Gli autori riconoscono la Fondazione Armenise-Harvard, il Marie-Curie Trentino COFUND (ACS), la Provincia Autonoma di Trento (Ecomm), e CIBIO per il finanziamento.

1. Preparazione del modello di DNA <ol><li> Purificare plasmide da un ceppo standard di laboratorio di E. coli, come E. coli DH5a o Nova blu con un kit commerciale. Alternativamente, un prodotto di PCR lineare può essere purificato in modo simile con un kit commerciale. Eluire il DNA con H 2 O solo. </li><li> Fenolo-cloroformio estrarre la soluzione di DNA 26. </li><li> Determinare la concentrazione di DNA e la purezza, ad esempio mediante assorbimento UV o altri metodi idonei. È importante utilizzare il DNA altamente puro per efficiente trascrizione-traduzione. </li></ol> 2. Preparazione del Thin Film Lipid <ol><li> Pesare la polvere secca lipidica e sciogliere in solvente. Per 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), le soluzioni madre sono preparati in cloroformio ad una concentrazione di 40 mg / ml. Nota: Solventi organici devono essere sempre maneggiati con pipette di vetro e bottiglie. In altre parole, non deve mai essere usata plastica. Conservare ssoluzioni tac in stretto, bottiglie di vetro aria solvente resistenti ambra a -20 ° C, preferibilmente sotto argon. </li><li> Aliquota 12 micromol POPC (220 ml di 40 mg / ml di soluzione) in un pallone a fondo tondo da 5 ml. </li><li> Evaporare il solvente con un evaporatore rotante (Figura 1) per generare il sottile film lipidico. <ol><li> Montare saldamente il pallone al tubo di distillazione con un fermaglio circolare e avviare la rotazione del pallone. </li><li> Avviare la circolazione di acqua attraverso la serpentina del condensatore. Utilizzando un bagno di calore non è necessario, perché cloroformio ha un basso punto di ebollizione di 61,2 ° C a pressione atmosferica normale. </li><li> Assicurare che il sistema è aperto all&#39;atmosfera controllando che il rubinetto è aperto. Accendere la pompa del vuoto e chiudere lentamente il rubinetto di applicare il vuoto al sistema. </li><li> Un sottile film lipidico si deposita sulle pareti del pallone durante evaporazione rotante formando una pellicola opacache è visibile ad occhio. Lasciate che l&#39;evaporazione rotante proseguire per 0,5-2 ore. Per arrestare il processo, rilasciare lentamente la pressione del vuoto, fermare la rotazione, e togliere il pallone a fondo tondo. </li></ol></li></ol> 3. Lipid risospensione e Vesicle omogeneizzazione <ol><li> Aggiungere 1 ml 18,2 MW H 2 O al film lipidico sottile direttamente nel pallone a fondo tondo. Vortice vigorosamente la soluzione alla massima velocità, circa 3.200 rpm, finché il film lipidico stacca dal vetro, che è osservabile ad occhio. </li><li> Trasferire la dispersione dei lipidi in una provetta da 2 ml. </li><li> Set-up di un anello stand per tenere un omogeneizzatore con una punta di 5 mm. Posizionare un supporto sotto il microcentrifuga omogeneizzatore per tenere saldamente la dispersione dei lipidi. Risciacquare l&#39;elemento disperdente del omogeneizzatore immergendo la punta in 18,2 MW H 2 O e funzionante per alcuni secondi. </li><li> Posizionare l&#39;elemento disperdente direttamente nella dispersione lipidica garantendo thsulla punta non tocchi il fondo della provetta. Omogeneizzare per 1 min a livello di potenza 4 o 14.000 rpm. </li></ol> 4. Vescicola Estrusione e liofilizzazione <ol><li> Assemblare le parti della mini-estrusore (Figura 2), che consiste in un involucro esterno e un dado di bloccaggio che ospita due membrane teflon interno supporta, due O-ring, e un cuscinetto Teflon. <ol><li> Posizionare i due O-ring nelle scanalature dei supporti membrane interne. Prewet due filtri e una membrana 400 nm. I filtri saranno collocati contro il Teflon all&#39;interno degli O-ring con la membrana tra loro. </li><li> Posizionare la membrana supporta nella guaina estrusore con la membrana circondato da due filtri in fra gli O-ring. Posizionare il cuscinetto in teflon all&#39;interno del carter e fissare il dado di fermo e serrare a mano. </li></ol></li><li> Risciacquare due siringhe e riempire uno con 18,2 MW acqua. Inserire gli aghi della siringa nel piccolo holes in teflon su entrambe le estremità del gruppo estrusore. Gli aghi devono scivolare nel facile, non forzare gli aghi. Fissare l&#39;estrusore con le siringhe nel corpo estrusore e fissare. </li><li> Passare l&#39;acqua attraverso l&#39;estrusore premendo lentamente l&#39;acqua fuori una siringa e nell&#39;altro. Questo rappresenta un passaggio. Ripetere per un totale di tre passaggi di assicurare che non vi siano perdite presenti. Rimuovere la siringa di acqua e smaltire l&#39;acqua. </li><li> Riempire una siringa con il campione, allegare l&#39;estrusore, e lentamente passare la soluzione attraverso la membrana vescicola come descritto sopra nel passo 4.3. Ripetere 10 volte per un totale di 11 brani. Dell&#39;andamento del processo di estrusione, il campione diventa meno torbido e facile spingere attraverso la membrana. Una improvvisa diminuzione della resistenza, comunque, di solito indica una rottura della membrana. </li><li> Trasferire la soluzione vescicola estruso e fare 40 microlitri aliquote delle vescicole in provette da microcentrifuga.Flash congelare ciascuna aliquota in ghiaccio secco o in azoto liquido. </li><li> Lyophilize ciascuna aliquota con un evaporatore centrifugo notte a 30 ° C. Conservare le vescicole vuote liofilizzate a -20 ° C. </li></ol> 5. Incapsulando meccanismi di trascrizione-traduzione <ol><li> Miscelare i componenti della reazione di trascrizione-traduzione e aggiungere 20 unità di inibitore della RNasi. Incubare in ghiaccio. </li><li> Aggiungere il modello di DNA. Per una reazione di controllo, 250 ng di plasmide mVenus codifica una proteina fluorescente o simile dietro un promotore trascrizionale T7 e un forte E. coli sito di legame del ribosoma è raccomandato. </li><li> Portare il volume finale di 25 microlitri di acqua priva di RNasi. </li><li> Idrato una aliquota di vescicole liofilizzati (dal punto 4.6) con 10 microlitri della reazione assemblato nel passo 5.3. Brevemente vortex la miscela fino a quando le vescicole sono risospesi. Questo dovrebbe richiedere meno di 30 