الكتاب نعترف مؤسسة Armenise-هارفارد، وماري كوري ترينتينو COFUND (ACS)، المقاطعة المتمتعة بالحكم الذاتي من ترينتو (Ecomm)، وCIBIO للحصول على التمويل.

1. إعداد قالب الحمض النووي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية البلازميد من سلالة المختبرية القياسية من E. القولونية، مثل E. القولونية DH5a أو نوفا الأزرق مع مجموعة تجارية. بدلا من ذلك، وهو منتج PCR خطي يمكن تنقيته وبالمثل مع مجموعة تجارية. أزل الحمض النووي مع H 2 O فقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفينول كلوروفورم استخراج الحمض النووي حل 26. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد تركيز الحمض النووي والنقاء، على سبيل المثال عن طريق امتصاص الأشعة فوق البنفسجية أو طرق أخرى مناسبة. من المهم أن استخدام الحمض النووي نقية للغاية لكفاءة النسخ الترجمة. </li></ol> 2. إعداد فيلم الدهن رقيقة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وزن مسحوق الدهون الجافة وتذوب في المذيبات. ل 1-بالميتويل-2-oleoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (POPC)، يتم إعداد الحلول الأسهم في الكلوروفورم بتركيز 40 ملغ / مل. ملاحظة: يجب دائما التعامل مع المذيبات العضوية الماصات الزجاج والزجاجات. وبعبارة أخرى، يجب ألا تستخدم أبدا البلاستيك. متجر لياليحلول توك في ضيق، المذيبات مقاومة الزجاجات العنبر الهواء عند درجة حرارة -20 درجة مئوية، ويفضل أن يكون تحت الأرجون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة 12 ميكرومول POPC (220 ميكرولتر من 40 ملغ / مل محلول المخزون) في الجولة 5 مل قارورة أسفل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتبخر المذيب مع المبخر الدوار (الشكل 1) لتوليد فيلم الدهون رقيقة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق آمن قارورة أسفل جولة لأنبوب التقطير مع مقطع دائري وبدء دوران من القارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء تداول المياه من خلال لفائف المكثف. باستخدام حمام الحرارة ليست ضرورية، لأن الكلوروفورم لديه نقطة غليان منخفضة من 61.2 درجة مئوية تحت الضغط الجوي العادي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن نظام مفتوح إلى الغلاف الجوي عن طريق التحقق من أن محبس مفتوح. بدوره على مضخة فراغ وببطء إغلاق محبس لتطبيق فراغ إلى النظام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يترسب فيلم رقيقة الدهون على جدران القارورة أسفل جولة خلال التبخر الدوارة تشكيل فيلم مبهمةأن يكون مرئيا بالعين. السماح للتبخر الدوارة يستمر لمدة 0.5-2 ساعة. لإيقاف عملية، والإفراج عن ببطء ضغط الفراغ، والتوقف عن الدوران، وإزالة قارورة أسفل جولة. </li></ol></li></ol> 3. إعادة تعليق الدهون والتجانس الحويصلة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل 18.2 MΩ H 2 O للفيلم الدهون رقيقة مباشرة في قارورة أسفل جولة. دوامة بقوة حل في أقصى سرعة، ما يقرب من 3،200 دورة في الدقيقة، حتى الفيلم الدهون يفصل من الزجاج، والتي يمكن ملاحظتها بالعين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تشتت الدهون في أنبوب microcentrifuge 2 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انشاء حلقة الوقوف على عقد الخالط مع طرف 5 مم. وضع الوقوف microcentrifuge تحت الخالط لعقد آمن تشتت الدهون. شطف عنصر تشتيت للالخالط بغمر طرف في 18.2 MΩ H 2 O والجري لبضع ثوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع عنصر تشتيت مباشرة في تشتت الدهون ضمان الفي الطرف لا تلمس الجزء السفلي من أنبوب microcentrifuge. التجانس لمدة 1 دقيقة في مستوى الطاقة 4 أو 14،000 دورة في الدقيقة. </li></ol> 4. النتوء حويصلة وتجفيد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع أجزاء من مصغرة الطارد (الشكل 2)، والذي يتكون من الغلاف الخارجي والجوز التجنيب الذي يضم اثنين من غشاء تفلون الداخلية تدعم، واثنين من الحلقات، واحدة تحمل تفلون. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع اثنين O-الخواتم في الأخاديد من الدعم الغشاء الداخلي. Prewet اثنين من المرشحات واحدة 400 نانومتر الغشاء. سيتم وضع فلاتر ضد تفلون داخل O-حلقات مع غشاء بينهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع غشاء يدعم في الغلاف الخارجي الطارد مع غشاء يحيط بها اثنين من المرشحات في بين O-حلقات. ضع تحمل تفلون داخل غلاف وإرفاق الجوز التجنيب وتشديد باليد. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف اثنين من المحاقن وملء واحدة مع 18.2 MΩ المياه. إدراج إبر حقنة في ح الصغيرةأوليس في تفلون على حد سواء من الجمعية الطارد. ينبغي أن الإبر الانزلاق بسهولة في؛ لا قوة الإبر. تأمين الطارد مع المحاقن في الطارد الإسكان وربط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمرير المياه من خلال الطارد عن طريق دفع المياه ببطء للخروج من حقنة واحدة وإلى الآخر. هذا يمثل مرور واحدة. تكرار لما مجموعه ثلاثة مقاطع ضمان عدم وجود تسرب الحالي. إزالة المحقنة من المياه والتخلص من المياه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء حقنة واحدة مع العينة، نعلق على الطارد، وببطء تمرير حل حويصلة من خلال الغشاء كما هو موضح أعلاه في الخطوة 4.3. كرر 10X لما مجموعه 11 المقاطع. ومع استمرار عملية البثق، وسوف العينة تصبح أقل عكر وأسهل للدفع عبر الغشاء. انخفاض مفاجئ في المقاومة، ومع ذلك، عادة ما يشير إلى تمزق الغشاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الحل حويصلة مقذوف وجعل 40 مأخوذة ميكرولتر من الحويصلات في أنابيب microcentrifuge.تجميد فلاش كل قسامة في أي من الثلج الجاف أو في النيتروجين السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجفد كل قسامة مع المبخر الطرد المركزي بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية. تخزين حويصلات فارغة مجفف بالتجميد في -20 درجة مئوية. </li></ol> 5. التغليف ماكينات النسخ الترجمة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط مكونات رد فعل النسخ الترجمة وإضافة 20 وحدة من ريبونوكلياز المانع. احتضان على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة القالب الحمض النووي. لرد فعل السيطرة، 250 نانوغرام من mVenus ترميز البلازميد أو بروتين فلوري مماثلة وراء المروج T7 النسخي وE. قوية ينصح القولونية موقع ملزمة الريبوسوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جلب الحجم النهائي إلى 25 ميكرولتر مع ريبونوكلياز خالية من المياه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هيدرات قسامة من الحويصلات مجفف بالتجميد (من الخطوة 4.6) مع 10 ميكرولتر من رد فعل تجميعها في الخطوة 5.3. دوامة لفترة وجيزة الخليط حتى يتم معلق الحويصلات. وهذا ينبغي أن يستغرق أقل من 30 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان رد فعل على الجليد لمدة 30 دقيقة للسماح الحويصلات إلى تضخم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الخليط حويصلة 20 أضعاف لتصل إلى الحجم النهائي من 30 ميكرولتر من خلال إضافة 1.5 ميكرولتر من الحويصلات إلى 27.0 ميكرولتر من 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 50 ملي مول كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.4 و 1.5 ميكرولتر من 20.2 ملغ / مل بروتين K. الدناز وريبونوكلياز ويمكن أيضا أن تضاف في هذه المرحلة كبديل للبروتين كاف أن تتحلل المواد extravesicular. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 2.5 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية. </li></ol> 6. المجهر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دراسة الحويصلات والتقدم من إنتاج بروتين فلوري في نقاط زمنية مختلفة. سوف الحويصلات يكون قطرها أكبر من 400 نانومتر حجم المسام في الغشاء تستخدم لقذف حويصلة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد غرفة عينة عن طريق وضع 20 × 5 مم التبادل السيليكون على شريحة المجهر القياسية. ماصة 10 ميكرولتر من الحويصلات إلى حجرة العينة. وضع غطاء زجاجي siliconized الانزلاق على الحجرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاحظ الحويصلات مع 63X النفط تشتت سR هدف مماثل من قبل حقل مشرق ومضان المجهري باستخدام مجموعة التصفية المناسب للبروتين فلوري استغلالها. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Forster, A. C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+synthesis+of+a+minimal+cell.">Towards synthesis of a minimal cell.</a> Mol. Syst. Biol. 2, 1-10 (2006).</li><li>Noireaux, V., Maeda, Y. T., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+artificial+cell,+from+self-organization+to+computation+and+self-reproduction.">Development of an artificial cell, from self-organization to computation and self-reproduction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 3473-3480 (2011).</li><li>Harris, D. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+biology:+Exploiting+the+interface+between+synthetic+biology+and+synthetic+chemistry.">Cell-free biology: Exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry.</a> Curr. Opin. Biotech. 23, (2012).