLRP3, PYCARD חלבון מתאם (הידוע גם בASC), וקרח. עם הפעלת inflammasome PYCARD נקשר לתחומים מסוף NLRP3 N ומגייס ICE באמצעות הפעלת caspase ותחום גיוס תחומים (כרטיס). המרת אנזים אינטרלויקין 1 בתחילה נוצר כאב תסס מכיל מוטיב כרטיס בN-הסופית שלה. תוצאות היווצרות Inflammasome בהבאת שתי מולקולות ICE מספיק קרובה כדי לגרום להפעלת זירוזם. מורכב inflammasome הוא הכרחי להפעלת ICE ובכך מאפשרת לו להמיר-IL-1β פרו cytoplasmic להבשיל ציטוקינים. הפרשה מוצלחת של IL-1β בDCs דורש חישה של שני אותות סכנה שונים ועצמאיים. ראשית, חישת TLR של PAMPs, damps, או ציטוקינים איתות (TNFα או IL-1β) גורמת להגברת ביטוי של ביטוי חלבון פרו IL-1β-cytoplasmic. שנייה, לעתים קרובות שונה, אות נדרשת להיווצרות מורכבת inflammasome במעלה הזרם של התבגרות ICE. Inflammasome כמה מגרה אותות כוללים רעלים נקבוביות קרום חיידק יוצרים (כגון nigericin), גבישי lysosomal שיבוש (כגון גבישי urate גלוטמט, MSU), וה-ATP תאי. המנגנון נגד הזרם המוביל לNLRP3 הפעלת inflammasome ידי מפעילים המגוונים אלה אינם ברור. מחקרים חוקרים במעלה הזרם איתות של היווצרות inflammasome מציע כי אירועים תאיים, כגון אינדוקציה של היפוקלמיה או מיני חמצן תגובתי (ROS) בעקיפין להפעיל inflammasome 13-28. בקרב המפעילים נגיפיים השונים של inflammasome NLRP3 היא שפעת, המספקת בOTH האות הראשונית ומשנית הנדרשת להפרשה IL-1β 3, 29-33. באמצעות מודלים נוקאאוט NLRP3 עכבר נמצא כי הפרשת IL-1β בDCS היא NLRP3 תלויה 32. בנוסף, עכברי נוקאאוט NLRP3 נמשכים פחות לויקוציטים לאתר של זיהום וחוו תמותה גבוהה יותר 2, 5. שני מאמרים אחרונים מציעים מנגנון להפעלת inflammasome NLRP3 במהלך זיהום בנגיף שפעת; הראשון, תחול באמצעות הכרה של רנ&quot;א הנגיפי על ידי TLR7 או TLR8 (תלוי בביטוי TLR של התא להגיב) או באמצעות חישה של חיידקי commensal ידי TLRs האחר כדי לגרום ביטוי פרו IL-1β-cytoplasmic, ואחריו אות שנייה, הפעלה של NLRP3 היווצרות inflammasome ידי חלבון ערוץ יון הנגיפי M2 ברשת טרנס גולג&#39;י 33, 34. בשלב האחרון, מפעילה של inflammasome NLRP3 מושגת על ידי הפרעה של יונית תאיים &lt;em&gt; הסביבה המובילה לייצור ROS, שהוא, בפשטות, חש ידי NLPR3 כאות ליצירת inflammasome. עם זאת, המנגנון המדויק של מעלה זרם הפעלת inflammasome פעילות ICE במהלך זיהום שפעת עדיין אינו ברור. עבודה זו מתארת ​​טכניקת ערך ללימוד inflammasome NLRP3 בmoDCs אדם שיכול לשמש כבסיס לחקירה נוספת של המסלול שבבסיס DC מבוסס הפרשת IL-1β בתגובה לקשירת TLR8 עם R848 ואחרי הפעלה של inflammasome ידי כן activator הידוע של NLRP3, nigericin. וריאציות של שיטה זו ניתן להשתמש בסוגי תאים אחרים, כולל, אך לא מוגבלת ל: מונוציטים, מקרופאגים, תת DC אחר, ותאי אפיתל.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1081px;" width="1081">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:179px;">Company</td>
			<td style="width:121px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:391px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">IL-4</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">GM-CSF</td>
			<td style="width:179px;">Genzyme</td>
			<td style="width:121px;">NDC 58468-0180-2</td>
			<td>We acquire this item through our local pharmacy with a prescription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">RPMI 1640 with L-glutamine</td>
			<td style="width:179px;">Cellgro</td>
			<td style="width:121px;">10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Peripheral blood mononuclear cells</td>
			<td style="width:179px;">New York Blood Center</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>PBMCs were isolated from the blood of healthy donors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">12-well tissue culture plates</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">96-well round bottom tissue culture plates</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-IL-1&#946;-FITC</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;">IC201F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">FITC isotype control</td>
			<td style="width:179px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:121px;">130-092-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-&#946;-Tubulin</td>
			<td style="width:179px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:121px;">SC-9014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-IL-1&#946;</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;">mab201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">PVDF Immobilon-FL membrane</td>
			<td style="width:179px;">Millipore</td>
			<td style="width:121px;">IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">gradient 4-12 % polycrylamide gel</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-1159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">laemmli sample buffer</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">BSA</td>
			<td style="width:179px;">Equitech Bio Inc</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>30% solution sterile/filtered</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">PFA</td>
			<td style="width:179px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:121px;">15710</td>
			<td>16% solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">human inflammatory cytokine bead array kit</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">551811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">nigericin</td>
			<td style="width:179px;">Invivogen</td>
			<td>tlrl-nig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">R848</td>
			<td>3M Corp.</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-CD14</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">340436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-CD11c</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">555392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">TBS</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>On site stock room</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tween-20</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">P2287-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"><a>Nunc EasYFlask 225cm2, Filter Cap, 70mL working volume, 30/Cs</a></td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">159933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">20 &#956;M Sterile Disposable Filter Units</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">569-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Hepes</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">goat &#945;-mouse IRDye 800CW</td>
			<td style="width:179px;">Licor</td>
			<td style="width:121px;">926-32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">donkey &#945;-rabbit IRDye 680RD</td>
			<td style="width:179px;">Licor</td>
			<td style="width:121px;">926-68073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Spectra multicolor broad range protein ladder</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">26634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tris Glycine SDS 10x</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tris Glycine 10x</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-0734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Methanol - 4L</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">A433P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Prolong Gold antifade Reagent with DAPI</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td>P-36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide</td>
			<td style="width:179px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:121px;">354108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activation and measurement of nlrp3 inflammasome activity using il-1&#946; in human monocyte-derived dendritic cells