sec. </li><li> Incubare la reazione in ghiaccio per 30 min per permettere le vescicole a gonfiarsi. </li><li> Diluire la miscela vescicola 20 volte ad un volume totale di 30 microlitri con l&#39;aggiunta di 1,5 ml di vescicole in 27,0 ml di 50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7,4 e 1,5 ml di 20,2 mg / ml di proteinasi K. DNasi e RNasi possono anche essere aggiunti a questo punto come alternativa alla proteinasi K a degradare materiale extravesicular. </li><li> Incubare per almeno 2,5 ore a 37 ° C. </li></ol> 6. Microscopia <ol><li> Esaminare le vescicole e il progresso della produzione di proteina fluorescente in momenti diversi. Le vescicole avranno un diametro maggiore rispetto alle 400 nm pori di dimensioni della membrana utilizzata per vescicola estrusione. <ol><li> Preparare una camera del campione mettendo un 20 x 5 mm distanziale di silicio su un vetrino da microscopio standard. Pipettare 10 ml di vescicole nell&#39;apposita camera. Posizionare un vetrino di vetro siliconato sopra la camera. </li><li> Osservare le vescicole con un 63X olio-dispersione or obiettivo analogo da campo chiaro e microscopia a fluorescenza con filtro corrispondente per la proteina fluorescente sfruttati. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Forster, A. C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+synthesis+of+a+minimal+cell.">Towards synthesis of a minimal cell.</a> Mol. Syst. Biol. 2, 1-10 (2006).</li><li>Noireaux, V., Maeda, Y. T., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+artificial+cell,+from+self-organization+to+computation+and+self-reproduction.">Development of an artificial cell, from self-organization to computation and self-reproduction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 3473-3480 (2011).</li><li>Harris, D. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+biology:+Exploiting+the+interface+between+synthetic+biology+and+synthetic+chemistry.">Cell-free biology: Exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry.</a> Curr. Opin. Biotech. 23, (2012).</li><li>Nishikawa, T., Sunami, T., Matsuura, T., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+Evolution+of+Proteins+through+In+Vitro+Protein+Synthesis+in+Liposomes.">Directed Evolution of Proteins through In Vitro Protein Synthesis in Liposomes.</a> J. Nucleic Acids. 2012, 1-11 (2012).</li><li>Forlin, M., Lentini, R., Mansy, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+imitations.">Cellular imitations.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 16, 586-592 (2012).</li><li>Chiarabelli, C., Stano, P., Anella, F., Carrara, P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+chemical+synthetic+biology.">Approaches to chemical synthetic biology.</a> FEBS Lett. 586, 2138-2145 (2012).</li><li>Noireaux, V., Shin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+Coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70.">Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> J. Biol. Eng. 4, 1-9 (2010).</li><li>Fujiwara, K., Nomura, S. -. i. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condensation+of+an+Additive-Free+Cell+Extract+to+Mimic+the+Conditions+of+Live+Cells.">Condensation of an Additive-Free Cell Extract to Mimic the Conditions of Live Cells.</a> PLoS ONE. 8, e54155 (2013).</li><li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nat. Biotechnol. 19, 751-755 (2001).</li><li>Hosoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Study+of+the+Structure+of+Multilamellar+Giant+Liposomes+As+a+Container+of+Protein+Synthesis+Reaction.">Quantitative Study of the Structure of Multilamellar Giant Liposomes As a Container of Protein Synthesis Reaction.</a> Langmuir. 24, 13540-13548 (2008).</li><li>Sunami, T., Matsuura, T., Suzuki, H., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Functional+Protiens+Within+Liposomes.">Synthesis of Functional Protiens Within Liposomes.</a> Methods Mol. Biol. 607, 243-256 (2010).</li><li>Murtas, G., Kuruma, Y., Bianchini, P., Diaspro, A., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+in+liposomes+with+a+minimal+set+of+enzymes.">Protein synthesis in liposomes with a minimal set of enzymes.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 363, 12-17 (2007).</li><li>Pereira de Souza, T., Stano, P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Minimal+Size+of+Liposome-Based+Model+Cells+Brings+about+a+Remarkably+Enhanced+Entrapment+and+Protein+Synthesis.">The Minimal Size of Liposome-Based Model Cells Brings about a Remarkably Enhanced Entrapment and Protein Synthesis.</a> ChemBioChem. 10, 1056-1063 (2009).</li><li>Caschera, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+Vesicle+Fusion+Triggers+Gene+Expression.">Programmed Vesicle Fusion Triggers Gene Expression.</a> Langmuir. 27, 13082-13090 (2011).</li><li>Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Godefroy, J., Salman, H., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+an+artificial+cell+based+on+gene+expression+in+vesicles.">Toward an artificial cell based on gene expression in vesicles.</a> Phys. Biol. 2, P1-P8 (2005).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox:+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells.">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> ACS Synth. Biol. 1, 29-41 (2012).</li><li>Kobori, S., Ichihashi, N., Kazuta, Y., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+controllable+gene+expression+system+in+liposomes+that+includes+a+postive+feedback+loop.">A controllable gene expression system in liposomes that includes a postive feedback loop.</a> Mol. Syst. Biol. 9, 1282-1285 (2013).</li><li>Martini, L., Mansy, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-like+Systems+with+Riboswitch+Controlled+Gene+Expression.">Cell-like Systems with Riboswitch Controlled Gene Expression.</a> Chem. Commun. 47, 10734-10736 (2011).</li><li>Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cell-free+genetic+circuit+assembly.">Principles of cell-free genetic circuit assembly.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12672-12677 (2003).</li><li>Sunami, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Association+and+Fusion+of+Giant+Vesicles+Using+a+Fluorescence-Activated+Cell+Sorter.">Detection of Association and Fusion of Giant Vesicles Using a Fluorescence-Activated Cell Sorter.