</li><li>Nishikawa, T., Sunami, T., Matsuura, T., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+Evolution+of+Proteins+through+In+Vitro+Protein+Synthesis+in+Liposomes.">Directed Evolution of Proteins through In Vitro Protein Synthesis in Liposomes.</a> J. Nucleic Acids. 2012, 1-11 (2012).</li><li>Forlin, M., Lentini, R., Mansy, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+imitations.">Cellular imitations.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 16, 586-592 (2012).</li><li>Chiarabelli, C., Stano, P., Anella, F., Carrara, P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+chemical+synthetic+biology.">Approaches to chemical synthetic biology.</a> FEBS Lett. 586, 2138-2145 (2012).</li><li>Noireaux, V., Shin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+Coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70.">Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> J. Biol. Eng. 4, 1-9 (2010).</li><li>Fujiwara, K., Nomura, S. -. i. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condensation+of+an+Additive-Free+Cell+Extract+to+Mimic+the+Conditions+of+Live+Cells.">Condensation of an Additive-Free Cell Extract to Mimic the Conditions of Live Cells.</a> PLoS ONE. 8, e54155 (2013).</li><li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nat. Biotechnol. 19, 751-755 (2001).</li><li>Hosoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Study+of+the+Structure+of+Multilamellar+Giant+Liposomes+As+a+Container+of+Protein+Synthesis+Reaction.">Quantitative Study of the Structure of Multilamellar Giant Liposomes As a Container of Protein Synthesis Reaction.</a> Langmuir. 24, 13540-13548 (2008).</li><li>Sunami, T., Matsuura, T., Suzuki, H., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Functional+Protiens+Within+Liposomes.">Synthesis of Functional Protiens Within Liposomes.</a> Methods Mol. Biol. 607, 243-256 (2010).</li><li>Murtas, G., Kuruma, Y., Bianchini, P., Diaspro, A., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+in+liposomes+with+a+minimal+set+of+enzymes.">Protein synthesis in liposomes with a minimal set of enzymes.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 363, 12-17 (2007).</li><li>Pereira de Souza, T., Stano, P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Minimal+Size+of+Liposome-Based+Model+Cells+Brings+about+a+Remarkably+Enhanced+Entrapment+and+Protein+Synthesis.">The Minimal Size of Liposome-Based Model Cells Brings about a Remarkably Enhanced Entrapment and Protein Synthesis.</a> ChemBioChem. 10, 1056-1063 (2009).</li><li>Caschera, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+Vesicle+Fusion+Triggers+Gene+Expression.">Programmed Vesicle Fusion Triggers Gene Expression.</a> Langmuir. 27, 13082-13090 (2011).</li><li>Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Godefroy, J., Salman, H., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+an+artificial+cell+based+on+gene+expression+in+vesicles.">Toward an artificial cell based on gene expression in vesicles.</a> Phys. Biol. 2, P1-P8 (2005).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox:+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells.">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> ACS Synth. Biol. 1, 29-41 (2012).</li><li>Kobori, S., Ichihashi, N., Kazuta, Y., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+controllable+gene+expression+system+in+liposomes+that+includes+a+postive+feedback+loop.">A controllable gene expression system in liposomes that includes a postive feedback loop.</a> Mol. Syst. Biol. 9, 1282-1285 (2013).</li><li>Martini, L., Mansy, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-like+Systems+with+Riboswitch+Controlled+Gene+Expression.">Cell-like Systems with Riboswitch Controlled Gene Expression.</a> Chem. Commun. 47, 10734-10736 (2011).</li><li>Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cell-free+genetic+circuit+assembly.">Principles of cell-free genetic circuit assembly.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12672-12677 (2003).</li><li>Sunami, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Association+and+Fusion+of+Giant+Vesicles+Using+a+Fluorescence-Activated+Cell+Sorter.">Detection of Association and Fusion of Giant Vesicles Using a Fluorescence-Activated Cell Sorter.</a> Langmuir. 26, 15098-15103 (2010).</li><li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Resolved+Tracking+of+a+Minimum+Gene+Expression+System+Reconstituted+in+Giant+Liposomes.">Time-Resolved Tracking of a Minimum Gene Expression System Reconstituted in Giant Liposomes.</a> ChemBioChem. 10, 1640-1643 (2009).</li><li>Lentini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Proteins+and+in+Vitro+Genetic+Organization+for+Cell-Free+Synthetic+Biology.">Fluorescent Proteins and in Vitro Genetic Organization for Cell-Free Synthetic Biology.</a> ACS Synth. Biol. , (2013).</li><li>Du, L., Villarreal, S., Forster, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multigene+Expression+In+Vivo:+Supremacy+of+Large+Versus+Small+Terminators+for+T7+RNA+Polymerase.">Multigene Expression In Vivo: Supremacy of Large Versus Small Terminators for T7 RNA Polymerase.</a> Biotechnol. Bioeng. 109, 1043-1050 (2011).</li><li>Trochilin, V. P., Weissig, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liposomes: A Practical Approach. , (2003).</li><li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+vesicles:+preparations+and+applications.">Giant vesicles: preparations and applications.</a> ChemBioChem. 11, 848-865 (2010).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. , (2001).</li><li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly.">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17669-17674 (2004).</li><li>Yu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Functional+Protein+in+Liposome.">Synthesis of Functional Protein in Liposome.</a> J. Biosci. Bioeng. 92, 590-593 (2001).</li><li>Caschera, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+vesicles+composed+of+monocarboxylic+or+dicarboxylic+fatty+acids+and+trimethylammonium+amphiphiles.">Stable vesicles composed of monocarboxylic or dicarboxylic fatty acids and trimethylammonium amphiphiles.</a> Langmuir. 27, 14078-14090 (2011).</li><li>Pereira de Souza, T., Steiniger, F., Stano, P., Fahr, A., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+crowding+of+ribosomes+and+proteins+inside+vesicles:+a+possible+mechanism+for+the+origin+of+cell+metabolism.">Spontaneous crowding of ribosomes and proteins inside vesicles: a possible mechanism for the origin of cell metabolism.</a> ChemBioChem. 12, 2325-2330 (2011).</li><li>Niederholtmeyer, H., Xu, L., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+mRNA+Measurement+during+an+in+Vitro+Transcription+and+Translation+Reaction+Using+Binary+Probes.">Real-Time mRNA Measurement during an in Vitro Transcription and Translation Reaction Using Binary Probes.</a> ACS Synth. Biol. 10, (2012).</li><li>St&#246;gbauer, T., Windhager, L., Zimmer, R., R&#228;dler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiment+and+mathematical+modeling+of+gene+expression+dynamics+in+a+cell-free+system.">Experiment and mathematical modeling of gene expression dynamics in a cell-free system.</a> Integr. Biol. 4, 494-501 (2012).</li><li>Lazzerini-Ospri, L., Stano, P., Luisi, P., Marangoni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+emergent+properties+of+a+synthetic+quasi-cellular+system.">Characterization of the emergent properties of a synthetic quasi-cellular system.</a> BMC Bioinformatics. 13, 1-10 (2011).</li><li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Replication,+Synthesis,+and+Assembly+of+the+Bacteriophage+T7+in+a+Single+Cell-Free+Reaction.">Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction.</a> ACS Synth. Biol. 1, 408-413 (2012).</li><li>Zhu, T. F., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Large+Monodisperse+Vesicles.">Preparation of Large Monodisperse Vesicles.</a> PLoS ONE. 4, 1-4 (2009).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

