Gli autori desiderano ringraziare Olivier Manches, Ph.D., Davor Frleta, Ph.D., e Meagan O&#39;Brien, MD per il loro supporto e feedback. Questa ricerca è stata sostenuta dal National Institute of Allergy e malattie infettive e completato con finanziamenti NIH concede Ruth L. Kirschstein Nazionali servizio di ricerca Awards per i diversi predoctoral Fellowships (F31) per promuovere la diversità nella ricerca in campo sanitario (AI089030) e RO1 (AI081848 ).

Dichiarazione Etica: i campioni di ricerca sono ottenuti e conservati per la ricerca con il consenso dei donatori. Tutti i campioni devono essere codificati o anonimizzati prima dell&#39;uso. Questo protocollo segue le linee guida del nostro Institutional Review Board. 1. Differenziazione del sangue periferico umano monociti in cellule dendritiche derivate da monociti. Nota: buffy coat umani servono come fonte di cellule umane del sangue periferico (PBMC) e sono stati ottenuti dal New York Blood Center (New York, NY). Donatori di sangue sono volontari sani. La procedura di cinque giorni inizia con la placcatura di cellule umane mononucleate del sangue periferico (PBMC) su colture di tessuti Boccette 35,36. Notevoli differenze dei protocolli pubblicati sono i seguenti: <ol><li> Utilizzare 225 centimetri 2 non pirogeniche fiasche di coltura tissutale polistirene con un tappo del filtro di aderire un totale di 2x10 8 PBMC al pallone invece di 10 centimetri di polistirolo piastra di coltura tissutales (58 gli cm 2) (step 1). </li><li> Preparare media con 5% di siero umano (pool PHS; 30 ml) a 500 ml RPMI-1640 + L-glutammina, tampone 5 ml 1 M HEPES, e 1,4 ml di 50 mg / ml di gentamicina (5% PHS media) seguita da filtrazione attraverso un filtro 20 micron. Aggiungere un totale di 50 ml 5% PHS supporti per 225 centimetri pallone di coltura tissutale 2. </li><li> Lavare le cellule aderito tre volte con 25 ml fresco RPMI-1640. Agitare energicamente per 5 secondi durante ogni lavaggio e aspirare le cellule non aderenti (punto 4). </li><li> Aggiungere 190 ml di 400 UI / mL di IL-4 e 380 ml di 100 UI / ml GM-CSF per bombola (fase 3) al giorno 0, 2 e 4. Giorno 0 è definita come la PBMC giorni sono inizialmente placcati in fase 1 (punto 8). </li><li> Giorno Harvest 5 moDCs una concentrazione di 1x10 6 cellule / ml (passo 15). </li><li> Utilizzare immediatamente moDCs nel loro stato di riposo. Passi 17-22 non sono mai eseguite. Nota: I campioni devono essere trattati il ​​più presto possibile dopo la raccolta per i migliori risultati. </li><li> MoDCs aliquote ad una concentrazionezione di 2x10 5 cellule / pozzetto (200 pl / pozzetto della 1x10 6 cellule / ml) in una piastra da 96 pozzetti a fondo rotondo (western blot, ELISA, FACS) o su un chamberslide poli-L-lisina trattati (microscopia) per la sperimentazione . Nota: Ci sono almeno quattro condizioni: Completamente non stimolato (controllo negativo), adescamento solo, solo l&#39;attivazione, e adescamento seguita da attivazione. Le condizioni possono essere espanse per includere controlli diluente per R848 e nigericin se lo si desidera. Se il test a valle è ICS, duplicati sono necessari per i controlli isotipo. </li></ol> . 2 adescamento del inflammasome - Segnale 1 <ol><li> Ricostituire liofilizzato R848 in DMSO secondo le istruzioni del produttore. Diluire magazzino lavorare a RT con RPMI-1640. </li><li> Aggiungi R848 ad una concentrazione finale di 10 micron di appropriarsi di pozzi per 18 ore. Cellule posto in un incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2. </li></ol> 3 Attivazione del NLRP3 inflammasome -. Segnale2 <ol><li> Ricostituire nigericin liofilizzato in etanolo secondo le istruzioni del produttore. Diluire magazzino lavorare a RT con RPMI-1640 prima di aggiungere alle condizioni appropriate. </li><li> Aggiungere nigericin ad una concentrazione finale di 20 mM e tornare alla incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2 per 6 ore. Nessun fasi di lavaggio si verificano tra adescamento e durante l&#39;attivazione. Nota: La secrezione di IL-1β è incrementata dalla presenza di ionofori del calcio, brefeldina A, monensina, dinitrofenolo, o cianuro di carbonile chlorophenylhydrazone 37, 38. Pertanto, l&#39;aggiunta di questi inibitori di secrezione non sono raccomandati quando si analizzano adescamento o attività inflammasome in quanto altera la secrezione di IL-1β. </li></ol> 4. IL-1SS Raccolta dei campioni <ol><li> Centrifugare la piastra con cellule e surnatanti a 974 xg per 3 min. </li><li> Senza disturbare il pellet cellulare, aspirare il surnatante e trasferire comeeparate rotondo fondo piatto per misurare la secrezione di citochine dai surnatanti. Nota: I surnatanti sono temporaneamente conservati a -20 ° C o -80 ° C per una conservazione a lungo termine. </li><li> Lavare il pellet cellulari tre volte con 200 microlitri di PBS 1x a 974 xg per 3 minuti per rimuovere ogni extracellulare IL-1β dai campioni cellulari. Nota: Quando si lavano pellet cellulari da una piastra a 96 pozzetti, rimuovere il lavaggio da una rapida inversione piastra in un contenitore di raccolta in modo da non disturbare il campione. </li></ol> 5. Misura di IL-1SS Da cellulari e surnatante Campioni <ol><li> Intracellulare di citochine colorazione (ICS): Il