著者はArmenise-ハーバード財団、マリー·キュリートレンCOFUND（ACS）、トレント（ECOMM）自治州、および資金調達のためにCIBIOを認める。

1。 DNAテンプレートの準備<ol><li> E.標準の実験室株からのプラスミド浄化例えば大腸菌などの大腸菌 、市販のキットで大腸菌 DH5αをまたはノヴァブルー。あるいは、線形PCR産物を、同様に市販のキットを用いて精製することができる。唯一のH 2 OでDNAを溶出。 </li><li>フェノール-クロロホルムはDNA溶液26を抽出します。 </li><li> UV吸光度または他の適当な方法によって、 例えば DNA濃度と純度を決定します。転写翻訳効率的な高純度のDNAを用いることが重要である。 </li></ol> 2。薄い脂質フィルムを準備する<ol><li>乾燥脂質粉末を秤量し、溶媒中に溶解する。 1 -パルミトイル-2 -オレオイル-sn-グリセロ-3 -ホスホコリン（POPC）については、ストック溶液は、40 mg / mlの濃度のクロロホルム中で調製される。 注：有機溶剤は常にガラスピペットとボトルで処理しなければなりません。言い換えれば、プラスチックを使用してはいけません。店舗s好ましくは、アルゴン下、-20℃で気密、耐溶剤アンバーガラスボトルタックソリューション。 </li><li>アリコート12マイクロモルPOPC（40 mg / mlのストック溶液220μL）5 mlの丸底フラスコに。 </li><li>薄い脂質フィルムを生成するためのロータリーエバポレーター（ 図1）で溶媒を蒸発させる。 <ol><li>しっかりと円形のクリップで蒸留管に丸底フラスコを取り付け、フラスコの回転を開始。 </li><li>凝縮器コイルを通じて水の循環を開始します。クロロホルム61.2の低沸点℃で常圧でCを持っているので、熱浴を使用して、必要ではない。 </li><li>システムはコックが開いていることを確認することにより、大気に開放されていることを確認してください。真空ポンプの電源を入れ、ゆっくりとシステムに真空を適用するためのコックを閉じてください。 </li><li>薄い脂質膜は遮光膜を形成し、回転蒸発中の丸底フラスコの壁面上に堆積されるそれは、目で見えるようになります。ロータリーエバポレーターは0.5-2時間続けてみましょう。プロセスを停止するには、徐々に、真空圧力を解放回転を停止し、丸底フラスコを除去する。 </li></ol></li></ol> 3。脂質再懸濁およびベシクル均質<ol><li>直接丸底フラスコ内の薄い脂質膜に1ミリリットル18.2MΩH 2 Oを加える。最大速度で激しく渦ソリューション、約3,200 rpmで、脂質膜が目で観察されたガラスから切り離しまで。 </li><li> 2 mlのマイクロチューブに脂質分散を転送します。 </li><li>セットアップリングは、5mmチップでホモジナイザーを保持するために立っている。しっかりと脂質分散を保持するためにホモジナイザー下マイクロスタンドを置きます。 18.2MΩH 2 Oで先端を浸漬し、数秒間実行することにより、ホモジナイザーの分散要素をすすぐ。 </li><li>番目を確保脂質分散に直接分散要素を配置先端にマイクロ遠心チューブの底に触れない。電力レベル4または14,000 rpmで1分間ホモジナイズする。 </li></ol> 4。小胞の放出と凍結乾燥<ol><li>アウターケーシングや家2テフロン内部の膜がサポートするリテーナナット、2つのOリング、および1テフロン軸受けで構成されたミニ押出機（ 図2）の部品を組み立てる。 <ol><li>内部膜支持体の溝に2個の​​O-リングを置きます。予め湿らせつのフィルタと1 400 nmの膜。