على الرغم من أن البيولوجيا الاصطناعية خالية من الخلايا لا يزال في مراحله الأولى، قد وضعت أساسا من التقدم الذي نظم مثل الخلية التي تزداد تعقيدا ويمكن إجراء. كان إعادة تشكيل آلات النسخ، الترجمة من يعرف تماما مكونات 9 داخل الحويصلات 28 أهمية خاصة في تسهيل جهود لاحقا في بناء اصطناعية تستجيب للبيئة cells17، 18. وبالمثل، وقد استخدمت دراسات الخلية الاصطناعية لبحث العمليات التطورية 4،29،30، وتفاصيل الآلية من RNA وتخليق البروتين 22،31، وتأثيرات أيضية load32، 33، والجمعية من الجسيمات الفيروسية 34. الأهم من ذلك، ما يكفي من المعرفة موجود الآن يمكن أن يعاد تشكيل تلك الوظيفة الخلوية الأساسية داخل الحويصلات في المختبر بعد هذه التقارير السابقة والبروتوكولات المذكورة في هذه الوثيقة. بالإضافة إلى كونه سهل، والتغليف وصفها العلاقات العامةocedure له فوائد عدة. على سبيل المثال، يمكن إجراء العديد من فارغة، مأخوذة حويصلة مجفف بالتجميد في وقت مبكر وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا. بروتوكول يفعل الجزيئات البيولوجية لا تخضع للمذيبات العضوية، والتغيرات في درجات الحرارة جذرية، أو فترات طويلة من غسيل الكلى. ونحن نتوقع أن دماثة الإجراء سيسهل دمج مكونات إضافية حسب الحاجة. ونحن أيضا لم يلاحظ الآثار السلبية لتغير تكوين الدهون في غشاء على التغليف أو كفاءة النسخ الترجمة. ولذلك، والدهون أكثر استعدادا لإدراج بروتينات الغشاء، الأشكال التضاريسية محددة، أو التصور يمكن تصور أن تستغل. فإن القيود الرئيسية من الطريقة الموضحة هو أن الحويصلات الناتجة ليست متجانسة في الحجم أو lamellarity. للعديد من التطبيقات، هذه الصعوبات لا تتعارض مع تفسير البيانات. ومع ذلك، إذا لزم الأمر، ويمكن إدراج خطوات إضافية لال ضيقتوزيع حجم البريد وتقلل من طبقات من الأغشية، مثل جولات أخرى من قذف بعد التغليف، وتجميد ذوبان الجليد، أو غسيل الكلى 35. وسيتم تطوير طرق أفضل مما لا شك فيه أن الالتفاف على هذه المشاكل وغيرها. حتى ذلك الحين، نجد بروتوكول الموصوفة هنا لتكون مناسبة تماما لبناء يقلد الخلوية.