protocollo ICS è descritto di seguito 39, 40. Nota: non sospendere le cellule se il test a valle è la microscopia. Tutti i lavaggi e aspirazioni dovrebbe essere fatto senza disturbare lo strato di cellule / pellet (a seconda del dosaggio a valle). <ol><li> Aggiungere 100 ml di 5% mezzi PHS nei pozzetti. Aggiungerevolume appropriato (circa 1 μl/2x10 5 celle o 1 ml / pozzetto) di fluorescente α-CD11c e α-CD14 (marcatori fenotipo; clone B-ly6 e MφP9 rispettivamente) o controllo isotipico alle cellule per 10 minuti a RT al buio. </li><li> Lavare tre volte con PBS 1x a 974 xg per 3 min. </li><li> Fissare le cellule con l&#39;aggiunta di 100 ml di PFA 4% per 20 minuti a temperatura ambiente al buio. </li><li> Pausa Point: Lavare con 100 microlitri 1x PBS a 974 xg per 3 min e conservare a 4 ° CO / N in 1x PBS. </li><li> Aggiungere 100 microlitri di tampone di permeabilizzazione alle cellule per 30 min. Nota: tampone permeabilizzazione è composto di 1x PBS con 0,3% Triton X-100, e 1% di albumina di siero bovino (BSA) per permeabilizzazione. Non disturbare cellule aderenti quando dosaggio valle è microscopia. </li><li> Aggiungi volume adeguato (circa il 62 ng antibody/2x10 5 celle, circa o 2,5 microlitri / pozzetto) di α-IL-1β-FITC (clone 8516) o il controllo isotipico per2 ore in un incubatore a 37 ° C. </li><li> Lavare le cellule tre volte con 200 microlitri di tampone di permeabilizzazione a 974 xg per 3 minuti al buio. </li><li> Optional: Stain con DAPI, aggiungere mezzo di montaggio e posizionare coprioggetto delicatamente sulla sommità di un vetrino. Lasciare montante per curare O / N prima di catturare immagini di microscopia. </li><li> Acquisire i dati da FACS o microscopia. Nota: Confronta isotipo per ogni condizione per la colorazione appropriata quando si analizzano da FACS o microscopia. <ol><li> FAC: Acquisire un campione alla volta. Impostare la FSC / cancello SSC sulle cellule vive, seguita da gating su CD11c + CD14 - cellule prima di analizzare la popolazione modc pro-IL-1β colorazione. </li><li> Microscopia: Impostare il tempo di esposizione con il campione di colorazione positiva - R848 trattato. Utilizzare DAPI + pro-IL-1β + e DAPI + pro-IL-1β - per determinare la percentuale di pro-IL-1β + moDCs esprimono. </li></ol></li></ol></li><li> SDS-Pagina: Immunoblotting viene eseguita per rilevare pro-IL-1β. Nota: La tecnica descritta di seguito unisce tecnica standard immunoblotting, pendenza 4-20% gel di poliacrilammide, e la rilevazione fluorescente o chemiluminescente 41, 42. <ol><li> Lisare le cellule direttamente in 10 microlitri di denaturazione buffer di lisi (5 microlitri β-mercaptoethanol/950 tampone campione microlitri Laemmli seguita da diluire 1:1 con tampone di lisi cellulare). Trasferire il lisato a 1,5 ml provette Eppendorf. </li><li> Lisato calore su una piastra secco per 10 minuti a 100 ° C. </li><li> Spin lisato a 20.800 xg su un minicentrifuge per 1 min per concentrare il volume di liquido. Punto Pausa: i campioni possono essere congelati a -20 ° C per la conservazione a breve termine. </li><li> Caricare il volume totale sul gel di poliacrilamide. Eseguire 140 V attraverso la scatola gel per circa 1 ora, o fino a quando il fronte del colorante fuoriesce dal fondo del gel. </li><li> Trasferire la proteina dal gel di poliacrilammide su un membr PVDF Immobilon-FLane per 90 min a 100 V. Block la membrana con 5% BSA in Tris Buffered Saline / 0,1% Tween-20 (TBS-T) per 1 ora. Nota: PVDF Immobilon-FL è la migliore per l&#39;utilizzo con la rilevazione fluorescente. Una membrana con una diversa composizione è raccomandato per altre tecniche di rilevamento per aumentare il rapporto segnale sfondo. </li><li> Diluire gli anticorpi primari e secondari in 10 ml di 5% BSA / TBS-T. Eseguire incubazioni anticorpi primari a 4 ° CO / N mentre stringe e anticorpo secondario a temperatura ambiente per 1 ora agitando. </li><li> Lavare la membrana 3 volte con TBS-T per 5 minuti agitando tra le incubazioni anticorpi primari e secondari e di nuovo tra le incubazioni secondari e imaging. Nota: Bands possono essere rilevati utilizzando fluorescenti o rivelazione chemiluminescente. Seguire le istruzioni del produttore per il rilevamento. </li></ol></li><li> ELISA: I campioni che vengono congelati per la conservazione necessità di equilibrare a RT prima dell&#39;analisi. Spin down campioni in una centrifuga per consolidare condensa surnatantezione. Seguire le istruzioni del produttore per la misura di IL-1β. Nota: In questo protocollo IL-1β è specificamente misurato; Tuttavia, la misurazione simultanea di TNFa, IL-6, e il immunomodulante citochina IL-10 assicurare le condizioni appropriate erano pronti. </li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Citochine infiammatorie sono parte integrante nel guidare la risposta immunitaria innata e adattativa per combattere le infezioni virali. Secreto IL-1β è stato dimostrato di aumentare durante l&#39;infezione influenzale 3, 43, 44. I meccanismi precisi con cui queste citochine sono elaborate in risposta al riconoscimento virale in cellule dendritiche umane non sono pienamente compresi. Kit di isolamento DC mieloidi sono costose e richiedono tempo. Kit di isolamento e FAC ordinamento possono involontariamente...