</a> Langmuir. 26, 15098-15103 (2010).</li><li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Resolved+Tracking+of+a+Minimum+Gene+Expression+System+Reconstituted+in+Giant+Liposomes.">Time-Resolved Tracking of a Minimum Gene Expression System Reconstituted in Giant Liposomes.</a> ChemBioChem. 10, 1640-1643 (2009).</li><li>Lentini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Proteins+and+in+Vitro+Genetic+Organization+for+Cell-Free+Synthetic+Biology.">Fluorescent Proteins and in Vitro Genetic Organization for Cell-Free Synthetic Biology.</a> ACS Synth. Biol. , (2013).</li><li>Du, L., Villarreal, S., Forster, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multigene+Expression+In+Vivo:+Supremacy+of+Large+Versus+Small+Terminators+for+T7+RNA+Polymerase.">Multigene Expression In Vivo: Supremacy of Large Versus Small Terminators for T7 RNA Polymerase.</a> Biotechnol. Bioeng. 109, 1043-1050 (2011).</li><li>Trochilin, V. P., Weissig, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liposomes: A Practical Approach. , (2003).</li><li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+vesicles:+preparations+and+applications.">Giant vesicles: preparations and applications.</a> ChemBioChem. 11, 848-865 (2010).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. , (2001).</li><li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly.">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17669-17674 (2004).</li><li>Yu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Functional+Protein+in+Liposome.">Synthesis of Functional Protein in Liposome.</a> J. Biosci. Bioeng. 92, 590-593 (2001).</li><li>Caschera, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+vesicles+composed+of+monocarboxylic+or+dicarboxylic+fatty+acids+and+trimethylammonium+amphiphiles.">Stable vesicles composed of monocarboxylic or dicarboxylic fatty acids and trimethylammonium amphiphiles.</a> Langmuir. 27, 14078-14090 (2011).</li><li>Pereira de Souza, T., Steiniger, F., Stano, P., Fahr, A., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+crowding+of+ribosomes+and+proteins+inside+vesicles:+a+possible+mechanism+for+the+origin+of+cell+metabolism.">Spontaneous crowding of ribosomes and proteins inside vesicles: a possible mechanism for the origin of cell metabolism.</a> ChemBioChem. 12, 2325-2330 (2011).</li><li>Niederholtmeyer, H., Xu, L., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+mRNA+Measurement+during+an+in+Vitro+Transcription+and+Translation+Reaction+Using+Binary+Probes.">Real-Time mRNA Measurement during an in Vitro Transcription and Translation Reaction Using Binary Probes.</a> ACS Synth. Biol. 10, (2012).</li><li>St&#246;gbauer, T., Windhager, L., Zimmer, R., R&#228;dler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiment+and+mathematical+modeling+of+gene+expression+dynamics+in+a+cell-free+system.">Experiment and mathematical modeling of gene expression dynamics in a cell-free system.</a> Integr. Biol. 4, 494-501 (2012).</li><li>Lazzerini-Ospri, L., Stano, P., Luisi, P., Marangoni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+emergent+properties+of+a+synthetic+quasi-cellular+system.">Characterization of the emergent properties of a synthetic quasi-cellular system.</a> BMC Bioinformatics. 13, 1-10 (2011).</li><li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Replication,+Synthesis,+and+Assembly+of+the+Bacteriophage+T7+in+a+Single+Cell-Free+Reaction.">Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction.</a> ACS Synth. Biol. 1, 408-413 (2012).</li><li>Zhu, T. F., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Large+Monodisperse+Vesicles.">Preparation of Large Monodisperse Vesicles.</a> PLoS ONE. 4, 1-4 (2009).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Anche se la biologia sintetica privo di cellule è ancora nella sua infanzia, i progressi hanno gettato le basi da cui sempre più complessi sistemi di cellule simili possono essere fatte. La ricostituzione di meccanismi di trascrizione-traduzione da completamente definita componenti 9 all&#39;interno di vescicole 28 è stato particolarmente significativo nel facilitare gli sforzi successivi nella costruzione artificiale sensibile ambientalmente cells17, 18. Allo stesso modo, gli studi sulle cellule artificiali sono stati utilizzati per sondare i processi evolutivi 4,29,30, i dettagli meccanicistici di RNA e proteine ​​22,31, le influenze di metabolica load32, 33, e l&#39;assemblaggio delle particelle virali 34. È importante sottolineare che, abbastanza Ormai sappiamo che le funzioni cellulari di base può essere ricostituita all&#39;interno di vescicole in laboratorio seguendo questi precedenti relazioni ei protocolli descritti nel presente documento. Oltre ad essere facile, l&#39;incapsulamento descritto procedure ha diversi vantaggi. Ad esempio, molti vuoti, aliquote vescicola liofilizzati possono essere fatte in anticipo e conservati a -20 ° C per un uso successivo. Il protocollo non soggette molecole biologiche ai solventi organici, sbalzi di temperatura, o lunghi periodi di dialisi. Ci aspettiamo che la dolcezza della procedura faciliterà l&#39;integrazione di componenti aggiuntivi, se necessario. Inoltre, non abbiamo osservato effetti negativi per cambiare la composizione lipidica della membrana su incapsulamento o efficienza di trascrizione-traduzione. Pertanto, concettualmente, potrebbe essere sfruttata lipidi più suscettibili alla incorporazione di proteine ​​di membrana, morfologie specifiche, o di visualizzazione. La maggiore limitazione del metodo descritto è che le vescicole risultanti non sono omogenee in dimensioni o lamellarity. Per molte applicazioni, queste difficoltà non interferiscono con l&#39;interpretazione dei dati. Tuttavia, se necessario, ulteriori passi possono essere incorporati a stretto thdistribuzione delle dimensioni di posta e diminuire gli strati di membrane, come i cicli di estrusione dopo incapsulamento, gelo-disgelo, o dialisi 35. Saranno sviluppati metodi indubbiamente meglio che eludono questi e altri problemi. Fino ad allora, troviamo il protocollo qui descritto per essere adatto per la costruzione di mimici cellulari.