خالية من الخلايا، في المختبر التفاعلات النسخ الترجمة وتوليد الحويصلات من الدهون الاصطناعية ليست شيئا جديدا. ومع ذلك، والجمع بين اثنين الى الخلوية تقليد هو أكثر بكثير challenging1-6. E. مقتطفات الخلية القولونية مع أو بدون T7 RNA البلمرة يمكن استخدامها كمصدر للآلات النسخ، ترجمة 7،8. فائدة مقتطفات خلية من وجود المكونات الخلوية الإضافية التي يمكن أن تسهل تعبير البروتين وقابلة للطي. بدلا من ذلك، مزيج من حدة تنقية الحمض النووي الريبي وجزيئات البروتين، أي نظام PURE 9، ويمكن استخدامها للتوسط intravesicular تخليق البروتين 4،10-14. نظام PURE يسمح لبناء يقلد الخلوية محددة تماما ولا يعاني من النشاط نوكلياز وجدت في مقتطفات الخلية. عمليا، هذا يعني أنه مطلوب قالب الحمض النووي أقل من ذلك بكثير، مما يسهل عمليات مع انخفاض كفاءة التغليف 11 </sup&gt;. وإن كانت أقل استخداما، ويمكن أن يبنى يقلد الخلوية مع مقتطفات الخلية المستمدة من cells15 حقيقية النواة. حتى الآن، تم الإبلاغ عن شلالات مغلفة المشفرة وراثيا ويقلد الخلوية التي الإحساس بالبيئة 16-18. إن أبسط طريقة لرصد ردود الفعل النسخ الترجمة هو قياس مضان أو التلألؤ من عناصر المشفرة وراثيا. عادة، luciferase يراعة 19 أو GFP تستخدم، على الرغم من أن في المختبر غالبا ما تقاس ردود الفعل من قبل radiolabeling. الكشف عن مضان يسمح أيضا لرصد السكان من الحويصلات 20،21 من خلال الطرق المعتمدة على الخلوي، مما يوفر بعض التبصر في طبيعة العشوائية من العمليات البيولوجية مثل. وقد استخدمت هذه الأساليب الرصد لتحديد مجموعة صغيرة من قواعد التصميم ومكتبة من أجزاء من خلالها بناء من، بما في ذلك مجموعة من البروتينات الفلورية التي تتوافق مع طن النسخ المختبر الترجمة 22، وتأثير منظمة الجيني على التعبير 22، النشاط من العوامل سيجما 16، وكفاءة الإنهاء النسخي 23. ومع ذلك، لا يزال هناك الكثير الذي يتعين القيام به لزيادة القدرة على بناء يمكن التنبؤ بها في المختبر والأجهزة المشفرة وراثيا. هناك العديد من الأساليب المتاحة لجعل الحويصلات. الأساليب الأكثر شيوعا تعتمد على جيل من فيلم الدهون رقيقة على سطح الزجاج تليها إعادة تعليق في solution24 مائي. إذا كان محلول مائي يحتوي على آلات النسخ، الترجمة، على سبيل المثال، ثم جزء من الحويصلات شكلت شأنه أن يحتوي على العناصر اللازمة لإنتاج البروتين. ومع ذلك، فإن كفاءة التغليف من هذه الأساليب هو منخفض، وهذا يعني أنه ليس هناك سوى نسبة ضئيلة من الحويصلات نشطة. العديد من الطرق البديلة التي تتسم أعلى من ذلك بكثير EFF التغليفiciency استغلال التحويل من قطرات الماء في مستحلب النفطية إلى حويصلات. في حين أنه من المرجح أن مثل هذه الأساليب سوف تكون أمرا شائعا في المستقبل، في الوقت الراهن هذه الأساليب يعانون من الحاجة إلى المعدات المتخصصة وإعطاء الحويصلات مع التراكيب غشاء تتغير 25. ميزة واضحة من المياه في النفط إلى أساليب حويصلة هو القدرة على السيطرة lamellarity الغشاء. وتستند هذه الطريقة الموصوفة هنا على بروتوكول فيلم الدهون رقيقة وصفها من قبل المختبر Yomo 11 مع تعديلات طفيفة بما في ذلك خطوة التجانس إضافية. هذه الطريقة سهلة ورخيصة، ويعطي الحويصلات قوية مناسبة تماما لتغليف آلات النسخ، الترجمة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="745">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Quick Spin Mini-prep kit</td>
			<td style="width:243px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spectrometer</td>
			<td style="width:243px;">NanoDrop 1000</td>
			<td style="width:119px;">NDB767ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">770557</td>
			<td style="width:167px;">MW 760 g/mol 
			Transition Temp -2 &#176;C 
			CAS# 26853-31-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">459836</td>
			<td>Anhydrous, &#62;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Phenol-choloroform-isoamyl alcohol 25:24:1, for molecular biology use</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P3803-100mL</td>
			<td>Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform</td>
			<td>Biotech Grade Fluka</td>
			<td style="width:119px;">496189-1L</td>
			<td>Contain ethanol at 0.5-1.0% v/v as stabilizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Brown amber glass bottles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89043-518</td>
			<td>55X 48 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi Rotovapor R-210/Sigma</td>
			<td>Z563846EU-1EA</td>
			<td>With jack and water bath, 29/32 joint 240 V</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Analog vortex mixer</td>
			<td style="width:243px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">945300</td>
			<td>Speed 1,000-3,200 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Homogenizer</td>
			<td>IKA T10 Basic Ultra-Turbax</td>
			<td style="width:119px;">3420000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Extruder filters</td>
			<td>Whatman</td>
			<td style="width:119px;">610014</td>
			<td>drain disc 10 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Extruder polycarbonate membrane 400 nm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td style="width:119px;">61007</td>
			<td>nuclepore polycarbonate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Speed vacuum</td>
			<td>Labconco</td>
			<td style="width:119px;">7970011</td>
			<td>Centritrap DNA concentrator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PURExpress kit</td>
			<td style="width:243px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">NRM #E6800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNAse inhibitor (40,000 U/ml)</td>
			<td style="width:243px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">#M0307S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K (20.2 mg/ml)</td>
			<td style="width:243px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">#EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:243px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microscope</td>
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Zeiss Observer Z1with a AxioCam MRm camera</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RealTime</td>
			<td style="width:243px;">CFX96 Real time PCR Detection System (Biorad)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Silicon press to seal&#160;&#160;-Molecular Probe</td>
			<td style="width:243px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">P18174</td>
			<td>Resistant from&#160; -25-30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Siliconized glass circle cover slides</td>
			<td style="width:243px;">Hampton Research</td>
			<td style="width:119px;">HR3-231</td>
			<td>&#160;&#160; Diameter= 22 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ</td>
			<td style="width:243px;">NIH&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the encapsulation of cell-free transcription and translation machinery in vesicles for the construction of cellular mimics