L&#39;attivazione del sistema immunitario innato è necessario per orientare le risposte immunitarie adattative durante l&#39;infezione, la malattia, e la vaccinazione 7. Le cellule dendritiche sono le più potenti cellule presentanti l&#39;antigene del sistema immune innato; sono specializzati per l&#39;assorbimento di antigeni, la migrazione ai linfonodi, e l&#39;attivazione di ingenuo CD4 + e CD8 + citolitica cellule T 8-10. Per attivare il rilevamento rapido patogeno il sistema immunitario innato utilizza numerosi germinali codificato pattern recognition recettori (PRR), che riconoscono patogeni conservati motivi derivati ​​o ospitano derivata marcatori di stress e danno cellulare. Toll like receptors (TLR) sono recettori di membrana legato pattern recognition che riconoscono certi extracellulare patogeno fagocitato pattern molecolari associati (PAMPs) e modelli molecolari pericolo associato (smorza). Per cenno contrario like receptors (NLRs) sono citosolico e rispondere ad una vasta gamma di PAMPs e smorza. Nod like receptors representare una seconda linea di difesa contro gli agenti patogeni che eludono superficie cellulare e PRRs endocitiche. L&#39;interazione del patogeno derivata o &quot;pericolo&quot; associata, fattori con TLR e NLR ligandi porta ad uno stato di maturazione delle DC conseguente maggiore interazione DC con altre cellule immunitarie e promozione della cellula T e l&#39;attivazione delle cellule natural killer 11. L&#39;interleuchina-1β è una componente cruciale della difesa dell&#39;ospite contro le infezioni. All&#39;atto della rilevazione di un microrganismo, la citochina proinfiammatoria molto, IL-1β, è secreta e funziona come un attrattivo chemio e attivatore delle cellule immunitarie innate e adattative. In vivo IL-1β è in gran parte responsabile della risposta di fase acuta tra cui febbre e citochine infiammatorie sintesi 12. La maggior parte NLRs contengono un dominio ricco di ripetizione C leucina terminale che è pensato per funzionare in sensing ligando, un nucleotide dominio di legame centrale (NACHT), che è imponella documentazione, per NLRP3 oligomerizzazione, ed un terminale di dominio effettore N (PYD in NLRP3) che media la trasduzione del segnale a bersagli a valle attraverso interazioni proteina proteina. La proteina NLRP3 definisce il complesso più intensamente studiati inflammasome. Questa proteina è un membro della famiglia NLR e ha la capacità di formare un complesso proteico molecolare più composto NLRP3, il PYCARD proteina adattatore (noto anche come ASC), e ICE. Dopo l&#39;attivazione inflammasome PYCARD si lega ai domini terminali NLRP3 N e recluta ICE, attraverso l&#39;attivazione delle caspasi e il dominio di reclutamento (CARD) domini. Interleuchina-1 enzima di conversione viene inizialmente generato come zimogeno contenente un motivo CARD al suo N-terminale. Risultati formazione inflammasome nel portare due molecole ICE sufficientemente vicino per indurre la loro attivazione autocatalitica. Il complesso inflammasome necessari all&#39;attivazione ICE permettendo così di convertire citoplasmatica pro-IL-1β maturare citochina. La secrezione di successo di IL-1β in DC richiede rilevamento di due segnali di pericolo diversi e indipendenti. Primo, TLR rilevamento di PAMPs, smorza o segnalazione citochine (TNFa o IL-1β) causa un upregulation dell&#39;espressione della proteina pro-IL-1β citoplasmatica. È necessaria una seconda, spesso diversi, segnale per inflammasome formazione del complesso monte di ICE maturazione. Alcuni inflammasome segnali di stimolare includono le tossine membrana batterica formazione di pori (come nigericin), lisosomiali interrompendo cristalli (come ad esempio cristalli di urato monosodico, MSU), e ATP extracellulare. Il meccanismo che porta a monte NLRP3 attivazione inflammasome da questi diversi attivatori è chiaro. Gli studi che indagano monte segnalazione della formazione inflammasome propone di eventi intracellulari, come l&#39;induzione di ipopotassiemia o di specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS) indirettamente attivano il inflammasome 13-28. Tra i diversi attivatori virali del inflammasome NLRP3 è influenza, che fornisce bOth il segnale primario e secondario richiesto per la secrezione di IL-1β 3, 29-33. Utilizzando modelli NLRP3 topo knockout è stato trovato che la secrezione di IL-1β in DC è NLRP3 dipendente 32. Inoltre, NLRP3 topi knockout attratti minor numero di leucociti nel sito di infezione e sperimentato una maggiore mortalità 2, 5. Due lavori recenti suggeriscono un meccanismo per l&#39;attivazione inflammasome NLRP3 durante l&#39;infezione da virus influenzale; prima, adescamento attraverso il riconoscimento di RNA virale da TLR7 o TLR8 (seconda espressione TLR della cellula risponde) o tramite rilevamento di batteri commensali da altri TLR per indurre l&#39;espressione citoplasmatica pro-IL-1β, seguito da un secondo segnale, l&#39;attivazione di NLRP3 formazione inflammasome da proteine ​​canale ionico M2 virale sulla rete transeuropea Golgi 33, 34. In quest&#39;ultima fase, l&#39;attivazione del inflammasome NLRP3 è compiuto da disturbi del ionico intracellulare &lt;em&gt; ambiente che porta alla produzione di ROS, che è semplice, rilevata da NLPR3 come segnale per formare il inflammasome. Tuttavia, il meccanismo preciso di inflammasome monte l&#39;attivazione di attività ICE durante l&#39;infezione influenzale rimane ancora poco chiaro. Questo lavoro descrive una tecnica utile per studiare la inflammasome NLRP3 in moDCs umani che può essere utilizzato come base per ulteriori indagini della via sottostante DC basato secrezione di IL-1β in risposta a TLR8 legatura con R848 seguita dall&#39;attivazione del inflammasome da un pozzo attivatore noto di NLRP3, nigericin. Variazioni di questo metodo possono essere utilizzati con altri tipi di cellule inclusi, ma non limitati a: monociti, macrofagi, altri sottoinsiemi DC e cellule epiteliali.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1081px;" width="1081">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:179px;">Company</td>
			<td style="width:121px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:391px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">IL-4</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">GM-CSF</td>
			<td style="width:179px;">Genzyme</td>
			<td style="width:121px;">NDC 58468-0180-2</td>
			<td>We acquire this item through our local pharmacy with a prescription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">RPMI 1640 with L-glutamine</td>
			<td style="width:179px;">Cellgro</td>
			<td style="width:121px;">10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Peripheral blood mononuclear cells</td>
			<td style="width:179px;">New York Blood Center</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>PBMCs were isolated from the blood of healthy donors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">12-well tissue culture plates</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">96-well round bottom tissue culture plates</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-IL-1&#946;-FITC</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;">IC201F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">FITC isotype control</td>
			<td style="width:179px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:121px;">130-092-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-&#946;-Tubulin</td>
			<td style="width:179px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:121px;">SC-9014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-IL-1&#946;</td>
			<td style="width:179px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:121px;">mab201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">PVDF Immobilon-FL membrane</td>
			<td style="width:179px;">Millipore</td>
			<td style="width:121px;">IPFL00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">gradient 4-12 % polycrylamide gel</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-1159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">laemmli sample buffer</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">BSA</td>
			<td style="width:179px;">Equitech Bio Inc</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>30% solution sterile/filtered</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">PFA</td>
			<td style="width:179px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:121px;">15710</td>
			<td>16% solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">human inflammatory cytokine bead array kit</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">551811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">nigericin</td>
			<td style="width:179px;">Invivogen</td>
			<td>tlrl-nig</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">R848</td>
			<td>3M Corp.</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-CD14</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">340436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#945;-CD11c</td>
			<td style="width:179px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">555392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">TBS</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td>On site stock room</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tween-20</td>
			<td style="width:179px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">P2287-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"><a>Nunc EasYFlask 225cm2, Filter Cap, 70mL working volume, 30/Cs</a></td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">159933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">20 &#956;M Sterile Disposable Filter Units</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">569-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Hepes</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">goat &#945;-mouse IRDye 800CW</td>
			<td style="width:179px;">Licor</td>
			<td style="width:121px;">926-32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">donkey &#945;-rabbit IRDye 680RD</td>
			<td style="width:179px;">Licor</td>
			<td style="width:121px;">926-68073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Spectra multicolor broad range protein ladder</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:121px;">26634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tris Glycine SDS 10x</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Tris Glycine 10x</td>
			<td style="width:179px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:121px;">161-0734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Methanol - 4L</td>
			<td style="width:179px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:121px;">A433P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Prolong Gold antifade Reagent with DAPI</td>
			<td style="width:179px;">Life Technologies</td>
			<td>P-36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide</td>
			<td style="width:179px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:121px;">354108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activation and measurement of nlrp3 inflammasome activity using il-1&#946; in human monocyte-derived dendritic cells