Privo di cellule, in vitro le reazioni di trascrizione-traduzione e la generazione di vescicole di lipidi sintetici sono nulla di nuovo. Tuttavia, combinando i due in un cellulare imitare è significativamente più challenging1-6. E. coli estratti cellulari con o senza T7 RNA polimerasi possono essere utilizzati come fonte di meccanismi di trascrizione-traduzione 7,8. Estratti cellulari beneficio dalla presenza di componenti cellulari aggiuntivi che possono facilitare l&#39;espressione proteica e pieghevole. In alternativa, una miscela di RNA purificati individualmente e molecole proteiche, cioè il sistema PURE 9, può essere usato per mediare la sintesi proteica intravesicular 4,10-14. Il sistema PURE permette la costruzione di mimici cellulari completamente definite e non soffre l&#39;attività nucleasi trovato in estratti cellulari. In pratica, ciò significa che è necessario molto meno stampo di DNA, facilitando così i processi a bassa efficienza di incapsulamento 11 </sup&gt;. Anche se meno frequente, imita cellulari possono essere costruiti con estratti di cellule derivate da eucarioti cells15. Finora, cascate incapsulati geneticamente codificate e mima cellulari che percepiscono l&#39;ambiente sono stati segnalati 16-18. Il modo più semplice per monitorare le reazioni di trascrizione-traduzione è quello di misurare la fluorescenza o luminescenza di elementi geneticamente codificati. Tipicamente, lucciola luciferasi 19 o GFP sono utilizzati, anche se in vitro reazioni sono frequentemente misurate da radiomarcatura. Rilevazione a fluorescenza consente inoltre il monitoraggio delle popolazioni di vescicole 20,21 attraverso metodi basati citometria, offrendo così un po &#39;di comprensione della natura stocastica dei processi biologici simili. Questi metodi di controllo sono stati utilizzati per definire un piccolo insieme di regole di progettazione e di una libreria di parti da cui costruire, includendo una collezione di proteine ​​fluorescenti che sono compatibili con in vitro trascrizione-traduzione 22, l&#39;influenza di organizzazione genetica sull&#39;espressione 22, l&#39;attività dei fattori sigma 16, e l&#39;efficienza trascrizionale terminatori 23. Tuttavia, c&#39;è ancora molto che deve essere fatto per aumentare la capacità di costruire prevedibile in vitro, dispositivi geneticamente codificati. Ci sono molti metodi disponibili per fare vescicole. I metodi più comuni dipendono dalla generazione di un film lipidico sottile su una superficie di vetro seguita da risospensione in solution24 acquosa. Se la soluzione acquosa contiene meccanismi di trascrizione-traduzione, per esempio, allora una frazione delle vescicole formato dovrebbe contenere i componenti necessari per la produzione di proteine. Tuttavia, l&#39;efficienza di incapsulamento di tali metodi è bassa, il che significa che solo una piccola percentuale di vescicole sono attivi. Molti dei metodi alternativi caratterizzati da molto superiore eff incapsulamentoiciency sfruttare la conversione di goccioline di emulsione acqua-in-olio di vescicole. Mentre è probabile che tali metodi saranno all&#39;ordine in futuro, attualmente questi metodi soffrono la necessità di attrezzature specializzate e danno vescicole di membrana con composizioni alterati 25. Un vantaggio di acqua-in-olio ai metodi vescicole è il potenziale di membrana di controllare lamellarity. Il metodo qui descritto è basato sul protocollo sottile film lipidico descritto dal laboratorio Yomo 11 con lievi modifiche, compresa una fase di omogeneizzazione aggiuntiva. Questo metodo è facile, economico, e dà vescicole robusti e adatti per l&#39;incapsulamento dei meccanismi di trascrizione-traduzione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="745">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Quick Spin Mini-prep kit</td>
			<td style="width:243px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spectrometer</td>
			<td style="width:243px;">NanoDrop 1000</td>
			<td style="width:119px;">NDB767ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">770557</td>
			<td style="width:167px;">MW 760 g/mol 
			Transition Temp -2 &#176;C 
			CAS# 26853-31-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">459836</td>
			<td>Anhydrous, &#62;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Phenol-choloroform-isoamyl alcohol 25:24:1, for molecular biology use</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P3803-100mL</td>
			<td>Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform</td>
			<td>Biotech Grade Fluka</td>
			<td style="width:119px;">496189-1L</td>
			<td>Contain ethanol at 0.5-1.0% v/v as stabilizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Brown amber glass bottles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89043-518</td>
			<td>55X 48 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi Rotovapor R-210/Sigma</td>
			<td>Z563846EU-1EA</td>
			<td>With jack and water bath, 29/32 joint 240 V</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Analog vortex mixer</td>
			<td style="width:243px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">945300</td>
			<td>Speed 1,000-3,200 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Homogenizer</td>
			<td>IKA T10 Basic Ultra-Turbax</td>
			<td style="width:119px;">3420000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Extruder filters</td>
			<td>Whatman</td>
			<td style="width:119px;">610014</td>
			<td>drain disc 10 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Extruder polycarbonate membrane 400 nm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td style="width:119px;">61007</td>
			<td>nuclepore polycarbonate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Speed vacuum</td>
			<td>Labconco</td>
			<td style="width:119px;">7970011</td>
			<td>Centritrap DNA concentrator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PURExpress kit</td>
			<td style="width:243px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">NRM #E6800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNAse inhibitor (40,000 U/ml)</td>
			<td style="width:243px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">#M0307S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K (20.2 mg/ml)</td>
			<td style="width:243px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">#EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:243px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microscope</td>
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Zeiss Observer Z1with a AxioCam MRm camera</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RealTime</td>
			<td style="width:243px;">CFX96 Real time PCR Detection System (Biorad)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Silicon press to seal&#160;&#160;-Molecular Probe</td>
			<td style="width:243px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">P18174</td>
			<td>Resistant from&#160; -25-30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Siliconized glass circle cover slides</td>
			<td style="width:243px;">Hampton Research</td>
			<td style="width:119px;">HR3-231</td>
			<td>&#160;&#160; Diameter= 22 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ</td>
			<td style="width:243px;">NIH&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the encapsulation of cell-free transcription and translation machinery in vesicles for the construction of cellular mimics