フィルタは、それらの間の膜とO-リングの内側にテフロン（登録商標）に対して配置される。 </li><li>膜がOリングの間に2つのフィルタに囲ま膜と押出アウターケーシングにサポートしています置きます。ケーシング内にテフロンベアリングを配置し、リテーナナットを取り付け、手で締めます。 </li></ol></li><li> 2シリンジをすすぎ、18.2MΩ水を持つものを記入してください。小さな時間に注射針を挿入します押出機アセンブリの両端にテフロンでoles。針は簡単にスライドするはず;針を無理に押し込まないでください。押出機ハウジングと締めに注射器で押出機を固定します。 </li><li>ゆっくりと1注射器のうち、その他の中に水を押すことにより押出機を通して水を渡します。これは、1つの通路を表している。現在の漏れがないことを確実に3通路の合計に対して、この手順を繰り返します。水の注射器を取り出し、水を処分する。 </li><li>サンプルと1シリンジを埋める、押出機に取り付け、ステップ4.3で上記のように徐々に膜を通って小胞ソリューションを渡す。 11通路の合計10倍を繰り返します。押出プロセスが進むにつれて、試料は、膜を横切ってプッシュするために以下の混濁かつ容易になるであろう。抵抗の急激な減少が、しかしながら、通常、膜の破裂を示している。 </li><li>押し出された小胞のソリューションを転送し、マイクロチューブに小胞の40μlのアリコートを行います。Flashには、どちらのドライアイスや液体窒素の各アリコートを凍結。 </li><li> 30で一晩遠心エバポレーター℃まで、各アリコートを凍結乾燥-20℃で凍結乾燥した空胞を保存</li></ol> 5。転写 - 翻訳機械をカプセル化<ol><li>転写·翻訳反応の成分を混合し、RNase阻害の20ユニットを追加。氷の上でインキュベートする。 </li><li> DNAテンプレートを追加します。コントロール反応のために、250をコードするプラスミドのmVenusのNGまたはT7転写プロモーターの後ろに類似の蛍光タンパク質と強いE.大腸菌リボソーム結合部位をお勧めします。 </li><li> RNaseフリー水で最終体積を25μlをもたらす。 </li><li>ステップ5.3で組み立て反応液10μlと凍結乾燥胞の水和物アリコート（ステップ4.6から）。簡潔にボルテックス混合ベシクルを再懸濁されるまで。これは、以下の30秒を取るべきである。 </li><li> 3のために氷の上での反応をインキュベート胞を膨潤できるように0分。 </li><li> 50mMのトリス-HCl、50mMのNaCl、pH7.4のの27.0μL及び20.2 mg / mlのプロテ​​イナーゼKのDNaseとRNaseを1.5μlのに小胞の1.5μLを加えることにより、30μlの最終容量に20倍胞混合物を希釈また胞外物質を分解するプロテイナーゼKの代替として、この時点で添加することができる。 </li><li> 37少なくとも2.5時間インキュベート℃、 </li></ol> 6。顕微鏡検査<ol><li>小胞と異なる時点で蛍光タンパク質生産の進捗状況を調べる。小胞は400nmの小胞の放出のために使用される膜の孔径よりも大きな直径を有する。 <ol><li>標準的な顕微鏡スライド上に20×5ミリメートルシリコンスペーサを配置することによって、試料室を準備します。試料室への小胞のピペットを10μl。室以上シリコン処理ガラスカバースリップを置きます。 </li><li> 63X油分散Oで小胞を観察する搾取蛍光タンパク質の適切なフィルターセットを用いて明視野と蛍光顕微鏡法によるRと同様の目的。 </li></ol></li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