Processi infiammatori derivanti dalla secrezione di interleuchina (IL) -1 citochine famiglia di cellule immunitarie portano a infiammazione locale o sistemica, rimodellamento tissutale e riparazione, e il controllo virologico 1, 2. L&#39;interleuchina-1β è un elemento essenziale della risposta immunitaria innata e contribuisce ad eliminare agenti patogeni invasori evitando la creazione di infezione persistente 1-5. Inflammasomes sono la piattaforma chiave di segnalazione per l&#39;attivazione di interleuchina 1 enzima di conversione (ICE o caspasi-1). Il inflammasome NLRP3 richiede almeno due segnali in DC per provocare la secrezione di IL-1β 6. Espressione proteica Pro-IL-1β è limitato in cellule quiescenti; Pertanto è richiesto un segnale di innesco per IL-1β trascrizione e l&#39;espressione della proteina. Un secondo segnale rilevato dai risultati NLRP3 nella formazione del multi-proteina NLRP3 inflammasome. La capacità delle cellule dendritiche di responsabilitàd per i segnali necessari per la secrezione di IL-1β può essere testato utilizzando un purinico sintetico, R848, che è rilevata da TLR8 in monociti umana derivata cellule dendritiche (moDCs) di cellule primarie, seguita da attivazione del inflammasome NLRP3 con la tossina batterica e ionophore potassio, nigericin. Monociti DC derivati ​​vengono facilmente prodotte nella cultura e forniscono significativamente più cellule purificate di cellule dendritiche mieloidi umane. Il metodo qui presentato differisce da altri saggi inflammasome dal fatto di utilizzare in vitro umana, invece di topo derivata, DC permettendo così lo studio della inflammasome nella malattia umana e infezione.