Come spostamenti interesse da singole molecole a sistemi di molecole, un numero crescente di laboratori hanno cercato di costruire dal basso imita cellulari che meglio rappresentano la complessità della vita cellulare. Ad oggi ci sono una serie di percorsi che potrebbero essere adottate per costruire imita compartimenti cellulari, compreso lo sfruttamento delle emulsioni acqua-in-olio, dispositivi microfluidici, e vescicole. Ognuna delle opzioni presenta vantaggi e svantaggi specifici. Ad esempio, emulsioni acqua-in-olio sono ad alto rendimento incapsulamento ma non imitano bene la barriera di permeabilità delle cellule viventi. Il vantaggio principale dei metodi qui descritti è che sono tutti facili ed economici da realizzare. Meccanismi di trascrizione-traduzione è incapsulato all&#39;interno di vescicole fosfolipidiche attraverso un processo che sfrutta strumentazione comune, come ad esempio un evaporatore centrifugo e un estrusore. Le reazioni sono monitorati mediante spettroscopia di fluorescenza. Il protocollos può essere adattato per l&#39;espressione di proteine ​​ricombinanti, la costruzione di imita cellulari, l&#39;esplorazione dei requisiti minimi per la vita cellulare, o l&#39;assemblaggio di circuiti genetici.