كما التحولات الفائدة من الجزيئات الفردية لأنظمة الجزيئات، وقد سعى عدد متزايد من مختبرات لبناء من أسفل إلى أعلى يقلد الخلوية التي تمثل أفضل تعقيد الحياة الخلوية. حتى الآن هناك عددا من المسارات التي يمكن اتخاذها لبناء يقلد الخلوية مجزأة، بما في ذلك استغلال مستحلبات الماء في الزيت، وأجهزة ميكروفلويديك، والحويصلات. كل واحد من الخيارات المتاحة لديها مزايا وعيوب محددة. على سبيل المثال، مستحلبات الماء في الزيت تعطي كفاءة عالية التغليف ولكن لا تحاكي جيدا حاجز نفاذية الخلايا الحية. الميزة الأساسية من الطرق الموصوفة هنا هو أنها كلها سهلة ورخيصة لتنفيذ. يتم تغليف آلات النسخ الترجمة داخل الحويصلات فوسفورية خلال العملية التي تستغل الأجهزة المشتركة، مثل المبخر الطرد المركزي والطارد. ويتم رصد ردود الفعل من قبل مضان الطيفي. بروتوكولو يمكن تكييفها لالمؤتلف تعبير البروتين، وبناء يحاكي الخلوية، واستكشاف متطلبات الحد الأدنى للحياة الخلوية، أو الجمعية من الدوائر الجينية.