Queste tecniche misurano TLR8 adescamento con R848. Intracellulare colorazione citochina per pro-IL-1β permette di microscopia e FAC letture da CD14 - CD11c + moDCs. Entrambe le tecniche possono essere quantificate rispetto ad un non innescato, o di riposo, controllo delle cellule così come un controllo isotipico (figure 1 e 2). Percentuale di cellule pro-IL-1β + colorazione viene moltiplicato per il mediano geometrico di questa popolazione per fornire l&#39;intensit?...

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Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&amp;#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Le cellule dendritiche (DC) secernono IL-1β in risposta al riconoscimento di TLR8 purinico sintetico, R848, seguita dall&#39;attivazione inflammasome NLRP3 con nigericin, dunque, IL-1β può essere utilizzata per misurare l&#39;attività inflammasome NLRP3. Intracellulare colorazione citochina, immunoblotting, ELISA e sono utilizzati per misurare con precisione NLRP3 inflammasome adescamento e l&#39;attivazione tramite l&#39;espressione di IL-1β.

Attivazione e misurazione dei NLRP3 inflammasome all&#39;attività utilizzando IL-1β in cellule dendritiche umane derivate da monociti

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

20.7K Views.  New York University School of Medicine.  Le cellule dendritiche (DC) secernono IL-1β in risposta al riconoscimento di TLR8 purinico sintetico, R848, seguita dall'attivazione inflammasome NLRP3 con nigericin, dunque, IL-1β può essere utilizzata per misurare l'attività inflammasome NLRP3. Intracellulare colorazione citochina, immunoblotting, ELISA e sono utilizzati per misurare con precisione NLRP3 inflammasome adescamento e l'attivazione tramite l'espressione di IL-1β. 