תהליכים דלקתיים כתוצאה מההפרשה של אינטרלויקין (IL) -1 ציטוקינים על ידי תאי מערכת החיסון משפחה להוביל לדלקת מקומית או מערכתית, שיפוץ ותיקון רקמות, ושליטה virologic 1, 2. אינטרלויקין 1β הוא מרכיב חיוני של תגובת החיסון המולדת ותורמים לחיסול פולש פתוגנים תוך מניעת הקמתה של זיהום המתמשך 1-5. Inflammasomes הוא פלטפורמת האיתות המרכזית להפעלה של אנזים אינטרלוקין 1 המרה (ICE או caspase-1). Inflammasome NLRP3 דורש לפחות שני אותות בDCs לגרום להפרשת IL-1β 6. ביטוי חלבון Pro-IL-1β מוגבל ב נח תאים; לכן אות תחול נדרש לשעתוק IL-1β וביטוי חלבון. אות שנייה חשה ידי תוצאות NLRP3 בהיווצרות inflammasome NLRP3 חלבון רב. היכולת של תאים הדנדריטים לresponד לאותות הנדרשים להפרשת IL-1β ניתן לבדוק באמצעות פורין סינטטי, R848, אשר חש ידי TLR8 במונוציטים אדם נגזרים תאים דנדריטים (moDCs) לתאי ראש, ואחרי הפעלה של inflammasome NLRP3 עם רעלן החיידק ו ionophore אשלגן, nigericin. DCs נגזר מונוציטים מיוצרים בקלות בתרבות ולספק יותר באופן משמעותי מאשר תאי DCs מיאלואידית האנושית מטוהר. השיטה המוצגת כאן שונה ממבחני inflammasome אחרים בכך שהוא משתמש באדם חוץ גופית, במקום עכבר נגזר, DCS ובכך מאפשר לחקר inflammasome במחלות וזיהומים אנושיים.