مضان المجهري يكشف لوحظ أن مضان فقط داخل الحويصلات، وذلك لأن مادة extravesicular هو المتدهورة إنزيمي (الشكل 3). للتعبير عن mVenus، يبدأ intravesicular مضان التي يجب مراعاتها بعد 1.5 ساعة عند 37 درجة مئوية وتصل أقصى كثافة مضان في غضون 6 ساعة. درجة الحرارة المثلى وفترة حضانة يمكن أن تختلف تبعا للبنيات المحددة المستخدمة. على سبيل المثال، البروتينات الفلورية مختلفة تنضج بشكل مختلف تماما في درجة الحرارة بطريقة تعتمد. وبعبارة أخرى، فإن المراقبة من إنتاج البروتين لا تعتمد فقط على تخليق البروتين وقابلة للطي ولكن أيضا على تشكيل حامل اللون. ويمكن زيادة تخليق البروتين الكلي من خلال دمج المسام بروتين الغشاء للسماح لتدفق المكونات اللازمة لالمنضب النسخ والترجمة 27. فمن المستحسن لإجراء مماثل النسخ، transla<html> رد فعل نشوئها في غياب حويصلات لضمان بناء الوراثية استغلال وظيفي. ويتم رصد رد الفعل هذا التحكم بسهولة أكبر عن طريق التحليل الطيفي مضان بدلا من المجهري. الشكل 4 يظهر في رد فعل النسخ المختبر-ترجمة لmVenus ترميز بناء. ردود الفعل Unencapsulated تعطي أعلى بكثير مجموع كثافة مضان من ردود الفعل intravesicular مماثلة. هذا يرجع إلى كفاءة التغليف ولأن إجمالي حجم intravesicular هو أقل بكثير من حجم extravesicular (أي تأثير التخفيف). <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig1.jpg" width="600px" /> الشكل 1. المبخر الدوار ومضخة فراغ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig1highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . FO: المحافظة على together.within الصفحات = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الشكل 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig2.jpg" width="600px" /> الشكل 2. وترد السكن وأجزاء من الطارد بشكل منفصل. من اليسار إلى اليمين، حقنة، الجوز التجنيب، تفلون واضعة، الغشاء الداخلي يدعم مع الأسود O-الخواتم التي تواجه بعضها البعض، الطارد الغلاف الخارجي، وحقنة ثانية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig2highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الشكل (3)" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig3.jpg" width="600px" /> الشكل 3 صور الإسفار من إنتاج البروتين mVenus في الجسيمات الشحمية A و C:. الصور مجال مشرق من الحويصلات الصفاحات بعد 1.5 ساعة و 2.5 ساعة وB &amp;# 160؛ D: إنتاج mVenus هو تصور من قبل مضان (اللون الأخضر) بعد 1.5 و 2.5 ساعة على التوالي. شريط النطاق هو 20 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig3highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الشكل 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig4.jpg" width="600px" /> الشكل 4. وفي رد فعل السيطرة المختبر من عديم المحفظة في المختبر النسخ والترجمة من mVenus. وقد تم قياس كثافة مضان كل 5 دقائق أكثر من 4 ساعة. تم الحصول على البيانات بأداة PCR الوقت الحقيقي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig4highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> .

Watch this Scientific Journal Video about The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics at JoVE.com

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

هنا نحن تصف طرق بسيطة لإعداد الحويصلات، والتغليف من النسخ وآلات الترجمة، ورصد إنتاج البروتين. نظم خالية من الخلايا الناتجة يمكن استخدامها كنقطة انطلاق من خلالها لبناء يقلد الخلوية تزداد تعقيدا.

وتغليف من النسخ خالية من الخلايا وآلات الترجمة في الحويصلات لتشييد المقلدون الخلوية

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

the-encapsulation-cell-free-transcription-translation-machinery

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.9K Views.  University of Trento.  هنا نحن تصف طرق بسيطة لإعداد الحويصلات، والتغليف من النسخ وآلات الترجمة، ورصد إنتاج البروتين. نظم خالية من الخلايا الناتجة يمكن استخدامها كنقطة انطلاق من خلالها لبناء يقلد الخلوية تزداد تعقيدا. 