Video: Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin which forms an insoluble clot that stops hemorrhage. Factor V (FV) in its activated form, FVa, is a critical cofactor for the protease FXa and accelerator of thrombin generation during fibrin clot formation as part of prothrombinase 1, 2. Manual FV assays have been described 3, 4, but they are time consuming and subjective. Automated FV assays have been reported 5-7, but the analyzer and reagents are expensive and generally provide only the clot time, not the rate and extent of fibrin formation. The microplate platform is preferred for measuring enzyme-catalyzed events because of convenience, time, cost, small volume, continuous monitoring, and high-throughput 8, 9. Microplate assays have been reported for clot lysis 10, platelet aggregation 11, and coagulation Factors 12, but not for FV activity in human plasma. The goal of the method was to develop a microplate assay that measures FV activity during fibrin formation in human plasma.
This novel microplate method outlines a simple, inexpensive, and rapid assay of FV activity in human plasma. The assay utilizes a kinetic microplate reader to monitor the absorbance change at 405nm during fibrin formation in human plasma (Figure 1) 13. The assay accurately measures the time, initial rate, and extent of fibrin clot formation. It requires only &mu;l quantities of plasma, is complete in 6 min, has high-throughput, is sensitive to 24-80pM FV, and measures the amount of unintentionally activated (1-stage activity) and thrombin-activated FV (2-stage activity) to obtain a complete assessment of its total functional activity (2-stage activity - 1-stage activity).
Disseminated intravascular coagulation (DIC) is an acquired coagulopathy that most often develops from pre-existing infections 14. DIC is associated with a poor prognosis and increases mortality above the pre-existing pathology 15. The assay was used to show that in 9 patients with DIC, the FV 1-stage, 2-stage, and total activities were decreased, on average, by 54%, 44%, and 42%, respectively, compared with normal pooled human reference plasma (NHP).
The FV microplate assay is easily adaptable to measure the activity of any coagulation factor. This assay will increase our understanding of FV biochemistry through a more accurate and complete measurement of its activity in research and clinical settings. This information will positively impact healthcare environments through earlier diagnosis and development of more effective treatments for coagulation disorders, such as DIC.

This study describes a novel microplate assay that measures FV coagulation activity during fibrin clot formation in human plasma which has not been reported previously. The method uses a kinetic microplate reader to continuously measure the change in absorbance at 405nm during fibrin clot formation in human plasma.

Misura di attività del Fattore V nel plasma umano usando un saggio di coagulazione Microplate

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and pathogenesis of inflammation. Isolation and study of DCs have been important in biological research because of their distinctive features. Although they are essential key mediators of the immune system, DCs are very rare in blood, accounting for approximately 0.1 - 1% of total blood mononuclear cells. Therefore, alternatives for isolation methods rely on the differentiation of DCs from monocytes isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The utilization of proper isolation techniques that combine simplicity, affordability, high purity, and high yield of cells is imperative to consider. In the current study, two distinct methods for the generation of DCs will be compared. Monocytes were selected by adherence or negatively enriched using magnetic separation procedure followed by differentiation into DCs with IL-4 and GM-CSF. Monocyte and MDDC viability, proliferation, and phenotype were assessed using viability dyes, MTT assay, and CD11c/ CD14 surface marker analysis by imaging flow cytometry. Although the magnetic separation method yielded a significant higher percentage of monocytes with higher proliferative capacity when compared to the adhesion method, the findings have demonstrated the ability of both techniques to simultaneously generate monocytes that are capable of proliferating and differentiating into viable CD11c+ MDDCs after seven days in culture. Both methods yielded &gt; 70% CD11c+ MDDCs. Therefore, our results provide insights that contribute to the development of reliable methods for isolation and characterization of human DCs.

This study compares two different methods of human monocyte isolation for obtaining in vitro dendritic cells (DCs). Monocytes are selected by adherence or negatively enriched by magnetic separation. Monocyte yield and viability along with MDDC viability, proliferation and CD11c/CD14 surface marker expression will be compared between both methods.