טכניקות אלה מודדים TLR8 תחול עם R848. מכתים ציטוקינים תאיים לפרו-IL-1β מאפשר למיקרוסקופיה וFACS קריאות מCD14 - CD11c + moDCs. ניתן לכמת את שני הטכניקות ביחס למי שאינו דרוך, או מנוחה, בקרת תא, כמו גם שליטת אלוטיפ (איורים 1 ו -2). אחוזים של תאים פרו-IL-1β + צביעה מוכפ...

Watch this Scientific Journal Video about Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1Î² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells at JoVE.com

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&amp;#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

תאים דנדריטים (DC) להפריש IL-1β בתגובה להכרה TLR8 של פורין הסינתטי, R848, ואחרי הפעלת inflammasome NLRP3 עם nigericin, ולכן, IL-1β יכולים לשמש למדידת פעילות inflammasome NLRP3. צביעה תאית ציטוקינים, immunoblotting, וELISA משמשים למדידת inflammasome NLRP3 תחול והפעלה באמצעות ביטוי IL-1β במדויק.

הפעלה ומדידה של NLRP3 Inflammasome פעילות באמצעות IL-1β בתאים דנדריטים נגזרות מונוציטים אדם

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

activation-measurement-nlrp3-inflammasome-activity-using-il-1-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

20.7K Views.  New York University School of Medicine.  תאים דנדריטים (DC) להפריש IL-1β בתגובה להכרה TLR8 של פורין הסינתטי, R848, ואחרי הפעלת inflammasome NLRP3 עם nigericin, ולכן, IL-1β יכולים לשמש למדידת פעילות inflammasome NLRP3. צביעה תאית ציטוקינים, immunoblotting, וELISA משמשים למדידת inflammasome NLRP3 תחול והפעלה באמצעות ביטוי IL-1β במדוי?...

Video: Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin which forms an insoluble clot that stops hemorrhage. Factor V (FV) in its activated form, FVa, is a critical cofactor for the protease FXa and accelerator of thrombin generation during fibrin clot formation as part of prothrombinase 1, 2. Manual FV assays have been described 3, 4, but they are time consuming and subjective. Automated FV assays have been reported 5-7, but the analyzer and reagents are expensive and generally provide only the clot time, not the rate and extent of fibrin formation. The microplate platform is preferred for measuring enzyme-catalyzed events because of convenience, time, cost, small volume, continuous monitoring, and high-throughput 8, 9. Microplate assays have been reported for clot lysis 10, platelet aggregation 11, and coagulation Factors 12, but not for FV activity in human plasma. The goal of the method was to develop a microplate assay that measures FV activity during fibrin formation in human plasma.
This novel microplate method outlines a simple, inexpensive, and rapid assay of FV activity in human plasma. The assay utilizes a kinetic microplate reader to monitor the absorbance change at 405nm during fibrin formation in human plasma (Figure 1) 13. The assay accurately measures the time, initial rate, and extent of fibrin clot formation. It requires only &mu;l quantities of plasma, is complete in 6 min, has high-throughput, is sensitive to 24-80pM FV, and measures the amount of unintentionally activated (1-stage activity) and thrombin-activated FV (2-stage activity) to obtain a complete assessment of its total functional activity (2-stage activity - 1-stage activity).
Disseminated intravascular coagulation (DIC) is an acquired coagulopathy that most often develops from pre-existing infections 14. DIC is associated with a poor prognosis and increases mortality above the pre-existing pathology 15. The assay was used to show that in 9 patients with DIC, the FV 1-stage, 2-stage, and total activities were decreased, on average, by 54%, 44%, and 42%, respectively, compared with normal pooled human reference plasma (NHP).
The FV microplate assay is easily adaptable to measure the activity of any coagulation factor. This assay will increase our understanding of FV biochemistry through a more accurate and complete measurement of its activity in research and clinical settings. This information will positively impact healthcare environments through earlier diagnosis and development of more effective treatments for coagulation disorders, such as DIC.