Video: The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro follicle techniques provide a tool to model follicle development in order to investigate basic biology, and are further being developed as a technique to preserve fertility in the clinic1-4. Our in vitro culture system employs hydrogels in order to mimic the native ovarian environment by maintaining the 3D follicular architecture, cell-cell interactions and paracrine signaling that direct follicle development 5. Previously, follicles were successfully cultured in alginate, an inert algae-derived polysaccharide that undergoes gelation with calcium ions6-8. Alginate hydrogels formed at a concentration of 0.25% w/v were the most permissive for follicle culture, and retained the highest developmental competence 9. Alginate hydrogels are not degradable, thus an increase in the follicle diameter results in a compressive force on the follicle that can impact follicle growth10. We subsequently developed a culture system based on a fibrin-alginate interpenetrating network (FA-IPN), in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. This combination provides a dynamic mechanical environment because both components contribute to matrix rigidity initially; however, proteases secreted by the growing follicle degrade fibrin in the matrix leaving only alginate to provide support. With the IPN, the alginate content can be reduced below 0.25%, which is not possible with alginate alone 5. Thus, as the follicle expands, it will experience a reduced compressive force due to the reduced solids content. Herein, we describe an encapsulation method and an in vitro culture system for ovarian follicles within a FA-IPN. The dynamic mechanical environment mimics the natural ovarian environment in which small follicles reside in a rigid cortex and move to a more permissive medulla as they increase in size11. The degradable component may be particularly critical for clinical translation in order to support the greater than 106-fold increase in volume that human follicles normally undergo in vivo .

A new method for ovarian follicle encapsulation in a 3D fibrin-alginate interpenetrating network is described. This system combines structural support with proteolytic degradation to support the development of immature follicles to produce mature oocytes. This method may be applied to culture cell aggregates to maintain cell-cell contacts without limiting expansion.

وهناك طريقة لتغليف المسام المبيض والثقافة في نظام 3 تحلل Proteolytically الأبعاد

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue geometry. The resulting 3D hydrogel-based cellular constructs have been introduced as an alternative to animal experiments for advanced biological studies, pharmacological assays and organ transplant applications. Although hydrogel-based particles and fibers can be easily fabricated, it is difficult to manipulate them for tissue reconstruction. In this video, we describe a fabrication method for micropatterned alginate hydrogel sheets, together with their assembly to form a macro-scale 3D cell culture system with a controlled cellular microenvironment. Using a mist form of the calcium gelling agent, thin hydrogel sheets are easily generated with a thickness in the range of 100 - 200 &#181;m, and with precise micropatterns. Cells can then be cultured with the geometric guidance of the hydrogel sheets in freestanding conditions. Furthermore, the hydrogel sheets can be readily manipulated using a micropipette with an end-cut tip, and can be assembled into multi-layered structures by stacking them using a patterned polydimethylsiloxane (PDMS) frame. These modular hydrogel sheets, which can be fabricated using a facile process, have potential applications of in vitro drug assays and biological studies, including functional studies of micro- and macrostructure and tissue reconstruction.

We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment.

بناء وحدات صفائح هيدروجيل لتحجيم الكلي Micropatterned 3D الخلوية العمارة

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

قمع النسخ الجيني قبل إعادة توجيه الأجهزة الخلوية مع المعدلات جينية الكيميائية

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

فلاش نانوبريسيبيتيشن لتغليف مركبات مسعور وماء في الجسيمات النانوية البوليمرية

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

إعداد البروتين إنتاج الخلايا الاصطناعية باستخدام مقتطفات البكتيريا الحرة الخلية، Liposomes ونقل المستحلب

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Finite Element Modelling of a Cellular Electric Microenvironment

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the mechanisms of cell response when exposed to electrical fields can therefore guide the optimization of clinical applications. In vitro experiments aim to help uncover those, offering the advantage of wider input and output ranges that can be ethically and effectively assessed. However, the advancements in in vitro experiments are difficult to reproduce directly in clinical settings. Mainly, that is because the ES devices used in vitro differ significantly from the ones suitable for patient use, and the path from the electrodes to the targeted cells is different. Translating the in vitro results into in vivo procedures is therefore not straightforward. We emphasize that the cellular microenvironment's structure and physical properties play a determining role in the actual experimental testing conditions and suggest that measures of charge distribution can be used to bridge the gap between in vitro and in vivo. Considering this, we show how in silico finite element modelling (FEM) can be used to describe the cellular microenvironment and the changes generated by electric field (EF) exposure. We highlight how the EF couples with geometric structure to determine charge distribution. We then show the impact of time dependent inputs on charge movement. Finally, we demonstrate the relevance of our new in silico model methodology using two case studies: (i) in vitro fibrous Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) poly(styrenesulfonate) (PEDOT-PSS) scaffolds and (ii) in vivo collagen in extracellular matrix (ECM).

This paper presents a strategy for building finite element models of fibrous conductive materials exposed to an electric field (EF). The models can be used to estimate the electrical input that cells seeded in such materials receive and assess the impact of changing the scaffold's constituent material properties, structure or orientation.

نمذجة العناصر المحدودة لبيئة كهربائية خلوية

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the ...

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their cellular source, such as platelet lysate (PL). When used as treatment, EVs are expected to enter the target cells and effect a response from these. In this research, PL-derived EVs have been studied as a cell-free treatment for osteoarthritis (OA). Thus, a method was set up to label EVs and test their uptake on cartilage explants. PL-derived EVs are labeled with the lipophilic dye PKH26, washed twice through a column, and then tested in an in vitro inflammation-driven&#160;OA model for 5 h after particle quantification by nanoparticle tracking analysis (NTA). Hourly, cartilage explants are fixed, paraffined, cut into 6 &#181;m sections to mount on slides, and observed under a confocal microscope. This allows verification of whether EVs enter the target cells (chondrocytes) during this period and analyze their direct effect.