無細胞合成生物学は、まだ始まったばかりであるが、進歩は、ますます複雑化する細胞のようなシステムを作ることができ、そこから基礎を築いた。完全に定義されたコンポーネントからの転写·翻訳機構の再構成胞28の9内部は環境対応人工cells17、18を構築する後の努力を促進する上で特に顕著であった。同様に、人工細胞研究は、進化の過程4,29,30、機械的なRNAの詳細およびタンパク質合成22,31、代謝load32、33の影響、およびウイルス粒子の集合体34をプローブするために使用されている。重要なのは、十分な知識は今、基本的な細胞機能が存在するこれらの以前の報告とここに記載されているプロトコルは、次の研究室での小胞の内側に再構成することができる。 、説明されたカプセルは、PRに簡単であることに加えてocedureは、いくつかの利点を持っています。例えば、多くの空、凍結乾燥された小胞のアリコートを事前に行うことができ、後の使用のために-20℃で保存した。プロトコルは、有機溶剤、急激な温度変化、または透析の長い期間に受けない生体分子を行います。我々は、必要に応じて手順の優しさは、追加コンポーネントの取り込みを促進することを期待しています。我々はまた、カプセル化または転写 - 翻訳効率に膜の脂質組成の変化に悪影響を観察していない。従って、膜タンパク質、特定の形態、または可視化の取り込みに、より適した脂質は多分悪用される可能性があります。 記載されている方法の主な制限は、結果として小胞のサイズまたはラメラで均質でないことである。多くのアプリケーションでは、これらの問題は、データの解釈に干渉しない。ただし、必要に応じて、追加のステップが狭い番目に組み込むことができ電子サイズ分布及びカプセル化の後、押出のさらなるラウンドのような膜の層を、減少させるが、凍結融解、又は透析35。間違いなく、これらおよびその他の問題を回避するより良い方法が開発される。それまで、私たちは、プロトコルがよく携帯模倣の建設のために適していることが、ここで説明を見つける。