This study describes a novel microplate assay that measures FV coagulation activity during fibrin clot formation in human plasma which has not been reported previously. The method uses a kinetic microplate reader to continuously measure the change in absorbance at 405nm during fibrin clot formation in human plasma.

מדידה של פעילות פקטור V בפלזמה אנושית באמצעות Assay קרישת Microplate

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and pathogenesis of inflammation. Isolation and study of DCs have been important in biological research because of their distinctive features. Although they are essential key mediators of the immune system, DCs are very rare in blood, accounting for approximately 0.1 - 1% of total blood mononuclear cells. Therefore, alternatives for isolation methods rely on the differentiation of DCs from monocytes isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The utilization of proper isolation techniques that combine simplicity, affordability, high purity, and high yield of cells is imperative to consider. In the current study, two distinct methods for the generation of DCs will be compared. Monocytes were selected by adherence or negatively enriched using magnetic separation procedure followed by differentiation into DCs with IL-4 and GM-CSF. Monocyte and MDDC viability, proliferation, and phenotype were assessed using viability dyes, MTT assay, and CD11c/ CD14 surface marker analysis by imaging flow cytometry. Although the magnetic separation method yielded a significant higher percentage of monocytes with higher proliferative capacity when compared to the adhesion method, the findings have demonstrated the ability of both techniques to simultaneously generate monocytes that are capable of proliferating and differentiating into viable CD11c+ MDDCs after seven days in culture. Both methods yielded &gt; 70% CD11c+ MDDCs. Therefore, our results provide insights that contribute to the development of reliable methods for isolation and characterization of human DCs.

This study compares two different methods of human monocyte isolation for obtaining in vitro dendritic cells (DCs). Monocytes are selected by adherence or negatively enriched by magnetic separation. Monocyte yield and viability along with MDDC viability, proliferation and CD11c/CD14 surface marker expression will be compared between both methods.

אפיון של תאי דנדריטים אדם נגזר מונוציטים ידי cytometry זרימת הדמיה: השוואה בין שני פרוטוקולי בידוד מונוציטים

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

דור של תאי דנדריטים אדם נגזר מונוציטים מן הדם מלא

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

פיתוח ובדיקת של מולקולה בודדת העדינה מערך דיגיטלי מקושרים-אנזים Immunosorbent Assay עבור אינטרפרון אנושי-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.

זיהוי של Inflammasome ההפעלה ומוות תא Pyroptotic של מקרופאגים הנגזרות מח עצם מאתר

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of monocyte-derived macrophages can impair wound healing. We showed that high fat and high sugar diets promote monocyte priming and dysfunction, converting healthy blood monocytes into a hyper chemotactic phenotype poised to differentiate into macrophages with dysregulated activation profiles and impaired phenotypic plasticity. The over-recruitment of monocyte-derived macrophages and recruitment of macrophages with dysregulated activation profiles is believed to be a major contributor to the development of chronic inflammatory diseases associated with metabolic disorders, including atherosclerosis and obesity. The goal of this protocol is to quantify the chemotactic activity of blood monocytes as a biomarker for monocyte priming and dysfunction and to characterize the macrophage phenotype blood monocytes are poised to differentiate into in these mouse models. Using single cell Western blot analysis, we show that after 24 h 33%of cells recruited into MCP-1-loaded basement membrane-derived gel plugs injected into mice are monocytes and macrophages; 58% after day 3. However, on day 5, monocyte and macrophage numbers were significantly decreased. Finally, we show that this assays also allows for the isolation of live macrophages from the surgically retrieved basement membrane-derived gel plugs, which can then be subjected to subsequent characterization by single cell Western blot analysis.