Caratterizzazione delle derivate da monociti cellule dendritiche umane di Citometria a Flusso Imaging: un confronto tra due protocolli di isolamento dei monociti

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Generazione di derivate da monociti cellule dendritiche umane da sangue intero

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. This system enables the quantification of human IFN-&#945; protein with unprecedented sensitivity, and with no cross-reactivity for other species of IFN.
The first key step of the protocol is the choice of the antibody pair, followed by the conjugation of the capture antibody to paramagnetic beads, and biotinylation of the detection antibody. Following this step, different parameters such as assay configuration, detector antibody concentration, and buffer composition can be modified until optimum sensitivity is achieved. Finally, specificity and reproducibility of the method are assessed to ensure confidence in the results. Here, we developed an IFN-&#945; single molecule array assay with a limit of detection of 0.69 fg/mL using high-affinity autoantibodies isolated from patients with biallelic mutations in the autoimmune regulator (AIRE) protein causing autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1/autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy (APS1/APECED). Importantly, these antibodies enabled detection of all 13 IFN-&#945; subtypes.
This new methodology allows the detection and quantification of IFN-&#945; protein in human biological samples at attomolar concentrations for the first time. Such a tool will be highly useful in monitoring the levels of this cytokine in human health and disease states, most particularly infection, autoimmunity, and autoinflammation.

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&amp;#945;

Here we present a protocol to describe the development and validation of a single molecule array digital ELISA assay, which enables the ultra-sensitive detection of all IFN-&#945; subtypes in human samples.

Sviluppo e validazione di una singola molecola ultrasensibile di matrice digitale analisi enzima-collegata dell'immunosorbente per umana dell'interferone-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.

Rilevamento di attivazione Inflammasome e morte delle cellule Pyroptotic in macrofagi murini derivate da midollo osseo

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of monocyte-derived macrophages can impair wound healing. We showed that high fat and high sugar diets promote monocyte priming and dysfunction, converting healthy blood monocytes into a hyper chemotactic phenotype poised to differentiate into macrophages with dysregulated activation profiles and impaired phenotypic plasticity. The over-recruitment of monocyte-derived macrophages and recruitment of macrophages with dysregulated activation profiles is believed to be a major contributor to the development of chronic inflammatory diseases associated with metabolic disorders, including atherosclerosis and obesity. The goal of this protocol is to quantify the chemotactic activity of blood monocytes as a biomarker for monocyte priming and dysfunction and to characterize the macrophage phenotype blood monocytes are poised to differentiate into in these mouse models. Using single cell Western blot analysis, we show that after 24 h 33%of cells recruited into MCP-1-loaded basement membrane-derived gel plugs injected into mice are monocytes and macrophages; 58% after day 3. However, on day 5, monocyte and macrophage numbers were significantly decreased. Finally, we show that this assays also allows for the isolation of live macrophages from the surgically retrieved basement membrane-derived gel plugs, which can then be subjected to subsequent characterization by single cell Western blot analysis.

Here we present a protocol to quantify the chemotactic activity of blood monocytes in mouse models, to assess the effects of nutritional, pharmacological and genetic interventions on blood monocyte and to characterize the blood monocytes derived macrophages in mouse models using monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-loaded basement membrane-derived gel plugs.

Quantificazione dell'attività chemiotatica monocite in vivo e caratterizzazione dei macrofagi derivati monociti del sangue

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas autophagic flux is only observed in iDCs. To gain mechanistic insights, we developed efficient strategies to interfere with HSV-1-induced autophagic turnover. An inhibitor-based strategy, to modulate HSV-1-induced autophagy, constitutes the first choice, since it is an easy and fast method. To circumvent potential unspecific off-target effects of such compounds, we developed an alternative siRNA-based strategy, to modulate autophagic turnover in iDCs upon HSV-1 infection. Indeed, electroporation of iDCs with FIP200-specific siRNA prior to HSV-1 infection is a very specific and successful method to ablate FIP200 protein expression and thereby to inhibit autophagic flux. Both presented methods result in the efficient inhibition of HSV-1-induced autophagic turnover in iDCs, whereby the siRNA-based technique is more target specific. An additional siRNA-based approach was developed to selectively silence the protein expression of KIF1B and KIF2A, facilitating autophagic turnover upon HSV-1 infection in mDCs. In conclusion, the technique of siRNA electroporation represents a promising strategy, to selectively ablate the expression of distinct proteins and to analyze their influence upon an HSV-1 infection.

In this study, we present inhibitor- and siRNA-based strategies to interfere with autophagic flux in Herpes simplex virus type-1 (HSV-1)-infected monocyte-derived dendritic cells.

L'elettroporazione di siRNA alla modulazione dell'autofagia nell'herpes Simplex Virus Tipo 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic inflammation. Neutrophil ETs (NETs) consist of a mesh of DNA, histone proteins, and various granule proteins (i.e., myeloperoxidase, elastase, and cathepsin G). Other immune cells, including macrophages, can also produce ETs; however, to what extent this occurs in vivo and whether macrophage extracellular traps (METs) play a role in pathological mechanisms has not been examined in detail. To better understand the role of METs in inflammatory pathologies, a protocol was developed for visualizing MET release from primary human macrophages in vitro, which can also be exploited in immunofluorescence experiments. This allows further characterization of these structures and their comparison to ETs released from neutrophils. Human monocyte-derived macrophages (HMDM) produce METs upon exposure to different inflammatory stimuli following differentiation to the M1 pro-inflammatory phenotype. The release of METs can be visualized by microscopy using a green fluorescent nucleic acid stain that is impermeant to live cells (e.g., SYTOX green). Use of freshly isolated primary macrophages, such as HMDM, is advantageous in modeling in vivo inflammatory events that are relevant to potential clinical applications. This protocol can also be used to study MET release from human monocyte cell lines (e.g., THP-1) following differentiation into macrophages with phorbol myristate acetate or other macrophage cell lines (e.g., the murine macrophage-like J774A.1 cells).