Microscopia di fluorescenza che rivela la fluorescenza si osserva solo all&#39;interno delle vescicole, perché il materiale extravesicular è enzimaticamente degradata (Figura 3). Per l&#39;espressione di mVenus, intravesicular fluorescenza comincia ad essere osservata dopo 1,5 ore a 37 ° C e raggiunge l&#39;intensità di fluorescenza massima entro 6 ore. La temperatura ottimale e il tempo di incubazione può variare a seconda dei costrutti specifici utilizzati. Per esempio, le proteine ​​fluorescenti diverse maturano in modo diverso in un modo dipendente dalla temperatura. In altre parole, l&#39;osservazione della produzione di proteine ​​non è solamente dipende sintesi proteica e ripiegamento, ma anche sulla formazione cromoforo. Sintesi proteica generale può essere aumentata incorporando pori proteine ​​di membrana per permettere un afflusso di componenti impoverito necessari per la trascrizione e la traduzione 27. Si consiglia di effettuare un analogo trascrizione-traduzionizione reazione in assenza di vescicole a garantire che il costrutto genetico sfruttati è funzionale. Questa reazione di controllo è più facilmente monitorato mediante spettroscopia di fluorescenza anziché microscopia. Figura 4 mostra una reazione di trascrizione-traduzione in vitro di un costrutto mVenus codifica. Le reazioni non incapsulata danno totale intensità molto maggiore fluorescenza di reazioni intravesicular simili. Questo è dovuto alla efficienza di incapsulamento e poiché il volume totale intravesicular è molto inferiore al volume extravesicular (cioè un effetto di diluizione). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig1.jpg" width="600px" /> Figura 1. L&#39;evaporatore rotante e pompa del vuoto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . Figura 2. L&#39;involucro e parti dell&#39;estrusore sono mostrati separatamente. Da sinistra a destra, la siringa, il dado di fermo, cuscinetto in teflon, membrana interna supporta con O-ring nero uno di fronte all&#39;altro, estrusore tubo esterno e seconda siringa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig3.jpg" width="600px" /> Figura 3. Immagini di fluorescenza di produzione di proteine ​​mVenus in liposomi A e C:.. Immagini in campo chiaro di vescicole multilamellari dopo 1,5 ore e 2,5 ore e B &amp;# 160; D: La produzione di mVenus è visualizzato mediante fluorescenza (di colore verde), dopo 1,5 e 2,5 ore, rispettivamente. Barra di scala è di 20 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig4.jpg" width="600px" /> Figura 4. Nella reazione di controllo vitro di nonencapsulated trascrizione in vitro e la traduzione di mVenus. Intensità di fluorescenza è stata misurata ogni 5 min oltre 4 ore. I dati sono stati acquisiti con uno strumento Real-Time PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> .