無細胞は、in vitroで転写·翻訳反応と合成脂質からの小胞の生成は、新しいものではありません。しかし、模倣携帯に2を組み合わせること。E. challenging1-6かなり多くあるT7 RNAポリメラーゼの有無にかかわらず大腸菌細胞抽出物を転写-翻訳機構7,8の供給源として使用することができる。細胞抽出物は、タンパク質発現および折り畳みを容易にすることができる付加的な細胞成分の存在から恩恵を受ける。あるいは、個別にRNAと蛋白質分子の精製混合物が、9 PUREシステム、すなわち 、膀胱内タンパク質合成4,10-14を媒介するために使用することができる。 PUREシステムは完全に定義された細胞の模倣の建設を可能にし、細胞抽出物で見つかったヌクレアーゼ活性に悩まされることはありません。実際には、このことにより、低封入効率11とプロセスを容易にする、はるかに少ないDNAテンプレートが必要であることを意味する</sup&gt;。あまり頻繁に使用されますが、細胞の模倣は、真核生物cells15由来の細胞抽出物を使用して構築することができます。これまで、環境を感知遺伝的にエンコードされカプセル化されたカスケードおよび細胞模倣は16-18報告されている。 転写翻訳反応を監視する最も簡単な方法は、遺伝的にコード要素の蛍光又はルミネセンスを測定することである。 インビトロ反応で頻繁に放射性標識によって測定されるが、典型的には、ホタルルシフェラーゼ19又はGFPが用いられる。蛍光検出は、さらにそれによって生物学のような過程の確率的性質にいくつかの洞察を提供し、サイトメトリーベースのメソッドを介して小胞20,21の個体群のモニタリングを可能にします。これらの監視方法は、iのと互換性のある蛍光タンパク質の集合を含むデザインルールとからビルドするのに部品のライブラリの小さなセットを定義するために使用されているN体外転写翻訳22、表現22、シグマ因子16の活動、および転写ターミネーター23の効率に遺伝子組織の影響。それにもかかわらず、 インビトロで予測可能な遺伝的にエンコードされた装置を構築する能力を高めるために行われる必要があり、その多くが残っている。 小胞を作るために利用できる多くの方法がある。最も一般的な方法は、水性solution24で再懸濁し、続いてガラス表面上に薄い脂質膜の生成に依存する。水溶液転写 - 翻訳機構が含まれている場合、例えば、次いで形成された小胞の割合は、タンパク質産生のために必要なコンポーネントを含むであろう。しかしながら、このような方法のカプセル化効率は、小胞のごく一部がアクティブであることを意味し、低い。はるかに高い封入EFFが特徴の代替メソッドの多くiciencyは、小胞の油中水型エマルジョン液滴の変換を利用する。そのような方法は、将来的には一般的であろうと思われているが、現在のところ、これらの方法は、特殊な装置を必要と苦しむ、変更された膜組成物25と小胞を得た。小胞のメソッドへの油中水型の明確な利点は、膜ラメラを制御するための電位である。本明細書に記載された方法は、追加の均質化工程を含むわずかな変更を加えて四方実験室11に記載の薄膜脂質膜プロトコルに基づいている。この方法は安価で、簡単で、うまく転写 - 翻訳機械のカプセル化に適した堅牢な小胞を与える。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="745">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Quick Spin Mini-prep kit</td>
			<td style="width:243px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spectrometer</td>
			<td style="width:243px;">NanoDrop 1000</td>
			<td style="width:119px;">NDB767ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">770557</td>
			<td style="width:167px;">MW 760 g/mol 
			Transition Temp -2 &#176;C 
			CAS# 26853-31-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">459836</td>
			<td>Anhydrous, &#62;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Phenol-choloroform-isoamyl alcohol 25:24:1, for molecular biology use</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P3803-100mL</td>
			<td>Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform</td>
			<td>Biotech Grade Fluka</td>
			<td style="width:119px;">496189-1L</td>
			<td>Contain ethanol at 0.5-1.0% v/v as stabilizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Brown amber glass bottles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89043-518</td>
			<td>55X 48 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi Rotovapor R-210/Sigma</td>
			<td>Z563846EU-1EA</td>
			<td>With jack and water bath, 29/32 joint 240 V</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Analog vortex mixer</td>
			<td style="width:243px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">945300</td>
			<td>Speed 1,000-3,200 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Homogenizer</td>
			<td>IKA T10 Basic Ultra-Turbax</td>
			<td style="width:119px;">3420000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Extruder filters</td>
			<td>Whatman</td>
			<td style="width:119px;">610014</td>
			<td>drain disc 10 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Extruder polycarbonate membrane 400 nm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td style="width:119px;">61007</td>
			<td>nuclepore polycarbonate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Speed vacuum</td>
			<td>Labconco</td>
			<td style="width:119px;">7970011</td>
			<td>Centritrap DNA concentrator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PURExpress kit</td>
			<td style="width:243px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">NRM #E6800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNAse inhibitor (40,000 U/ml)</td>
			<td style="width:243px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">#M0307S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K (20.2 mg/ml)</td>
			<td style="width:243px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">#EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:243px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microscope</td>
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Zeiss Observer Z1with a AxioCam MRm camera</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RealTime</td>
			<td style="width:243px;">CFX96 Real time PCR Detection System (Biorad)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Silicon press to seal&#160;&#160;-Molecular Probe</td>
			<td style="width:243px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">P18174</td>
			<td>Resistant from&#160; -25-30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Siliconized glass circle cover slides</td>
			<td style="width:243px;">Hampton Research</td>
			<td style="width:119px;">HR3-231</td>
			<td>&#160;&#160; Diameter= 22 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ</td>
			<td style="width:243px;">NIH&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the encapsulation of cell-free transcription and translation machinery in vesicles for the construction of cellular mimics