Here we present a protocol to quantify the chemotactic activity of blood monocytes in mouse models, to assess the effects of nutritional, pharmacological and genetic interventions on blood monocyte and to characterize the blood monocytes derived macrophages in mouse models using monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-loaded basement membrane-derived gel plugs.

הכמת של פעילות כימוכתית מונוציט בVivo ואפיון מקרופאגים הנגזרים מונוציט

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas autophagic flux is only observed in iDCs. To gain mechanistic insights, we developed efficient strategies to interfere with HSV-1-induced autophagic turnover. An inhibitor-based strategy, to modulate HSV-1-induced autophagy, constitutes the first choice, since it is an easy and fast method. To circumvent potential unspecific off-target effects of such compounds, we developed an alternative siRNA-based strategy, to modulate autophagic turnover in iDCs upon HSV-1 infection. Indeed, electroporation of iDCs with FIP200-specific siRNA prior to HSV-1 infection is a very specific and successful method to ablate FIP200 protein expression and thereby to inhibit autophagic flux. Both presented methods result in the efficient inhibition of HSV-1-induced autophagic turnover in iDCs, whereby the siRNA-based technique is more target specific. An additional siRNA-based approach was developed to selectively silence the protein expression of KIF1B and KIF2A, facilitating autophagic turnover upon HSV-1 infection in mDCs. In conclusion, the technique of siRNA electroporation represents a promising strategy, to selectively ablate the expression of distinct proteins and to analyze their influence upon an HSV-1 infection.

In this study, we present inhibitor- and siRNA-based strategies to interfere with autophagic flux in Herpes simplex virus type-1 (HSV-1)-infected monocyte-derived dendritic cells.

siRNA אלקטרופורציה כדי לווסת את החלונות האוטומטיים בווירוס הרפס סוג 1-מונוציט הנגזר מונולוייט תאים דנדריטים

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic inflammation. Neutrophil ETs (NETs) consist of a mesh of DNA, histone proteins, and various granule proteins (i.e., myeloperoxidase, elastase, and cathepsin G). Other immune cells, including macrophages, can also produce ETs; however, to what extent this occurs in vivo and whether macrophage extracellular traps (METs) play a role in pathological mechanisms has not been examined in detail. To better understand the role of METs in inflammatory pathologies, a protocol was developed for visualizing MET release from primary human macrophages in vitro, which can also be exploited in immunofluorescence experiments. This allows further characterization of these structures and their comparison to ETs released from neutrophils. Human monocyte-derived macrophages (HMDM) produce METs upon exposure to different inflammatory stimuli following differentiation to the M1 pro-inflammatory phenotype. The release of METs can be visualized by microscopy using a green fluorescent nucleic acid stain that is impermeant to live cells (e.g., SYTOX green). Use of freshly isolated primary macrophages, such as HMDM, is advantageous in modeling in vivo inflammatory events that are relevant to potential clinical applications. This protocol can also be used to study MET release from human monocyte cell lines (e.g., THP-1) following differentiation into macrophages with phorbol myristate acetate or other macrophage cell lines (e.g., the murine macrophage-like J774A.1 cells).

Presented here is a protocol to detect macrophage extracellular trap (MET) production in live cell culture using microscopy and fluorescence staining. This protocol can be further extended to examine specific MET protein markers by immunofluorescence staining.