Presented here is a protocol to detect macrophage extracellular trap (MET) production in live cell culture using microscopy and fluorescence staining. This protocol can be further extended to examine specific MET protein markers by immunofluorescence staining.

Stimolazione in vitro e visualizzazione del rilascio di trap extracellulari nei Macrofagi derivati da Monciti Umani differenziati

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct regulation of inflammatory signaling and is activated by proximity-induced dimerization following recruitment to inflammasomes. Caspase-1 is abundant in the monocytic cell lineage and induces maturation of the pro-inflammatory cytokines interleukin (IL)-1&#946; and IL-18 to active secreted molecules. The other inflammatory caspases, caspase-4 and -5 (and their murine homolog caspase-11) promote IL-1&#946; release by inducing pyroptosis. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is a tool used to measure inflammatory caspase induced proximity as a readout of caspase activation. The caspase-1, -4, or -5 prodomain, which contains the region that binds to the inflammasome, is fused to non-fluorescent fragments of the yellow fluorescent protein Venus (Venus-N [VN] or Venus-C [VC]) that associate to reform the fluorescent Venus complex when the caspases undergo induced proximity. This protocol describes how to introduce these reporters into primary human monocyte-derived macrophages (MDM) using nucleofection, treat the cells to induce inflammatory caspase activation, and measure caspase activation using fluorescence and confocal microscopy. The advantage of this approach is that it can be used to identify the components, requirements, and localization of the inflammatory caspase activation complex in living cells. However, careful controls need to be considered to avoid compromising cell viability and behavior. This technique is a powerful tool for the analysis of dynamic caspase interactions at the inflammasome level as well as for the interrogation of the inflammatory signaling cascades in living MDM and monocytes derived from human blood samples.

This protocol describes the workflow to obtain monocytes-derived macrophages (MDM) from human blood samples, a simple method to efficiently introduce inflammatory caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) reporters into human MDM without compromising cell viability and behavior, and an imaging-based approach to measure inflammatory caspase activation in living cells.

Visualizzazione della prossimità indotta da caspasi infiammatorie nei macrofagi derivati da monociti umani

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and play a unique role within the immune system by linking the innate and adaptive immune responses. These cells can phagocytize and then present captured antigens to effector immune cells, triggering a diverse range of immune responses. This paper demonstrates a standardized method for the in vitro generation of bovine monocyte-derived dendritic cells (MoDCs) isolated from cattle peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and their application in evaluating vaccine immunogenicity.
Magnetic-based cell sorting was used to isolate CD14+ monocytes from PBMCs, and the supplementation of complete culture medium with interleukin (IL)-4 and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) was used to induce the differentiation of CD14+ monocytes into naive MoDCs. The generation of immature MoDCs was confirmed by detecting the expression of major histocompatibility complex II (MHC II), CD86, and CD40 cell surface markers. A commercially available rabies vaccine was used to pulse the immature MoDCs, which were subsequently co-cultured with naive lymphocytes.
The flow cytometry analysis of the antigen-pulsed MoDCs and lymphocyte co-culture revealed the stimulation of T lymphocyte proliferation through the expression of Ki-67, CD25, CD4, and CD8 markers. The analysis of the mRNA expression of IFN-&#947; and Ki-67, using quantitative PCR, showed that the MoDCs could induce the antigen-specific priming of lymphocytes in this in vitro co-culture system. Furthermore, IFN-&#947; secretion assessed using ELISA showed a significantly higher titer (**p &#60; 0.01) in the rabies vaccine-pulsed MoDC-lymphocyte co-culture than in the non-antigen-pulsed MoDC-lymphocyte co-culture. These results show the validity of this in vitro MoDC assay to measure vaccine immunogenicity, meaning this assay can be used to identify potential vaccine candidates for cattle before proceeding with in vivo trials, as well as in vaccine immunogenicity assessments of commercial vaccines.

The methodology describes the generation of bovine monocyte-derived dendritic cells (MoDCs) and their application for the in vitro evaluation of antigenic candidates during the development of potential veterinary vaccines in cattle.

Determinazione dell'immunogenicità del vaccino utilizzando cellule dendritiche derivate da monociti bovini

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...