Watch this Scientific Journal Video about The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics at JoVE.com

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

Qui descriviamo semplici metodi per la preparazione di vescicole, l&#39;incapsulamento di trascrizione e traduzione macchinari, e il monitoraggio della produzione di proteine. La risultante sistemi cell-free possono essere utilizzati come punto di partenza da cui costruire imita cellulari sempre più complessi.

L&#39;incapsulamento di trascrizione privo di cellule e macchinari traduzione in vescicole per la costruzione di Mimics cellulari

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

the-encapsulation-cell-free-transcription-translation-machinery

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.0K Views.  University of Trento.  Qui descriviamo semplici metodi per la preparazione di vescicole, l'incapsulamento di trascrizione e traduzione macchinari, e il monitoraggio della produzione di proteine. La risultante sistemi cell-free possono essere utilizzati come punto di partenza da cui costruire imita cellulari sempre più complessi. 

Video: The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro follicle techniques provide a tool to model follicle development in order to investigate basic biology, and are further being developed as a technique to preserve fertility in the clinic1-4. Our in vitro culture system employs hydrogels in order to mimic the native ovarian environment by maintaining the 3D follicular architecture, cell-cell interactions and paracrine signaling that direct follicle development 5. Previously, follicles were successfully cultured in alginate, an inert algae-derived polysaccharide that undergoes gelation with calcium ions6-8. Alginate hydrogels formed at a concentration of 0.25% w/v were the most permissive for follicle culture, and retained the highest developmental competence 9. Alginate hydrogels are not degradable, thus an increase in the follicle diameter results in a compressive force on the follicle that can impact follicle growth10. We subsequently developed a culture system based on a fibrin-alginate interpenetrating network (FA-IPN), in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. This combination provides a dynamic mechanical environment because both components contribute to matrix rigidity initially; however, proteases secreted by the growing follicle degrade fibrin in the matrix leaving only alginate to provide support. With the IPN, the alginate content can be reduced below 0.25%, which is not possible with alginate alone 5. Thus, as the follicle expands, it will experience a reduced compressive force due to the reduced solids content. Herein, we describe an encapsulation method and an in vitro culture system for ovarian follicles within a FA-IPN. The dynamic mechanical environment mimics the natural ovarian environment in which small follicles reside in a rigid cortex and move to a more permissive medulla as they increase in size11. The degradable component may be particularly critical for clinical translation in order to support the greater than 106-fold increase in volume that human follicles normally undergo in vivo .

A new method for ovarian follicle encapsulation in a 3D fibrin-alginate interpenetrating network is described. This system combines structural support with proteolytic degradation to support the development of immature follicles to produce mature oocytes. This method may be applied to culture cell aggregates to maintain cell-cell contacts without limiting expansion.

Un metodo per l&#39;incapsulamento follicolo ovarico e la cultura in un proteoliticamente degradabile 3 Sistema dimensionale

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Ricerca

Bioingegneria

Describing a Transcription Factor Dependent Regulation of the MicroRNA Transcriptome

While the transcription regulation of protein coding genes was extensively studied, little is known on how transcription factors are involved in transcription of non-coding RNAs, specifically of microRNAs. Here, we propose a strategy to study the potential role of transcription factor in regulating transcription of microRNAs using publically available data, computational resources and high throughput data. We use the H3K4me3 epigenetic signature to identify microRNA promoters and chromatin immunoprecipitation (ChIP)-sequencing data from the ENCODE project to identify microRNA promoters that are enriched with transcription factor binding sites. By transfecting cells of interest with shRNA targeting a transcription factor of interest and subjecting the cells to microRNA array, we study the effect of this transcription factor on the microRNA transcriptome. As an illustrative example we use our study on the effect of STAT3 on the microRNA transcriptome of chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells.

Herein we propose a strategy to study the effect of a transcription factor of interest on the microRNA transcriptome using publically available data, computational resources and high throughput data from microRNA arrays after transfecting cells with small hairpin (sh)RNA targeting a transcription factor of interest.

Descrivendo un regolamento Dipendente Fattore di trascrizione del MicroRNA trascrittoma

While the transcription regulation of protein coding genes was extensively studied, little is known on how transcription factors are involved in ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue geometry. The resulting 3D hydrogel-based cellular constructs have been introduced as an alternative to animal experiments for advanced biological studies, pharmacological assays and organ transplant applications. Although hydrogel-based particles and fibers can be easily fabricated, it is difficult to manipulate them for tissue reconstruction. In this video, we describe a fabrication method for micropatterned alginate hydrogel sheets, together with their assembly to form a macro-scale 3D cell culture system with a controlled cellular microenvironment. Using a mist form of the calcium gelling agent, thin hydrogel sheets are easily generated with a thickness in the range of 100 - 200 &#181;m, and with precise micropatterns. Cells can then be cultured with the geometric guidance of the hydrogel sheets in freestanding conditions. Furthermore, the hydrogel sheets can be readily manipulated using a micropipette with an end-cut tip, and can be assembled into multi-layered structures by stacking them using a patterned polydimethylsiloxane (PDMS) frame. These modular hydrogel sheets, which can be fabricated using a facile process, have potential applications of in vitro drug assays and biological studies, including functional studies of micro- and macrostructure and tissue reconstruction.