בגירוי חוץ-גופית והדמיה של שחרור מלכודת השמנה ב הבדיל מונוקרוציט האדם הנגזר

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct regulation of inflammatory signaling and is activated by proximity-induced dimerization following recruitment to inflammasomes. Caspase-1 is abundant in the monocytic cell lineage and induces maturation of the pro-inflammatory cytokines interleukin (IL)-1&#946; and IL-18 to active secreted molecules. The other inflammatory caspases, caspase-4 and -5 (and their murine homolog caspase-11) promote IL-1&#946; release by inducing pyroptosis. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is a tool used to measure inflammatory caspase induced proximity as a readout of caspase activation. The caspase-1, -4, or -5 prodomain, which contains the region that binds to the inflammasome, is fused to non-fluorescent fragments of the yellow fluorescent protein Venus (Venus-N [VN] or Venus-C [VC]) that associate to reform the fluorescent Venus complex when the caspases undergo induced proximity. This protocol describes how to introduce these reporters into primary human monocyte-derived macrophages (MDM) using nucleofection, treat the cells to induce inflammatory caspase activation, and measure caspase activation using fluorescence and confocal microscopy. The advantage of this approach is that it can be used to identify the components, requirements, and localization of the inflammatory caspase activation complex in living cells. However, careful controls need to be considered to avoid compromising cell viability and behavior. This technique is a powerful tool for the analysis of dynamic caspase interactions at the inflammasome level as well as for the interrogation of the inflammatory signaling cascades in living MDM and monocytes derived from human blood samples.

This protocol describes the workflow to obtain monocytes-derived macrophages (MDM) from human blood samples, a simple method to efficiently introduce inflammatory caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) reporters into human MDM without compromising cell viability and behavior, and an imaging-based approach to measure inflammatory caspase activation in living cells.

הדמיה של קספאזות דלקתיות המושרות קרבה במקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and play a unique role within the immune system by linking the innate and adaptive immune responses. These cells can phagocytize and then present captured antigens to effector immune cells, triggering a diverse range of immune responses. This paper demonstrates a standardized method for the in vitro generation of bovine monocyte-derived dendritic cells (MoDCs) isolated from cattle peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and their application in evaluating vaccine immunogenicity.
Magnetic-based cell sorting was used to isolate CD14+ monocytes from PBMCs, and the supplementation of complete culture medium with interleukin (IL)-4 and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) was used to induce the differentiation of CD14+ monocytes into naive MoDCs. The generation of immature MoDCs was confirmed by detecting the expression of major histocompatibility complex II (MHC II), CD86, and CD40 cell surface markers. A commercially available rabies vaccine was used to pulse the immature MoDCs, which were subsequently co-cultured with naive lymphocytes.
The flow cytometry analysis of the antigen-pulsed MoDCs and lymphocyte co-culture revealed the stimulation of T lymphocyte proliferation through the expression of Ki-67, CD25, CD4, and CD8 markers. The analysis of the mRNA expression of IFN-&#947; and Ki-67, using quantitative PCR, showed that the MoDCs could induce the antigen-specific priming of lymphocytes in this in vitro co-culture system. Furthermore, IFN-&#947; secretion assessed using ELISA showed a significantly higher titer (**p &#60; 0.01) in the rabies vaccine-pulsed MoDC-lymphocyte co-culture than in the non-antigen-pulsed MoDC-lymphocyte co-culture. These results show the validity of this in vitro MoDC assay to measure vaccine immunogenicity, meaning this assay can be used to identify potential vaccine candidates for cattle before proceeding with in vivo trials, as well as in vaccine immunogenicity assessments of commercial vaccines.

The methodology describes the generation of bovine monocyte-derived dendritic cells (MoDCs) and their application for the in vitro evaluation of antigenic candidates during the development of potential veterinary vaccines in cattle.

קביעת אימונוגניות החיסון באמצעות תאים דנדריטיים שמקורם במונוציטים של בקר

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...