Here, we present a protocol to label platelet lysate-derived extracellular vesicles to monitor their migration and uptake in cartilage explants used as a model for osteoarthritis.

وضع العلامات على الحويصلات خارج الخلية لرصد الهجرة والإقبال في الغضاريف Explants

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their ...

From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous developments have made the CFPS platform more accessible to new users and have expanded the range of applications. For lysate based CFPS systems, cell extracts can be generated from a variety of organisms, harnessing the unique biochemistry of that host to augment protein synthesis. Within the last 20 years, Escherichia coli (E. coli) has become one of the most widely used organisms for supporting CFPS due to its affordability and versatility. Despite numerous key advances, the workflow for E. coli cell extract preparation has remained a key bottleneck for new users to implement CFPS for their applications. The extract preparation workflow is time-intensive and requires technical expertise to achieve reproducible results. To overcome these barriers, we previously reported the development of a 24 hour cell-free autoinduction (CFAI) workflow that reduces user input and technical expertise required. The CFAI workflow minimizes the labor and technical skill required to generate cell extracts while also increasing the total quantities of cell extracts obtained. Here we describe that workflow in a step-by-step manner to improve access and support the broad implementation of E. coli based CFPS.

This work describes the preparation of cell extract from Escherichia coli (E. coli) followed by cell-free protein synthesis (CFPS) reactions in under 24 hours. Explanation of the cell-free autoinduction (CFAI) protocol details improvements made to reduce researcher oversight and increase quantities of cell extract obtained.

من الخلايا إلى تخليق البروتين الخالي من الخلايا في غضون 24 ساعة باستخدام سير عمل الحث التلقائي الخالي من الخلايا

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous ...

A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications

Streptomyces spp. are a major source of clinical antibiotics and industrial chemicals. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 is a fast-growing strain and a natural producer of chloramphenicol, jadomycin, and pikromycin, which makes it an attractive candidate&#160;as a next-generation synthetic biology chassis. Therefore, genetic tools that accelerate the development of S. venezuelae ATCC 10712, as well as other Streptomyces spp. models, are highly desirable for natural product engineering and discovery. To this end, a dedicated S. venezuelae ATCC 10712 cell-free system is provided in this protocol to enable high-yield heterologous expression of high G+C (%) genes. This protocol is suitable for small-scale (10-100 &#956;L) batch reactions in either 96-well or 384-well plate format, while reactions are potentially scalable. The cell-free system is robust and can achieve high yields (~5-10 &#956;M) for a range of recombinant proteins in a minimal setup. This work also incorporates a broad plasmid toolset for real-time measurement of mRNA and protein synthesis, as well as in-gel fluorescence staining of tagged proteins. This protocol can also be integrated with high-throughput&#160;gene expression characterization workflows or the study of enzyme pathways from high G+C (%) genes present in Actinomycetes genomes.

A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications

This protocol details an enhanced method for synthesizing high yields of recombinant proteins from a Streptomyces venezuelae cell-free transcription-translation (TX-TL) system.

مجموعة أدوات النسخ والترجمة العقدية عالية الإنتاجية للبيولوجيا التركيبية وتطبيقات المنتجات الطبيعية

Streptomyces spp. are a major source of clinical antibiotics and industrial chemicals. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 is a fast-growing strain and a ...

Rapid Encapsulation of Reconstituted Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

Giant unilamellar vesicles (GUVs) are frequently used as models of biological membranes and thus are a great tool to study membrane-related cellular processes in vitro. In recent years, encapsulation within GUVs has proven to be a helpful approach for reconstitution experiments in cell biology and related fields. It better mimics confinement conditions inside living cells, as opposed to conventional biochemical reconstitution. Methods for encapsulation inside GUVs are often not easy to implement, and success rates can differ significantly from lab to lab. One technique that has proven to be successful for encapsulating more complex protein systems is called continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE). Here, a cDICE-based method is presented for rapidly encapsulating cytoskeletal proteins in GUVs with high encapsulation efficiency. In this method, first, lipid-monolayer droplets are generated by emulsifying a protein solution of interest in a lipid/oil mixture. After being added into a rotating 3D-printed chamber, these lipid-monolayered droplets then pass through a second lipid monolayer at a water/oil interface inside the chamber to form GUVs that contain the protein system. This method simplifies the overall procedure of encapsulation within GUVs and speeds up the process, and thus allows us to confine and observe the dynamic evolution of network assembly inside lipid bilayer vesicles. This platform is handy for studying the mechanics of cytoskeleton-membrane interactions in confinement.

This article introduces a simple method for expeditious production of giant unilamellar vesicles with encapsulated cytoskeletal proteins. The method proves to be useful for bottom-up reconstitution of cytoskeletal structures in confinement and cytoskeleton-membrane interactions.

التغليف السريع للهيكل الخلوي المعاد تشكيله داخل حويصلات يونيلاميلار العملاقة

Giant unilamellar vesicles (GUVs) are frequently used as models of biological membranes and thus are a great tool to study membrane-related cellular ...