個々の分子から分子のシステムへの関心がシフトしたように、研究室が増えて、より良い携帯人生の複雑さを表す携帯ミミックボトムアップからビルドしようとしてきた。これまでに、油中水型エマルジョン、マイクロ流体デバイス、および小胞の利用を含む区画セルラ模倣物の構築を取ることができるパスの数が存在する。利用可能なオプションには、それぞれ固有の利点と欠点を有する。例えば、油中水型エマルジョンは、高い封入効率を与えるが、よく生きた細胞の透過障壁を模倣しない。本明細書に記載の方法の主な利点は、すべての実装が容易で安価であることである。転写·翻訳機構は、遠心エバポレーター、押出機などの一般的なインストゥルメンテーションを、悪用プロセスを通じてリン脂質小胞の内部に封入されている。反応を蛍光分光法によって監視されます。プロトコルSは、組換えタンパク質の発現、細胞の模倣の建設、携帯生命の最小要件の探査、または遺伝回路の組み立てに適合させることができる。

蛍光顕微鏡は、胞外物質が酵素的に分解されるため、その蛍光のみ（ 図3）、小胞の内側に観測される明らかにする。 mVenusの発現のために、胞内蛍光は37℃で1.5時間後に観察され始め、6時間以内に最大蛍光強度に到達する。最適な温度およびインキュベーション時間は、使用される特定の構築物に応じて変化し得る。例えば、異なる蛍光タンパク質は、温度依存的にまったく異なる成熟。換言すれば、タンパク質生産の観察は、タンパク質合成および折り畳み時だけでなく、発色団の形成にもっぱら依存しない。全体的なタンパク質合成は、転写および翻訳のために必要な27枯渇成分の流入を可能にするために、膜タンパク質の細孔を組み込むことによって高めることができる。 これは、類似した転写並進を行うことをお勧めします搾取遺伝子構築物が機能していることを確認するために小胞が存在しない場合に化反応。このコントロール反応をより簡単に蛍光分光法ではなく、顕微鏡によって監視される。 図4は、構築物、符号化mVenusのインビトロ転写翻訳反応で示している。カプセル化されていない反応が似胞内反応よりもはるかに高い総蛍光強度を与える。これは、カプセル化効率によるものであり、総胞内量は胞外体積（ すなわち、希釈効果）よりもはるかに少ないからである。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig1.jpg" width="600px" /> 図1。ロータリーエバポレーターと真空ポンプは <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig1highres.jpg" target="_blank">大きな画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 図2ハウジングおよび押出機の部品を別々に示されている 。左から右に、注射器、リテーナナット、テフロンベアリング、内部の膜が互いに直面黒Oリング、押出アウターケーシング、及び第2のシリンジでサポートされています<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig2highres.jpg" target="_blank">大きな画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig3.jpg" width="600px" /> 図3のリポソーム中mVenusタンパク質生産の蛍光画像とC：。。。多層小胞の明るいフィールド画像1.5時間と2.5時間後にBと＆＃160; D：mVenusの生産は、それぞれ1.5と2.5時間後（緑色）蛍光によって可視化される。スケールバーは20μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig3highres.jpg" target="_blank">大きな画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig4.jpg" width="600px" /> （4）in vitro転写とmVenusの翻訳でカプセル化されていないのin vitroでのコントロール反応の図 。蛍光強度を4時間かけて5分毎に測定した。データはリアルタイムPCR装置で取得した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig4highres.jpg" target="_blank">画像を拡大表示するには、ここをクリック</a> 。

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The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

本明細書で我々は、小胞の調製、転写および翻訳機構のカプセル化、およびタンパク質の産生を監視するための簡単​​な方法を記載する。得られた無細胞系がますます複雑な細胞模倣物の構築の開始点として使用することができる。

セルラーミミックの構築のための小胞における無細胞転写および翻訳機構のカプセル化

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

the-encapsulation-cell-free-transcription-translation-machinery

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.0K ビュー.  University of Trento. 本明細書で我々は、小胞の調製、転写および翻訳機構のカプセル化、およびタンパク質の産生を監視するための簡単​​な方法を記載する。得られた無細胞系がますます複雑な細胞模倣物の構築の開始点として使用することができる。 