We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment.

Costruzione di fogli modulare idrogel per micropatterned macro-scala 3D Cellular Architettura

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

Reprimere la trascrizione genica reindirizzando macchinario cellulare con modificatori epigenetici chimici

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

Flash nanoprecipitazione per l'incapsulamento di composti idrofobi e idrofili in nanoparticelle polimeriche

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

Misurazione della proteinasi metallica della matrice cellulare globale e l'attività metabolica in idrogel 3D

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical development, not only their pharmaceutical activity is important but also their production needs to be evaluated. In this context, research focuses on the isolation of EVs, their characterization, and their storage. The present manuscript aims at providing a facile procedure for the assessment of the effect of different storage conditions on EVs, without genetic manipulation or specific functional assays. This makes it possible to quickly get a first impression of the stability of EVs under a given storage condition, and EVs derived from different cell sources can be compared easily. The stability measurement is based on the physicochemical parameters of the EVs (size, particle concentration, and morphology) and the preservation of the activity of their cargo. The latter is assessed by the saponin-mediated encapsulation of the enzyme beta-glucuronidase into the EVs. Glucuronidase acts as a surrogate and allows for an easy quantification via the cleavage of a fluorescent reporter molecule. The present protocol could be a tool for researchers in the search for storage conditions that optimally retain EV properties to advance EV research toward clinical application.

Here we present a readily applicable protocol to assess the storage stability of extracellular vesicles, a group of naturally occurring nanoparticles produced by cells. The vesicles are loaded with glucuronidase as a model enzyme and stored under different conditions. After storage, their physicochemical parameters and the activity of the encapsulated enzyme are evaluated.

Valutazione della stabilità di conservazione delle vescicole extracellulari

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

Preparazione di proteine che producono cellule sintetiche utilizzando estratti batterici cell free, liposomi e trasferimento di emulsione

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Finite Element Modelling of a Cellular Electric Microenvironment

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the mechanisms of cell response when exposed to electrical fields can therefore guide the optimization of clinical applications. In vitro experiments aim to help uncover those, offering the advantage of wider input and output ranges that can be ethically and effectively assessed. However, the advancements in in vitro experiments are difficult to reproduce directly in clinical settings. Mainly, that is because the ES devices used in vitro differ significantly from the ones suitable for patient use, and the path from the electrodes to the targeted cells is different. Translating the in vitro results into in vivo procedures is therefore not straightforward. We emphasize that the cellular microenvironment's structure and physical properties play a determining role in the actual experimental testing conditions and suggest that measures of charge distribution can be used to bridge the gap between in vitro and in vivo. Considering this, we show how in silico finite element modelling (FEM) can be used to describe the cellular microenvironment and the changes generated by electric field (EF) exposure. We highlight how the EF couples with geometric structure to determine charge distribution. We then show the impact of time dependent inputs on charge movement. Finally, we demonstrate the relevance of our new in silico model methodology using two case studies: (i) in vitro fibrous Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) poly(styrenesulfonate) (PEDOT-PSS) scaffolds and (ii) in vivo collagen in extracellular matrix (ECM).

This paper presents a strategy for building finite element models of fibrous conductive materials exposed to an electric field (EF). The models can be used to estimate the electrical input that cells seeded in such materials receive and assess the impact of changing the scaffold's constituent material properties, structure or orientation.

Modellazione agli elementi finiti di un microambiente elettrico cellulare

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the ...

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their cellular source, such as platelet lysate (PL). When used as treatment, EVs are expected to enter the target cells and effect a response from these. In this research, PL-derived EVs have been studied as a cell-free treatment for osteoarthritis (OA). Thus, a method was set up to label EVs and test their uptake on cartilage explants. PL-derived EVs are labeled with the lipophilic dye PKH26, washed twice through a column, and then tested in an in vitro inflammation-driven&#160;OA model for 5 h after particle quantification by nanoparticle tracking analysis (NTA). Hourly, cartilage explants are fixed, paraffined, cut into 6 &#181;m sections to mount on slides, and observed under a confocal microscope. This allows verification of whether EVs enter the target cells (chondrocytes) during this period and analyze their direct effect.

Here, we present a protocol to label platelet lysate-derived extracellular vesicles to monitor their migration and uptake in cartilage explants used as a model for osteoarthritis.