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A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro follicle techniques provide a tool to model follicle development in order to investigate basic biology, and are further being developed as a technique to preserve fertility in the clinic1-4. Our in vitro culture system employs hydrogels in order to mimic the native ovarian environment by maintaining the 3D follicular architecture, cell-cell interactions and paracrine signaling that direct follicle development 5. Previously, follicles were successfully cultured in alginate, an inert algae-derived polysaccharide that undergoes gelation with calcium ions6-8. Alginate hydrogels formed at a concentration of 0.25% w/v were the most permissive for follicle culture, and retained the highest developmental competence 9. Alginate hydrogels are not degradable, thus an increase in the follicle diameter results in a compressive force on the follicle that can impact follicle growth10. We subsequently developed a culture system based on a fibrin-alginate interpenetrating network (FA-IPN), in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. This combination provides a dynamic mechanical environment because both components contribute to matrix rigidity initially; however, proteases secreted by the growing follicle degrade fibrin in the matrix leaving only alginate to provide support. With the IPN, the alginate content can be reduced below 0.25%, which is not possible with alginate alone 5. Thus, as the follicle expands, it will experience a reduced compressive force due to the reduced solids content. Herein, we describe an encapsulation method and an in vitro culture system for ovarian follicles within a FA-IPN. The dynamic mechanical environment mimics the natural ovarian environment in which small follicles reside in a rigid cortex and move to a more permissive medulla as they increase in size11. The degradable component may be particularly critical for clinical translation in order to support the greater than 106-fold increase in volume that human follicles normally undergo in vivo .

A new method for ovarian follicle encapsulation in a 3D fibrin-alginate interpenetrating network is described. This system combines structural support with proteolytic degradation to support the development of immature follicles to produce mature oocytes. This method may be applied to culture cell aggregates to maintain cell-cell contacts without limiting expansion.

タンパク質分解的に分解性3次元システムにおける卵胞のカプセル化と文化のための方法

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

生物工学

Describing a Transcription Factor Dependent Regulation of the MicroRNA Transcriptome

While the transcription regulation of protein coding genes was extensively studied, little is known on how transcription factors are involved in transcription of non-coding RNAs, specifically of microRNAs. Here, we propose a strategy to study the potential role of transcription factor in regulating transcription of microRNAs using publically available data, computational resources and high throughput data. We use the H3K4me3 epigenetic signature to identify microRNA promoters and chromatin immunoprecipitation (ChIP)-sequencing data from the ENCODE project to identify microRNA promoters that are enriched with transcription factor binding sites. By transfecting cells of interest with shRNA targeting a transcription factor of interest and subjecting the cells to microRNA array, we study the effect of this transcription factor on the microRNA transcriptome. As an illustrative example we use our study on the effect of STAT3 on the microRNA transcriptome of chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells.

Herein we propose a strategy to study the effect of a transcription factor of interest on the microRNA transcriptome using publically available data, computational resources and high throughput data from microRNA arrays after transfecting cells with small hairpin (sh)RNA targeting a transcription factor of interest.

マイクロRNAトランスクリプトームの転写因子依存性調節を記述する

While the transcription regulation of protein coding genes was extensively studied, little is known on how transcription factors are involved in ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue geometry. The resulting 3D hydrogel-based cellular constructs have been introduced as an alternative to animal experiments for advanced biological studies, pharmacological assays and organ transplant applications. Although hydrogel-based particles and fibers can be easily fabricated, it is difficult to manipulate them for tissue reconstruction. In this video, we describe a fabrication method for micropatterned alginate hydrogel sheets, together with their assembly to form a macro-scale 3D cell culture system with a controlled cellular microenvironment. Using a mist form of the calcium gelling agent, thin hydrogel sheets are easily generated with a thickness in the range of 100 - 200 &#181;m, and with precise micropatterns. Cells can then be cultured with the geometric guidance of the hydrogel sheets in freestanding conditions. Furthermore, the hydrogel sheets can be readily manipulated using a micropipette with an end-cut tip, and can be assembled into multi-layered structures by stacking them using a patterned polydimethylsiloxane (PDMS) frame. These modular hydrogel sheets, which can be fabricated using a facile process, have potential applications of in vitro drug assays and biological studies, including functional studies of micro- and macrostructure and tissue reconstruction.

We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment.

マイクロパターンマクロスケール3D細胞構造のためのモジュラーヒドロゲルシートの構築

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

化学のエピジェネティックな修飾剤の細胞機械装置をリダイレクトすることによって遺伝子の転写を抑制

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

高分子ナノ粒子の疎水性および親水性化合物のカプセル化のため NanoPrecipitation をフラッシュします。

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

世界的な細胞のマトリックスメタロプロテアーゼと 3 D ゲルの代謝活性を測定

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical development, not only their pharmaceutical activity is important but also their production needs to be evaluated. In this context, research focuses on the isolation of EVs, their characterization, and their storage. The present manuscript aims at providing a facile procedure for the assessment of the effect of different storage conditions on EVs, without genetic manipulation or specific functional assays. This makes it possible to quickly get a first impression of the stability of EVs under a given storage condition, and EVs derived from different cell sources can be compared easily. The stability measurement is based on the physicochemical parameters of the EVs (size, particle concentration, and morphology) and the preservation of the activity of their cargo. The latter is assessed by the saponin-mediated encapsulation of the enzyme beta-glucuronidase into the EVs. Glucuronidase acts as a surrogate and allows for an easy quantification via the cleavage of a fluorescent reporter molecule. The present protocol could be a tool for researchers in the search for storage conditions that optimally retain EV properties to advance EV research toward clinical application.

Here we present a readily applicable protocol to assess the storage stability of extracellular vesicles, a group of naturally occurring nanoparticles produced by cells. The vesicles are loaded with glucuronidase as a model enzyme and stored under different conditions. After storage, their physicochemical parameters and the activity of the encapsulated enzyme are evaluated.

細胞外小胞の保存性の評価

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

細胞を含まない細菌抽出物、リポソーム、エマルジョン移動を用いた合成細胞の調製

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Finite Element Modelling of a Cellular Electric Microenvironment

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the mechanisms of cell response when exposed to electrical fields can therefore guide the optimization of clinical applications. In vitro experiments aim to help uncover those, offering the advantage of wider input and output ranges that can be ethically and effectively assessed. However, the advancements in in vitro experiments are difficult to reproduce directly in clinical settings. Mainly, that is because the ES devices used in vitro differ significantly from the ones suitable for patient use, and the path from the electrodes to the targeted cells is different. Translating the in vitro results into in vivo procedures is therefore not straightforward. We emphasize that the cellular microenvironment's structure and physical properties play a determining role in the actual experimental testing conditions and suggest that measures of charge distribution can be used to bridge the gap between in vitro and in vivo. Considering this, we show how in silico finite element modelling (FEM) can be used to describe the cellular microenvironment and the changes generated by electric field (EF) exposure. We highlight how the EF couples with geometric structure to determine charge distribution. We then show the impact of time dependent inputs on charge movement. Finally, we demonstrate the relevance of our new in silico model methodology using two case studies: (i) in vitro fibrous Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) poly(styrenesulfonate) (PEDOT-PSS) scaffolds and (ii) in vivo collagen in extracellular matrix (ECM).

This paper presents a strategy for building finite element models of fibrous conductive materials exposed to an electric field (EF). The models can be used to estimate the electrical input that cells seeded in such materials receive and assess the impact of changing the scaffold's constituent material properties, structure or orientation.

細胞電微小環境の有限元素モデリング

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the ...

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their cellular source, such as platelet lysate (PL). When used as treatment, EVs are expected to enter the target cells and effect a response from these. In this research, PL-derived EVs have been studied as a cell-free treatment for osteoarthritis (OA). Thus, a method was set up to label EVs and test their uptake on cartilage explants. PL-derived EVs are labeled with the lipophilic dye PKH26, washed twice through a column, and then tested in an in vitro inflammation-driven&#160;OA model for 5 h after particle quantification by nanoparticle tracking analysis (NTA). Hourly, cartilage explants are fixed, paraffined, cut into 6 &#181;m sections to mount on slides, and observed under a confocal microscope. This allows verification of whether EVs enter the target cells (chondrocytes) during this period and analyze their direct effect.

Here, we present a protocol to label platelet lysate-derived extracellular vesicles to monitor their migration and uptake in cartilage explants used as a model for osteoarthritis.